本发明属于免疫检测分析技术领域，具体涉及一种人类T淋巴细胞白血病病毒抗体的化学发光检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
人类T淋巴细胞病毒（Human T-cell lymphotropic virus，HTLV）是一种复杂的逆转录病毒，呈世界性广泛分布。与人类免疫缺陷病毒具有相似的转录调节机制，又有其独特性，如基因组稳定、潜伏期更长，可引起成人T淋巴细胞白血病、热带痉挛性下肢瘫痪/ HTLV-Ⅰ相关骨髓病等相关疾病。HTLV的传播主要通过母乳喂养、性传播、输血、静脉注射毒品共用针头等途径传播。
HTLV是逆转录病毒科肿瘤病毒亚科中唯一能引起人类疾病的病毒。HTLV为球形颗粒，直径约80-130 nm。内部由RNA、核蛋白及围绕在外面的20面体蛋白衣壳组成，直径为40-60 nm，病毒最外层具有包膜结构，表面嵌有糖蛋白。病毒基因主要有gag、pol、env、pX。gag主要编码3种核心蛋白p19、p24、p15；pol主要编码病毒的逆转录酶、整合酶，核酸酶H；env编码包膜糖蛋白gp46和穿膜糖蛋白p21e；病毒的pX基因主要编码3种非结构蛋白：p40tax, p27rex 和p21X。以上基因及蛋白在临床的检测中具有重要意义。
目前用于检测人类T淋巴细胞白血病病毒的检测方法主要有聚合酶链式反应（PCR）、试纸类快速检测法、放射免疫分析法、酶联免疫分析法等。其中， PCR方法检测病毒DNA，由于污染问题不易解决、设备要求高及其它各种局限，因而未广泛采用；试纸类快速检测法由于灵敏度和特异性不够高、批量检测能力不足等因素，不适于确认性的检测应用；放射免疫测定法虽然具有高灵敏度、高特异性的优点，但其操作步骤较多，需要特殊的检测设备，试剂价格昂贵，需使用配套的仪器且存在放射性污染，使操作人员受到放射性危害，另外，放射性同位素易衰减，有效期短，不易保存；酶联免疫分析法抗原、抗体是在固相（ELISA板反应孔）表面进行结合反应，存在灵敏度低、不易实现全自动化、检测时间长等的缺点。因此，建立一种有效、快速、简单、灵敏、抗干扰性高的检测人类T淋巴细胞白血病病毒抗体的方法具有十分重要的意义。
本发明以磁分离化学发光技术为检测手段，同时结合酶标记技术进行检测。
酶促化学发光（如HRP-鲁米诺系统、ALP-AMPPD系统、黄嘌呤氧化酶-鲁米诺系统等）用于免疫分析具有许多优越性，发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，反应体系中发光剂充分过量，发光信号强而稳定，且发光时间在数分钟至数十分钟以上；发光时间较长，其信号检测无需原位进样，一般以速率法测量，即在发光信号相对稳定的区域任意点测量单位时间的发光强度。因此，酶是一类非常有效的化学发光标记物。
磁分离免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体而建立的一种新型免疫检测方法，该方法可使抗原、抗体的结合反应在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作简便、灵敏度更高、反应快速、稳定、准确地定量测定人类T淋巴细胞白血病病毒抗体的磁微粒化学发光测定试剂盒及制备方法。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
一种人类T淋巴细胞白血病病毒抗体的磁微粒化学发光试剂盒及其制备方法，本发明所提供的人类T淋巴细胞白血病病毒抗体的磁微粒化学发光试剂盒，采用磁微粒偶联人类T淋巴细胞白血病病毒抗原、酶标记的人类T淋巴细胞白血病病毒抗原。试剂盒还包括人类T淋巴细胞白血病病毒抗体校准品溶液、化学发光底物液以及清洗液。
作为本发明进一步的方案，所述磁微粒的内核为四氧化三铁或三氧化二铁，磁微粒的表面修饰基团为一种或多种活性功能基团，包括但不限于羧基、氨基、对甲苯磺酰基或链霉亲和素-生物素。
作为本发明进一步的方案，所述的磁微粒可直接与人类T淋巴细胞白血病病毒抗原偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记人类T淋巴细胞白血病病毒抗原。
作为本发明进一步的方案，所述的化学发光标记物为酶，如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等。
作为本发明进一步的方案，所述的酶标记的是人类T淋巴细胞白血病病毒抗原。
作为本发明进一步的方案，所述的酶标记人类T淋巴细胞白血病病毒抗原的缓冲液是pH 8.0-11.0、浓度为0.01-0.20 mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
作为本发明进一步的方案，所述的校准品是用含有0.5-5.0% BSA的Tris或PBS或HEPES缓冲液为基质，加入人类T淋巴细胞白血病病毒抗体纯品配置而成，校准品形态为液态。
作为本发明进一步的方案，所述的人类T淋巴细胞白血病病毒抗体校准品溶液浓度分别为0 ng/mL、2 ng/mL、8 ng/mL、32 ng/mL、128 ng/mL、256 ng/mL。
作为本发明进一步的方案，所述的清洗液是pH 7.0-9.0、浓度为5-50 mmol/L的Tris或HEPES或其它溶液，其中含质量分数为0.01-0.25%的Tween-20。
本发明检测试剂盒采用的原理是双抗原夹心法，具体是通过磁微粒偶联的抗原与样本中的抗体特异性结合，再与酶标记的抗原结合形成复合物，最后利用酶催化底物反应产生的光子以检测产物浓度。
本发明的优点在于以磁分离化学发光技术为检测手段，同时采用酶标记技术进行检测以建立一种检测人类T淋巴细胞白血病病毒抗体的化学发光试剂盒。以磁性微粒为固相分离载体可使抗原、抗体的结合反应在近似液相的条件下进行，反应快速、彻底；酶作为化学发光标记具有发光效率高、标记稳定、可提高系统整体灵敏度的明显优势；本发明操作简单方便，具有发光值稳定、灵敏度高、检测快速方便、准确性高、重复性好、特异性强等优点。
具体实施方式
本发明提供一种人类T淋巴细胞白血病病毒抗体的化学发光试剂盒及其制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加明确、清楚，以下对本发明进一步详细说明。
本发明提供一种人类T淋巴细胞白血病病毒抗体的化学发光试剂盒，以磁分离化学发光技术作为检测手段，同时结合酶标记技术进行检测。该试剂盒包括：磁微粒偶联的人类T淋巴细胞白血病病毒抗原、酶标记的人类T淋巴细胞白血病病毒抗原、人类T淋巴细胞白血病病毒抗体校准品溶液、化学发光底物液、清洗液。
具体地，本发明所述的磁微粒可直接与人类T淋巴细胞白血病病毒抗原偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记人类T淋巴细胞白血病病毒抗原。
具体地，本发明在制备磁微粒混悬液时，所述偶联抗体缓冲液为pH 5.0-6.0，浓度为20-200 mmol/L 的MES缓冲液。
具体地，本发明在制备磁微粒混悬液时，所述封闭缓冲液为含1%BSA的缓冲液。
具体地，本发明所述的酶标记的是人类T淋巴细胞白血病病毒抗原。
具体地，本发明所述的酶标记缓冲液是pH 8.0-11.0、浓度为0.01-0.20 mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
具体地，本发明所述的校准品缓冲液是含有0.5-5.0% BSA的Tris或PBS或HEPES缓冲液为基质，加入人类T淋巴细胞白血病病毒抗体纯品配置而成，校准品形态为液态。
具体地，本发明所述的化学发光底物A液为pH 7-9的Tris溶液，其中含有浓度为0.001-0.1 mol/L的鲁米诺、0.001-0.01 mol/L的对甲苯酚；B液为pH 2-5的柠檬酸缓冲液，其中含有质量分数为0.01-25％的过氧化氢。
具体地，本发明所述的清洗液是pH 7.0-9.0、浓度为5.0-50.0 mmol/L的Tris或HEPES或其它溶液，其中含有质量分数为0.01-0.25%的Tween-20。
下面通过实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：所述的一种检测人类T淋巴细胞白血病病毒抗体化学发光试剂盒的组建及制备方法，包括以下步骤：
1. 试剂盒组建
组建一种人类T淋巴细胞白血病病毒抗体的磁微粒化学发光检测试剂盒，使其含有下列组分：
羧基磁珠偶联的人类T淋巴细胞白血病病毒抗原；
辣根过氧化物酶标记的人类T淋巴细胞白血病病毒抗原；
人类T淋巴细胞白血病病毒抗体系列校准品溶液；
化学发光底物A液和化学发光底物B液；
清洗液。
2. 偶联有人类T淋巴细胞白血病病毒抗原的磁微粒混悬液的制备
（1）取1 mg羧基磁微粒于0.5 mL离心管中，加入200 μL的0.1 mol/L MES（pH 6.0）缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5 min使磁微粒与液体分开，弃去上清，洗涤3次，再加入200 μL的MES缓冲液（pH 6.0），涡旋。
（2）加入15 μg的人类T淋巴细胞白血病病毒抗原，使羧基与抗原摩尔比为150:1，于旋转反应器上涡旋，室温孵育30 min。
（3）加入10 μL浓度为10 mg/mL的偶联试剂EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺），于旋转反应器上涡旋，室温孵育2 h。
（4）取200 μL含1% BSA的甘氨酸缓冲液（浓度为50 mmol/L）进行封闭，时间为1 h。
（5）去上清，加入200 μL清洗缓冲液（TBS+0.05% Tween-20），洗涤3次。
（6）将上述制备好的磁微粒混悬液置于500 μL保存液（300 mmol/L甘氨酸、2%甘油、5%蔗糖）中，2-8℃保存。
3. 辣根过氧化物酶标记的人类T淋巴细胞白血病病毒抗原的制备
（1）称取2 mg HRP溶解于0.5 mL双蒸水中，加入0.5 mL新配制的0.06 mol/L NaIO4溶液，4℃避光作用30 min。
（2）向反应液中加入160 mmol/L的乙二醇0.5 mL，4℃搅拌反应30 min。
（3）将反应液用0.05 mol/L pH 9.0 碳酸钠缓冲液透析3 h。
（4） 纯化后的人类T淋巴细胞白血病病毒抗原2 mg，加入0.05 mol/L pH 9.0碳酸钠缓冲液500 μL，滴加入醛化后的HRP溶液中，室温避光反应1 h，4℃搅拌过夜。
（5）向反应液中滴加200 μL新配的4 mg/mL NaBH4液，4℃搅拌下反应2 h。
（6） 将装入透析袋内，在0.02 mol/L pH 7.4 PBS透析，4℃过夜(中途更换PBS 3次)。
（7）将透析液中液体吸至微量离心管中，4℃下10000 rpm离心30 min，将上清液吸出，加等量甘油，混匀，-20℃保存备用。
4. 人类T淋巴细胞白血病病毒抗体校准品的制备
用含有2% BSA的Tris-NaCl缓冲液将人类T淋巴细胞白血病病毒抗体纯品配制成标示浓度为0 ng/mL、2 ng/mL、8 ng/mL、32 ng/mL、128 ng/mL、256 ng/mL的一系列校准品。
5. 化学发光底物的制备
（1）化学发光底物A液为pH 8的Tris溶液，其中含有浓度为0.01 mol/L的鲁米诺、0.001 mol/L的对甲苯酚；
（2）化学发光底物B液为pH 4的柠檬酸缓冲液，其中含有质量分数为1.5％的过氧化氢。
6. 清洗液的制备
称量3.05 g Tris，8.775 g NaCl至1000 mL的烧杯中，加入1 mL质量分数为0.05% Tween-20，搅拌混匀，定容，将pH调至 7.6后保存备用。
实施例2：实际样本中人类T淋巴细胞白血病病毒抗体的检测
本发明人类T淋巴细胞白血病病毒抗体定量检测试剂盒的使用操作程序如下：
试剂盒的检测
（1）在反应杯中加入待测样本50 μL，再加入磁颗粒偶联悬浮液150 μL，振荡混匀，37℃孵育8 min。
（2）分离，清洗3次，将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。
（3）向反应杯中加入辣根过氧化物酶酶标记物150 μL，振荡混匀，37℃孵育7 min。
（4）分离，清洗3次，将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。
（5）加入化学发光底物A液、B液各100 μL，测量其相对发光强度，样本中人类T淋巴细胞白血病病毒抗体的含量与其相对发光强度成一定比例关系。
实施例3：性能指标检测结果
（1）分析灵敏度
用试剂盒中0 ng/mL 校准品作为待测样本，重复测定20次，得出20次测量结果的 RLU值（相对发光值），计算其平均值（M）和标准差（SD），得出 M+2SD 所对应 RLU值，根据零浓度校准品与相邻校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU值带入上述方程中，求出对应的浓度值。按检测方案中最低检测限检测方法，重复3次实验，最后求出本试剂盒对人类T淋巴细胞白血病病毒抗体的分析灵敏度为0.1 ng/mL。
（2）稳定性
取人类T淋巴细胞白血病病毒抗体检测试剂盒进行常规贮存稳定性试验，2-8℃放置分别按时间1，3，5，7，9，11，12，13，14，15个月进行检测；开盖稳定性试验分别按2-8℃放置0天、7天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天、28天、30天、32天进行测定。结果显示人类T淋巴细胞白血病病毒抗体检测试剂盒贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为12个月。开盖贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为30天。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。