拉曼光谱中一种用溴化钾淬灭荧光的方法与流程

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及拉曼光谱中一种用溴化钾淬灭荧光的方法。

背景技术：

印度物理学家拉曼(c.v.raman)与他的学生克里希南(k.s.krishnan)于1928年在nature杂志上报道了一种新的可见光散射现象，发生这种散射时散射光的频率会发生变化，这种现象称为拉曼散射。由于发现了拉曼效应和拉曼散射，拉曼于1930年获得了诺贝尔物理奖。此外，在1928年两位前苏联科学家也发现了类似的现象。拉曼现象是一种光的非弹性散射现象。光子与物质分子发生碰撞时，分子在电磁场的作用下产生诱导偶极矩导致极化，分子与光子之间发生能量转移，这个过程可以用一个拉曼的“虚能级”来解释。频率降低的散射光称为斯托克斯散射，频率升高的散射光称为反斯托克斯散射。入射光的能量比较低时，发生的散射称为正常拉曼散射，是一种线性现象，这时斯托克斯线通常强于反斯托克斯线。本文研究的是此种散射。

在振动过程中，分子极化率的变化属于拉曼活性，通常来讲非极性基团的振动拉曼谱峰较强。拉曼光谱的应用范围很广泛，在新材料、新能源、生物医学、物理学、地质、司法等学科领域有非常重要的应用，如石墨烯、氮化碳、壳聚糖、稀土矿物等研究领域都采用拉曼光谱作为重要的表征手段。拉曼光谱有力地促进了这些领域的发展。

但是拉曼光谱在实验中经常会受到荧光的干扰。荧光是电子吸收光子、并再发射的过程，荧光的波长大于入射光的波长且比拉曼散射光的强度高几个数量级。当拉曼散射的虚能级与电子的真实能级接近时，荧光就会对拉曼光谱的检测造成干扰，有时甚至使分析完全无法进行。而很多被研究的物质都会发生荧光干扰现象，因此避免荧光干扰非常重要。目前采用的方法有很多，比如变更激发波长(通常采用长波长)、缩短采集时间、改小狭缝、光漂白，以及加入淬灭剂等。在荧光干扰特别强烈时，必须采用加入淬灭剂的方法。淬灭剂有很多种，溴化钾是常用的淬灭剂，但单纯把样品同溴化钾混合或者压片一般并不能有效淬灭强烈的荧光。因此在实际工作中，荧光的克服仍旧是拉曼检测最棘手的问题之一。

技术实现要素：

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供拉曼光谱中一种用溴化钾淬灭荧光的方法。

本发明目的通过以下技术方案实现：

拉曼光谱中一种用溴化钾淬灭荧光的方法，包括如下步骤：

(1)采用通用红外模具压制溴化钾片；

首先注意对红外模具进行选择。传统模具可把溴化钾片方便地取下，而有些新类型的模具则是把溴化钾片镶嵌其中，较难取下，因此应选用易取下溴化钾片的模具。溴化钾采用红外制样时所用的溴化钾即可，不用另外处理。压好的溴化钾片可不用在干燥器中保存，因为水的拉曼峰本来就较弱，溴化钾片轻微的吸潮不会对实验造成任何影响；当然也不应保存在潮湿的环境中。

(2)在溴化钾片上制作刻痕；

刻痕的制作极为重要，因为只有获得一定宽度的刻痕才能满足下一步实验的条件。用普通的小刀划刻是不行的，因为刻痕太宽。而砂纸和磨盘表面粘附有磨料，磨料的粒度(目数)有很多规格，因此用砂纸和磨盘打磨是有效选择。下文将详述磨料目数的优化过程。结果表明，220目～320目可以获得较为理想的条带，采用320目磨料可获得最佳效果。可以采用320目的碳化硅砂纸或者320目的金刚石磨盘作为制作刻痕的工具。操作时，若采用砂纸，则先使砂纸伸展，然后食指和拇指拿住溴化钾片的两端在砂纸上向一个方向滑动，滑动距离约3cm，滑动一次即可。若采用磨盘，可采用和砂纸同样的方法，或者用中指压住溴化钾片在磨盘上推动，用力适度即可(比如1千克力)。砂纸用后可用洗耳球清洁，磨盘用后需用水冲洗干净自然晾干，均不可用纸擦拭。

(3)上样与最终制片；

上样即采用适当方法将样品分布于已制作刻痕的溴化钾片上，使样品有效分散在刻痕区域中。这同样是关键步骤之一。首先将溴化钾片刻痕朝上，置于干净的称量纸上。若室内光线不是十分明亮，需准备手电或者红外灯以备观察。对于不同形态的样品，采取的具体方法有所不同。

①粉末样品和小颗粒状样品：用药匙取0.2mg左右的样品，轻轻抖动，使其适当均匀地分布在溴化钾片上。对粉末状样品，用折好的称量纸轻轻拨动，使团聚的样品分散开。若是小颗粒状样品，用药匙轻轻按压，使其粉碎。接着，顺着刻痕方向拨动样品，使样品尽量分散在刻痕区域中。这时注意观察样品，对于直径大于刻痕宽度的颗须用称量纸轻轻拨除，直到样品中没有明显的上述颗粒。同时溴化钾片上不能有大片的样品聚集的区域。另外，若是大颗粒状的样品，当然应该首先在玛瑙研钵中将其研碎。

②粘稠液体：用玻璃毛细管蘸取少许样品，沿刻痕方向运动，使样品沿刻痕方向分布。醮取三四次样品即可。用手挥动使溶剂蒸发。

③溶液样品：用玻璃毛细管吸取样品，在溴化钾片上轻点，可选择不同位置轻点四次。其中两次让液体顺着刻痕自由运动(毛细运动)，另外两次用毛细管沿刻痕方向拨动液体，应有一次拨动至溴化钾片边缘。用手挥动使溶剂蒸发。

注意上样时的关键原则是宜少不宜多，否则溴化钾片上将到处分布着强荧光区域，可能会使实验失败。上样完成后，用镊子将样品轻轻放在模具上，样品面朝上，放上上垫片，用压片机对上压杆施压，通过上压杆使上垫片和样品片进入模具中。后续步骤同正常压片一致。

(4)拉曼光谱检测；

采用上述制样方法的目的是获得特定形状的样品区域，有且只有这种区域才能获得理想的拉曼光谱图，其它形状的区域均无法实现。这种特定形状的区域就是条带状区域(stripearea)，这种区域的典型尺寸是长度大于100μm，宽度5～10μm，当然更窄一点会更好。符合典型尺寸的条带谱图质量会特别好，荧光基本能够被淬灭；但非典型条带通过仔细选点通常也可获得较好谱图。检测时应注意以下条件、方法和技巧。

观察和采谱时使用50倍镜头。由于条带较小，用10倍物镜无法观察；若用100倍物镜，由于视野较小，则观察速度会变慢。用正常50倍镜头和50倍长焦镜头均可，对观察无影响。但从信号强度考虑，用正常50倍镜头较好。寻找条带状区域和选点非常依赖于技巧。最值得注意的一点是，条带区域在溴化钾片的边缘和外周区域出现的频率较高，这应该是重点关注的区域。对片的观察方法是，先将物镜定位到溴化钾片的一端(比如最左面的边缘)，然后沿y轴运动物镜进行观察和寻找。保持物镜沿x轴移动，直至完成全片的观察(必要的话)。一个溴化钾片通常有1～2条典型条带，有时有3～4条。有时条带在初始位置的相反方向，故寻找时要有耐心。对于典型条带，在条带中心选点即可。对于非典型条带要注意选取适当的点进行检测。若条带过宽，可选择在条带的末端狭窄处选点；若没有合适的条带而只有离散的点，可选择呈条带状排列的点。选择的点未必都合适，若荧光仍较强可在附近再行寻找，甚至更换区域。样品的荧光越强，条带宽度应越细。激光器通常选用532nm即可，若仍旧有弱荧光存在，可选择633nm，一般都会得到高质量谱图。若样品没有标准谱图，通常须选择两个不同的点采集谱图，两次结果需一致才能确认谱图；若有标准谱图，则应于标准谱图一致。实际上只要条带理想，谱图通常都非常理想。

本方法的优势在于，实验室即便只有532nm或者633nm一种激光器，通过上述制样和采谱方法也能够处理各种类型的固体和液体样品，尤其是带有荧光的样品，而不需要购置特定波长的激光器，大大方便了普通类型的拉曼实验室。有的样品甚至采用更换激光器的方法也无法获得理想的谱图，本方法就是获得拉曼谱图的有力方法，甚至是唯一方法。

另一方面，虽然有时更换激光器可以获得较好的谱图，但在不同的激发波长条件下，同一样品的谱图可能不同。采用表面增强的方法，虽然可以淬灭荧光，但表面增强后的光谱图往往与不增强时有一定差异。因此在强荧光条件下，若要研究某个激发波长在正常实验条件时的拉曼光谱图，本方法提供了一个强有力的手段。

附图说明

图1为本发明实施例1中采用320目砂纸在溴化钾片上制作刻痕后获得的壳聚糖的拉曼光谱图(a)、参考文献的拉曼光谱图(b)和典型条带的照片图(c)。

图2为本发明实施例2中碳酸钙的标准谱图(a)、淀粉的标准谱图(b)、所得样品的拉曼光谱图(c)和选取的条带的照片图(d)。

图3为本发明实施例3中所得样品的拉曼光谱图(a)和选取的条带的照片图(b)。

图4为文献中报道的氮化碳谱图(a和b)、实施例4中氮化碳样品的拉曼光谱图(c)和选取的准条带的照片图(d)。

图5为文献中报道的罗丹明6g(r6g)谱图(a)、实施例5所得r6g样品的拉曼光谱图(b)和选取的准条带的照片图(c)。

图6为本发明实施例6中所得样品中糖类物质的拉曼光谱图(a)和选取的条带的照片图(b)；脂类和蛋白质类物质的拉曼光谱图(c)和选取的准条带的照片图(d)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)采用通用红外模具(直径13mm)压制溴化钾片；

(2)在溴化钾片上制作刻痕：

取压好的溴化钾片，用食指和拇指拿住片的两端，分别在120目、220目、280目、320目、360目、400目与500目7种目数碳化硅砂纸上滑动，滑动距离约3cm，得到有刻痕的溴化钾片。

(3)上样与最终制片(壳聚糖样品的制备是非常典型的粉末状样品的制样过程)：

将溴化钾片刻痕面朝上，置于干净的称量纸上。用药匙取约0.2mg壳聚糖粉末(去乙酰度大于95％)均匀撒在溴化钾片上，用一条称量纸将粉末进一步分散，然后顺着刻痕方向拨动粉末，使其尽可能分布在刻痕中。再拨除个别较大的颗粒，对于片上的成片有颜色的区域，也拨除干净。将溴化钾片用镊子放置于红外模具上，放上上垫片，然后压片，压力为12mpa。

(4)拉曼光谱检测：

制片完成后将样品置于拉曼光谱仪的反射光路中进行检测。仪器条件为：激发波长532nm，到样品上的功率6mw，50x镜头，光栅600gr/mm，狭缝200μm，针孔100μm，累积时间30s，累积2次。

观察和试验结果如下。

(1)120目：溴化钾片表面不规整区域较多，很难找到条带。有一条条带宽度很宽，约50μm，且中间有很多大块颗粒。合适宽度的条带(5～10μm)只有一条，且长度很短(～25μm)。无法获得理想的谱图。

(2)220目：可以在溴化钾片的边缘和外围各找到一条合适的条带，一条宽度～10μm，另一条宽度为8μm和15μm，长度均为～500μm，可以获得理想的谱图。但条带中仍有较多大块颗粒。另有一条长度为250μm的条带，但宽度～20μm，不满足要求。

(3)280目：可以发现片上有很多细刻痕，宽度3μm或者8μm。在片的外围发现了两条几乎平行的条带，宽度12μm，长度分别为900μm和400μm，谱图尚可。另发现条带两条，长度/宽度分别为：350μm/8μm和250μm/12μm。采用280目的砂纸虽然条带数目明显增多，但宽度仍显略宽。

(4)320目：片上有很多细刻痕，宽度3μm。在片的边缘发现了长度为150μm的条带，宽度4～5μm，谱图非常好。另在边缘和外围发现各发现一条条带，长度/宽度分别为350μm/10μm～15μm与200μm/5μm，后者谱图良好。320目砂纸的条带宽度比280目明显下降。本方法获得的壳聚糖的拉曼光谱图如图1中a所示，与参考文献基本一致(图1中b)。典型条带的照片如图1c所示。

(5)360目：片上有很多细刻痕，宽度3μm。只找到一条条带，长度/宽度为150μm/7μm，但谱图中有较强荧光，谱图较差。

(6)400目：片上有很多细刻痕，宽度3μm。只找到一条条带，长度/宽度为120μm/8μm，但谱图中有较强荧光，谱图较差。

(7)500目：片上有非常多的细刻痕，宽度2μm，且深度较浅。只找到一条很短的条带，长度/宽度为80μm/8μm，谱图中有较强荧光，出峰较弱，谱图较差。

由以上优化过程可见，320目砂纸的条带数目较多，宽度较窄，获得的谱图非常理想，因此320目为最优目数。120目难以获得条带。220目和280目虽然可以获得较为理想的条带，但条带宽度仍较宽，通常大于10μm。对于荧光不是特别强的样品，10～15μm的条带尚可获得理想的谱图，但对于强荧光和甚强荧光的样品，条带宽度必须比较窄(如5μm或更小)才能获得良好的谱图。因此220目和280目有较大局限性，且220目的条带并不规整。对于360目、400目和500目砂纸，条带数量很少，只有一条。虽然尺寸基本合适，但荧光都较强，难以获得理想谱图，可能是因为条带较浅的缘故。因此320目是最优目数，对各种荧光强度的样品均有较好的适应性。

采用320目砂纸对壳聚糖重复制样，均可获得理想条带，长度大于100μm，宽度～5μm，谱图均非常理想且基本一致。因此该制样方法稳定性良好。

比较了国内外不同品牌的320目碳化硅砂纸，条带尺寸、数量和谱图质量均基本一致，因此不同品牌对制样质量无影响。

比较了320目普通砂纸(磨料面成暗红色，主要磨料为碳化硅和氧化铝)、320目碳化硅砂纸和320目金刚石磨盘的制样质量。320目普通砂纸形成的条带谱图质量一般，且容易有磨料脱落形成污染，因此普通砂纸不易选用。金刚石磨盘和碳化硅砂纸的效果相当，因此也可以选用。

实施例2

本实施例样品(样品1)为淡粉红色粉末，由以下方法制备：称取碳酸钙和淀粉各1.0g，搅拌均匀。加入10μg/ml的罗丹明6g(r6g)水溶液1ml，再进行充分搅拌使混合均匀。由于r6g的存在，样品显示强烈荧光。碳酸钙没有荧光，其特征峰在1089cm^-1、716cm^-1和283cm^-1。淀粉也不显示荧光，其特征峰出现在2916cm^-1、1339cm^-1和1131cm^-1。

(1)采用通用红外模具(直径13mm)压制溴化钾片；

(2)在溴化钾片上制作刻痕：

取压好的溴化钾片，用食指和拇指拿住片的两端，在320目碳化硅砂纸上滑动，滑动距离约3cm，得到有刻痕的溴化钾片。

(3)上样与最终制片(碳酸钙和淀粉分别为无机和有机粉末，它们组成的混合物是粉末样品的典型形态，操作过程也代表了粉末状样品的典型操作过程)：

将溴化钾片刻痕面朝上，置于干净的称量纸上。用药匙取约0.2mg样品均匀撒在溴化钾片上，用一条称量纸将粉末进一步分散，然后顺着刻痕方向拨动粉末，使其尽可能分布在刻痕中。再拨除个别较大的颗粒，对于片上的成片有颜色的区域，也拨除干净。将溴化钾片用镊子放置于红外模具上，放上上垫片，然后压片，压力为12mpa。

(4)拉曼光谱检测：

完成后将样品置于拉曼光谱仪的反射光路中进行检测。仪器条件为：激发波长532nm，到样品上的功率6mw，50x镜头，光栅600gr/mm，狭缝200μm，针孔100μm，累积时间30s，累积2次。在溴化钾片上共找到5个条带，其中最合适的条带在片的中间部位出现，长度/宽度分别为300μm/6μm，得到的谱图良好。碳酸钙的标准谱图(a)、淀粉的标准谱图(b)、样品谱图(c)和条带的照片图(d)见图2。条带的取点位置为十字光标处。

实施例3

本实施例的样品(样品2)为市售的卷纸。卷纸显示强烈荧光，可能原因是其中含有荧光增白剂。卷纸为柔软的二维样品，由纤维构成，可采取以下方法制样。将卷纸在320目金刚石磨盘上轻擦，形成细的纤维粉，用洗耳球吹去较大的碎屑。

(1)采用通用红外模具(直径13mm)压制溴化钾片；

(2)在溴化钾片上制作刻痕：

取压好的溴化钾片，用中指按住，在之前金刚石磨盘上形成细纤维粉的位置推动，推动距离约3cm，得到有刻痕的溴化钾片，同时刻痕内均匀分布卷纸的细纤维粉。

(3)上样与最终制片：

将溴化钾片刻痕面朝上，放上上垫片，然后压片，压力为12mpa。

(4)拉曼光谱检测：

完成后将样品置于拉曼光谱仪的反射光路中进行检测。仪器条件为：激发波长532nm，到样品上的功率6mw，50x镜头，光栅600gr/mm，狭缝200μm，针孔100μm，累积时间30s，累积2次。在溴化钾片上共找到6个条带，其中有4条谱图良好，长度/宽度分别为800μm/8μm、400μm/8μm、100μm/8μm和200μm/8μm。因为卷纸本身由纤维构成，因此容易形成优质条带。样品谱图(a)和条带的照片图(b)见图3。条带的取点位置为十字光标处。

实施例4

本实施例的样品(样品3)为氮化碳(c3n4)，由实验室自行制备。方法为：将双氰胺加入到瓷坩埚中，放置于马弗炉中500℃条件下灼烧。氮化碳为一种新型材料，对可见光有良好吸收，可以作为光催化剂和制造荧光传感器的材料。但采用可见光激发时，有甚强荧光出现。制样方法如下。

(1)采用通用红外模具(直径13mm)压制溴化钾片；

(2)在溴化钾片上制作刻痕：

取压好的溴化钾片，用食指和拇指拿住片的两端，在320目碳化硅砂纸上滑动，滑动距离约3cm，得到有刻痕的溴化钾片。

(3)上样与最终制片：

将溴化钾片刻痕面朝上，置于干净的称量纸上。用药匙取约0.2mg样品均匀撒在溴化钾片上，用一条称量纸将粉末进一步分散，然后顺着刻痕方向拨动粉末，使其尽可能分布在刻痕中。再拨除个别较大的颗粒，对于片上的成片有颜色的区域，也拨除干净。由于氮化碳的颗粒较细，因此应多清除一些。将溴化钾片用镊子放置于红外模具上，放上上垫片，然后压片，压力为12mpa。

(4)拉曼光谱检测：

完成后将样品置于拉曼光谱仪的反射光路中进行检测。仪器条件为：激发波长532nm，到样品上的功率10mw，50x镜头，分辨率4cm^-1，针孔50μm，曝光时间0.25s，累积200次。氮化碳样品较为特殊，较难形成有效条带，只能以离散点的方式或者断续的方式形成准条带。虽然荧光较有效条带为强，但氮化碳的主要谱峰仍旧非常明显，能够满足分析需要。文献中报道的氮化碳谱图(a和b)、氮化碳的样品谱图(c)和准条带的照片图(d)见图4，条带的取点位置为十字光标处。由照片可见，氮化碳从上到下形成了一条准条带。本文得到的氮化碳谱图与文献基本一致，其中a参照其中“块状g-c3n4”的谱图(主要谱峰为1236cm^-1和704cm^-1～708cm^-1)，b参照其中“a”的谱图(激发波长244nm)。

实施例5

本实施例的样品(样品4)为罗丹明6g(r6g)的水溶液，浓度为1％，溶液呈红色。r6g是一种有机染料，可用于生物染色和成像。

(1)采用通用红外模具(直径13mm)压制溴化钾片；

(2)在溴化钾片上制作刻痕：

取压好的溴化钾片，用食指和拇指拿住片的两端，在320目碳化硅砂纸上滑动，滑动距离约3cm，得到有刻痕的溴化钾片。

(3)上样与最终制片：

将溴化钾片刻痕面朝上，置于干净的称量纸上。将样品稀释10倍，得浓度为0.1％的供试品溶液。用玻璃毛细管吸取适量的供试品溶液，在溴化钾片的中心轻点一下，使少量溶液转移到溴化钾片上，然后顺着刻痕方向划动液体，直至片的边缘。在片的外围亦选一个位置同样操作。在片的外围另选一点，点样后使溶液顺着刻痕流动，实际上是刻痕的毛细作用导致的。必要时还可在片的边缘处轻点。用手挥动，使溶剂挥干，然后压片，压力为12mpa。

(4)拉曼光谱检测：

完成后将样品置于拉曼光谱仪的反射光路中进行检测。仪器条件为：激发波长532nm，到样品上的功率6mw，50x镜头，光栅600gr/mm，狭缝200μm，针孔100μm，累积时间20s，累积2次。r6g样品亦较为特殊，也难以形成有效条带，只能以离散点或者嵌入细刻痕的方式形成准条带，但亦可有较佳谱图。文献中报道的r6g谱图(a)、r6g的样品谱图(b)和准条带的照片图(c)见图5，条带的取点位置为十字光标处。由图5的c可见，片上形成了由离散点构成的准条带，末端嵌入了细刻痕(宽度2μm)中。在条带的细刻痕处选点，获得了良好的谱图，主要谱峰位置在1364cm^-1、1307cm^-1、1189cm^-1、1773cm^-1、613cm^-1及1649cm^-1处。文献中给出的谱图见图5中a(a)，采用1064nm波长激发。本文得到的谱图与文献基本一致。

实施例6

本实施例的样品(样品5)为市售的婴幼儿配方奶粉，呈白色粉末状。奶粉的成分很复杂，由纯奶和多种添加剂配方而成，主要成分为糖类、脂肪和蛋白质等化合物。

(1)采用通用红外模具(直径13mm)压制溴化钾片；

(2)在溴化钾片上制作刻痕：

取压好的溴化钾片，用食指和拇指拿住片的两端，在320目碳化硅砂纸上滑动，滑动距离约3cm，得到有刻痕的溴化钾片。

(3)上样与最终制片：

将溴化钾片刻痕面朝上，置于干净的称量纸上。用药匙取约0.2mg样品均匀撒在溴化钾片上，用一条称量纸将粉末进一步分散，然后顺着刻痕方向拨动粉末，使其尽可能分布在刻痕中。再拨除个别较大的颗粒。将溴化钾片用镊子放置于红外模具上，放上上垫片，然后压片，压力为12mpa。

(4)拉曼光谱检测：

完成后将样品置于拉曼光谱仪的反射光路中进行检测。仪器条件为：激发波长633nm，到样品上的功率3mw，50x镜头，光栅600gr/mm，狭缝200μm，针孔100μm，累积时间30s，累积2次。试验表明，对于奶粉样品用633nm激发比532nm效果更好，因此选用633nm激发。在样品上找到一条很短的光亮条带(见图6b)，经检测鉴别为糖类物质形成的条带(谱图见图6a)，1094cm^-1和1122cm^-1为糖类物质的特征峰。又在片的其它区域发现突起的、“光滑”的准条带(见图6d)，经检测鉴别为脂类和蛋白质类物质(谱图见图6c)，其中1748cm^-1为脂类物质特征峰，1656cm^-1为蛋白质类物质的特征峰。对于奶粉等成分非常复杂的物质，本方法较难获得样品的平均光谱，但可获得特定成分的光谱，亦对分析有重要帮助。特别地，当样品中某种成分的含量很低采用常规方法无法获得拉曼光谱时，本方法可实现低含量成分的富集、分离，从而实现检测。条带的取点位置均为十字光标处。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。