VDAC1蛋白在制备乳腺癌术后预后评估试剂盒中的应用、乳腺癌预后评估试剂盒及方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及vdac1蛋白在制备乳腺癌术后预后评估试剂盒中的应用、乳腺癌预后评估试剂盒及方法。

背景技术：

女性乳腺是由皮肤、纤维组织、乳腺腺体和脂肪组成的，乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。乳腺癌中99％发生在女性，男性仅占1％。

乳腺并不是维持人体生命活动的重要器官，原位乳腺癌并不致命；但由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，细胞之间连接松散，容易脱落。癌细胞一旦脱落，游离的癌细胞可以随血液或淋巴液播散全身，形成转移，危及生命。目前，乳腺癌已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。

全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。美国8名妇女一生中就会有1人患乳腺癌。中国不是乳腺癌的高发国家，但不宜乐观，近年我国乳腺癌发病率的增长速度却高出高发国家1～2个百分点。据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的2009年乳腺癌发病数据显示：全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位。

乳腺癌的发生发展及预后与癌基因的激活和抑癌基因功能失活密切关联，是多因素诱导，多基因参与的复杂病理过程。近年来，乳腺癌早期复发转移的分子机制是该领域的热门课题，深入阐明该分子机制，并在其特异性环节中导入靶向性治疗措施，有望很大幅度提高乳腺癌术后总体治疗效果。因此，探寻切实有效的乳腺癌乳腺切除术后早期复发相关预警分子标志，阐明其与乳腺癌早期复发转移的关系，这对提高乳腺癌术后治疗效果、评估乳腺癌早期复发风险、判断预后和个体化治疗有着至关重要的意义。

电压依赖性阴离子通道蛋白1(voltage-dependentanionchannel1,vdac1)位于真核生物线粒体外膜上，是一种线粒体外膜上的孔型蛋白。vdac1在atp和adp的跨线粒体外膜转运中起着重要作用。目前认为vdac1与多种疾病有关，如神经变性疾病，肿瘤，心血管疾病等。

乳腺癌做为对女性健康威胁最大的肿瘤之一，至今其发生的分子机制仍不清楚，对乳腺癌的治疗也缺少特异性的分子靶点，而vdac1做为十分重要的肿瘤癌基因，目前尚无文献报道vdac1蛋白与判断乳腺癌预后或乳腺癌转移相关。本发明研究发现在乳腺癌中的vdac1表达与病人术后预后存在显著的关系，暗示vdac1可作为乳腺癌的术后预后的有效预警蛋白。

技术实现要素：

本发明目的在于提供vdac1蛋白在制备乳腺癌术后预后评估试剂盒中的应用，并提供用于乳腺癌术后预后评估的试剂盒及方法。

本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测vdac1蛋白在乳腺癌组织中的相对表达量，能够判断乳腺癌患者出现乳腺癌复发转移的风险。基于vdac1蛋白表达量与乳腺癌复发转移的相关性，以vdac1蛋白作为预后标记物对其表达量进行检测可以用于指导乳腺癌的预后判断。

因此，本发明提供了vdac1蛋白在制备乳腺癌术后预后评估试剂盒中的应用，该应用是以vdac1蛋白作为分子标记，利用vdac1单克隆抗体或vdac1多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测vdac1蛋白在乳腺癌组织中的相对表达量。

本发明还提供了所述应用中用于乳腺癌术后预后评估的试剂盒，该试剂盒包括：人源vdac1单克隆抗体或vdac1多克隆抗体、免疫组化实验试剂。所述免疫组化实验试剂为本领域免疫组化实验中的常用试剂。

本发明经过研究发现，vdac1在复发转移乳腺癌组织中表达高于未复发转移乳腺癌组织，可以推测vdac1在乳腺癌术后复发转移中发挥重要作用。查阅国内外文献，vdac1与乳腺癌的发生以及复发转移的相关研究少，在本研究中，vdac1在乳腺癌组织中的表达上调，而在癌旁和正常肝组织中则表达下调，且与未复发转移组相比，vdac1在复发转移组中表达也上调，表明vdac1可能作为促进因子参与乳腺癌发生发展过程。通过kaplan-meier生存曲线分析，vdac1表达程度与乳腺癌患者的预后有关，vdac1高表达的患者预后不良(p<0.05)。

综上所述，vdac1在乳腺癌组织中高表达，vdac1的高表达与乳腺癌患者术后复发转移有关。vdac1可以作为乳腺癌预后的一个重要候选分子标记物。

优选的，所述人源vdac1多克隆抗体由序列为seqidno.1所示的vdac1蛋白免疫兔子获得，可自行制备，也可采用市购商品。

本发明所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％h2o2(水溶液)、3％bsa封闭液(以pbs配制)、dab显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶(用于标记二抗)、pbs(ph7.4)、0.01medta修复液。

利用本发明所述试剂盒进行乳腺癌术后预后评估的方法如下：

(1)取乳腺癌患者病理标本，利用人源vdac1单克隆抗体或人源vdac1多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，进行免疫组化染色；

其中，病理标本来自于乳腺癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。免疫组化方法利用sp染色法，具体步骤如下：

(a)制备乳腺癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。

(b)切片脱腊。依次浸泡：二甲苯i：10min；二甲苯ii：10min；二甲苯iii：10min。

(c)切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90％(v/v)乙醇：3min；80％乙醇：3min；75％乙醇：3min。

(d)pbs清洗3次，每次5min。

(e)edta抗原高压修复：切片放入0.01medta修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。pbs清洗3次，每次5min。

(f)加入300μl的3％(w/w)过氧化氢水溶液，37℃10min。pbs清洗3次，每次5min。

(g)加入300μl的3％(w/w)bsa封闭液(pbs配制)，37℃1h。pbs清洗3次，每次5min。

(h)加入一抗：vdac1抗体浓度：1：500，4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min，然后pbs洗4次，每次5min。

(i)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔igg(购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释)，37℃45min。pbs洗4次，每次5min。

(j)pbs洗3次，每次5min。dab(dab显色试剂盒，购自上海生工)显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s，用自来水冲洗浸泡。

(k)脱水。依次浸泡：75％乙醇：2min；80％乙醇：2min；90％乙醇：2min；无水乙醇：2min。

(l)用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。

(2)利用显微镜和成像装置随机选取乳腺癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用aperioimagescope软件对组织样本的相片进行扫描，扫描后采用该软件的algorithms(positivepixelcountv9)程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：

(3)每个组织样本的免疫组织化学评分计算为positivity×log10[255/iavg]，其中positivity＝npositive/ntotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量/显色总数量；iavg＝(iwp+ip+isp)/(nwp+np+nsp)，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)，即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。

(4)采用spss18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用kaplan-meier生存分析，对数秩和检验(log-ranktest)比较生存曲线的差别。本发明显示vdac1蛋白与乳腺癌的预后具有显著的相关性，为预测乳腺癌的复发转移及术后的生存率提供一条全新途径，对乳腺癌患者的预后有重要作用。当癌组织vdac1免疫组化评分高于0.236时，乳腺癌易出现复发转移，乳腺癌患者术后易死亡。

本发明的有益效果主要体现在：本发明研究发现在乳腺癌中的vdac1表达与病人术后预后存在显著的关系，暗示vdac1可作为乳腺癌的术后预后的有效预警蛋白。因此，本发明提供了vdac1蛋白在制备乳腺癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用于制备判断乳腺癌患者预后的蛋白质分子标记，对于乳腺癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。

附图说明

图1为vdac1在乳腺癌患者术后1年内无复发转移的组织样本中弱表达；

图2为vdac1在乳腺癌患者术后1年内复发转移的组织样本中高表达；

图3为vdac1在乳腺癌旁组织中弱表达；

图4为乳腺癌组织中vdac1低表达组与高表达组生存曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不限于此：

实施例1

用于乳腺癌术后预后评估的试剂盒，该试剂盒包括：用于对乳腺癌组织中的vdac1蛋白的相对表达量进行检测的人源vdac1单克隆抗体或vdac1多克隆抗体、免疫组化实验试剂。其中，免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％h2o2、3％bsa封闭液、dab显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶、pbs以及0.01medta修复液。

本发明所述人源vdac1多克隆抗体由序列为seqidno.1所示的vdac1蛋白免疫兔子获得。可自行制备，也可采用市购商品。

本发明所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％h2o2(水溶液)、3％bsa封闭液(以pbs配制)、dab显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶(用于标记二抗)、pbs(ph7.4)、0.01medta修复液。

实施例2

vdac1蛋白在制备乳腺癌术后预后评估试剂盒中的应用，该应用是利用本发明试剂盒进行乳腺癌术后预后评估，方法如下：

(1)取乳腺癌患者病理标本，利用人源vdac1单克隆抗体或人源vdac1多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，进行免疫组化染色；

其中，病理标本来自于乳腺癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。免疫组化方法利用sp染色法，具体步骤如下：

(a)制备乳腺癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。

(b)切片脱腊。依次浸泡：二甲苯i：10min；二甲苯ii：10min；二甲苯iii：10min。

(c)切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90％(v/v)乙醇：3min；80％乙醇：3min；75％乙醇：3min。

(d)pbs清洗3次，每次5min。

(e)edta抗原高压修复：切片放入0.01medta修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。pbs清洗3次，每次5min。

(f)加入300μl的3％(w/w)过氧化氢水溶液，37℃10min。pbs清洗3次，每次5min。

(g)加入300μl的3％(w/w)bsa封闭液(pbs配制)，37℃1h。pbs清洗3次，每次5min。

(h)加入一抗：vdac1抗体浓度：1：500，4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min，然后pbs洗4次，每次5min。

(i)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔igg(购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释)，37℃45min。pbs洗4次，每次5min。

(j)pbs洗3次，每次5min。dab(dab显色试剂盒，购自上海生工)显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s，用自来水冲洗浸泡。

(k)脱水。依次浸泡：75％乙醇：2min；80％乙醇：2min；90％乙醇：2min；无水乙醇：2min。

(l)用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。

(2)利用显微镜和成像装置随机选取乳腺癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用aperioimagescope软件对组织样本的相片进行扫描，扫描后采用该软件的algorithms(positivepixelcountv9)程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：

(3)每个组织样本的免疫组织化学评分计算为positivity×log10[255/iavg]，其中positivity＝npositive/ntotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量/显色总数量；iavg＝(iwp+ip+isp)/(nwp+np+nsp)，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)，即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。vdac1高低表达标准以326例乳腺癌组织中vdac1表达评分的中位数(0.236)为界。

(4)采用spss18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用kaplan-meier生存分析，对数秩和检验(log-ranktest)比较生存曲线的差别。

按照上述方法，本发明在326例乳腺癌病人的肿瘤组织中检测结果如图1-3所示：vdac1在1年内无复发转移组中弱表达；在复发转移组中高表达(图2)；在癌旁组织中弱表达(图3)。

vdac1与乳腺癌患者预后的关系：

通过kaplan-meier生存曲线分析，vdac1的表达程度与乳腺癌患者的预后相关，如图4所示，vdac1高表达的患者平均生存期(存活率)低于vdac1低表达的患者。

实施例3

取某乳腺癌术后肿瘤样本进行石蜡包埋切片，并利用以上所述的免疫组织化学方法进行检测，经计算，其癌组织的vdac1免疫组化组织评分为0.695。经过术后随访发现，该患者在术后第10个月发生乳腺癌复发转移，术后十六个月死亡。

实施例4

取某乳腺癌术后肿瘤样本进行石蜡包埋切片，并利用以上所述的免疫组织化学方法进行检测，经计算，其癌组织的vdac1免疫组化组织评分为0.108。经过术后随访发现，该患者在术后1年均未发现转移复发，健在。

由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测vdac1蛋白分子相对表达量能预测乳腺癌远处转移风险以及患者术后的生存或死亡。当癌组织vdac1的免疫组化评分高于0.236时，乳腺癌易出现复发转移，乳腺癌患者术后易死亡。显然vdac1蛋白与乳腺癌具有相关性，因此，以vdac1蛋白作为蛋白质分子标记对其表达量进行检测能预测乳腺癌手术后复发转移等事件，并判断预后。

序列表

<110>福建师范大学

<120>vdac1蛋白在制备乳腺癌术后预后评估试剂盒中的应用、乳腺癌预后评估试剂盒及方法

<130>1

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>283

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metalavalproprothrtyralaaspleuglylysseralaargasp

151015

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202530

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354045

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65707580

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859095

leuthrpheaspserserpheserproasnthrglylyslysasnala

100105110

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115120125

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130135140

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275280