本发明涉及一种基于草酸银桥联三联吡啶钌纳米复合物的电化学发光传感器的制备方法及应用，属于纳米材料和分析化学领域。
背景技术：
n末端b型利钠肽原是近年来研究较多的化学因子，在心力衰竭的筛选、疗效评估和预后判断中具有重要的价值。作为心功能紊乱最敏感和最特异的指标，n末端b型利钠肽原具有重要的临床指标意义。它是一种对容量负荷较为敏感的心脏神经激素，主要由心室的心肌细胞在心室容量增加及压力负荷增加时分泌，反映左室内的压力及室壁张力变化。舒张性心功能不全的患者，即使无心功能不全的相应临床症状，血浆n末端b型利钠肽原也可以升高，可作为早期诊断舒张性心力衰竭的新指标，如何能高效准确实现n末端b型利钠肽原的检测是现在面临的亟待解决的问题。
近年来，电化学发光方法由于其突出的优势受到广泛的关注，电化学发光是电化学和化学发光两种方法的结合，集成了两种方法的优点：第一，其发光不需要施加外在的激发光源，背景干扰小，且线性范围宽，因此通过电致化学发光对待测物检测，表现出较高的灵敏度。第二，电致化学发光可通过选择不同的共反应剂或调节高压来控制其发光，提高其选择性，有的共反应剂可以再生，重新参与到反应中，与过量的发光物质反应释放能量，产生发光现象，再生共反应剂可节约成本并简化实验装置。鉴于此，发明一种电化学发光检测n末端b型利钠肽原的传感器，具有重要的现实意义。
本发明制备了一种草酸银桥联三联吡啶钌电化学发光传感器，具体采用金功能化氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料作为传感器平台，四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料作为n末端b型利钠肽原抗体标记物，构建了一种夹心型电化学发光传感器，并用于n末端b型利钠肽原的灵敏检测。三联吡啶钌作为电化学发光信号源，三联吡啶钌分子水溶性较好，其固定方法一直是个棘手的问题。cn1752745的专利公开了一种在电化学电极表面固定三联吡啶钌的方法。将三联吡啶钌和柠檬酸根阴离子保护的贵金属纳米粒子的水溶液按照一定比例混合,得到了三联吡啶钌-贵金属纳米粒子聚集体悬浮液,然后把此聚集体悬浮液固定在表面巯基化的电极表面。bard小组将三联吡啶钌或它的衍生物以形成langmuir-blodgett膜或自组装膜的方式固定在电极表面（j.phys.chem.b,1998,92,5566）。dong小组利用层层自组装方法将三联吡啶钌固定在电极表面，形成二氧化硅/三联吡啶钌多层膜（anal.chem.2004,76,184），同时该小组还公开了一种将含有碳纳米管和nafion的复合膜用于在玻碳电极上固定三联吡啶钌的新方法（anal.chem.2004,26,2683）。但是上述方法存在一些缺陷，比如三联吡啶钌与其他物质之间通过静电吸附作用力不强，nafion膜的传质比较慢，固定的量较少，或者需要经过繁琐的层层组装过程等。为了弥补以上三联吡啶钌固定方法的缺陷，本发明通过一步法制备草酸银与三联吡啶钌复合物纳米球，草酸根离子与三联吡啶钌通过配位形成稳定的化学键结合，不仅使得三联吡啶钌能更加稳定的固定在电极表面，形成的草酸银与三联吡啶钌复合物纳米球还包含大量的三联吡啶钌分子，使得电化学发光传感器表现出稳定且较强的电化学发光信号，实现对n末端b型利钠肽原的灵敏检测。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提出一种在电极表面固定三联吡啶钌ru(bpy)32+的方法。在含有氧化石墨烯-碳酸银纳米复合材料的溶液中，同时加入草酸和三联吡啶钌，以草酸根为配体，在碳酸银转化为草酸银的同时，草酸配体桥联三联吡啶钌形成氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料，可有效的将大量三联吡啶钌分子固载在电极表面。
本发明的目的之二制备了四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料，聚多巴胺中的醌式结构与三联吡啶钌发生能量转移，可有效猝灭三联吡啶钌的电化学发光。同时聚多巴胺上含丰富的官能团，可直接连接n末端b型利钠肽原抗体，不需要使用其它连接剂，简化了实验操作。
本发明的目的之三采用三联吡啶钌/过硫酸钾体系采集三联吡啶钌阴极电化学发光信号。在该体系中，分别有两个途径生成三联吡啶钌的激发态：（1）ru(bpy)32+的还原产物ru(bpy)3+与过硫酸根的还原产物硫酸根阴离子自由基通过电子转移可直接形成ru(bpy)32+的激发态ru(bpy)32+*；（2）ru(bpy)32+直接与过硫酸根的还原产物硫酸根阴离子自由基反应生成ru(bpy)33+，进而ru(bpy)33+在负电位下得到电子，形成ru(bpy)32+的激发态ru(bpy)32+*，两个途径同时可生成三联吡啶钌的激发态，进而返回基态，可发射更强的电化学发光信号，有利于检测更高浓度的n末端b型利钠肽原，拓宽对n末端b型利钠肽原检测的范围。
本发明的目的之四制备了一种信号降低型电化学发光传感器，可增加对n末端b型利钠肽原的检测下限，实现更宽范围浓度的检测，提高检测的灵敏度。
本发明的技术方案如下：
1.一种基于草酸银桥联三联吡啶钌纳米复合物的电化学发光传感器的制备方法
（1）金功能化氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料的制备
将60~100mg硝酸银，0.5~2g聚乙烯吡咯烷酮和1~10mg氧化石墨烯溶于20ml超纯水中，向溶液中逐滴加入10~30ml、浓度为0.05mol/l的碳酸氢钠溶液，室温下持续搅拌1h，离心分离，分别用水和乙醇洗3次，制得氧化石墨烯-碳酸银纳米复合材料；
将10~70mg氧化石墨烯-碳酸银纳米复合材料分散于20ml乙二醇中，超声4h，得到溶液a；将50~300mg草酸和1~5ml、浓度为1mmol/l的三联吡啶钌溶液溶于20ml乙二醇中，得到溶液b；将溶液a逐滴加入到溶液b，持续搅拌1h，将其离心分离得到产物，分别用超纯水和乙醇洗产物3次，制得氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料；
将50~200mg氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料分散于20ml超纯水中，超声4h，得到溶液c，将1~7ml、质量分数为2%的氯金酸溶液，1~10mg聚乙烯吡咯烷酮和1~3ml、质量分数为5%的柠檬酸钠溶液混合，得到溶液d，搅拌下将溶液d逐滴加入到溶液c中得到混合溶液，向混合溶液中加入1~5mg硼氢化钠，混合溶液变成暗红色，持续搅拌3~10h，离心分离，制得金功能化氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料；
（2）四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料标记的n末端b型利钠肽原抗体溶液的制备
将50~200mg四氧化三铁纳米粒子和100~300mg多巴胺加入到120ml、ph为8.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液和50~200ml异丙醇的混合溶液中，持续搅拌20~50h，溶液变成黑色，离心分离，用超纯水洗涤5次，将黑色产物置于35ºc真空干燥箱中干燥，制得四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料；
将0.5~2ml浓度为10μg/ml的n末端b型利钠肽原检测抗体溶液加入到1~3ml、浓度为10mg/ml四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料溶液，4ºc下搅拌48h，离心分离，将固体产物重新分散于1ml、ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料标记的n末端b型利钠肽原抗体溶液；
（3）电化学发光传感器的制备
1）玻碳电极经al2o3粉打磨至镜面，用超纯水彻底清洗干净；
2）将6μl、浓度为3~10mg/ml的金功能化氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料溶液滴加到电极表面，4ºc下干燥；
3）继续滴加6μl、浓度为6~12μg/ml的n末端b型利钠肽原捕获抗体溶液于修饰电极表面，4ºc保存至干燥；
4）继续滴加3μl、质量分数为0.5~1%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用ph为7.4的pbs溶液冲洗电极表面，4ºc晾干；
5）分别滴加6μl不同浓度的n末端b型利钠肽原抗原于修饰电极表面，4ºc下孵化20~40min，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4ºc晾干；
6）将6μl、浓度为5~15mg/ml的四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料标记的n末端b型利钠肽原抗体溶液修饰在电极上，室温下孵化30~60min，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4ºc晾干，制得一种夹心型电化学发光传感器。
2.金功能化氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料中，草酸银/三联吡啶钌是通过草酸银与三联吡啶钌配位作用制得。
3.基于草酸银桥联三联吡啶钌纳米复合物的电化学发光传感器作为n末端b型利钠肽原检测的应用。
4.电化学发光传感器作为n末端b型利钠肽原检测的应用，检测步骤如下：
（1）将电化学发光传感器为工作电极，ag/agcl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，使用10ml、ph为6.0~8.4的含40~140mmol/l过硫酸钾溶液电解质溶液，制备电化学工作站，并将其和化学发光检测仪连接在一起进行测试；
（2）化学发光检测仪参数设置为，光电倍增管的高压设置为900v，扫描速率为0.1v/s；
（3）电化学工作站参数设置为，循环伏安扫描电位范围为-1.6v~0v，扫描速率为0.1v/s；
（4）将待测的n末端b型利钠肽原样品溶液代替n末端b型利钠肽原抗原标准溶液进行检测，本发明的基于草酸银桥联三联吡啶钌纳米复合物的电化学发光传感器用于n末端b型利钠肽原检测，检测范围为0.0005-100.0ng/ml，检测限为2.8pg/ml。
所述氧化石墨烯，制备方法如下：将0.3g石墨粉和1.8g高锰酸钾放入500ml的三口烧瓶中，加入36ml浓硫酸和4ml磷酸混合液，将三口烧瓶置于油浴中，50ºc下反应12h，反应结束后，将溶液倾倒在40ml超纯水制得的冰块上，搅拌下缓慢加入300µl的过氧化氢，继续搅拌30min，将得到的混合溶液在8000r/min的转速下离心30min，然后用30ml、浓度为0.2mol/l的盐酸离心洗涤3次，再用无水乙醇离心洗涤3次，最后用乙醚离心洗涤，将得到的固体样品置于35ºc真空干燥箱中干燥，制得氧化石墨烯。
所述四氧化三铁纳米粒子，粒径为250±10nm，制备方法如下：将2.7g三氯化铁溶于100ml乙二醇中，搅拌下加入7.2g醋酸钠和2.0g聚乙二醇，将混合溶液置于50ºc下反应12h，转入不锈钢反应釜中，200ºc下反应8h，磁性分离，分别用水和乙醇洗涤3次，将黑色产物置于80ºc真空干燥箱中干燥，制得四氧化三铁纳米粒子。
所述三联吡啶钌，购于百灵威科技有限公司公司，其它原料在国药集团化学试剂有限公司购得。
本发明的有益成果
（1）本发明通过草酸银桥联三联吡啶钌，实现了对三联吡啶钌的高效固定。
（2）本发明利用聚多胺醌式结构与三联吡啶钌之间可发生能量共振转移机理，构建了一种猝灭型电化学发光传感器，可实现对n末端b型利钠肽原的宽范围浓度的检测，
（3）本发明制备了一种四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料，利用四氧化三铁良好的磁性，有利于材料的分离，聚多巴胺也可直接连接n末端b型利钠肽原抗体，不需要其他连接剂，采用四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料构建传感器，简化实验操作。
（4）本发明制备了一种草酸银桥联三联吡啶钌电化学发光传感器并用于n末端b型利钠肽原的检测。操作简单，响应时间短，信号响应范围宽，检测线性范围为0.0005-100.0ng/ml，检测限为2.8pg/ml，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。
具体实施方式
实施例1
1.一种基于草酸银桥联三联吡啶钌纳米复合物的电化学发光传感器的制备方法
（1）金功能化氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料的制备
将60mg硝酸银，0.5g聚乙烯吡咯烷酮和1mg氧化石墨烯溶于20ml超纯水中，向溶液中逐滴加入10ml、浓度为0.05mol/l的碳酸氢钠溶液，室温下持续搅拌1h，离心分离，分别用水和乙醇洗3次，制得氧化石墨烯-碳酸银纳米复合材料；
将10mg氧化石墨烯-碳酸银纳米复合材料分散于20ml乙二醇中，超声4h，得到溶液a；将50mg草酸和1ml、浓度为1mmol/l的三联吡啶钌溶液溶于20ml乙二醇中，得到溶液b；将溶液a逐滴加入到溶液b，持续搅拌1h，将其离心分离得到产物，分别用超纯水和乙醇洗产物3次，制得氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料；
将50mg氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料分散于20ml超纯水中，超声4h，得到溶液c，将1ml、质量分数为2%的氯金酸溶液，1mg聚乙烯吡咯烷酮和1ml、质量分数为5%的柠檬酸钠溶液混合，得到溶液d，搅拌下将溶液d逐滴加入到溶液c中得到混合溶液，向混合溶液中加入1mg硼氢化钠，混合溶液变成暗红色，持续搅拌3h，离心分离，制得金功能化氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料；
（2）四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料标记的n末端b型利钠肽原抗体溶液的制备
将50mg四氧化三铁纳米粒子和100mg多巴胺加入到120ml、ph为8.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液和50ml异丙醇的混合溶液中，持续搅拌20h，溶液变成黑色，离心分离，用超纯水洗涤5次，将黑色产物置于35ºc真空干燥箱中干燥，制得四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料；
将0.5ml浓度为10μg/ml的n末端b型利钠肽原检测抗体溶液加入到1ml、浓度为10mg/ml四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料溶液，4ºc下搅拌48h，离心分离，将固体产物重新分散于1ml、ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料标记的n末端b型利钠肽原抗体溶液；
（3）电化学发光传感器的制备
1）玻碳电极经al2o3粉打磨至镜面，用超纯水彻底清洗干净；
2）将6μl、浓度为3mg/ml的金功能化氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料溶液滴加到电极表面，4ºc下干燥；
3）继续滴加6μl、浓度为6μg/ml的n末端b型利钠肽原捕获抗体溶液于修饰电极表面，4ºc保存至干燥；
4）继续滴加3μl、质量分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用ph为7.4的pbs溶液冲洗电极表面，4ºc晾干；
5）分别滴加6μl不同浓度的n末端b型利钠肽原抗原于修饰电极表面，4ºc下孵化20min，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4ºc晾干；
6）将6μl、浓度为5mg/ml的四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料标记的n末端b型利钠肽原抗体溶液修饰在电极上，室温下孵化30min，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4ºc晾干，制得一种夹心型电化学发光传感器。
2.所述的电化学发光传感器用于n末端b型利钠肽原检测
（1）将电化学发光传感器为工作电极，ag/agcl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，使用10ml、ph为6.0~8.4的含40~140mmol/l过硫酸钾溶液电解质溶液，制备电化学工作站，并将其和化学发光检测仪连接在一起进行测试；
（2）化学发光检测仪参数设置为，光电倍增管的高压设置为900v，扫描速率为0.1v/s；
（3）电化学工作站参数设置为，循环伏安扫描电位范围为-1.6v~0v，扫描速率为0.1v/s；
（4）将待测的n末端b型利钠肽原样品溶液代替n末端b型利钠肽原抗原标准溶液进行检测。
实施例2
1.一种基于草酸银桥联三联吡啶钌纳米复合物的电化学发光传感器的制备方法
（1）金功能化氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料的制备
将100mg硝酸银，2g聚乙烯吡咯烷酮和10mg氧化石墨烯溶于20ml超纯水中，向溶液中逐滴加入30ml、浓度为0.05mol/l的碳酸氢钠溶液，室温下持续搅拌1h，离心分离，分别用水和乙醇洗3次，制得氧化石墨烯-碳酸银纳米复合材料；
将70mg氧化石墨烯-碳酸银纳米复合材料分散于20ml乙二醇中，超声4h，得到溶液a；将300mg草酸和5ml、浓度为1mmol/l的三联吡啶钌溶液溶于20ml乙二醇中，得到溶液b；将溶液a逐滴加入到溶液b，持续搅拌1h，将其离心分离得到产物，分别用超纯水和乙醇洗产物3次，制得氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料；
将200mg氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料分散于20ml超纯水中，超声4h，得到溶液c，将7ml、质量分数为2%的氯金酸溶液，10mg聚乙烯吡咯烷酮和3ml、质量分数为5%的柠檬酸钠溶液混合，得到溶液d，搅拌下将溶液d逐滴加入到溶液c中得到混合溶液，向混合溶液中加入5mg硼氢化钠，混合溶液变成暗红色，持续搅拌10h，离心分离，制得金功能化氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料；
（2）四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料标记的n末端b型利钠肽原抗体溶液的制备
将200mg四氧化三铁纳米粒子和300mg多巴胺加入到120ml、ph为8.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液和200ml异丙醇的混合溶液中，持续搅拌50h，溶液变成黑色，离心分离，用超纯水洗涤5次，将黑色产物置于35ºc真空干燥箱中干燥，制得四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料；
将2ml浓度为10μg/ml的n末端b型利钠肽原检测抗体溶液加入到3ml、浓度为10mg/ml四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料溶液，4ºc下搅拌48h，离心分离，将固体产物重新分散于1ml、ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料标记的n末端b型利钠肽原抗体溶液；
（3）电化学发光传感器的制备
1）玻碳电极经al2o3粉打磨至镜面，用超纯水彻底清洗干净；
2）将6μl、浓度为10mg/ml的金功能化氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料溶液滴加到电极表面，4ºc下干燥；
3）继续滴加6μl、浓度为12μg/ml的n末端b型利钠肽原捕获抗体溶液于修饰电极表面，4ºc保存至干燥；
4）继续滴加3μl、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用ph为7.4的pbs溶液冲洗电极表面，4ºc晾干；
5）分别滴加6μl不同浓度的n末端b型利钠肽原抗原于修饰电极表面，4ºc下孵化40min，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4ºc晾干；
6）将6μl、浓度为15mg/ml的四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料标记的n末端b型利钠肽原抗体溶液修饰在电极上，室温下孵化60min，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4ºc晾干，制得一种夹心型电化学发光传感器。
2.所述的电化学发光传感器用于n末端b型利钠肽原检测
（1）将电化学发光传感器为工作电极，ag/agcl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，使用10ml、ph为6.0~8.4的含40~140mmol/l过硫酸钾溶液电解质溶液，制备电化学工作站，并将其和化学发光检测仪连接在一起进行测试；
（2）化学发光检测仪参数设置为，光电倍增管的高压设置为900v，扫描速率为0.1v/s；
（3）电化学工作站参数设置为，循环伏安扫描电位范围为-1.6v~0v，扫描速率为0.1v/s；
（4）将待测的n末端b型利钠肽原样品溶液代替n末端b型利钠肽原抗原标准溶液进行检测。
实施例3
1.一种基于草酸银桥联三联吡啶钌纳米复合物的电化学发光传感器的制备方法
（1）金功能化氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料的制备
将80mg硝酸银，1.0g聚乙烯吡咯烷酮和5mg氧化石墨烯溶于20ml超纯水中，向溶液中逐滴加入20ml、浓度为0.05mol/l的碳酸氢钠溶液，室温下持续搅拌1h，离心分离，分别用水和乙醇洗3次，制得氧化石墨烯-碳酸银纳米复合材料；
将50mg氧化石墨烯-碳酸银纳米复合材料分散于20ml乙二醇中，超声4h，得到溶液a；将200mg草酸和3ml、浓度为1mmol/l的三联吡啶钌溶液溶于20ml乙二醇中，得到溶液b；将溶液a逐滴加入到溶液b，持续搅拌1h，将其离心分离得到产物，分别用超纯水和乙醇洗产物3次，制得氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料；
将100mg氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料分散于20ml超纯水中，超声4h，得到溶液c，将5ml、质量分数为2%的氯金酸溶液，5mg聚乙烯吡咯烷酮和2ml、质量分数为5%的柠檬酸钠溶液混合，得到溶液d，搅拌下将溶液d逐滴加入到溶液c中得到混合溶液，向混合溶液中加入3mg硼氢化钠，混合溶液变成暗红色，持续搅拌7h，离心分离，制得金功能化氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料；
（2）四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料标记的n末端b型利钠肽原抗体溶液的制备
将100mg四氧化三铁纳米粒子和200mg多巴胺加入到120ml、ph为8.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液和100ml异丙醇的混合溶液中，持续搅拌30h，溶液变成黑色，离心分离，用超纯水洗涤5次，将黑色产物置于35ºc真空干燥箱中干燥，制得四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料；
将1ml浓度为10μg/ml的n末端b型利钠肽原检测抗体溶液加入到2ml、浓度为10mg/ml四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料溶液，4ºc下搅拌48h，离心分离，将固体产物重新分散于1ml、ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料标记的n末端b型利钠肽原抗体溶液；
（3）电化学发光传感器的制备
1）玻碳电极经al2o3粉打磨至镜面，用超纯水彻底清洗干净；
2）将6μl、浓度为6mg/ml的金功能化氧化石墨烯-草酸银/三联吡啶钌纳米复合材料溶液滴加到电极表面，4ºc下干燥；
3）继续滴加6μl、浓度为10μg/ml的n末端b型利钠肽原捕获抗体溶液于修饰电极表面，4ºc保存至干燥；
4）继续滴加3μl、质量分数为0.7%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用ph为7.4的pbs溶液冲洗电极表面，4ºc晾干；
5）分别滴加6μl不同浓度的n末端b型利钠肽原抗原于修饰电极表面，4ºc下孵化30min，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4ºc晾干；
6）将6μl、浓度为10mg/ml的四氧化三铁@聚多巴胺核壳复合材料标记的n末端b型利钠肽原抗体溶液修饰在电极上，室温下孵化50min，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4ºc晾干，制得一种夹心型电化学发光传感器。
2.所述的电化学发光传感器用于n末端b型利钠肽原检测
（1）将电化学发光传感器为工作电极，ag/agcl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，使用10ml、ph为6.0~8.4的含40~140mmol/l过硫酸钾溶液电解质溶液，制备电化学工作站，并将其和化学发光检测仪连接在一起进行测试；
（2）化学发光检测仪参数设置为，光电倍增管的高压设置为900v，扫描速率为0.1v/s；
（3）电化学工作站参数设置为，循环伏安扫描电位范围为-1.6v~0v，扫描速率为0.1v/s；
（4）将待测的n末端b型利钠肽原样品溶液代替n末端b型利钠肽原抗原标准溶液进行检测。
实施例4
实施例1-3所述氧化石墨烯，制备方法如下：将0.3g石墨粉和1.8g高锰酸钾放入500ml的三口烧瓶中，加入36ml浓硫酸和4ml磷酸混合液，将三口烧瓶置于油浴中，50ºc下反应12h，反应结束后，将溶液倾倒在40ml超纯水制得的冰块上，搅拌下缓慢加入300µl的过氧化氢，继续搅拌30min，将得到的混合溶液在8000r/min的转速下离心30min，然后用30ml、浓度为0.2mol/l的盐酸离心洗涤3次，再用无水乙醇离心洗涤3次，最后用乙醚离心洗涤，将得到的固体样品置于35ºc真空干燥箱中干燥，制得氧化石墨烯；
所述四氧化三铁纳米粒子，粒径为250±10nm，制备方法如下：将2.7g三氯化铁溶于100ml乙二醇中，搅拌下加入7.2g醋酸钠和2.0g聚乙二醇，将混合溶液置于50ºc下反应12h，转入不锈钢反应釜中，200ºc下反应8h，磁性分离，分别用水和乙醇洗涤3次，将黑色产物置于80ºc真空干燥箱中干燥，制得四氧化三铁纳米粒子；
所述三联吡啶钌，购于百灵威科技有限公司公司，其它原料在国药集团化学试剂有限公司购得。
实施例5
实施例1-3所述的草酸银桥联三联吡啶钌电化学发光传感器并用于n末端b型利钠肽原的检测，检测线性范围为0.0005-100.0ng/ml，检测限为2.8pg/ml，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。