一种气相色谱检测氟尿嘧啶中苯残留的方法与流程

本发明属于生物化工技术领域，尤其涉及一种用气相色谱法检测氟尿嘧啶中苯残留的方法。

背景技术：

氟尿嘧啶(fluorouracil,5-fu)，分子式c4h3fn2o2，分子量130.08，为白色或类白色的结晶或结晶性粉末。本品在水中略溶，在乙醇中微溶，在三氯甲烷中几乎不溶，在稀盐酸或氢氧化钠溶液中溶解。氟尿嘧啶是抗嘧啶类药物，临床上用于多种肿瘤如消化道肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、宫颈癌、膀胱癌、肝癌、皮肤癌等的治疗有效，尤对消化道癌及其他实体瘤有良好疗效，可静脉或腔内注射，口服吸收不完全。

目前，工业上生产氟尿嘧啶通常采用的方法是缩合环化法。该方法主要以氟乙酸甲酯为原料，在甲醇钠、甲苯催化下与甲酸乙酯缩合得氟代甲酰乙酸酯烯醇式钠盐(化合物ⅰ)，化合物ⅰ与o-甲基异脲硫酸盐环合得2-甲氧基-5-氟尿嘧啶(化合物ⅱ)，ⅱ在稀盐酸中水解为5-氟尿嘧啶。根据ich指南的要求苯的残留限度为2ppm，因此，氟尿嘧啶中苯含量的测定对于氟尿嘧啶的质量、患者的健康方面均具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种提供能实现检测的连续性，提高检测的灵敏度及重复性的气相色谱检测氟尿嘧啶中苯残留的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种气相色谱检测氟尿嘧啶中苯残留的方法，其创新点在于：包括以下步骤：

步骤1.苯标准液的配制：a.称取0.05g苯加入到100ml容量瓶中，用乙醇溶液定容，然后精密吸取1.0ml于100ml另一容量瓶中，用乙醇溶液定容，得到苯标准储备液；b.精密吸取1.0ml苯标准储备液于25ml容量瓶中，用乙醇溶液定溶，即得苯标准液；

步骤2.样品供试液的配制：精密称取氟尿嘧啶样品1.0g，置于10ml容量瓶中，乙醇溶液定容，即得供试液；

步骤3.设定色谱仪的工作条件：色谱柱为hp-5毛细管色谱柱，大小为30m×0.32mm×0.25μm，进样口温度为260℃，检测器温度为260℃，氮气流速为30ml/min，氢气流速为40ml/min，空气流速为400ml/min，分流比为50:1，进样量为1μl；

步骤4.进样检测：将步骤1和步骤2得到的溶液注入配有氢火焰离子化检测器的气相色谱仪，通过色谱数据处理机，得到标准品色图谱和样品色谱图，所述进样顺序为以第一针空白样，然后连续五针标准液，接着进样品供试液，最后再进一针标准液的进样顺序依次进样检测；

步骤5.结果计算：根据标准色谱图和样品色谱图计算氟尿嘧啶中苯的含量，所述计算公式为：

式中：

a样—样品供试液中苯的峰面积；

a标—标准液中苯的峰面积；

c样—样品供试液中氟尿嘧啶的浓度，g/ml；

c标—标准液中苯的浓度，g/ml。

进一步的，所述步骤3中柱温采用程序升温，初始温度60℃，保持2min，以5℃/min升温速率升至80℃，保持5min，以30℃/min升温速率升至220℃，保持2min。

进一步的，所述步骤4中连续进样品的针数不得超过十针，多余十针的则每十针之间再交叉进一针标准液。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明通过气相色谱仪检测氟尿嘧啶中苯的残留量方法简便、快捷、准确、稳定、可靠，能更加全面、客观、科学地评价氟尿嘧啶的质量，对患者的健康方面均具有重要的意；本发明整个工艺具有检测速度快、操作方便、精确度高的优点；

(2)本发明通过优化检测色谱条件，在保证了各峰分离度较好的前提下，乙醇保留时间为1.78min，苯保留时间为3.51min，大大缩短了分析时间；

(3)本发明通过优化了检测色谱条件，苯的检测限为0.19μg/ml，定量限为0.4μg/ml，回收率在99～101％之间，大大提高了检测的灵敏度。

附图说明

图1为本发明空白溶剂检测得到的气相色谱图；

图2为本发明标准液检测得到的气相色谱图；

图3为本发明苯标准液线性关系图；

图4本发明检测限溶液的色谱图；

图5为本发明定量限溶液的色谱图；

图6为本发明供试液检测得到的气相色谱图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

以下实施例采用的气相色谱仪：岛津gc-2014,labsolution工作站，色谱柱为hp-5毛细管柱，配有氢火焰离子化检测器。

色谱住工作条件为：色谱柱为hp-5毛细管色谱柱，大小为30m×0.32mm×0.25μm，进样口温度为260℃，检测器温度为260℃，柱温采用程序升温，初始温度60℃，保持2min，以5℃/min升温速率升至80℃，保持5min，以30℃/min升温速率升至220℃，保持2min，氮气流速为30ml/min，氢气流速为40ml/min，空气流速为400ml/min，分流比为50:1，进样量为1μl。

(1)专属性试验

精密称取苯0.05g加入少量乙醇的100ml容量瓶中，用乙醇定容，精密吸取该溶液1.0ml于10ml容量瓶中，定容，得到苯标准储备液，精密吸取苯标准储备液1ml于25ml容量瓶中，乙醇定容，配制成苯标准液。

精密量取1μl的空白乙醇溶剂，注入气相色谱仪，记录空白溶剂色谱图，如图1所示。精密量取1μl苯标准液，注入气相色谱仪，记录苯标准液色谱图，如图2所示。

由图1和图2可知，空白溶剂不干扰本品测定，各峰之间无干扰。

(2)线性关系考察

精密量取苯标准储备液配制成五种浓度的溶液，分别为0.712μg/ml、1.064μg/ml、1.655μg/ml、1.982μg/ml、2.316μg/ml。分别精密量取各溶度的溶液1μl，依次进样，每个溶度进样3针，记录峰面积；以标苯标准储备液浓度为横坐标，苯平均峰面积为纵坐标绘制标准曲线，苯线性关系图，如图3所示，线性实验结果如表1所示。

表1线性试验结果

由表1和图3可知，苯浓度为0.712μg/ml～2.316μg/ml范围内相关系数大于0.999，峰面积与浓度间呈良好的线性关系。

(3)精密度试验

精密称取苯0.05g加入少量乙醇的100ml容量瓶中，用乙醇定容，精密吸取该溶液1.0ml于10ml容量瓶中，定容，得到苯标准储备液。

分别精密吸取苯标准储备液0.8ml，0.9ml，1ml于25ml容量瓶中，乙醇定容，分别配制不同浓度的苯标准液，作为对照溶液。

精密称取氟尿嘧啶标准品1g，置于25ml容量瓶中，分别加入苯标准液0.8ml，0.9ml，1ml加乙醇溶解并稀释至刻度，混匀，各配制3份，作为供试品溶液。

精密量取对照溶液及各供试品溶液1μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算回收率，结果见表2所示。

表2精密度试验结果

由表2可知，回收率在99％～101％之间，达到标准要求，方法可行，精密度良好。

(4)重复性试验

配制六份浓度相同的苯标准溶液，精密量取各标准溶液1μl，依次进样，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，考察重复性。结果如表3所示。

表3重复性试验结果

由表3可知，该测定方法重复性较好。

(5)检测限与定量限试验

精密称取苯0.05g加入少量乙醇的100ml容量瓶中，用乙醇定容，精密吸取该溶液1.0ml于10ml容量瓶中，定容，得到苯标准储备液。取苯标准储备液适量，加乙醇逐级稀释，按信噪比约3：1为检测限溶液，信噪比约10：1为定量限溶液，连续进样三次，进样量1μl，记录色谱图，如图4、5所示，并记录结果，结果如表4所示。

表4检测限、定量限结果

由表4可知，信噪比约3∶1的标准为检测限0.19μg/ml，信噪比约10∶1的标准为定量限0.4μg/ml。

实施例1

一种气相色谱检测氟尿嘧啶中苯残留的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1.苯标准液的配制：a.称取0.05g苯加入到100ml容量瓶中，用乙醇溶液定容，然后精密吸取1.0ml于100ml另一容量瓶中，用乙醇溶液定容，得到苯标准储备液；b.精密吸取1.0ml苯标准储备液于25ml容量瓶中，用乙醇溶液定溶，即得苯标准液；

步骤2.样品供试液的配制：精密称取氟尿嘧啶样品1.0g，置于10ml容量瓶中，乙醇溶液定容，即得供试液；

步骤3.设定色谱仪的工作条件：色谱柱为hp-5毛细管色谱柱，大小为30m×0.32mm×0.25μm，进样口温度为260℃，检测器温度为260℃，柱温采用程序升温，初始温度60℃，保持2min，以5℃/min升温速率升至80℃，保持5min，以30℃/min升温速率升至220℃，保持2min，氮气流速为30ml/min，氢气流速为40ml/min，空气流速为400ml/min，分流比为50:1，进样量为1μl；

步骤4.进样检测：将步骤1和步骤2得到的溶液注入配有氢火焰离子化检测器的气相色谱仪，通过色谱数据处理机，得到标准品色图谱和样品色谱图，进样顺序为以第一针空白样，然后连续五针标准液，接着进样品供试液，最后再进一针苯标准液的进样顺序依次进样检测。连续进样品的针数不得超过十针，多余十针的则每十针之间再交叉进一针苯标准液。

步骤5.结果计算：根据标准色谱图和样品色谱图计算氟尿嘧啶中苯的含量，计算公式为：

式中：

a样—样品供试液中苯的峰面积；

a标—标准液中苯的峰面积；

c样—样品供试液中氟尿嘧啶的浓度，g/ml；

c标—标准液中苯的浓度，g/ml。

由图1和图2可知，样品供试液中苯的峰面积a样：30810、标准液中苯的峰面积a标：55114、样品供试液中氟尿嘧啶的浓度c样：0.103g/ml、标准液中苯的浓度c标：1.982×10^-7g/ml。

结果显示，残留溶剂含量为1.076ppm，符合ich指南的要求。

上述实施例只是本发明的较佳实施例，并不是对本发明技术方案的限制，只要是不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方案，均应视为落入本发明专利的权利保护范围内。