一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法与流程

文档序号:11197638阅读:806来源:国知局

本发明涉及蚕丝领域,尤其涉及一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法。



背景技术:

蚕丝是一种动物蛋白纤维材料,主要由丝素蛋白和丝胶蛋白组成,其中丝素蛋白约占70%,是蚕丝的主要成分,决定蚕丝的性质和用途。桑蚕丝是生活中比较常见的蚕丝之一,其在各领域中都有实际应用。

丝素基质在蚕体内的生化合成十分复杂,不同蚕丝腺内的丝素蛋白原液不同,而且在吐丝过程中,丝素原液受到蚕体内的压力及口器的作用,会表现出不同的流变性,最终导致不同种类蚕丝丝素的分子结构和超分子结构等微结构的不同。

桑蚕丝和柞蚕丝丝素蛋白中含有18种氨基酸(不含有20种基本氨基酸中的谷氨酰胺和天冬酰胺),主要由甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)、丝氨酸(ser)和酪氨酸(tyr)组成。桑蚕丝素中四种氨基酸的含量在85%以上,而柞蚕丝素中四种氨基酸含量在82%以上。此外,经过研究发现,除了不同种类的蚕丝其氨基酸分布不同之外,同一桑蚕丝的氨基酸在其径向上的分布是不同的。

为了实现桑蚕丝更好地进行利用,有必要比较研究桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸的径向分布和变化规律。目前,在研究过程中,可通过使用酸、碱溶液或各种蛋白酶对丝素蛋白进行不同程度(通过控制水解/酶解时间的长短来实现径向上的逐层侵蚀)的溶解,以得到残余的丝素纤维,再采用红外光谱、x射线衍射等技术进行分析。但上述溶解方法容易损伤氨基酸,并且容易对丝素纤维内层暂时不希望被水解的蛋白质造成误水解/酶解,从而造成分析结果不够准确。此外,上述方法还无法进行较详细的定量研究。



技术实现要素:

为了解决上述技术问题,本发明提供了一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法。本发明根据桑蚕丝丝素纤维径向上氨基酸分布的特点,采用多次酶解法对丝素蛋白进行溶解,特异性高,作用条件温和,对氨基酸的破坏小,使结果更准确。

本发明的具体技术方案为:1.一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法,其特征在于包括以下步骤:

1)称取桑蚕丝作为样品,用去离子水清洗,去除表面污染物,烘干。

2)将烘干的样品以1:95-105的浴比在含有0.4-0.6wt%na2po4和0.8-1.2wt%c17h35coona的混合溶液中煮沸25-35min,进行脱胶处理,共脱胶两次。

本发明在脱胶过程中,加入c17h35coona缓冲剂,提高脱胶效率,同时减少对丝素纤维的伤害。

3)脱胶之后,将样品用去离子水冲洗干净,放入55-65℃烘箱,得到干燥的丝素纤维。

4)取直径相近的丝素纤维,等质量分为a、b、c、d、e五组,其中a组作为对照组,不做任何处理。

5)将b、c、d、e组浸入到胰蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理,保留b组残余丝素。

6)将步骤5)酶解过的c、d、e组浸入到碱性蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理,保留c组残余丝素。

7)将步骤6)酶解过的d、e组浸入到木瓜蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理,保留d组残余丝素。

8)将步骤7)酶解过的e组浸入到胰弹性蛋白酶溶液中进行酶解,反应完成后,对酶进行灭活处理。

9)对b、c、d、e组残余丝素进行过滤和洗涤处理,得到在径向上具有不同程度溶蚀的残余丝素。

10)利用氨基酸自动分析仪对a和b、c、d、e组残余丝素进行氨基酸分析,可得到各组中氨基酸的种类和含量。

与现有技术中只使用同一种水解方法、仅采用不同时长来控制对丝素纤维的腐蚀程度的方法相比,本发明人经过长期研究,根据桑蚕丝其径向上大概、粗略的氨基酸分布情况,每腐蚀一层丝素纤维时选用不同的蛋白酶。其依据是:丝素纤维径向上不同部位,其氨基酸分布具有不同的特征,桑蚕丝丝素中存在多层次结构,其表层无定形区的比例较高,里层结晶区的比例较高;侧基较大的氨基酸和赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和酪氨酸等在丝素的表层分布较多,而甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸等小侧基氨基酸在中间至里层分布较多。本发明根据每一层氨基酸的含量,选用不同的蛋白酶针对性的对该层进行酶解。利用每一种蛋白酶对不同氨基酸组成的蛋白质酶解能力的不同,使得在对丝素纤维的每一层进行酶解时,只会对目标层的蛋白质具有最好的酶解效果,而对于目标层内层的蛋白质的酶解效果较差。该方法能够取得的技术效果是,在对目标层进行酶解时能够使目标层彻底酶解残留少,同时对目标层内层的丝素蛋白的“误伤”程度较小,从而实现对目标层的“精准腐蚀”,最终提高后续氨基酸检测的准确性,进而分析其分布对蚕丝性能的影响。

作为优选,步骤5)中酶解反应具体为:将b、c、d、e组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/l的胰蛋白酶溶液中,控制反应温度45-50℃,溶液ph7~9,反应时间为6h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留b组残余丝素。

作为优选,步骤6)中酶解反应具体为:将步骤5)酶解过的c、d、e组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/l的碱性蛋白酶溶液中,控制反应温度40~55℃,溶液ph9~10,继续反应6h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留c组残余丝素。

作为优选,步骤7)中酶解反应具体为:将步骤6)酶解过的d、e组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/l的木瓜蛋白酶溶液中,控制反应温度50~60℃,溶液ph6~7,继续反应6h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留d组残余丝素。

作为优选,步骤8)中酶解反应具体为:将步骤7)酶解过的e组以1:40的浴比放入预先配制好的1.0g/l的胰弹性蛋白酶溶液中,控制反应温度35~39℃,溶液ph8.5~9.2,继续反应6h;反应完成后,对酶进行灭活处理。

桑蚕丝丝素中存在多层次结构,表层无定形区的比例较高,里层结晶区的比例较高;侧基较大的氨基酸和赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和酪氨酸等在丝素的表层分布较多,而甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸等小侧基氨基酸在中间至里层分布较多。在众多蛋白酶中,胰蛋白酶的作用位点为精氨酸(arg)和赖氨酸(lys),主要分布在外层;木瓜蛋白酶的作用位点为精氨酸(arg)、赖氨酸(lys)、酪氨酸(tyr)和甘氨酸(gly),主要分布在外层和中层;碱性蛋白酶的作用位点是亮氨酸(leu)、酪氨酸(tyr)、丙氨酸(gly)和缬氨酸(val),主要分布在外层和中层;胰弹性蛋白酶的作用位点是丙氨酸(ala)、甘氨酸(gly)、丝氨酸(ser)、缬氨酸(val),主要分布在内层。所以依次选择这四种蛋白酶对桑蚕丝丝素纤维进行水解。

作为优选,步骤5)至步骤8)中的酶溶液需要现配现用;同时需要用0.1%na2co3溶液调节溶液ph。

作为优选,步骤5)至步骤8)中灭酶处理为:在90℃的烘箱中保温1h或改变溶液的ph使溶液呈现过酸或过碱,使酶失活。

与现有技术对比,本发明的有益效果是:

(1)本发明在脱胶过程中,加入c17h35coona缓冲剂,提高脱胶效率,同时减少对丝素纤维的伤害。

(2)本发明根据桑蚕丝丝素纤维径向上氨基酸分布的特点,采用多次酶解法对丝素蛋白进行溶解,特异性高,作用条件温和,对氨基酸的破坏小,使结果更准确。

(3)本发明中采用的生物酶无毒无害、与环境友好,同时用量少,节约资源。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1

一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法,包括以下步骤:

1)称取桑蚕丝作为样品,用去离子水清洗,去除表面污染物,烘干。

2)将烘干的样品以1:100的浴比在含有0.5wt%na2po4和1wt%c17h35coona的混合溶液中煮沸30min,进行脱胶处理,共脱胶两次;

3)脱胶之后,将样品用去离子水冲洗干净,放入60℃烘箱,得到干燥的丝素纤维。

4)取直径相近的丝素纤维,等质量分为a、b、c、d、e五组,其中a组作为对照组,不做任何处理。

5)将b、c、d、e组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/l的胰蛋白酶溶液中,控制反应温度48℃,溶液ph8,反应时间为6h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留b组残余丝素。

6)将步骤5)酶解过的c、d、e组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/l的碱性蛋白酶溶液中,控制反应温度48℃,溶液ph9.5,继续反应6h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留c组残余丝素。

7)将步骤6)酶解过的d、e组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/l的木瓜蛋白酶溶液中,控制反应温度55℃,溶液ph6.5,继续反应6h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留d组残余丝素。

8)将步骤7)酶解过的e组以1:40的浴比放入预先配制好的1.0g/l的胰弹性蛋白酶溶液中,控制反应温度37℃,溶液ph8.9,继续反应6h;反应完成后,对酶进行灭活处理。

9)对b、c、d、e组残余丝素进行过滤和洗涤处理,得到在径向上具有不同程度溶蚀的残余丝素。

10)利用氨基酸自动分析仪对a和b、c、d、e组残余丝素进行氨基酸分析,可得到各组中氨基酸的种类和含量。

其中,在步骤5)至步骤8)中的酶溶液需要现配现用;同时需要用0.1%na2co3溶液调节溶液ph。在90℃的烘箱中保温1h或改变溶液的ph使溶液呈现过酸或过碱,使酶失活。

实施例2

一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法,包括以下步骤:

1)称取桑蚕丝作为样品,用去离子水清洗,去除表面污染物,烘干。

2)将烘干的样品以1:95的浴比在含有0.4wt%na2po4和0.8wt%c17h35coona的混合溶液中煮沸35min,进行脱胶处理,共脱胶两次;

3)脱胶之后,将样品用去离子水冲洗干净,放入55℃烘箱,得到干燥的丝素纤维。

4)取直径相近的丝素纤维,等质量分为a、b、c、d、e五组,其中a组作为对照组,不做任何处理。

5)将b、c、d、e组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/l的胰蛋白酶溶液中,控制反应温度45℃,溶液ph7,反应时间为6h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留b组残余丝素。

6)将步骤5)酶解过的c、d、e组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/l的碱性蛋白酶溶液中,控制反应温度40℃,溶液ph9,继续反应6h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留c组残余丝素。

7)将步骤6)酶解过的d、e组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/l的木瓜蛋白酶溶液中,控制反应温度50℃,溶液ph6,继续反应6h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留d组残余丝素。

8)将步骤7)酶解过的e组以1:40的浴比放入预先配制好的1.0g/l的胰弹性蛋白酶溶液中,控制反应温度35℃,溶液ph8.5,继续反应6h;反应完成后,对酶进行灭活处理。

9)对b、c、d、e组残余丝素进行过滤和洗涤处理,得到在径向上具有不同程度溶蚀的残余丝素。

10)利用氨基酸自动分析仪对a和b、c、d、e组残余丝素进行氨基酸分析,可得到各组中氨基酸的种类和含量。

其中,在步骤5)至步骤8)中的酶溶液需要现配现用;同时需要用0.1%na2co3溶液调节溶液ph。在90℃的烘箱中保温1h或改变溶液的ph使溶液呈现过酸或过碱,使酶失活。

实施例3

一种分析桑蚕丝丝素蛋白中氨基酸径向分布的方法,包括以下步骤:

1)称取桑蚕丝作为样品,用去离子水清洗,去除表面污染物,烘干。

2)将烘干的样品以1:105的浴比在含有0.6wt%na2po4和1.2wt%c17h35coona的混合溶液中煮沸25min,进行脱胶处理,共脱胶两次;

3)脱胶之后,将样品用去离子水冲洗干净,放入65℃烘箱,得到干燥的丝素纤维。

4)取直径相近的丝素纤维,等质量分为a、b、c、d、e五组,其中a组作为对照组,不做任何处理。

5)将b、c、d、e组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/l的胰蛋白酶溶液中,控制反应温度50℃,溶液ph9,反应时间为6h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留b组残余丝素。

6)将步骤5)酶解过的c、d、e组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/l的碱性蛋白酶溶液中,控制反应温度55℃,溶液ph10,继续反应6h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留c组残余丝素。

7)将步骤6)酶解过的d、e组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/l的木瓜蛋白酶溶液中,控制反应温度60℃,溶液ph7,继续反应6h;反应完成后,对酶进行灭活处理,保留d组残余丝素。

8)将步骤7)酶解过的e组以1:40的浴比放入预先配制好的1.0g/l的胰弹性蛋白酶溶液中,控制反应温度38℃,溶液ph9.2,继续反应6h;反应完成后,对酶进行灭活处理。

9)对b、c、d、e组残余丝素进行过滤和洗涤处理,得到在径向上具有不同程度溶蚀的残余丝素。

10)利用氨基酸自动分析仪对a和b、c、d、e组残余丝素进行氨基酸分析,可得到各组中氨基酸的种类和含量。

其中,在步骤5)至步骤8)中的酶溶液需要现配现用;同时需要用0.1%na2co3溶液调节溶液ph。在90℃的烘箱中保温1h或改变溶液的ph使溶液呈现过酸或过碱,使酶失活。

本发明中所用原料、设备,若无特别说明,均为本领域的常用原料、设备;本发明中所用方法,若无特别说明,均为本领域的常规方法。

以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何限制,凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换,均仍属于本发明技术方案的保护范围。

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