一种天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜指纹图谱的构建方法及鉴别应用与流程

本发明属于蜂蜜区分检测领域，具体涉及一种天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜指纹图谱的构建方法及鉴别应用。

背景技术：

蜜源植物花蜜的挥发物是蜂蜜香味物质的重要来源，不同蜜源植物来源的蜂蜜或添加了不同物质的假蜂蜜常含有不同的挥发性成分(vilmaetal.,2008；任佳淼等，2016)。蜂蜜的挥发性成分色谱指纹图谱(chromatographicfingerprint)是指能够鉴别不同蜜源植物或不同地区来源蜂蜜样本间差异的色谱图谱(konstantinosaetal.,2010；jasicka-misiaketal.,2018)。这种色谱图谱多态性丰富，且具有高度的蜂蜜品种特异性和地区稳定性的特点。对于单花蜜而言，由于同种蜜源植物具有整体的遗传相似性，因此利用蜂蜜的挥发性成分色谱指纹图谱可进行准确鉴别(soaresetal.,2017)。如夏立娅等(2010)利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法建立了由14个共有峰组成的枣花蜂蜜挥发性成分指纹图谱。涂世等(2011)则采用超声波辅助萃取法，并结合气相-氢火焰化离子检测和气相色谱-质谱联用技术建立了油菜单花蜜的挥发性成分指纹图谱。

天然荔枝蜜，是我国南方地区生产的上等蜂蜜，为我国单花蜜中的特色品种，因其具有特殊的生津、益血和理气等功效而深受消费者的偏爱。然而，由于当前天然荔枝蜜标准化的质量控制指标的缺乏，导致市场上依然存在诸多劣质或掺假蜜；且同时由于国内市场上天然中华蜜蜂(apisceranacerana，中蜂)蜂蜜的价格是天然意大利蜜蜂(a.melliferaligustica，意蜂)蜂蜜的3-5倍，在利益驱使下，市场上亦常出现使用天然意蜂荔枝蜜掺入或冒充天然中蜂荔枝蜜的现象，给中蜂的养殖者及其相关蜂产品的加工企业带来了较大损失，也容易引发消费者的信任危机(胡福良等，2016)。目前，国内外尚无有关天然中意蜂荔枝蜜gc/ms指纹图谱的相关报道，对天然中意蜂荔枝蜜的区分主要停留在消费者或蜂农的人为主观区分，这些方法主要依靠经验、主观性大，无法对天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜进行科学鉴别。因此，生产上亟需一种科学的方法来区分鉴别这两种荔枝蜜，以在一定程度上遏制市场上以低价天然意蜂荔枝蜜冒充或掺入高价天然中蜂荔枝蜜的乱象。

技术实现要素：

本发明的目的是为了提供一种天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜指纹图谱的构建方法及鉴别应用。

本发明的第一个目的是提供一种天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：通过采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用的方法和中药指纹图谱相似度评价系统分别构建得到天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱；对指纹图谱中各色谱峰对应的质谱图进行多点校正和峰匹配分析，确定天然中蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱中含有19种共有特征挥发性成分，天然意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱中含有16种共有特征挥发性成分。

所述的天然中蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱中的19种共有特征挥发性成分为：庚醛、1-庚醇、5-乙烯基-5-甲基-2(3h)-二氢呋喃酮、顺式芳樟醇氧化物、反式芳樟醇氧化物、芳樟醇、脱氢芳樟醇、异佛尔酮、4-氧代异佛尔酮、紫丁香醛a、紫丁香醛c、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢呋喃-3-醇、正壬醇、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢-2h-呋喃-3-醇、2,6-二甲基-3,7-辛二烯)-2,6-二醇、4-亚甲基异佛尔酮、2-羟基-3,5,5-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮、乙酸苯乙酯、大马士酮；所述的天然意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱中的16种共有特征挥发性成分为：庚醛、5-乙烯基-5-甲基-2(3h)-二氢呋喃酮、顺式芳樟醇氧化物、反式芳樟醇氧化物、芳樟醇、脱氢芳樟醇、异佛尔酮、4-氧代异佛尔酮、紫丁香醛a、紫丁香醛c、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢呋喃-3-醇、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢-2h-呋喃-3-醇、2,6-二甲基-3,7-辛二烯)-2,6-二醇、4-亚甲基异佛尔酮、2-羟基-3,5,5-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮、大马士酮。

优选，所述的天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜指纹图谱的构建方法，具体步骤为：

(1)天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜中挥发性成分的萃取：将天然荔枝蜜样品装入顶空萃取瓶中，70℃保持10min后，利用固相微萃取于70℃条件下萃取50min；

(2)天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜中挥发性成分的分离检测：步骤(1)萃取结束后，迅速将固相微萃取头插入至气相色谱-质谱仪的进样口内解吸附5min进样，气相色谱条件为：色谱柱：hp-5ms色谱柱，进样口温度为250℃，不分流进样，载气为he；色谱柱的升温程序为：起始温度为50℃，保持3min；4℃/min升温至130℃，保持5min；10℃/min升温至250℃，保持3min；质谱条件为：接口温度280℃，离子源：ei源，离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃，电子倍增器电压：70ev，全扫描模式，扫描质量范围m/z35-450amu；分别获得天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜样品的挥发性成分总离子流色谱图；

(3)天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜挥发性成分指纹图谱的构建：将天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜样品的挥发性成分总离子流色谱图分别导入至中药指纹图谱相似度评价系统，经过峰匹配得到共有峰，从而分别构建得到天然中蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱和天然意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱；

(4)天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜挥发性成分中共有特征挥发性成分的确定：对步骤(3)中得到的天然中蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱和天然意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱，采用质谱库进行检索分析，从而明确天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜gc/ms指纹图谱中的共有特征挥发性成分。

本发明的第二个目的是提供一种基于指纹图谱技术区分天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜的方法，包括以下步骤：按照上述的天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜指纹图谱的构建方法构建待测天然荔枝蜜样品的挥发性成分总离子流色谱图，如果待测天然荔枝蜜样品的挥发性成分总离子流色谱图与天然中蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱的相似度大于0.900，并同时含有天然中蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱中的19种共有特征挥发性成分，则判定为天然中蜂荔枝蜜；如果待测天然荔枝蜜样品的挥发性成分总离子流色谱图与天然意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱的相似度大于0.900，并同时含有天然意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱中的16种共有特征挥发性成分，且不含有1-庚醇、正壬醇和乙酸苯乙酯这3种特征挥发性成分，则判定为天然意蜂荔枝蜜。

本发明的第三个目的是提供所述的基于指纹图谱技术区分天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜的方法在天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜的区分鉴别中的应用。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

①本发明提出了一种鉴别天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜的方法，根据两者在其挥发性成分gc/ms指纹图谱方面的差异来区分天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜。②本发明是通过指纹图谱技术，发现天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜在挥发性成分gc/ms指纹图谱上的差异，并确定其差异特征挥发性化合物的种类，以此来鉴别这两种不同蜂种来源的天然荔枝蜜，该方法检测灵敏度高，用量小，以特征挥发性成分为判定依据，可靠性高，唯一性强。③本发明十分有益于解决我国当前市场上存在天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜难以辨别这一问题，并在一定程度上遏制以低价天然意蜂荔枝蜜冒充或掺入高价天然中蜂荔枝蜜的乱象，具有非常明显的社会效益。

附图说明：

图1为天然中蜂荔枝蜜的挥发性成分总离子流色谱图(tic)的峰匹配结果；其中样品s1-s15分别为样品sz-01-sz-15；r为对照色谱图(即为天然中蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱)。

图2为天然意蜂荔枝蜜的挥发性成分总离子流色谱图(tic)的峰匹配结果；其中样品s1-s15分别为样品sy-01-sy-15；r为对照色谱图(即为天然意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱)。

图3为天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱；其中r1为天然中蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱；r2为天然意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱；1、庚醛；t1、1-庚醇；2、5-乙烯基-5-甲基-2(3h)-二氢呋喃酮；3、顺式芳樟醇氧化物；4、反式芳樟醇氧化物；5、芳樟醇；6、脱氢芳樟醇；7、异佛尔酮；8、4-氧代异佛尔酮；9、紫丁香醛a；10、紫丁香醛c；11、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢呋喃-3-醇；t2、正壬醇；12、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢-2h-呋喃-3-醇；13、2,6-二甲基-3,7-辛二烯)-2,6-二醇；14、4-亚甲基异佛尔酮；15、2-羟基-3,5,5-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮；t3、乙酸苯乙酯；16、大马士酮。

图4为实施例2中待测天然荔枝蜜样品a的挥发性成分总离子流色谱图，其中1、庚醛；t1、1-庚醇；2、5-乙烯基-5-甲基-2(3h)-二氢呋喃酮；3、顺式芳樟醇氧化物；4、反式芳樟醇氧化物；5、芳樟醇；6、脱氢芳樟醇；7、异佛尔酮；8、4-氧代异佛尔酮；9、紫丁香醛a；10、紫丁香醛c；11、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢呋喃-3-醇；t2、正壬醇；12、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢-2h-呋喃-3-醇；13、2,6-二甲基-3,7-辛二烯)-2,6-二醇；14、4-亚甲基异佛尔酮；15、2-羟基-3,5,5-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮；t3、乙酸苯乙酯；16、大马士酮。

图5为实施例3中待测天然荔枝蜜样品b的挥发性成分总离子流色谱图，其中1、庚醛；2、5-乙烯基-5-甲基-2(3h)-二氢呋喃酮；3、顺式芳樟醇氧化物；4、反式芳樟醇氧化物；5、芳樟醇；6、脱氢芳樟醇；7、异佛尔酮；8、4-氧代异佛尔酮；9、紫丁香醛a；10、紫丁香醛c；11、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢呋喃-3-醇；12、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢-2h-呋喃-3-醇；13、2,6-二甲基-3,7-辛二烯)-2,6-二醇；14、4-亚甲基异佛尔酮；15、2-羟基-3,5,5-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮；16、大马士酮。

具体实施方式：

本发明结合附图和实施例作进一步的说明，以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜gc/ms指纹图谱的构建

将20.00g天然荔枝蜜样品和磁力搅拌子装入100ml的顶空萃取瓶中，调整磁力搅拌子的转速为180rpm，充分混匀，70℃保持10min后，利用50/30μm的spme萃取头(dvb/car/pdms)于70℃条件下萃取50min；萃取结束后，取出spme萃取头，迅速插入agilent7890bgc/5977amsd气相色谱-质谱仪(gc-ms)的进样口内解吸附5min进样，gc条件：采用agilent公司的hp-5ms色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，进样口温度为250℃，不分流进样，载气为高纯he(>99.999％)；色谱柱的升温程序为：起始温度为50℃，保持3min；4℃/min升温至130℃，保持5min；10℃/min升温至250℃，保持3min。ms条件：溶剂延迟3min，接口温度280℃，离子源：ei源，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电子倍增器电压：70ev，全扫描模式，扫描质量范围m/z35-450amu；分别得到天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜的挥发性成分总离子流色谱图。分别将15个天然中蜂荔枝蜜样品(见表1的sz-01至sz-15)的挥发性成分总离子流色谱图导入至《中药指纹图谱相似度评价系统(2012版)》，采用多点校正法，经过峰匹配得到共有峰，从而构建得到天然中蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱(即生成的对照色谱图r，见图1)；分别将15个天然意蜂荔枝蜜样品(见表1的sy-01至sy-15)的挥发性成分总离子流色谱图导入至《中药指纹图谱相似度评价系统(2012版)》，采用多点校正法，经过峰匹配得到共有峰，从而构建得到天然意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱(即生成的对照色谱图r，见图2)。对建立的天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱，经质谱库检索和人工解析，得到天然中蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱中含有19种共有特征挥发性成分，而天然意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱中含有16种共有特征挥发性成分，并确定天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜gc/ms指纹图谱的差异特征挥发性成分为：1-庚醇、正壬醇和乙酸苯乙酯，这3种特征挥发性成分均仅在天然中蜂荔枝蜜的样品中被检出。

构建天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜gc/ms指纹图谱的天然荔枝蜜样品信息见表1。

表1构建天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜gc/ms指纹图谱的天然荔枝蜜样品信息

天然中蜂荔枝蜜的挥发性成分总离子流色谱图(tic)的峰匹配结果见图1，其中的对照色谱图r即为天然中蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱。

天然意蜂荔枝蜜的挥发性成分总离子流色谱图(tic)的峰匹配结果见图2，其中的对照色谱图r即为天然意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱。

天然中意蜂荔枝蜜的挥发性成分总离子流色谱图(tic)采用多点校正法，经过峰匹配得到共有峰，从而分别构建得到的天然中蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱和天然意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱结果见图3，其中r1为天然中蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱，r2为天然意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱。

天然中蜂荔枝蜜gc/ms指纹图谱中19个共有峰和天然意蜂荔枝蜜gc/ms指纹图谱中16个共有峰的化学组成及其相对含量(采用面积归一法进行确定)见表2。

表2天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜gc/ms指纹图谱中的共有色谱峰信息

注：*表示同行数据经t检验存在显著差异(p<0.05)，-表示不含有此化合物

从天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱的检索结果可以看出，这两种不同蜂种来源的天然荔枝蜜在其挥发性成分gc/ms指纹图谱组成上存在有明显的差异，可以根据其挥发性成分gc/ms指纹图谱的差异来鉴别两者。

实施例2：待测天然荔枝蜜样品a的鉴别

按照实施例1中天然中意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱的构建方法构建待测天然荔枝蜜样品a的挥发性成分总离子流色谱图(图4)，并将天然荔枝蜜样品a的挥发性成分总离子流色谱图导入至《中药指纹图谱相似度评价系统(2012版)》中，分别与天然中蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱或天然意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱进行峰匹配，并同时计算其与二者的相似度(表3)。从表3中可以看出该待测天然荔枝蜜样品a的挥发性成分总离子流色谱图与天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜gc/ms指纹图谱的相似度均大于0.900，但从图4中可以看出该待测天然荔枝蜜样品a的挥发性成分总离子流色谱图中不仅同时含有天然意蜂荔枝蜜gc/ms指纹图谱中的16种特征挥发性成分，而且还同时含有(t1)1-庚醇、(t2)正壬醇和(t3)乙酸苯乙酯这3种特征挥发性成分，因此判定该待测天然荔枝蜜样品a为天然中蜂荔枝蜜。判断结果与实际结果一致。

表3待测天然荔枝蜜样品a中与天然中蜂荔枝蜜和天然中蜂荔枝蜜gc/ms指纹图谱的相似度计算结果

实施例3：待测天然荔枝蜜样品b的鉴别

按照实施例1中天然中意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱的构建方法构建待测天然荔枝蜜样品b的挥发性成分总离子流色谱图(图5)，并将天然荔枝蜜样品b的挥发性成分总离子流色谱图导入至《中药指纹图谱相似度评价系统(2012版)》中，分别与天然中蜂荔枝蜜或天然意蜂荔枝蜜的gc/ms指纹图谱进行峰匹配，并同时计算其与二者的相似度(表4)。从表4中可以看出该待测天然荔枝蜜样品b的挥发性成分总离子流色谱图与天然中蜂荔枝蜜和天然意蜂荔枝蜜gc/ms指纹图谱的相似度均大于0.900，但从图5中可以看出该待测天然荔枝蜜样品b的挥发性成分总离子流色谱图中仅含有天然意蜂荔枝蜜gc/ms指纹图谱中的16种特征挥发性成分，且不含有(t1)1-庚醇、(t2)正壬醇和(t3)乙酸苯乙酯这3种特征挥发性成分，因此判定该待测天然荔枝蜜样品b为天然意蜂荔枝蜜。判断结果与实际结果一致。

表4待测天然荔枝蜜样品b中与天然中蜂荔枝蜜和天然中蜂荔枝蜜gc/ms指纹图谱的相似度计算结果

虽然上述实施例1，实施例2和实施例3已对本发明作出了详尽的描述，但本发明的保护范围并不局限于此，还可对本发明的方案作出其不偏离中心的修改，它们都属于本发明的保护范围。