本发明属于外泌体检测技术领域，具体涉及一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及其制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒。
背景技术：
外泌体是细胞释放到胞外的大小为30nm～200nm的双层膜性囊泡，携带大量蛋白质、脂质和rnas等物质，介导体内细胞间的信息传导，从而影响细胞的生理功能。外泌体膜表面除了共有标记物(如cd9、cd63、cd81等)外，亦表达多种特异性标记物(如gpc1、gpc3、psma、tmem256、epcam等)，这些特异性外泌体高度反映了宿主细胞类型和状态。研究显示，分离检测特异性外泌体对疾病诊断、治疗监控与预后判断具有重要意义，尤其在恶性肿瘤诊断方面具有很高诊断特异性和诊断灵敏度。
目前对于体液中特异性外泌体的检测主要是先通过超速离心法进行外泌体的分离纯化，然后对外泌体特殊标记物进行检测，这种方式耗时长，不方便，不利于临床常规开展。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及其制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒，包括超顺磁纳米微粒基体、外泌体共有标记物抗体；所述超顺磁纳米微粒基体包括氧化铁纳米粒子和偶联单元；所述超顺磁纳米微粒基体通过所述的偶联单元与外泌体共有标记物抗体偶联，所述偶联单元为羧基磷脂聚乙二醇。
优选的，所述外泌体共有标记物抗体包括anti-cd9、anti-cd63、anti-cd81和anti-flotillin-1中的一种或几种。
优选的，所述超顺磁纳米微粒的粒径为3～50nm。
本发明还提供了所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒的制备方法，包括以下步骤：1)将偶联单元羧基磷脂聚乙二醇、氧化铁纳米粒子和三氯甲烷在超声条件下中进行氧化反应，获得的羧基修饰氧化铁纳米粒子为超顺磁纳米微粒基体；2)将所述超顺磁纳米微粒基体与外泌体共有标记物抗体缩合偶联，获得捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。
优选的，步骤2)中所述的偶联采用n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐化学偶联法进行。
本发明还提供了一种特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒，包括上述的捕获外泌体的超顺磁纳米微粒、发光标记的外泌体特异性标记物抗体，封闭液、洗涤液、naoh水溶液、双氧水和校准品。
优选的，所述发光标记的外泌体特异性标记物抗体为吖啶酯标记的gpc1抗体。
优选的，所述封闭液为牛血清白蛋白溶液。
优选的，所述洗涤液为含吐温20的pbs溶液。
优选的，所述校准品为癌细胞的外泌体。
本发明的有益效果：本发明提供的超顺磁纳米微粒通过将超顺磁纳米微粒基体与外泌体共有标记物抗体偶联得到，所述超顺磁纳米微粒能够与外泌体的共有标记物特异性结合，从而实现对外泌体的快速、特异和高效捕获。
本发明提供的特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒，将超顺磁纳米微粒磁性和化学发光免疫的特异性、可检测性结合，能够实现简便、快速、定量检测特异性外泌体；本发明提供的特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒可以直接用于血清、血浆、胸腹水、尿液、脑脊液标本中特异外泌体的标记物的检测，灵敏度高、稳定性好且检测时间短，操作简便，非常适用于临床检测。
附图说明
图1实施例1中gpc1+外泌体蛋白westernblot结果图；
图2实施例1流式细胞检测方法筛选外泌体捕获抗体结果图；
图3-1为超顺磁纳米微粒基体的电镜图，图3-2为超顺磁纳米微粒基体的动态光散射图；
图4超顺磁纳米微粒捕获外泌体的分离装置示意图；
图5gpc1+外泌体化学发光免疫学检测技术原理示意图；
图6gpc1+外泌体的检测校准曲线图；
图7gpc1+外泌体在胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌患者中的表达水平差异对比图；
图8gpc1+外泌体对胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌诊断roc曲线图；
图9胰腺癌患者术前及术后5天血清gpc1+外泌体水平变化图。
具体实施方式
本发明提供了一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒，包括超顺磁纳米微粒基体、外泌体共有标记物抗体；所述超顺磁纳米微粒基体包括氧化铁纳米粒子和偶联单元；所述超顺磁纳米微粒基体通过所述的偶联单元与外泌体共有标记物抗体偶联。
在本发明中所述超顺磁纳米微粒的粒径优选的为3～50nm，更优选的为5～20nm。在本发明中所述的超顺磁纳米微粒大小均匀，分散性良好。在本发明中所述超顺磁纳米微粒基体通过偶联单元偶联外泌体共有标记物抗体，能够特异性结合外泌体。本发明中所述超顺磁纳米微粒基体为具有磁性的氧化铁纳米粒子，本发明中所述超顺磁纳米微粒基体负载外泌体共有标记物抗体的比例为0.1-3.0μg(fe)/μg(igg)。本发明中所述的外泌体共有标记物抗体优选的包括anti-cd9、anti-cd63、anti-cd81和anti-flotillin-1中的一种或几种；所述偶联单元优选的为羧基磷脂聚乙二醇。
本发明还提供了所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒的制备方法，包括以下步骤：1)将偶联单元、氧化铁纳米粒子和三氯甲烷在超声条件下中进行氧化反应，获得的羧基修饰氧化铁纳米粒子为超顺磁纳米微粒基体；2)将所述超顺磁纳米微粒基体与外泌体共有标记物抗体缩合偶联，获得捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。
在本发明中，用羧基磷脂聚乙二醇与氧化铁纳米粒子发生氧化反应，获得羧基修饰的氧化铁纳米粒子即为超顺磁纳米微粒基体。在本发明中，所述氧化铁纳米微粒的粒度优选为2～40nm；所述的氧化铁纳米粒子的制备方法优选包括：将铁、油酸和十八烯在300～340℃下混合搅拌发生氧化反应；将得到的反应产物经丙酮沉淀，得到氧化铁纳米微粒。
在本发明中，所述原料铁优选的为单质铁粉，本发明中所述反应优选的在氩气保护下进行，本发明中所述氩气的流速优选的为0.9～1.2m·s-1；本发明中所述氩气的作用为置换反应体系中空气，防止fe被氧化。在本发明中，所述搅拌的转速优选的为100r/min。在本发明中所述氧化反应的温度更优选为310～330℃；所述氧化反应的时间优选为20～40min，更优选为30min。
在本发明中所述氧化反应结束后优选的将反应产物自然降温至20～30℃，然后用丙酮沉淀反应产物；在本发明中所述丙酮的用量优选的为60ml。
本发明优选的将所述丙酮沉淀后的产物进行离心，收集固相组分获得氧化铁纳米粒子。在本发明中，所述离心的转速优选的为8000～12000rpm，更优选的为10000rpm；所述离心的时间优选的为8～12min，更优选的为10min。
在本发明中，所述氧化反应的过程优选具体包括以下步骤：将所述氧化铁纳米粒子和羧基磷脂聚乙二醇在三氯甲烷混合进行第一次超声震荡处理，得到第一混合物；浓缩所述第一混合物获得浓缩产物；对所述浓缩产物进行第二超声震荡处理获得超顺磁纳米微粒基体。
本发明在获得氧化铁纳米粒子后，将所述氧化铁纳米粒子和羧基磷脂聚乙二醇在三氯甲烷混合进行第一次超声震荡处理，得到第一混合物。本发明中所述氧化铁纳米粒子的质量、羧基磷脂聚乙二醇质量、三氯甲烷的体积混合比例优选的为(4～6):(8～12):(2～4)(m/m/v)；所述超声的功率优选为40～60w，更优选为50w；所述超声的频率优选为35～45khz，更优选的为40khz；本发明中所述超声震荡的时间优选为7～13min，更优选为10min。
本发明在所述第一次超声震荡处理后，优选的对第一次超声震荡处理后的第一混合物进行旋转蒸发浓缩，得到浓缩产物。本发明中所述旋转蒸发浓缩的温度优选的为200℃，时间优选的为10min。
本发明优选的在旋转蒸发浓缩后，将得到的浓缩产物与pbs缓冲液混合进行第二次超声震荡处理，获得超顺磁纳米微粒基体。本发明中，所述浓缩产物的质量以使用的氧化铁纳米粒子的质量计算，所述pbs缓冲液与氧化铁纳米粒子的质量体积比(mg/ml)优选为1:(0.5～2)；本发明中第二次超声震荡处理的时间优选的为5～15s，更优选的为10s；所述第二次超声震荡处理的其它参数与第一次超声震荡处理一致，在此不再赘述。
本发明在获得超顺磁纳米微粒基体后，优选的用透射电镜对所述超顺磁纳米微粒基体进行观测微粒大小，并用动态光散射(dynamiclightscattering，dls)测试微粒的分散性能。
本发明在获得超顺磁纳米微粒基体后，将所述超顺磁纳米微粒基体与外泌体共有标记物抗体偶联获得捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。本发明中，所述偶联优选的采用n-羟基琥珀酰亚胺/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(nhs/edc)化学偶联的方法进行。
在本发明中，所述偶联反应优选包括以下步骤：将所述超顺磁纳米微粒基体表面的偶联单元上的羧基激活，然后通过激活的羧基将所述超顺磁纳米微粒基体与抗体偶联。
在本发明中将所述超顺磁纳米微粒基体表面偶联单元上的羧基激活，本发明中所述羧基激活反应优选的nhs/edc-mes混合溶液中进行；所述nhs/edc-mes混合溶液的浓度优选为0.05～0.15m，更优选为0.1m；所述nhs/edc-mes混合溶液的ph值优选的为4.8～5.2，更优选的为5.0；所述nhs/edc-mes混合溶液通过以下方法制备获得：将等质量的nhs与edc溶解于10倍体积的mes中获得nhs/edc-mes混合溶液。在本发明中，所述的羧基激活具体为将所述超顺磁纳米微粒基体分散于所述nhs/edc-mes混合溶液中20～40min，激活所述超顺磁纳米微粒基体上的羧基获得超顺磁纳米微粒基体溶液。本发明中所述nhs/edc-mes混合溶液与超顺磁纳米微粒基体溶液的体积比优选的为1：(3～5)，更优选的为1:4，所述激活反应时间优选的为25～35min，更优选的为30min。
本发明所述激活反应结束后，优选的采用mes缓冲液对反应产物进行超滤离心，去除多余的激活剂，得到纯化的超顺磁纳米微粒基体。本发明中所述超滤离心的转速优选为11000～12000g，更优选的为11500g；所述超滤离心的时间优选的为5-15min，更优选的为10min。本发明中所述超滤离心优选的采用milliporeultrafree0.5的离心管进行；所述milliporeultrafree0.5的截留分子量优选的为30kda。
本发明在所述过滤离心后，猝灭nhs和edc，得到猝灭nhs和edc的超顺磁纳米微粒基体。在本发明中，所述猝灭nhs和edc优选的采用低温猝灭的方法，所述低温猝灭的温度优选为3～5℃；所述低温淬灭的时间优选为10～14h，更优选的为12h。
本发明在猝灭nhs和edc后，用bsa溶液封闭超顺磁纳米微粒基体上的非结合位点，然后将所述外泌体共有标记物抗体与封闭后的超顺磁纳米微粒基体偶联，获得捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。
本发明中，所述所述偶联的外泌体共有标记物抗体与封闭后的超顺磁纳米微粒基体的质量比优选的为0.8μg(fe)/μg(igg)；所述偶联的温度优选为20～30℃，更优选为25℃，所述偶联的时间优选为40～80min，更优选的为60min。
本发明在所述偶联结束后，优选的将所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒在4℃放置过夜后pbs缓冲液洗涤多余未结合抗体。
本发明中获得的所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒优选的置于4℃保藏。
本发明还提供了一种特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒，包括上述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒、发光标记的外泌体特异性标记物抗体，封闭液、洗涤液、naoh水溶液、双氧水和校准品。
本发明所述试剂盒包括发光标记的外泌体特异性标记物抗体；所述发光标记的外泌体特异性标记物抗体优选的为吖啶酯标记的gpc1抗体。在本发明中所述吖啶酯标记的gpc1抗体通过以下方法制备获得：将gpc1抗体与吖啶酯混合避光孵育，获得吖啶酯标记的gpc1抗体。本发明中所述gpc抗体的浓度优选为0.4～0.6mg/ml；更优选为0.5mg/ml,本发明中所述gpc抗体的溶剂优选的为0.1m磷酸盐缓冲液；所述吖啶酯的浓度优选为0.45～0.55mm，更优选为0.5mm，所述吖啶酯的溶剂优选的为0.1m碳酸盐缓冲液。本发明中所述gpc1抗体与吖啶酯的体积比优选的为10:2.5～3.5，更优选的为10：3。本发明中所述避光孵育的时间优选的为10～14h，更优选的为12h；所述避光孵育的温度优选的为20～30℃，更优选的为25℃。
本发明在所述避光孵育结束后，优选的将所述孵育后的混合物在pbs缓冲液中透析过夜，并通过15x80mmsephadexg-50脱盐柱纯化获得吖啶酯标记的gpc1抗体溶液。本发明在获得吖啶酯标记的gpc1抗体溶液后，将质量分数为10％nan3溶液与吖啶酯标记的gpc1抗体溶液溶液以1:95～105的体积比混合；储存于4℃备用。
本发明所述试剂盒还包括封闭液；所述封闭液优选的为牛血清白蛋白溶液，所述牛血清白蛋白溶液的质量浓度优选的为8～12％，更优选的为10％。所述封闭液的作用为减少吖啶酯标记抗体的非特异性吸附。
本发明所述试剂盒还包括洗涤液，所述洗涤液优选的为添加0.01％(w/w)吐温20的pbs溶液。所述洗涤液的作用为洗涤多余未结合物质。
本发明所述试剂盒还包括naoh水溶液，所述naoh水溶液的浓度优选的为0.1mol/l；所述naoh水溶液的作用为使反应体系变成碱性溶液，让吖啶酯发光。
本发明所述试剂盒还包括双氧水，所述双氧水的浓度优选的为0.01mol/l；所述双氧水的作用为吖啶酯发光反应提供活性氧。
本发明所述试剂盒还包括校准品，本发明中所述校准品为生长状态良好癌细胞的外泌体，在本发明中所述校准品优选的为胰腺癌细胞系panc-1的外泌体。本发明中所述胰腺癌细胞系panc-1的外泌体通过培养胰腺癌细胞系panc-1并从细胞培养上清通过超速离心的方式获得外泌体。取部分校准品外泌体，加入高效组织细胞裂解液(beyotime，p0013k)后在冰上裂解40分钟。通过gpc1检测试剂盒(gpc1humanelisakit，abin840422)定量检测gpc1蛋白总量。取相应量的定量样本加入
本发明所述的试剂盒用于快速简便地检测人体体液中特异性外泌体含量，本发明所述试剂盒的使用原理和流程图如图5所示：首先使用捕获外泌体的超顺磁纳米微粒捕获体液中的外泌体，然后利用捕获外泌体的超顺磁纳米微粒分离装置将捕获外泌体的超顺磁纳米微粒与体液中其他物质分离，同时使用发光标记的外泌体特异性标记物抗体与捕获的外泌体上的特异性标记物进行反应，通过检测其化学发光量根据绘制好的标准曲线对特异性外泌体进行定量检测。
本发明所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒的分离装置(结构如图4-1～4-3所示)，包括超顺磁纳米微粒分离柱(图4-1,左图为剖视图，右图为正视图)和配套的磁分离装置(图4-2和图4-3)。本发明中所述超顺磁纳米微粒分离柱优选的通过磁性分子筛分离所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。在本发明中所述超顺磁纳米微粒分离柱自上而下依次包括加样槽(1)、分离区(2)和液流区(3)。
本发明中所述加样槽(1)优选的自上而下依次包括圆柱形加样区(4)和漏斗状过渡区(5)，所述加样槽(1)优选的可容纳2～3ml液体，更优选的为2.5ml；在本发明中所述加样槽(1)的总高度优选的为17.5～18.5mm；更优选的为18mm。在本发明中，所述圆柱形加样区(4)的垂直高度优选的为12～14mm，更优选的为13mm；所述圆柱形加样区(4)的外径优选的为11.5～12.5mm，更优选的为12mm；所述圆柱形加样区(4)的内径优选的为11～12mm，更优选的为11.50mm。在本发明中所述漏斗状过渡区(5)的垂直高度优选的为1.5～2.5mm，更优选的为2.00mm。本发明中所述漏斗状过渡区(5)的大口直径优选的为12.0mm、所述漏斗状过渡区(5)的小口直径优选的为7.5mm。
在发明中所述加样槽漏斗状过渡区(5)的末端与分离区(2)直接相连；本发明中所述分离区(2)选的可容纳0.45～0.85ml液体，更优选的为0.7ml。本发明中所述分离区(2)的垂直总高度优选的为11.50～14.50mm，更优选的为13.00mm。本发明中所述分离区(2)包括初始分离柱(6)和窄缩分离柱(7)；所述初始分离柱(6)的垂直高度优选的为3.80～7.20mm，更优选的为5.00mm；所述初始分离柱(6)的外径优选的为7.00～8.00mm，更优选的为7.50mm，所述圆柱形初始过渡区的内径优选的为6.50～7.50mm，更优选的为6.00mm。本发明中所述窄缩分离柱(7)的垂直高度优选的为4.80～9.20mm，更优选的为8.00mm。本发明中所述窄缩分离柱(7)的外径优选的2.80～6.20mm，更优选的为5.5mm，所述窄缩分离柱内径优选的为2.10-5.80mm，更优选的为4.6mm。
本发明中所述初始分离柱(6)的顶端设置有分子滤网，底端设置有球形铁珠；在所述分子滤网和球形铁珠之间填充球形镍微粒。在本发明中，所述分子滤网的孔径优选的为5～10μm，更优选的为8μm；所述球形镍微粒的粒径优选的为10～1000μm。在本发明中所述磁性分子筛分离柱通过在分子滤网和球形铁珠之间填充的球形镍微粒形成的磁性分子筛分离所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。
在本发明中，所述窄缩分离区(7)的末端与液流区(3)直接相连；本发明中所述液流区(3)包括顺次连接的收集空心柱(8)和窄缩收集空心柱(9)；在本发明中，所述收集空心柱(8)的外径优选的为2.50～5.00mm，更优选的为3.80mm；所述收集空心柱(8)的内径优选的为1.50～4.00mm，更优选的为2.50mm；所述收集空心柱(8)的柱高优选的为6～12mm，更优选的为8.50mm。所述窄缩收集空心柱(9)的外径优选的为1.50～4.50mm，更优选的为1.80mm；所述窄缩收集空心柱(9)的内径优选的为1.00～3.00mm，更优选的为1.00mm；所述窄缩收集空心柱(9)的柱高优选的为1.00～3.50mm，更优选的为2.00mm。
在本发明中所述分离装置还包括配套的磁分离装置；所述配套的磁分离装置优选为中空磁分离箱结构如图4-2所示，所述中空磁分离箱顶面设置若干磁分离柱卡槽(10)，所述磁分离卡槽(10)优选的等间距设置在所述中空磁分离箱的顶面；所述磁分离柱卡槽(10)优选的为10～15个，更优选的为12个。本发明中，所述磁分离箱(12)对应磁分离柱卡槽两侧面分别平行设置磁铁(11)穿过箱体，所述磁铁(11)优选的为圆柱体n52钕铁硼强磁磁铁，本发明中所述磁铁提供强磁力，从而在分离过程中吸留超顺磁纳米微粒。
本发明中，所述磁分离箱(12)底部连接负压引流管路。在本发明具体实施过程中，将所述超顺磁纳米微粒分离柱插入磁分离柱卡槽上，在所述中空磁分离箱的箱体下方添加负压引流设备，超顺磁纳米微粒在磁铁的作用下停留在超顺磁纳米微粒分离柱中，洗涤液体通过磁分离箱(12)底部连接负压引流管路快速引流于废液瓶。
在所述分离完毕后，转移超顺磁纳米分离柱，静置1～5min，待超顺磁性微粒磁力完全消失后，通过正压推流装置完全收集分离柱内磁微粒及其表面捕获的囊泡蛋白。本发明中所述正压推流装置的推气速率优选的≥22l/min；正压调节范围优选的为0.02～0.09mpa(150～680mmhg)；噪声优选的≤20db(a)；电源参数优选的为220v、50hz。
在本发明中，所述配套的磁分离装置还可以为磁分离套管支具，结构如图4-3所示；所述磁分离套管支具为圆柱状，所述磁分离套管支具的直径优选的为18～19mm，更优选的为18.50mm；所述磁分离套管支具的柱高优选的为19.00～21.00mm，更优选的为20.00mm；本发明中所述磁分离套管支具的外侧壁对称设置离心支撑把，所述离心支撑把用于将套管支具悬挂于离心管管口。
在本发明中，所述磁分离套管支具顶面中心设置磁分离柱插孔，所述磁分离柱插孔的直径优选的为3.50mm～4.50mm，更优选的为4.00mm；所述磁分离柱插孔的垂直高度优选为19.00～21.00mm，更优选的为20.00mm。本发明中，所述磁分离柱插孔两侧分别设置磁铁插孔，用于固定磁铁；本发明中所述磁铁插孔与磁分离柱插孔的垂直间距优选的为2.00～4.00mm；所述磁铁插孔优选的为长方形，所述磁铁插孔的长优选的为10-20cm，宽优选的为4-8cm，垂直高度优选的为6-9cm。本发明中所述磁铁插孔中优选的放置n52钕铁硼强磁磁铁。
在本发明具体实施过程中，将放入磁铁后的整个磁分离套管支具放于离心管上方，然后将所述超顺磁纳米微粒分离柱插入套管支具的磁分离柱插孔中，加入洗涤液离心，从而快速分离洗涤液体于离心管中；洗涤完毕后，转移超顺磁纳米分离柱，静置1～5min，待超顺磁性微粒磁力完全消失后，通过正压推流装置完全收集分离柱内磁微粒及其表面捕获的囊泡蛋白。本发明中所述正压推流装置的推气速率优选的≥22l/min；正压调节范围优选的为0.02～0.09mpa(150～680mmhg)；所述正压推流装置的噪声优选的≤20db(a)；电源参数优选的为220v、50hz。
本发明所述的试剂盒的使用方法具体如下：将含外泌体样本加入反应管，然后加入封闭液、超顺磁纳米微粒，外泌体特异性标记物抗体，室温混匀反应获得混合液体。反应后，将分离柱置于所述分离装置上(两种装置任选一种)，向分离柱中加入上述混合液体，待所述混合液体流尽后，用洗涤液洗涤多余未结合物质，洗涤过程重复4～6次；待洗涤液流尽后，将超顺磁纳米分离柱从外加磁场中取出，静置，待柱内超顺纳米磁微粒的磁性消失后，通过正压推流装置收集超顺磁纳米微粒，将所述收集到的超顺磁纳米微粒与双氧水和naoh水溶液混合置于单管发光检测仪(型号：cla-01))上检测化学发光信号，根据标准曲线计算获得样品中特异性外泌体的含量。本发明中所述双氧水和naoh水溶液的用量独立的为
下面结合实施例对本发明提供的一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及其制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
外泌体的共有标记物和特异性标记物确认
用含10％胎牛血清(fbs)的rpmi1640培养胰腺癌细胞系panc-1和胰腺正常细胞系hpde，待其生长密度至80％，更换无fbs的rpmi1640培养基继续培养36h；收集培养上清用于提取外泌体。将上清分装至50ml离心管，1000g离心10min去除细胞碎片；将上清继续10000g离心20min去除微囊泡及细胞碎片；取上清110000g离心70min，去掉上清后用pbs缓冲液重悬沉淀物质后，再次110000g离心70min，得到沉淀物(外泌体)。用100μlpbs缓冲液重悬沉淀用于后续实验：透射电镜观察鉴定提取外泌体形态；纳米微粒跟踪分析技术nta(nanoparticletrackinganalysis)测定沉淀粒径和粒子数；bca蛋白定量试剂盒检测提取外泌体的表面总蛋白量。westernblot鉴定外泌体含有的共有膜蛋白以及特异性标记物，并从中分析选择表达较高的膜蛋白抗体进行后续研究。结果如图1显示：panc-1胰腺癌细胞来源外泌体表达gpc1、cd9、cd63、cd81、epcam、flotillin-1分子，而胰腺良性细胞仅表达共有外泌体标记物cd9、cd63、cd81分子。
实施例2
外泌体标记物特异性结合抗体的筛选
用流式细胞检测技术鉴定可与特异外泌体表面蛋白标记物结合的自制抗体包括gpc1、gpc3、psma、tmem256和epcam。取
实施例3
捕获外泌体的超顺磁纳米微粒的制备
(1)超顺磁纳米微粒基体的制备及表征：取1.8g铁置于油相中，加入0.57g油酸和10g十八烯加入到三口烧瓶中，氩气(0.9-1.2m·s-1)保护下搅拌并升温至320度，保持该温度继续搅拌30min，后温度降至室温，用60ml丙酮将其沉淀并离心(10000转，离心10min)分离获得氧化铁纳米粒子。称取5mg氧化铁纳米粒子和10mg羧基磷脂聚乙二醇，量取3ml三氯甲烷并超声(超声波功率为50w，超声波频率为40khz)震荡10min溶解。之后旋蒸10min后取出，并加入5mlpbs缓冲液，同上参数再次进行超声震荡10秒。得到羧基修饰的氧化铁纳米粒子。用透射电镜对产物进行观测及动态光散射(dynamiclightscattering，dls)测试，粒径为5～20nm。结果如图3所示，透射电镜和dls显示所制备超顺磁纳米微粒大小均匀，分散性良好。
(2)超顺磁纳米微粒基体与外泌体共有标记物抗体偶联：使用n-羟基琥珀酰亚胺/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(nhs/edc)化学偶联的方法，实现对包被聚乙二醇(peg)的超顺磁纳米微粒的抗体修饰。反应在0.1m2-(n-吗啡啉)乙磺酸(mes)缓冲液(ph＝5.0)体系中进行，将10mg的nhs和10mg的edc溶解在
实施例4
捕获外泌体的超顺磁纳米微粒的分离装置
包括超顺磁纳米微粒分离柱和中空磁分离箱，所述超顺磁纳米微粒分离柱的结构如附图4-1所示，所述超顺磁纳米微粒分离柱自上而下包括依次连通的加样槽(1)、分离区(2)和液流区(3)；
本发明中所述加样槽(1)优选的自上而下依次包括圆柱形加样区(4)和漏斗状过渡区(5)，所述加样槽(1)优选的可容纳2.5ml液体；在本发明中所述加样槽(1)的总高度为18mm。其中圆柱形加样区(4)的垂直高度为13mm；所述圆柱形加样区(4)的外径为12mm；内径为11.50mm。在本发明中所述漏斗状过渡区(5)的垂直高度为2.00mm。本发明中所述漏斗状过渡区(5)的大口直径为12.0mm，小口直径为7.5mm。
所述加样槽漏斗状过渡区(5)的末端与分离区(2)直接相连；本发明中所述分离区(2)可容纳0.7ml液体，所述分离区(2)的垂直总高度为13.00mm。本发明中所述分离(2)包括初始分离柱(6)和窄缩分离柱(7)；所述初始分离柱(6)的垂直高度为5.00mm；所述初始分离柱(6)的外径为7.50mm，所述圆柱形初始过渡区的内径为6.00mm。本发明中所述窄缩分离柱(7)的垂直高度为8.00mm。本发明中所述窄缩分离柱的外径为5.5mm，所述窄缩分离柱内径为4.6mm。
所述初始分离柱(6)的顶端设置有分子滤网，底端设置有球形铁珠；在所述分子滤网和球形铁珠之间填充球形镍微粒。在本发明中，所述分子滤网的孔径为8μm；所述球形镍微粒的粒径为10～1000μm。在本发明中所述磁性分子筛分离柱通过在分子滤网和球形铁珠之间填充的球形镍微粒形成的磁性分子筛分离所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。
在本发明中所述窄缩分离区(7)的末端与液流区(3)直接相连；本发明中所述液流区(3)包括顺次连接的收集空心柱(8)和窄缩收集空心柱(9)；在本发明中，所述收集空心柱(8)的外径为3.80mm；所述收集空心柱(8)的内径为2.50mm；所述收集空心柱(8)的柱高为8.50mm。所述窄缩收集空心柱(9)的外径为1.80mm；所述窄缩收集空心柱(9)的内径为1.00mm；所述窄缩收集空心柱(9)的柱高为2.00mm。
所述中空磁分离箱的结构如附图4-2所示，所述中空磁分离箱顶面等间距设置12个磁分离柱卡槽，所述磁分离箱对应磁分离柱卡槽两侧面分别平行设置圆柱体n52钕铁硼强磁磁铁，所述磁分离箱底部连接负压引流管路。
在具体实施过程中，将所述超顺磁纳米微粒分离柱置于磁分离柱卡槽上，在所述中空磁分离箱的箱体下方添加负压引流设备，超顺磁纳米微粒在磁铁的作用下停留在超顺磁纳米微粒分离柱中，洗涤液体通过磁分离箱底部连接负压引流管路快速引流于废液瓶。在所述分离完毕后，转移超顺磁纳米分离柱，静置2min，待超顺磁性微粒磁力完全消失后，通过正压推流装置完全收集分离柱内磁微粒及其表面捕获的囊泡蛋白。本发明中所述正压推流装置的推气速率≥22l/min；正压调节范围为0.02～0.09mpa(150～680mmhg)；噪声≤20db(a)；电源参数为220v、50hz。
实施例5
捕获外泌体的超顺磁纳米微粒的分离装置
包括超顺磁纳米微粒分离柱和磁分离套管支具，所述超顺磁纳米微粒分离柱的结构如附图4-1所示，所述超顺磁纳米微粒分离柱自上而下包括依次连通的加样槽(1)、分离区(2)和液流区(3)；
本发明中所述加样槽(1)优选的自上而下依次包括圆柱形加样区(4)和漏斗状过渡区(5)，所述加样槽(1)优选的可容纳2.5ml液体；在本发明中所述加样槽(1)的总高度为18mm。其中圆柱形加样区(4)的垂直高度为13mm；所述圆柱形加样区(4)的外径为12mm；内径为11.50mm。在本发明中所述漏斗状过渡区(5)的垂直高度为2.00mm。本发明中所述漏斗状过渡区(5)的大口直径为12.0mm，小口直径为7.5mm。
所述加样槽漏斗状过渡区(5)的末端与分离区(2)直接相连；本发明中所述分离区(2)可容纳0.7ml液体，所述分离区(2)的垂直总高度为13.00mm。本发明中所述分离(2)包括初始分离柱(6)和窄缩分离柱(7)；所述初始分离柱(6)的垂直高度为5.00mm；所述初始分离柱(6)的外径为7.50mm，所述圆柱形初始过渡区的内径为6.00mm。本发明中所述窄缩分离柱(7)的垂直高度为8.00mm。本发明中所述窄缩分离柱的外径为5.5mm，所述窄缩分离柱内径为4.6mm。
所述初始分离柱(6)的顶端设置有分子滤网，底端设置有球形铁珠；在所述分子滤网和球形铁珠之间填充球形镍微粒。在本发明中，所述分子滤网的孔径为8μm；所述球形镍微粒的粒径为10～1000μm。在本发明中所述磁性分子筛分离柱通过在分子滤网和球形铁珠之间填充的球形镍微粒形成的磁性分子筛分离所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。
在本发明中所述窄缩分离区(7)的末端与液流区(3)直接相连；本发明中所述液流区(3)包括顺次连接的收集空心柱(8)和窄缩收集空心柱(9)；在本发明中，所述收集空心柱(8)的外径为3.80mm；所述收集空心柱(8)的内径为2.50mm；所述收集空心柱(8)的柱高为8.50mm。所述窄缩收集空心柱(9)的外径为1.80mm；所述窄缩收集空心柱(9)的内径为1.00mm；所述窄缩收集空心柱(9)的柱高为2.00mm。
所述配套的磁分离装置为磁分离套管支具；所述磁分离套管支具的结构如附图4-3所示；所述磁分离套管支具为圆柱状，所述磁分离套管支具的直径为18.50mm；所述磁分离套管支具的柱高为20.00mm；所述磁分离套管支具的外侧壁对称设置离心支撑把，所述离心支撑把用于将套管支具悬挂于离心管管口。在本发明中，所述磁分离套管支具顶面中心设置磁分离柱插孔，所述磁分离柱插孔的直径为4.00mm；所述磁分离柱插孔的垂直高度为20.00mm。本发明中，所述磁分离柱插孔两侧分别设置磁铁插孔内n52钕铁硼强磁磁铁；本发明中所述磁铁插孔与磁分离柱插孔的垂直间距为1-3mm；所述磁铁插孔为长方形，所述磁铁插孔直径为0.50-1.50cm，垂直高度为1.00-2.50cm。
在具体实施过程中，然后将放入磁铁后的整个磁分离套管支具放于离心管上方，然后将所述超顺磁纳米微粒分离柱插入套管支具的磁分离柱插孔中，加入洗涤液离心，从而快速分离洗涤液体于离心管中；洗涤完毕后，转移超顺磁纳米分离柱，静置2min，待超顺磁性微粒磁力完全消失后，通过正压推流装置完全收集分离柱内磁微粒及其表面捕获的囊泡蛋白。本发明中所述正压推流装置的推气速率优选的≥22l/min；正压调节范围优选的为0.02～0.09mpa(150～680mmhg)；所述正压推流装置的噪声优选的≤20db(a)；电源参数优选的为220v、50hz。
实施例6
一种特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒，包括实施例3中获得的捕获外泌体的超顺磁纳米微粒、实施例4或5中的分离装置、吖啶酯标记gpc1抗体，10％bsa、含有质量分数0.01％吐温20的pbs溶液、naoh水溶液、双氧水和校准品，校准品为胰腺癌细胞系panc-1的外泌体。
吖啶酯标记抗体制备：取0.5mg自备gpc1抗体通过8000rpm离心6min，浓缩为1mg/ml。加入
利用上述试剂盒对gpc1+外泌体化学发光免疫学定量检测
实验原理如图5：捕获抗体cd63(此处以cd63抗体为例说明)被包被在超顺磁纳米微粒基体表面，将含外泌体样本分别加入1.5ml离心管，加入等量10％牛血清白蛋白(bsa)，取
校准品制备与赋值
取生长状态良好的胰腺癌细胞系panc-1，待其生长密度至80％后，更换无fbs的rpmi1640培养基继续培养36h；收集培养上清用于提取外泌体。将上清分装至50ml离心管，1000g离心10min去除细胞碎片；将上清继续10000g离心20分钟进一步去除微囊、以及细胞碎片；取上清110000g离心70分钟，去掉上清，用pbs重悬沉淀物质，再次110000g离心70分钟，沉淀即外泌体。用1mlpbs缓冲液重悬沉淀，分装并-80℃保存，作为后续实验的校准品原液使用。取部分校准品外泌体，加入高效组织细胞裂解液(beyotime，p0013k)后在冰上裂解40分钟。通过gpc1检测试剂盒(gpc1humanelisakit，abin840422)定量检测gpc1蛋白总量。取相应量的定量样本加入
特异性外泌体定量检测的方法学性能指标：
(1)精密度：本发明的化学发光免疫法定量检测gpc1+外泌体，具有较高精密度，其批内变异系数(cv)<10％，日间变异系数(cv)<15％。
(2)分析线性测量范围：结果如图6，利用直接化学发光免疫测定技术测定，其在
(3)最低检测限：本专利方法可最低检测3.8105/mlgpc1+的特异外泌体。
初步临床应用结果
(1)临床标本的准备。
标本采集：采集初诊未受治疗的且有明确病理诊断的患者血液标本。其中胰腺癌42例，良性胰腺疾病38例；前列腺癌56例，良性前列腺疾病48例；健康体检者60例。
标本处理：将血液标本置于黄头促凝管，用2500g在4℃下离心30分钟去除细胞，10000g离心20mi去除大囊泡，后将去掉沉淀，取上清于-80℃储存。
(2)血清gpc1+外泌体含量测定：采用具体实施方案6中操作对于血清标本中gpc1+外泌体进行定量检测。
(3)统计分析：用spss19.0(spssinc.chicago,usa)软件进行统计分析。
(4)临床标本测定结果：
如图7所示：血清gpc1+外泌体在胰腺癌、前列腺癌中相对于良性有明显的升高(p<0.01)；此外在良性疾病患者的血清中，gpc1+外泌体相对健康人无明显的升高。
如图8所示：gpc1+外泌体在胰腺癌、前列腺癌具有良好的特异性和敏感性。尤其在胰腺癌中，诊断特异性及敏感性均达到了100％。
在上述42例胰腺癌患者中选取16例，比较其术前及术后(术后5天)血清中gpc1+外泌体的水平。如图9所示，术后的胰腺癌患者血清gpc1+外泌体水平较术前有明显下降(p<0.05)，提示血清gpc1+外泌体与肿瘤负荷有关，可作为肿瘤复发的监测指标。
由上述实施例可知，本发明提供的超顺磁纳米微粒能够与外泌体的共有标记物特异性结合，从而实现对外泌体的快速、特异和高效捕获。本发明提供超顺磁纳米微粒的分离装置，在磁性分子筛和高强度外加磁场的共同作用下实现对结合有外泌体的超顺磁纳米微粒的快速有效分离。本发明提供的特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒，能够实现简便、快速、定量检测特异性外泌体；本发明提供的特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒可以直接用于血清、血浆、胸腹水、尿液、脑脊液标本中特异外泌体的标记物的检测，灵敏度高、稳定性好且检测时间短，操作简便，非常适用于临床检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。