GNL2蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用、肝癌预后评估试剂盒及方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及gnl2蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用、肝癌预后评估试剂盒及方法。

背景技术：

肝癌即肝脏恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类。大多数继发性肝癌患者肿瘤标志物在正常范围内，但少数来自胃、食管、胰腺及卵巢的肝转移癌则可有afp的升高。有症状者多伴有alp、ggt升高。癌胚抗原cea升高有助于肝转移癌的诊断，结直肠癌肝转移时cea阳性率高达60％～70％。选择性肝血管造影可发现直径1cm的病灶。选择性腹腔或肝动脉造影多显示为少血管型肿瘤；ct表现为混合不匀等密度或低密度占位，典型的呈现“牛眼”征；mri检查肝转移癌常显示信号强度均匀、边清、多发，少数有“靶”征或“亮环”征。

继发性肝癌患者多主诉上腹或肝区闷胀不适或隐痛，随着病情发展，患者出现乏力、食欲差、消瘦或发热等。体检时在中上腹部可扪及肿大的肝脏，或质地坚硬有触痛的硬结节，晚期患者可出现贫血、黄疸和腹水等。此类患者的临床表现类似于原发性肝癌，但一般发展相对缓慢，程度也相对较轻，多在做肝脏各种检查时疑及转移可能，进一步检查或在手术探查时发现原发肿瘤。部分患者经多种检查无法找到原发癌灶。

根据肝癌的不同阶段酌情进行个体化综合治疗，是提高疗效的关键；治疗方法包括手术、肝动脉结扎、肝动脉化疗栓塞、射频、冷冻、激光、微波以及化疗和放射治疗等方法。生物治疗，中医中药治疗肝癌也多有应用。

gnl2(guaninenucleotidebinding-protein-like2)能够影响p53的稳定性以及p53介导的细胞凋亡，p53是一个重要的抗癌基因使癌细胞凋亡，从而防止癌变；还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。这种功能对于受化疗药物作用而受伤的癌细胞，则起修复作用，而不是使癌细胞自杀。造成被修复的癌细胞在治疗后成为新的肿瘤。因此，gnl2与癌症的发生发展有着重要的关系。

肝癌做为对人类健康威胁最大的肿瘤之一，至今其发生的分子机制仍不清楚，对其的治疗也缺少特异性的分子靶点，而gnl2做为十分重要的肿瘤癌基因，目前尚无文献报道gnl2蛋白与判断肝癌预后或肝癌转移相关。本发明研究发现在肝癌中的gnl2表达与病人术后预后存在显著的关系，暗示gnl2可作为肝癌的术后预后的有效预警蛋白。

技术实现要素：

本发明目的在于提供gnl2蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，并提供用于肝癌术后预后评估的试剂盒及方法。

本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测gnl2蛋白在肝癌组织中的相对表达量，能够判断肝癌患者出现肝癌复发转移的风险。基于gnl2蛋白表达量与肝癌复发转移的相关性，以gnl2蛋白作为预后标记物对其表达量进行检测可以用于指导肝癌的预后判断。

因此，本发明提供了gnl2蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，该应用是以gnl2蛋白作为分子标记，利用gnl2单克隆抗体或gnl2多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测gnl2蛋白在肝癌组织中的相对表达量。

本发明还提供了所述应用中用于肝癌术后预后评估的试剂盒，该试剂盒包括：人源gnl2单克隆抗体或gnl2多克隆抗体、免疫组化实验试剂。所述免疫组化实验试剂为本领域免疫组化实验中的常用试剂。

发明人经过研究发现，gnl2在复发转移肝癌组织中表达高于未复发转移肝癌组织，可以推测gnl2在肝癌术后复发转移中发挥重要作用。查阅国内外文献，gnl2与肝癌的发生以及复发转移的相关研究少，在本研究中，gnl2在肝癌组织中的表达上调，而在癌旁和正常肝组织中则表达下调，且与未复发转移组相比，gnl2在复发转移组中表达也上调，表明gnl2可能作为促进因子参与肝癌发生发展过程。通过kaplan-meier生存曲线分析，gnl2表达程度与肝癌患者的预后有关，gnl2高表达的患者预后不良(p<0.05)。

综上所述，gnl2在肝癌组织中高表达，gnl2的高表达与肝癌患者术后复发转移有关。gnl2可以作为肝癌预后的一个重要候选分子标记物。

优选的，所述人源gnl2多克隆抗体由序列为seqidno.1所示的gnl2蛋白免疫兔子获得，可自行制备，也可采用市购商品。

本发明所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％h2o2(水溶液)、3％bsa封闭液(以pbs配制)、dab显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶(用于标记二抗)、pbs(ph7.4)、0.01medta修复液。

利用本发明所述试剂盒进行肝癌术后预后评估的方法如下：

(1)取肝癌患者病理标本，利用人源gnl2单克隆抗体或人源gnl2多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，进行免疫组化染色；

其中，病理标本来自于肝癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。免疫组化方法利用sp染色法，具体步骤如下：

(a)制备肝癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。

(b)切片脱腊。依次浸泡：二甲苯i：10min；二甲苯ii：10min；二甲苯iii：10min。

(c)切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90％(v/v)乙醇：3min；80％乙醇：3min；75％乙醇：3min。

(d)pbs清洗3次，每次5min。

(e)edta抗原高压修复：切片放入0.01medta修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。pbs清洗3次，每次5min。

(f)加入300μl的3％(w/w)过氧化氢水溶液，37℃10min。pbs清洗3次，每次5min。

(g)加入300μl的3％(w/w)bsa封闭液(pbs配制)，37℃1h。pbs清洗3次，每次5min。

(h)加入一抗：gnl2抗体浓度：1：500，4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min，然后pbs洗4次，每次5min。

(i)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔igg(购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释)，37℃45min。pbs洗4次，每次5min。

(j)pbs洗3次，每次5min。dab(dab显色试剂盒，购自上海生工)显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s，用自来水冲洗浸泡。

(k)脱水。依次浸泡：75％乙醇：2min；80％乙醇：2min；90％乙醇：2min；无水乙醇：2min。

(l)用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。

(2)利用显微镜和成像装置随机选取肝癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用aperioimagescope软件对组织样本的相片进行扫描，扫描后采用该软件的algorithms(positivepixelcountv9)程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：

(3)每个组织样本的免疫组织化学评分计算为positivity×log10[255/iavg]，其中positivity＝npositive/ntotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量/显色总数量；iavg＝(iwp+ip+isp)/(nwp+np+nsp)，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)，即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。

(4)采用spss18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用kaplan-meier生存分析，对数秩和检验(log-ranktest)比较生存曲线的差别。本发明显示gnl2蛋白与肝癌的预后具有显著的相关性，为预测肝癌的复发转移及术后的生存率提供一条全新途径，对肝癌患者的预后有重要作用。当癌组织gnl2免疫组化评分高于0.159时，肝癌易出现复发转移，肝癌患者术后易死亡。

本发明的有益效果主要体现在：本发明研究发现在肝癌中的gnl2表达与病人术后预后存在显著的关系，暗示gnl2可作为肝癌的术后预后的有效预警蛋白。因此，本发明提供了gnl2蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用于制备判断肝癌患者预后的蛋白质分子标记，对于肝癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。

附图说明

图1为gnl2在肝癌患者术后1年内无复发转移的组织样本中弱表达；

图2为gnl2在肝癌患者术后1年内复发转移的组织样本中高表达；

图3为gnl2在肝癌旁组织中弱表达；

图4为肝癌组织中gnl2低表达组与高表达组生存曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不限于此：

实施例1

用于肝癌术后预后评估的试剂盒，该试剂盒包括：用于对肝癌组织中的gnl2蛋白的相对表达量进行检测的人源gnl2单克隆抗体或gnl2多克隆抗体、免疫组化实验试剂。其中，免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％h2o2、3％bsa封闭液、dab显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶、pbs以及0.01medta修复液。

本发明所述人源gnl2多克隆抗体由序列为seqidno.1所示的gnl2蛋白免疫兔子获得。可自行制备，也可采用市购商品。

本发明所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％h2o2(水溶液)、3％bsa封闭液(以pbs配制)、dab显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶(用于标记二抗)、pbs(ph7.4)、0.01medta修复液。

实施例2

gnl2蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，该应用是利用本发明试剂盒进行肝癌术后预后评估，方法如下：

(1)取肝癌患者病理标本，利用人源gnl2单克隆抗体或人源gnl2多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，进行免疫组化染色；

其中，病理标本来自于肝癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。免疫组化方法利用sp染色法，具体步骤如下：

(a)制备肝癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。

(b)切片脱腊。依次浸泡：二甲苯i：10min；二甲苯ii：10min；二甲苯iii：10min。

(c)切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90％(v/v)乙醇：3min；80％乙醇：3min；75％乙醇：3min。

(d)pbs清洗3次，每次5min。

(e)edta抗原高压修复：切片放入0.01medta修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。pbs清洗3次，每次5min。

(f)加入300μl的3％(w/w)过氧化氢水溶液，37℃10min。pbs清洗3次，每次5min。

(g)加入300μl的3％(w/w)bsa封闭液(pbs配制)，37℃1h。pbs清洗3次，每次5min。

(h)加入一抗：gnl2抗体浓度：1：500，4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min，然后pbs洗4次，每次5min。

(i)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔igg(购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释)，37℃45min。pbs洗4次，每次5min。

(j)pbs洗3次，每次5min。dab(dab显色试剂盒，购自上海生工)显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s，用自来水冲洗浸泡。

(k)脱水。依次浸泡：75％乙醇：2min；80％乙醇：2min；90％乙醇：2min；无水乙醇：2min。

(l)用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。

(2)利用显微镜和成像装置随机选取肝癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用aperioimagescope软件对组织样本的相片进行扫描，扫描后采用该软件的algorithms(positivepixelcountv9)程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：

(3)每个组织样本的免疫组织化学评分计算为positivity×log10[255/iavg]，其中positivity＝npositive/ntotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量/显色总数量；iavg＝(iwp+ip+isp)/(nwp+np+nsp)，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)，即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。gnl2高低表达标准以358例肝癌组织中gnl2表达评分的中位数(0.159)为界。

(4)采用spss18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用kaplan-meier生存分析，对数秩和检验(log-ranktest)比较生存曲线的差别。

按照上述方法，本发明在358例肝癌病人的肿瘤组织中检测结果如图1-3所示：gnl2在1年内无复发转移组中弱表达；在复发转移组中高表达(图2)；在癌旁组织中弱表达(图3)。

gnl2与肝癌患者预后的关系：

通过kaplan-meier生存曲线分析，gnl2的表达程度与肝癌患者的预后相关，如图4所示，gnl2高表达的患者平均生存期(存活率)低于gnl2低表达的患者。

实施例3

取某肝癌术后肿瘤样本进行石蜡包埋切片，并利用以上所述的免疫组织化学方法进行检测，经计算，其癌组织的gnl2免疫组化组织评分为0.216。经过术后随访发现，该患者在术后第8个月发生肝癌复发转移，术第十九个月死亡。

实施例4

取某肝癌术后肿瘤样本进行石蜡包埋切片，并利用以上所述的免疫组织化学方法进行检测，经计算，其癌组织的gnl2免疫组化组织评分为0.092。经过术后随访发现，该患者在术后1年均未发现转移复发，健在。

由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测gnl2蛋白分子相对表达量能预测肝癌远处转移风险以及患者术后的生存或死亡。当癌组织gnl2的免疫组化评分高于0.159时，肝癌易出现复发转移，肝癌患者术后易死亡。显然gnl2蛋白与肝癌具有相关性，因此，以gnl2蛋白作为蛋白质分子标记对其表达量进行检测能预测肝癌手术后复发转移等事件，并判断预后。

序列表

<110>福建师范大学

<120>gnl2蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用、肝癌预后评估试剂盒及方法

<130>1

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

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<211>731

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

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