酒和/或酿酒副产物中酚酸和/或其酯的检测方法与流程

本发明涉及酒和/或酿酒副产物中酚酸和/或其酯的检测方法，属于化学分析
技术领域：
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背景技术：
：酚酸是一类含有酚环的有机酸，具有抗氧化活性及清除自由基的作用，其相对应的一些酚酸酯类化合物也具有类似的生物活性。如，阿魏酸及阿魏酸乙酯均具有抗血小板聚集，抑制血小板5-羟色胺释放，抑制血小板血栓素a2(txa2)的生成，增强前列腺素活性，镇痛，缓解血管痉挛，调节免疫功能，清除和抑制氧自由基，在人体中可起到健美和保护皮肤的作用。酿酒的原辅材料本身存在一些酚酸/酯类物质，另外，酿酒过程中，原辅材料在各酶系、微生物的作用下也会生成一些酚酸/酯，这些具有生物活性的物质经酿造过程进入酒体中，使得酒类产品具有一定的保健功效。研究酒中的酚酸/酯类物质，阐明其生理活性，能够为“适度饮酒有利于健康”这一观点提供理论依据，对酒类产品的市场推广有重要的意义。同时，分析酒中所含有的有益活性物质、明确其种类和含量，有利于提升酒的品质，并有助于对酒的质量进行有效监控。然而，由于酒及酿酒副产物成分及其复杂，酚酸/酯类化合物在其中仅为痕量物质，检测难度较大。而且，酚酸本身含有较多-oh和-cooh，使得它们具有极性强、柱保留弱的特点，而酚酸酯的极性相对较弱，柱保留较强，所以，要同时分离并检测这两类化合物难度就更大。目前，尚未见检测酒和/或酿酒副产物中酚酸和/或其酯类化合物的相关报道，因此，亟需提供一种操作简便、灵敏度高、准确度高的检测方法。技术实现要素：本发明的目的是提供酒和/或酿酒副产物中酚酸和/或其酯的检测方法。本发明提供了酒和/或酿酒副产物中酚酸和/或其酯的检测方法，通过高效液相色谱-质谱联用进行检测；所述高效液相色谱采用反相色谱，流动相的水相中含有0.1～1g/l甲酸或乙酸，有机相为甲醇或乙腈；所述质谱采用负模式检测。进一步地，所述高效液相色谱采用梯度洗脱，流动相为：0～15min：5～100％v/v甲醇；15～20min：100％v/v甲醇；20～22min：5％v/v甲醇；停止洗脱。进一步地，所述高效液相色谱的色谱柱为c18柱。进一步优选地，所述高效液相色谱的色谱柱为zorbaxeclipseplusc18柱。进一步优选地，所述zorbaxeclipseplusc18柱长100mm，内径2.1mm，粒径1.8μm。进一步地，所述高效液相色谱柱温为25～35℃，流速为0.1～0.4ml/min，进样量为1～10ul。进一步优选地，柱温为30℃，流速为0.2ml/min，进样量为2ul。进一步地，每1ml进样样品对应酒10ml；或，每1ml进样样品对应黄水1ml；或，每1ml进样样品对应酒糟2g。进一步地，水相含有0.1±0.01g/l甲酸或乙酸。进一步优选地，水相含有0.1g/l甲酸或乙酸。进一步地，所述质谱的检测条件为：采用电喷雾离子源，干燥气温度280～350℃，干燥气流量8～12l/min，雾化气压力30～40psig，毛细管电压3500～4000v，毛细管出口电压60～135v。进一步优选地，干燥气温度325℃，干燥气流量10l/min，雾化气压力40psig，毛细管电压3500v，毛细管出口电压90v。进一步地，进样高效液相色谱前，所述酒和/或酿酒副产物采用hlb固相萃取柱预处理。其中，所述hlb固相萃取柱的填料吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性n-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物。进一步地，所述hlb固相萃取柱预处理的方法为：上样，0.01％w/w甲酸水淋洗，90％甲醇水溶液洗脱，浓缩甲醇水洗脱液，即得检测样品。进一步地，所述检测样品用甲醇或乙腈溶解，样品溶解后再进样检测。进一步地，所述的酚酸为没食子酸、阿魏酸、香草酸、丁香酸、芥子酸、咖啡酸、原儿茶酸中一种或两种以上的混合物。进一步地，所述的酚酸酯为酚酸乙酯。进一步地，所述的酒为蒸馏酒。进一步优选地，所述的蒸馏酒为白酒。进一步优选地，所述白酒为五粮液浓香型白酒的基酒。进一步地，所述的酿酒副产物为酿造所述酒产生的酒糟、黄水、酒尾、底锅水中一种或两种以上的混合物。进一步地，所述质谱的检测器为四级杆飞行时间质谱检测器。进一步地，所述质谱选择m/z分子离子作为定量离子。进一步地，所述酒和/或酿酒副产物中酚酸或其酯的m/z信号峰根据标准物质对照品确定；采用所述检测方法，酚酸或其酯与相应的标准物质对照品m/z信号峰的出峰时间一致。进一步地，所述酚酸的m/z信号峰为：化合物m/z出峰时间/min没食子酸169.01423.167阿魏酸193.05068.22香草酸167.0356.60丁香酸197.04556.90芥子酸223.06128.10咖啡酸179.0356.77原儿茶酸153.01934.62所述酚酸酯的m/z信号峰为：化合物m/z出峰时间/min没食子酸乙酯197.04557.60香草酸乙酯195.066310.75阿魏酸乙酯221.081911.50进一步地，所述酚酸和/或其酯的含量计算方法还包括如下步骤：a、绘制标准曲线：配制酚酸和/或其酯的标准溶液，根据所述检测方法进样检测，分别以酚酸或其酯m/z信号峰的峰面积和标准溶液浓度为横纵坐标，绘制浓度-峰面积标准曲线；b、检测并计算含量：酒和/或酿酒副产物按所述检测方法进样检测，根据酚酸或其酯m/z信号峰的峰面积与步骤a的标准曲线计算出含量，即可。本发明提供了一种酒和/或酿酒副产物中酚酸和/或其酯的检测方法。该方法选择了合适的液相-质谱条件，通过向流动相中添加适量的甲酸或乙酸(0.1～1g/l)，不仅可以延长酚酸类物质的柱保留，实现几种化合物的良好分离，又不至于造成质谱负模式检测条件下仪器噪音基线过高、检测灵敏度降低等问题。进样检测前选择hlb固相萃取小柱对酒和/或酿酒副产品进行预处理，预处理方法简便快捷，一方面能同时吸附样品中的酚酸及酚酸酯两类亲水性质不同的化合物，另一方面又可以有效除去样品中的糖类物质，避免对酚酸/酯的检测造成干扰。此外，本发明利用高分辨的四级杆飞行时间质谱检测器，以质荷比(m/z)、同位素相对丰度、同位素比例等的相似度，定性各种酚酸/酯，检测灵敏度高，准确性好，可大大减少样品中其它离子的干扰，排除样品检测的假阳性结果。检测结果表明，采用本发明方法可以同时分离与检测没食子酸、阿魏酸等酒类产品中常见的酚酸/酯类化合物，灵敏度高且检测结果准确，是一种检测酒及酿酒副产物中这类物质种类及含量行之有效的方法。附图说明图1为标准溶液浓度为400μg/l时10种酚酸/酯类标准物质总离子流图及提取离子流图；图2为白酒样品总离子流图；图3为酒糟黄水样品总离子流图；图4为酒糟样品总离子流图；图5为对比例1中流动相不加酸的总离子流图及提取离子流图；图6为流动相甲酸含量为1.5g/l的总离子流图及提取离子流图；图7为对比例2中酒糟黄水样品总离子流图；图8为对比例3中酒糟黄水样品总离子流图。具体实施方式本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。本发明采用高效液相色谱-质谱联用法对酒和/或酿酒副产物中酚酸和/或其酯进行检测，填补了该领域检测方法的空白，主要具有以下创新点：1、由于酚酸类物质本身含有较多-oh、-cooh基团，使得它们具有极性强，柱保留弱的特点，所以必须向流动相中添加适宜种类的酸才能延长酚酸的柱保留，实现几种酚酸良好的分离。但是，由于质谱采用负模式检测(-oh、-cooh基团在流动相或者离子源离子化的过程中易于脱掉-h，变成带有负电荷的离子，适合采用负模式检测)，若流动相中酸的加入量过大，会抑制样品中待测化合物的离子化，导致仪器噪音基线过高，大大降低检测灵敏度。因此，流动水相中添加酸的种类和用量均非常关键。发明人经过反复考察，确定流动相中添加0.1～1g/l甲酸或乙酸为最佳，不仅可以延长酚酸类物质的柱保留，实现几种化合物的良好分离，又不至于造成质谱负模式检测条件下仪器噪音基线过高，检测灵敏度降低等问题。相反，若甲酸或乙酸含量小于0.1g/l，各酚酸类化合物之间难于分离、且出现峰拖尾；甲酸或乙酸含量大于1g/l时，所检测的酚酸化合物离子化响应降低，影响其检测限。2、前期研究发现，如果将样品浓缩后直接进样检测，酒类产品，特别是酒糟、酒糟黄水中高浓度的糖类和酚酸出峰时间比较靠近，对样品中酚酸的检测干扰非常大，所以必须除去样品中的糖类物质。本发明在进样检测前选择hlb固相萃取小柱对酒和/或酿酒副产品进行预处理。上样hlb小柱后，糖类物质经由甲酸水淋洗除去，此时所要检测的目标化合物酚酸/酯仍保留在小柱上，再经由甲醇洗脱下来，实现样品中目标化合物与杂质的分离，避免检测过程中杂质的干扰。另外，使用hlb小柱对样品进行预处理，才能够达到同时检测酚酸、酚酸酯两类物质的目的，使用其他小柱则无法实现这一目的：本发明的检测对象之一酚酸，其苯环上带有多个-oh以及-cooh，使得化合物具有较强的亲水性；而另一检测对象酚酸酯，由于-cooh亲水端消失，极性变弱，疏水性变强。也就是说，上述两类化合物一类亲水性强，一类疏水性较强，如何在预处理过程中对它们均产生一定的柱保留，并与糖类杂质完全分离，实现酚酸及其酯的同时检测，是需要解决的一大难题。发明人经过反复考察发现，hlb小柱对这两类亲水疏水性质不同的化合物均具有一定的柱保留；相反，如果采用其他类型的固相萃取小柱(如c18小柱)进行预处理，样品中部分酚酸无法保留在小柱上，不能与杂质有效分离，难以实现准确检测。以下具体实施例中，以酒类产品中常见的、极性强弱差别很大的七种酚酸和三种酚酸乙酯为代表，证明采用本发明方法可以同时分离与检测酚酸/酯类化合物，灵敏度高且结果准确，是一种检测酒及酿酒副产物中这类物质种类及含量行之有效的方法。以下例子采用安捷伦1290lc-6520qtof液质联用仪，waters公司的primehlb小柱。实施例1采用本发明方法检测白酒中酚酸/酯类化合物lc-qtof(高效液相色谱四级杆飞行时间质谱联用仪)的液相色谱条件：流动相：a为超纯水溶液(0.1g/l甲酸)，b为甲醇，梯度洗脱为：0-15min：5～100％v/vb(仪器自动实现梯度变化)；15-20min：100％v/vb；20-22min：5％v/vb；停止洗脱。色谱柱为zorbaxeclipseplusc18柱，柱长100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm，柱温为30℃，流速为0.2ml/min，进样量为2μl。lc-qtof联用仪的质谱条件为：采用电喷雾离子源，负模式，干燥气温度325℃，干燥气流量10l/min，雾化气压力40psig，毛细管电压3500v，毛细管出口电压90v。a、绘制标准曲线：以甲醇为溶剂，配制酚酸及酚酸酯混合标准母液100ml(没食子酸、阿魏酸、香草酸、丁香酸、芥子酸、咖啡酸、原儿茶酸、没食子酸乙酯、香草酸乙酯、阿魏酸乙酯浓度分别为1000mg/l)，用70％甲醇稀释母液，分别配制浓度为20μg/l、80μg/l、400μg/l、800μg/l、1500μg/l、2000μg/l的标准溶液并进样lc-qtof联用仪，根据各溶液浓度与其对应的m/z的峰面积计算得到了浓度-峰面积标准曲线。各酚酸类化合物的线性范围、线性方程、r2值、检测限、检测灵敏度(rsd)，如下表所述：表1各酚酸类化合物的标准曲线以上标准物质总离子流图及提取离子流图见图1(图中横坐标表示时间/min，纵坐标表示离子强度)，各酚酸类化合物的m/z信号峰见下表：表2各酚酸类化合物的m/z信号峰化合物m/z出峰时间/min没食子酸169.01423.167阿魏酸193.05068.22香草酸167.0356.60丁香酸197.04556.90芥子酸223.06128.10咖啡酸179.0356.77原儿茶酸153.01934.62没食子酸乙酯197.04557.60香草酸乙酯195.066310.75阿魏酸乙酯221.081911.50b、白酒样品处理：分别取白酒样品三份(五粮浓香型白酒的基酒，由五粮液技术研究中心分析研究室提供)，各10ml，其中的两份分别加入酚酸标准溶液100ug/l，800ug/l，于80℃蒸发浓缩，上样hlb，0.01％w/w甲酸水淋洗，90％甲醇水溶液洗脱，甲醇水洗脱液氮气吹干，1ml甲醇溶解，作为检测样品进样lc-qtof。白酒样品总离子流图见图2(图中横坐标表示时间/min，纵坐标表示离子强度)。c、分析色谱质谱图：在总离子流图中提取各酚酸类化合物的m/z，得到各酚酸类化合物提取离子色谱图，并积分，定量各酚酸类化合物。以步骤b处理后的白酒样品，进行方法的回收率测定，检测结果见下表：表3白酒样品的回收率测定结果实施例2采用本发明方法检测酒糟黄水中酚酸/酯类化合物a、标准曲线绘制与实施例1中的相同；lc-qtof联用仪的液相色谱的条件与实施例1相同。b、分别取酒糟黄水样品三份(由五粮液技术研究中心分析研究室提供)，各1ml，其中的两份分别加入酚酸标准溶液200ug/l，2000ug/l，上样hlb，0.01％w/w甲酸水淋洗，90％甲醇水溶液洗脱，甲醇水洗脱液氮气吹干，1ml甲醇溶解，作为检测样品进样lc-qtof。酒糟黄水样品总离子流图见图3(图中横坐标表示时间/min，纵坐标表示离子强度)。c、分析色谱质谱图：在总离子流图中提取各酚酸类化合物的m/z，得到提取离子色谱图，并积分，定量各酚酸类化合物。以步骤b处理后的酒糟黄水样品，进行方法的回收率测定，检测结果见下表：表4酒糟黄水样品的回收率测定结果实施例3采用本发明方法检测酒糟中酚酸/酯类化合物a、标准曲线绘制与实施例1中的相同；lc-qtof联用仪的液相色谱的条件与实施例1相同。b、分别取酒糟样品三份(酒糟样品由五粮液技术研究中心分析研究室提供)，各10g，其中的两份分别加入酚酸标准溶液200ug/l，2000ug/l，50ml甲醇浸提，取10ml浸提液于90℃蒸发除去甲醇，水稀释后上样hlb，0.01％w/w甲酸水淋洗，90％甲醇水溶液洗脱，甲醇水洗脱液氮气吹干，1ml甲醇溶解，作为检测样品进样lc-qtof。酒糟样品总离子流图见图4(图中横坐标表示时间/min，纵坐标表示离子强度)。c、分析色谱质谱图：在总离子流图中提取各酚酸类化合物的m/z，得到各酚酸类化合物的提取离子色谱图，并积分，定量各酚酸类化合物。以步骤b处理后的酒糟样品，进行方法的回收率测定，检测结果见下表：表5酒糟样品的回收率测定结果以下通过对比例进一步证明本发明的有益效果。对比例1流动水相中酸含量对检测效果的影响取实施例1中制备的浓度为400μg/l的标准溶液，分别在下述两种流动水相酸含量条件下进样检测，其余色谱、质谱条件均与实施例1相同：条件一：流动水相中不添加酸；条件二：流动水相中甲酸含量为1.5g/l。实验结果：流动水相中不添加酸的标样分离效果图见图5，流动水相中甲酸含量为1.5g/l的标样分离效果图见图6(图中横坐标表示时间/min，纵坐标表示离子强度)。从图中可以看出，流动水相中不添加甲酸，出峰时间靠前的几个化合物，出现峰宽，峰拖尾，且难于分离；流动水相中甲酸含量大于1g/l时，目标化合物响应明显降低，特别是极性较弱的酚酸酯，如阿魏酸乙酯无响应。在上述两种酸含量的条件下，酚酸/酯的分离效果均明显不如图1。上述实验结果表明，本发明确定的检测条件，即流动相中添加0.1～1g/l甲酸或乙酸，检测效果最佳，不仅可以延长酚酸类物质的柱保留，实现几种化合物的良好分离，又不至于造成质谱负模式检测条件下仪器噪音基线过高，检测灵敏度降低等问题。若流动水相中酸含量在该范围之外，均难以达到良好的检测效果。对比例2hlb小柱预处理对检测效果的影响取酒糟黄水样品，采用与实施例2相同的方法及条件进样检测，但进样前不使用hlb小柱预处理。检测结果见图7(图中横坐标表示时间/min，纵坐标表示离子强度)。从图中可以看出，所需检测的目标化合物出峰位置被大量杂质峰覆盖，根本无法准确检测(可与图3分离效果对比)。上述实验结果表明，进样检测前选择hlb固相萃取小柱对酒和/或酿酒副产品进行预处理，可以有效除去样品中的糖类物质，避免对酚酸/酯的检测造成干扰。对比例3梯度洗脱条件对检测效果的影响取酒糟黄水样品，采用与实施例2相同的方法及条件进样检测，但流动相不同：a为超纯水溶液(0.1g/l甲酸)，b为甲醇，梯度洗脱条件：0-10min：20～100％v/vb(仪器自动实现梯度变化)；10-15min：100％v/vb；15-17min：20％v/vb；停止洗脱。检测结果见图8(图中横坐标表示时间/min，纵坐标表示离子强度)。从图中可以看出，对比例实验中，流动相甲醇比例增加过快，结果难以实现样品中目标化合物与杂质的分离(可与图3分离效果对比)。上述实验结果表明，采用本发明梯度洗脱的流动相条件，可以最大限度地减小杂质干扰，实现所检测目标化合物的分离；若梯度洗脱过程中甲醇比例增加过快，会影响酚酸/酯类化合物之间的分离，且杂质对所检测化合物的干扰也更明显。当前第1页12