一种基于光纤的单细胞精准检测实验装置的制作方法

本发明属于精准医疗科研实验器材领域，具体涉及一种基于光纤的单细胞精准检测实验装置。

背景技术：

随着人类基因组计划的完成，个人基因组、肿瘤基因组、环境基因组学、基因测序技术的发展，以及生物及医学向着数据密集型科学的逐步转化，“精准医疗”作为生物和医学领域的一个全新概念应运而生，为临床病症更为准确、有效的诊断、治疗提供积极的指导作用。精准医疗的实施能够推动医学科技与大数据和信息科学的进一步交叉融合，从而使医疗模式从粗放型向精准型转变。因此，国内外各国政府和企业已经开始了“精准医疗”背景下的战略与科学研究部署。中国政府业已组建中国精准医疗战略专家组，积极制定“精准医疗”战略规划，并计划纳入“十三五”重大科技专项。以恶性肿瘤为例，目前的诊断主要依赖影像学检查、病理学检查及肿瘤标志物等，随着精准医疗时代的到来，单细胞控制与检测技术应运而生，已成为肿瘤学界的研究热点，使人类对恶性肿瘤的检测达到单细胞水平。

折射率作为医学检验参数占据着越来越重要的地位，人们可以从环境的折射率中分析出物质的一些特性，而生物细胞的折射率则更是反映光与细胞相互作用特性的一个重要物理量，是许多生物光学检验学实验中的一个基础参量。如用偏振散射光谱术进行癌症、特别是早期癌症检测诊断的实验研究时，需要给定细胞的相对折射率，进行光谱反演，才能从光谱数据中精确定量地获得细胞的形态信息。由于spr共振曲线对待测介质的折射率变化非常敏感，微小的折射率变化会使共振条件发生明显改变，通过测量共振曲线的变化可以确定待测介质的折射率变化，基于该检测原理，该技术可以应用在医疗检测领域。

肺癌是一种致死率极高的恶性肿瘤，在中国癌症控制策略研究报告中表明肺癌发病率逐年增长，严重威胁着人们的健康。目前ct影像检查是提高患者的生存率的主要手段。据现有的临床影像学诊断结果显示，通过影像学定性诊断的结果存在较高的假阳性率及误诊率。不同物质对光的散射及吸收的差异是ct影像技术的本质，这种差异是光与物质相互作用导致的光学不均匀性。宏观与微观尺度的活体组织光学不均匀性，对应主要理论不同。在分子级和细胞尺度上，电极化率和折射率则分别是衡量此不均匀性的标准。由此可见，对肺癌细胞折射率的确切认识对提高ct影像定性诊断的准确率具有重要意义。但现今对于肺癌单细胞折射率的数据报道甚少，因而对其单细胞的折射率进行实验研究十分重要。

由于大部分生物组织对可见光具有较强的散射和吸收，传统的基于折射定律的测量透明物体折射率的方法不再适用。目前，对生物组织折射率测量的方法主要有裸光纤探针测试法、光学相干层析(oct)法、全反射法以及利用菲涅尔公式将折射率测量归结为反射率的测量方法等；裸光纤探针测试法，是将被测样品作为光纤内芯的包层，通过测量“光纤”的数值孔径，从而确定样品的折射率。其缺点是，如果纤芯与样品接触不良或样品尺寸较小，该方法将失效；oct法是将低相干干涉仪与共焦扫描成像技术结合在一起，通过滤除多次散射光，从而较为准确地测量样品的折射率，但该方法光路复杂，不易调节。

技术实现要素：

鉴于此，本发明提供一种基于光纤的单细胞精准检测实验装置，在载物台上对单细胞进行捕获与检测的精准医疗实验研究。

本发明的目的是通过这样的技术方案实现的，一种基于光纤的单细胞精准检测实验装置，包括超连续谱光源1、耦合透镜组4、微结构多芯光纤i5-1、微结构多芯光纤ii5-3、光谱仪6、980nm光源7、载物台8和电子显微镜9，所述载物台用于承载待检测细胞；所述微结构多芯光纤i尾端设置有光纤spr传感探针5-2，所述微结构多芯光纤ii尾端设置有光纤光镊5-4；超连续谱光源1发出的光注入单模光纤i2-1，再经耦合透镜组4注入微结构多芯光纤i5-1，信号光在光纤spr传感探针5-2的端面反射，通过单模光纤ii2-2反向进入光谱仪6进行检测数据处理；980nm光源7发出的光由单模光纤iii2-3注入微结构多芯光纤ii5-3，在光纤光镊5-4的端面出射并汇聚，形成单细胞光阱捕获场；在电子显微镜9观测下，光纤光镊抓取放置于载物台上的待检测单细胞，送与光纤spr传感探针检测。

进一步，所述光纤光镊通过以下方法获得：截取一段长为2m、外包层直径为125μm，微结构特种环形芯光纤，在环形芯光纤两端利用米勒钳去除涂覆层2cm，用无纺布蘸取酒精擦拭干净，并使用光纤切割刀将其端面切割平整，利用光纤端研磨技术将环形芯光纤一端研磨成37.5°倾角的圆锥台，研磨深度为34.5μm，制作环形光纤，将环形芯光纤另一端面与单模光纤错位焊接，使单模光纤纤芯正对环形芯光纤纤芯某一点即可，单模光纤与捕获光源尾纤通过放电焊接连接牢固。

进一步，所述光纤spr传感探针通过以下方法获得：将外包层直径为125μm，微结构特种双芯光纤端面切平，夹持在光纤研磨系统上，在两芯中同时通入白光，便于通过研磨系统的ccd定位光纤的两个纤芯；沿轴向转动双芯光纤，使两纤芯所在直线垂直于研磨盘，下压光纤，使其与研磨盘成角，进行研磨；当研磨至设计深度时，上抬光纤，沿轴向将光纤旋转180度，再次下压光纤至与研磨盘成37.5°角进行研磨；第二次研磨时，在已经磨制完一侧纤芯中通入单频激光，在另一侧纤芯中监测光强，当光强达到最大值时，停止研磨，光在双芯光纤端面研磨成的锥角结构处经过三次反射，从入射纤芯回到了反射光收集纤芯；将磨制完毕的双芯光纤锥角探针端面向上放置在离子溅射仪金靶下方，镀制500nm厚金膜形成反射膜，保证在水溶液中光可以由入射纤芯反射至出射纤芯；用光纤研磨系统小心去除锥角探针顶面金膜，并在锥角探针顶面镀制50nm厚金膜，作为表面等离子体共振膜。

进一步，该装置还包括用于调节单模光纤i位置的三维调整模块i3-1、用于调节单模光纤ii位置的三维调整模块ii3-2和用于调节单模光纤iii位置的三维调整模块iii3-3。

进一步，所述单模光纤ii为532nm、633nm、980nm或者1310/1550nm的单模光纤。

进一步，所述耦合透镜组为光纤耦合物镜，倍数为4倍或10倍。

进一步，所述耦合透镜组为波导扇出型耦合器件，用于将单模光纤i的光束与单模光纤ii的光束间距平行压缩至微结构多芯光纤i两轴对称纤芯间距。

进一步，所述微结构多芯光纤i5-1的纤芯数为偶数，纤芯呈轴对称分布。

进一步，所述微结构多芯光纤ii5-3的纤芯数为奇数，纤芯呈轴对称分布，单模光纤iii通过拉锥法为微结构多芯光纤ii耦合注光。

由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：

本发明提出了一种基于光纤的单细胞精准检测实验装置，在精准医疗领域，使细胞控制与高灵敏的折射率检测达到单细胞水平。本发明可以实时、无损伤的测量与分析单细胞的折射率变化，从而进行细胞的生存与病变状态研究；其使用的特种微结构多芯光纤光镊与单细胞spr折射率检测探针圆锥台面直径低于100μm，与常规单细胞尺寸在同一量级，在精准医疗科研实验领域具有广阔的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为本发明的整体结构组成示意图；

图2为本发明单细胞spr折射率检测光路示意图；

图3为本发明单细胞光阱捕获场光路示意图。

具体实施方式

以下将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述；应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。

如图1所示，一种基于光纤的单细胞精准检测实验装置，包括超连续谱光源1、耦合透镜组4、微结构多芯光纤i5-1、微结构多芯光纤ii5-3、光谱仪6、980nm光源7、载物台8和电子显微镜9，所述载物台用于承载待检测细胞；所述微结构多芯光纤i尾端设置有光纤spr传感探针5-2，所述微结构多芯光纤ii尾端设置有光纤光镊5-4；超连续谱光源1发出的光注入单模光纤i2-1，再经耦合透镜组4注入微结构多芯光纤i5-1，信号光在光纤spr传感探针5-2的端面反射，通过单模光纤ii2-2反向进入光谱仪6进行检测数据处理；980nm光源7发出的光由单模光纤iii2-3注入微结构多芯光纤ii5-3，在光纤光镊5-4的端面出射并汇聚，形成单细胞光阱捕获场；在电子显微镜9观测下，光纤光镊抓取放置于载物台上的待检测单细胞，送与光纤spr传感探针检测。

在本实施例中，所述的超连续谱光源1为nktphotonics的superkcompact型号，波长范围450-2400nm，总功率大于100mw，0-100％可调。

在本实施例中，所述的单模光纤ii为532nm、633nm、980nm或者1310/1550nm单模光纤。

在本实施例中，检测实验装置还包括用于调节单模光纤i位置的三维调整模块i3-1、用于调节单模光纤ii位置的三维调整模块ii3-2和用于调节单模光纤iii位置的三维调整模块iii3-3。三维调整模块i3-1和三维调整模块ii3-2为thorlabs的mbt602，三维调整模块i3-3为thorlabs的mbt610d型号。

在本实施例中，所述的耦合透镜组4可以为光纤耦合物镜，倍数为4倍或10倍；也可以为波导扇出形耦合器件，用于将两单模光纤光束间距平行压缩至微结构多芯光纤两对称芯间距离大小。

在本实施例中，微结构多芯光纤i5-1包层直径为125μm，纤芯数为偶数，如双芯、四芯或六芯光纤，纤芯呈轴对称分布，光纤spr传感探针5-2为在微结构多芯光纤i5-1尾端进行裸光纤研磨成圆锥台结构并镀制50nm金膜制成；微结构多芯光纤ii5-3包层直径为125μm，纤芯数为奇数，如三芯、五芯或环形芯光纤，纤芯呈轴对称分布，单模光纤iii2-3通过拉锥法为其耦合注光；光纤光镊5-4为在微结构多芯光纤ii5-3尾端利用裸光纤研磨、氢氧焰拉锥或氢氟酸腐蚀成圆锥台形状，使多束光汇聚形成单细胞光阱捕获场。

下面对单细胞精准检测实验装置组成部件的制作做进一步说明。

1、制作单细胞捕获光纤光镊：截取一段长为2m、外包层直径为125μm，微结构特种环形芯光纤，在其两端利用米勒钳去除涂覆层2cm，用无纺布蘸取酒精擦拭干净，并使用光纤切割刀将其端面切割平整，利用光纤端研磨技术将光纤一端研磨成37.5°倾角的圆锥台，研磨深度(即圆锥台高度)为34.5μm，制作完成的环形芯光纤光镊结构及其出射光场如图3所示。将环形光纤另一端面与单模光纤错位焊接，使单模光纤纤芯正对环形芯光纤纤芯某一点即可，单模光纤与捕获光源尾纤通过放电焊接连接牢固。

2、制作光纤spr传感探针：将外包层直径为125μm，微结构特种双芯光纤端面切平，夹持在光纤研磨系统上，在两芯中同时通入白光，便于通过研磨系统的ccd定位光纤的两个纤芯。沿轴向转动双芯光纤，使两纤芯所在直线垂直于研磨盘，下压光纤，使其与研磨盘成α＝37.5°角，进行研磨。当研磨至设计深度时，上抬光纤，沿轴向将光纤旋转180度，再次下压光纤至与研磨盘成37.5°角进行研磨。第二次研磨时，在已经磨制完一侧纤芯中通入单频激光，在另一侧纤芯中监测光强，当光强达到最大值时，停止研磨，光在双芯光纤端面研磨成的锥角结构处经过三次反射，从入射纤芯回到了反射光收集纤芯。将磨制完毕的双芯光纤锥角探针端面向上放置在离子溅射仪金靶下方，镀制500nm厚金膜形成反射膜，保证在水溶液中光可以由入射纤芯反射至出射纤芯。用光纤研磨系统小心去除锥角探针顶面金膜，并在锥角探针顶面镀制50nm厚金膜，作为表面等离子体共振膜。

3、实验装置整体制作：取两根长约1m的单模光纤，两端利用米勒钳去除涂覆层2cm，用无纺布蘸取酒精擦拭干净，并使用光纤切割刀将其端面切割平整；处理好后的光纤用裸纤适配器夹持后，一根连接光源，一根连接光谱仪，将两根单模光纤另一端以及双芯光纤的平端面一端放置在精密三维调整架上，将耦合透镜组固定于单模光纤与双芯光纤之间，通过校准调节，实现如图2所示的光路传播效果，使光谱仪能够较好地接收到检测后的信号光。

4、装置操作：将双芯光纤制作的光纤spr传感探针至于载玻片上，取少量含有细胞的培养液滴加在探针上，浸没光纤spr传感探针，然后将环形芯光纤光镊用精密三维调整模块微操移至环境液体液面下，在电子显微镜辅助下，使光纤光镊与光纤spr传感探针共焦平面，并在微操操纵下，用光纤光镊捕获单个细胞，将其贴靠至光纤spr传感探针端面传感区，打开光源和光谱仪，待系统稳定后，通过光谱仪获取传感谱线。

本发明提出一种基于光纤的单细胞精准检测实验装置，检测设备由超连续谱单模输出光源与可编程光谱仪构成，检测探针由微结构多芯光纤制成，同时使用微结构多芯光纤制作光纤光镊，对单细胞进行控制，在显微镜下，将载物台上的单细胞通过光镊精确布放于微结构多芯spr探针圆锥台结构检测台面上。微结构多芯光纤直径仅有125μm，尖端研磨成圆锥台结构制成spr传感器探针及光镊，与单细胞几十微米量级相当，可以良好的用于精准医疗中对单细胞的精准捕获控制与折射率检测。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。