本发明属于免疫学技术领域，涉及一种口蹄疫病毒3b蛋白抗体的elisa检测方法及试剂盒。
背景技术：
fmd是由fmdv引起的偶蹄类动物烈性传染病，世界动物卫生组织（oie）将其列入必须通报的动物疫病。该病传播快、宿主范围广、发病率高，对畜牧业发展构成极大威胁。近年来我国畜牧养殖业发展迅速，口蹄疫是重大的潜在威胁。与发达国家通常采取的扑杀政策不同，发展中国家普遍采用免疫的方法来控制该病。因此，如何快速、可靠地区分免疫动物和感染动物，对于fmd的防制以及国际贸易尤为重要。基于动物感染fmdv后，既能产生结构蛋白抗体，又能产生nsp抗体，而疫苗免疫动物主要诱导机体产生fmdv结构蛋白抗体，与结构蛋白相比，非结构蛋白的变异较少，相对保守。在fmd诊断中，区分免疫动物和自然感染动物是一项十分重要的内容，鉴别自然感染动物和免疫动物也是oie判定一个国家有无fmd流行的依据。近年来，陆续建立了检测fmdvnsp抗体的诊断方法，以区分fmdv感染动物和注射疫苗动物。
fmdv的nsp是指除了衣壳蛋白1a、1b、1c、1d和它们的前体蛋白之外的所有由病毒编码但不参与病毒衣壳组成的蛋白，包括成熟蛋白l、2a、2b、2c、3a、3b、3c、3d以及它们的前体。ｆｍｄｖ的３ｂ蛋白是由非结构蛋白ｐ３编码区３个相连的但不完全相同的基因编码，大小分别为６９ｂｐ、７２ｂｐ、７２ｂｐ并产生３种不同的３ｂ蛋白（ｖｐｇ１～３），此现象在ｒｎａ病毒中少见。ｖｐｇ蛋白参与ｒｎａ病毒的起始合成和衣壳的形成。由于ｖｐｇ携带有ｐｕｐｕ结构与新合成的子代ｒｎａ相连，所以ｖｐｇ被认为是小ｒｎａ病毒ｒｎａ合成的引物。这种特殊的ｒｎａ复制方式与宿主ｍｒｎａ转录不同。因而，在宿主ｒｎａ合成受到抑制时，并不影响ｆｍｄｖｒｎａ的合成。ｖｐｇ基因的拷贝数与ｒｎａ病毒的感染力呈正相关，ｖｐｇ突变将导致病毒生命周期延长，这也意味着聚合蛋白的合成和加工被推迟，感染性粒子数目减少。目前，关于ｆｄｍｖ３ｂ蛋白的研究较少，它在病毒复制过程中的作用，及和宿主的相互作用还没有被完全揭示。而到目前为止，并未有口蹄疫病毒3b蛋白抗体的elisa检测试剂盒的研究报道和专利申请。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供一种设备简单，操作方便的口蹄疫病毒3b蛋白抗体的elisa检测方法及试剂盒。以3b抗原包被酶标板条，兔抗牛hrp酶标抗体，定性检测动物牛血清中的3b抗体。
具体技术方案为：
一种口蹄疫病毒3b蛋白抗体的elisa检测方法，包括以下步骤：
步骤1、以含o型akesu/58-2毒株3b基因的pcaggs-3b质粒为模板,扩增3b蛋白基因,并克隆至pet-30a(+)载体,进行原核表达及纯化。分别以akesu/58-2型口蹄疫病毒、纯化的3b蛋白为抗原；
步骤2、将3b标准蛋白用0.05mol/lph9.5的碳酸盐溶液(cbs)稀释成1.5mg/ml,4℃16h包被酶标板,封闭液为含1%明胶;根据待测样品数量取出所需酶标板并标记对照孔和样品孔,样品孔加入工作浓度的兔抗牛hrp酶标抗体和待测病毒培养液各100ul(对照孔加pbst),4℃孵育24h后移入酶标板上相应的孔中,37℃孵育45min后用pbst洗3次;
步骤3、每个样品孔加入工作浓度的酶标二抗,37℃孵育45min,pbst洗5次后加入底物,室温反应10min,加入终止液终止反应。用酶标仪读取各孔od值;结果判定,根据各样品的b/bo在标准曲线上求出其对应的质量浓度,或代入回归方程计算样品质量浓度的对数值x,求其反对数,即为样品中所含3b蛋白的质量浓度。
一种口蹄疫病毒3b蛋白抗体的elisa检测试剂盒，包括3b蛋白包被的检测板、工作浓度的兔抗牛hrp酶标抗体、阴性对照、阳性对照、tmb显色液、1n盐酸。
本发明的有益效果：
本发明可准确、快速检测出动物血清中3b抗体有无，用于检测动物血清中口蹄疫病毒非结构蛋白3b抗体，适用于动物群体感染状况监测和评估、发现早期隐性感染和进出境检疫，不受血清型的限制。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的方法作进一步详细地说明。
最适抗体工作浓度的确定
用碳酸盐缓冲液(ph9.6)先将兔抗牛hrp酶标抗体作1:100稀释,随后作2倍倍比稀释,直至1:204800,包被elisa板;固定阳性抗原和阴性抗原(同样处理的非感染bhk-21细胞)和兔抗牛hrp酶标二抗(1:5000);将单抗igg作1:10稀释,随后进一步作2倍倍比稀释,直至1:1280。通过方阵滴定,以获得最大的od差值(阳性样本od-阴性样本od)的条件为最适工作浓度。
实施例
(1)以最佳包被浓度的兔抗牛hrp酶标抗体,37℃1h后转入4℃冰箱过夜。次日取出,洗涤酶标板3次,每次3~4min,(2)用0.5%bsa封闭酶标板,37℃1h,同上洗板。(3)加入用0.1%bsa从1:10开始5倍稀释待检抗原和阴阳性对照抗原,37℃30min,同上洗板。(4)加入最适工作浓度的单克隆抗体,37℃30min,同上洗板。(5)加入底物,室温避光15min。(6)加入hf溶液终止反应,测定od630值。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。