一种降钙素原免疫比浊法检测试剂盒的制作方法

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种降钙素原免疫比浊法检测试剂盒。

背景技术：

降钙素原是降钙素的前体物，具有116个氨基酸糖蛋白，在人体内的半衰期约为20-24小时，稳定性好，降钙素原在正常人血清中含量极低，在系统炎症反应综合症(sirs)、败血症、急慢性肺炎、急性胰腺炎、活动性肝炎、创伤等患者血清中显著升高，而在病素毒感染时则保持低水平，降钙素原在严重细菌感染(2-3小时后)早期即可升高，因此具有早期诊断价值。在局部感染、病毒感染、慢性非特异性炎症、移植物宿主排斥反应或自身免疫性等疾病时降钙素原的浓度不增加或轻微增加，而只在严重的全身系统性感染时才明显增加，这就决定了降钙素原的高度特异性，因此也可用于各种临床情况的鉴别诊断。降钙素原的浓度和炎症严重程度成正相关，并随着炎症的控制和病情的缓解而降低至正常水平，因而降钙素原又可作为判断病情与预后以及疗效观察的可靠指标。

降钙素原的检测方法有放射免疫学分析法、双抗夹心免疫化学法、胶体金比色法和免疫比浊法。放射免疫学分析法耗时长(19-22h)，而且有放射性元素的污染导致其使用受到限制。胶体金比色法有快速简便，易观察的特点，但只能进行定性或半定量检测，灵敏度低。双抗夹心免疫化学法操作简便，特异性强，但灵敏度较低。

降钙素原免疫比浊法检测试剂盒具有高精密度和强特异性的特点，可以实现大批量自动化检测，但是同样存在稳定性和灵敏度不足的缺点，不利于临床应用推广。

技术实现要素：

针对降钙素原免疫比浊法检测试剂盒应用中存在的问题，本发明提供一种降钙素原免疫比浊法检测试剂盒，较常规检测试剂盒稳定性较好和线性范围大，分析灵敏度高，有利于试剂的推广应用。

本发明采用的方案如下：

一种降钙素原免疫比浊法检测试剂盒，包含试剂r1、试剂r2和校准品，其中试剂r1的组成为：40mmol/lph7.4磷酸盐缓冲液，0.1mmol/l聚乙二醇6000，0.1mmol/l氯化钠，1.5mmol/l叠氮钠。

试剂r2的组成为：0.1％-2％降钙素原抗体乳胶颗粒，0.1mmol/l氯化钠、1.5mmol/l叠氮钠、40mmol/lph7.4磷酸盐缓冲液、20-40g/l牛血清白蛋白。

上述的乳胶颗粒采用20-50nm纳米颗粒与6ml/l的羊抗人抗体偶联形成的偶联物。

上述试剂r1、试剂r2使用时体积比为r1：r2＝3：1。

降钙素原抗体乳胶颗粒制备方法为：20-50nm纳米胶乳颗粒在n-羟基琥珀酰亚胺和edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)作用下形成活性酯，再与6ml/l的羊抗人pct抗体反应，形成共价键，完成偶联，形成降钙素原抗体乳胶颗粒。

本发明的试剂盒在全自动生化分析仪中进行，具体的使用方法如下：

加入20ul的样本、校准品或生理盐水后加入240ul的试剂r1孵育5min后加入80ul试剂r2混匀延迟1min后读取吸光度a1，5分钟后读取吸光度a2，计算δa。

本发明的有益效果包括：

本发明试剂盒的分析灵敏度高于现有产品，通过提前对抗体乳胶颗粒的处理提高抗体和纳米颗粒结合稳定性，减少游离抗体与降钙素原的反应，增强反应的灵敏度，同时加入牛血清白蛋白和叠氮钠提高试剂的稳定性，较少各类细菌物质的形成，有利于试剂的保存。

附图说明

图1为实施例2准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性示意图；

图2为实施例3准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性示意图；

图3为实施例4准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性示意图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体的实施例进行说明。

实施例1(对照例)

一种市场上面常规的降钙素原免疫比浊法检测试剂盒，包含试剂1、试剂2和校准品

试剂1：

磷酸盐缓冲液40mmol/l

聚乙二醇0.1mmol/l；

试剂2：

降钙素原抗体6ml/l

磷酸盐缓冲液40mmol/l。

本实施例描述的降钙素原免疫比浊法检测试剂盒，采用迪瑞cs-600b全自动生化分析仪进行测定，具体操作如下：

加入20ul的样本、校准品或生理盐水后加入240ul的试剂r1孵育5min后加入80ul试剂r2混匀延迟1min后读取吸光度a1，5分钟后读取吸光度a2，计算δa。

本实施例的校准品为外购校准品。

实施例2

一种降钙素原免疫比浊法检测试剂盒包含试剂r1、试剂r2和校准品，其中试剂r1的组成为：

试剂r1：

试剂r2：

具体测试方法同实施例1。

实施例3

一种降钙素原免疫比浊法检测试剂盒包含试剂r1、试剂r2和校准品，其中试剂r1的组成为：

试剂r1：

试剂r2：

具体测试方法同实施例1。

实施例4

一种降钙素原免疫比浊法检测试剂盒包含试剂r1、试剂r2和校准品，其中试剂r1的组成为：

试剂r1：

试剂r2：

具体测试方法同实施例1。

下面对上述实施例1-4的试剂盒进行验证。

准确度相关性验证实验：

将实施例2、3、4的检测试剂盒作为实验组，将市场上获得认可的降钙素原免疫比浊法检测试剂盒作为对照组进行对比试验，检测的结果如图1-图3，图中x为对照例降钙素原浓度，y分别为实施例2、3、4的降钙素原浓度。

通过检测数据可知实施例2、3、4的检测试剂盒与对照组检测试剂盒的检测结果相关系数(r²)分别为0.9974、0.9972、0.9971均大于要求的0.990，相关系数较好，表明本发明的试剂盒与市场上获得认可的降钙素原免疫比浊法检测试剂盒有较好的一致性，证明本试剂盒添加的组分对试剂盒的准确度不会造成影响，试剂盒保持较好的准确度。

线性相关性验证实验：

找到降钙素原的高值样本为100ng/ml，用生理盐水进行稀释，配置6个浓度的样本，浓度依次为100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、0.5ng/ml，每个浓度样本分别测定3次，分别取其均值。分别利用施例1、2、3、4进行检测，检测结果如表1所示。

表1实施例1-4相关性验证实验结果

通过检测数据可知实施例1、2、3、4的检测试剂盒的检测结果相关系数均大于0.990，但是实施例2、3、4的相关系数均大于0.998，说明本发明的试剂盒具有更好的线性相关性。

稳定性验证实验：

在2℃-8℃无腐蚀性气体的避光环境中贮存试剂，检测4种实施例试剂的稳定性。4种试剂每月取同一样本测定其吸光度三次，取平均值，与新鲜的实施例1试剂检测结果进行对比，从而确定试剂的稳定时间，检测数据如表2所示。

表2实施例1-4稳定性验证实验结果

上述实验结果显示，实施例1试剂在2℃-8℃无腐蚀性气体的避光环境中贮存15个月稳定，而实施例2、3、4试剂在2℃-8℃无腐蚀性气体的避光环境中贮存20个月稳定，说明在试剂中加入牛血清白蛋白和叠氮钠能有效提高降钙素原免疫比浊法检测试剂盒的稳定性。

分析灵敏度验证实验：

用实施例1-4制得的降钙素原免疫比浊法检测试剂盒测试浓度为40ng/ml的样本，记录吸光度差值δa，分别用实施例1-4试剂进行检测，检测结果如表3所示。

表3实施例1-4分析灵敏度检测结果

上述实验结果显示，实施例2、3、4检测试剂盒的吸光度差值均比实施例1检测试剂盒的吸光度差值高，说明通过提前对抗体乳胶颗粒的处理提高了抗体和颗粒结合稳定性，减少了游离抗体与降钙素原的反应，增强了反应的灵敏度，提高了检测试剂盒的分析灵敏度。

综合上述分析，本发明实施例提供的降钙素原免疫比浊法检测试剂盒，通过在试剂中牛血清白蛋白和叠氮钠，提前对抗体乳胶颗粒的处理，提高了试剂盒的稳定性和分析灵敏度，同时对试剂的准确度没有影响。因此本发明所述提供的降钙素原免疫比浊法检测试剂盒有利于在市场中推广。