外泌体蛋白CD82、GPC1联合CA19-9用于胰腺癌早期诊断及疗效监控的制作方法

文档序号:17638847发布日期:2019-05-11 00:32阅读:367来源:国知局
外泌体蛋白CD82、GPC1联合CA19-9用于胰腺癌早期诊断及疗效监控的制作方法
发明涉及医学生物检测
技术领域
,具体地说,是一种将Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)、Exo-GPC1+(外泌体GPC1蛋白表达量)和CA19-9、检测联合使用,用于胰腺癌早期诊断及疗效监控检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
:胰腺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,具有极高的致死率,其5年生存率仅为3%。近40年来,胰腺癌患者的存活率并没有提高。而我国胰腺癌发病率呈上升趋势,2015年发病人数约达9.01万人。由于胰腺癌缺乏特异性肿瘤标志物,仅依靠传统的影像学手段难以实现胰腺癌的早期诊断及大规模的人群筛查,直接导致80%的胰腺癌患者在确诊时已发生转移,其中仅有15%的患者能够进行手术治疗,且术后复发率极高。因此,适用于临床胰腺癌早期诊断及疗效监控检测方法亟待开发。目前,胰腺癌诊断主要依靠影像学检查,CA19-9并不能完全代表胰腺癌病情;Exo-GPC1+用于胰腺癌早期诊断也仅处于研究阶段。而早发现早治疗这对患者预后改善和临床治疗效果提高至关重要,胰腺癌早期诊断和疗效监控可及时为患者提供个体化治疗方案提供决策依据,对患者生存期有着直接影响。因此在胰腺癌诊断治疗中迫切需要一种能够早期检测胰腺癌或预后的检测技术。技术实现要素:本发明的目的在于有效进行胰腺癌早期诊断及疗效监控检测,提供一种特异性和敏感性都极好的胰腺癌早期诊断及疗效监控检测试剂盒及其检测方法。本发明的第一方面,提供了Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)联合CA19-9或其检测试剂,或Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)联合Exo-GPC1+(外泌体GPC1蛋白表达量)和CA19-9或其检测试剂的用途,用于制备胰腺癌诊断和/或疗效监控检测试剂盒。在另一优选例中,所述的诊断包括预先判断。在另一优选例中,所述的诊断为早期诊断。在另一优选例中,所述检测试剂盒的检测样本包括血液样本。在另一优选例中,所述血液样品选自下组:血液、血浆、血清或其组合。在另一优选例中,所述血液样品是经预处理的血液样品。在另一优选例中,所述血液样品是经离心后的血浆。在另一优选例中,所述预处理包括步骤:对全血进行分离,得到血浆样本。在另一优选例中,所述血浆样本由EDTA采血管或肝素钠采血管收集后离心分离。在另一优选例中,所述检测试剂盒的检测样本为外周血样本。在另一优选例中,所述检测试剂盒的检测样本为血清样本。在另一优选例中,所述检测试剂包括:检测CA19-9含量的试剂,检测Exo-GPC1+(外泌体GPC1蛋白表达量)的试剂,检测Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)的试剂。在另一优选例中,所述检测试剂包括:检测CA19-9含量的试剂,检测Exo-GPC1+(外泌体GPC1蛋白表达量)的试剂,检测Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)的试剂,BCA检测蛋白浓度试剂盒。在另一优选例中,所述的检测试剂盒通过检测胰腺疾病患者血清中CA19-9含量和外泌体CD82蛋白表达量,或通过检测胰腺疾病患者血清中CA19-9含量、外泌体GPC1蛋白表达量和外泌体CD82蛋白表达量,用于胰腺癌诊断和/或疗效监控检测。在另一优选例中,所述的检测试剂盒通过检测胰腺疾病患者血清中CA19-9含量、Exo-GPC1+(外泌体GPC1蛋白表达量)和Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量),用于胰腺癌诊断和/或疗效监控检测。在另一优选例中,所述的检测试剂盒通过检测胰腺疾病患者血清中CA19-9含量和Exo-CD82+,用于胰腺癌诊断和/或疗效监控检测。在另一优选例中,所述的检测试剂盒通过检测胰腺疾病患者血清中CA19-9含量和Exo-GPC1+,用于胰腺癌诊断和/或疗效监控检测。在另一优选例中,所述诊断为评估患者胰腺癌患病的风险,预测是否为胰腺癌。在另一优选例中,所述试剂盒是一种无创的液体活检检测试剂盒。在另一优选例中,所述的外泌体采用密度梯度离心法和超速离心法分离纯化。在另一优选例中,所述检测试剂选自下组:检测CA19-9含量的试剂、检测Exo-CD82+的试剂、检测Exo-GPC1+的试剂、或其组合。在另一优选例中,所述检测试剂选自下组:检测血清中CA19-9含量的试剂、检测Exo-GPC1+的试剂、检测Exo-CD82+的试剂、或其组合。在另一优选例中,所述的检测试剂为检测血清中CA19-9含量的试剂,和采用流式细胞术法检测Exo-CD82+及Exo-GPC1+的试剂组合。在另一优选例中,所述的试剂盒包含:(1)检测血清中CA19-9含量的试剂和检测Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)的试剂、或,(2)检测血清中CA19-9含量的试剂、检测外泌体CD82蛋白表达量的试剂、和检测外泌体GPC1蛋白表达量的试剂。在另一优选例中,所述的试剂盒包含检测血清中CA19-9含量的试剂和检测Exo-CD82+的试剂。在另一优选例中,所述的试剂盒包含检测血清中CA19-9含量的试剂,检测Exo-CD82+的试剂,和检测Exo-GPC1+的试剂。在另一优选例中,所述的试剂盒包含检测Exo-CD82+的试剂和检测Exo-GPC1+的试剂。在另一优选例中,所述的试剂盒包含检测血清中CA19-9含量的试剂,和采用流式细胞术法检测Exo-CD82+的试剂。在另一优选例中,所述的试剂盒包含检测血清中CA19-9含量的试剂,和采用流式细胞术法检测Exo-CD82+及Exo-GPC1+的试剂。在另一优选例中,所述的Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)采用特异性抗体间接标定,流式细胞术检测。在另一优选例中,所述的Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)、Exo-GPC1+(外泌体GPC1蛋白表达量)采用特异性抗体间接标定,流式细胞术检测。在另一优选例中,所述的Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)采用微球偶联外泌体后抗体标记特异性蛋白的流式细胞术法检测。在另一优选例中,所述的Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)及Exo-GPC1+(外泌体GPC1蛋白表达量)采用微球偶联外泌体后抗体标记特异性蛋白的流式细胞术法检测。在另一优选例中,所述的CA19-9在试剂盒中用作阳性对照。在另一优选例中,所述的Exo-CD82+在试剂盒中用作阳性对照。在另一优选例中,所述的Exo-GPC1+在试剂盒中用作阳性对照。本发明的第二方面,提供了一种胰腺癌诊断和/或疗效监控检测的试剂盒,所述试剂盒包括:(i)CA19-9检测系统,包括用于检测血清中CA19-9含量的试剂;(ii)任选地外泌体分离纯化系统,所述外泌体分离纯化系统包括用于外泌体分离纯化的试剂;(iii)Exo-CD82+检测系统,或Exo-CD82+和Exo-GPC1+检测系统,所述检测系统包括用于检测Exo-CD82+的试剂,或用于检测Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)和Exo-GPC1+(外泌体GPC1蛋白表达量)的试剂;(iv)标签或说明书,所述标签或说明书注明所述试剂盒用于胰腺癌诊断和/或疗效监控检测。在另一优选例中,所述检测Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)的试剂为采用流式细胞术检测Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)的试剂。在另一优选例中,所述检测Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)和Exo-GPC1+(外泌体GPC1蛋白表达量)的试剂为采用流式细胞术检测Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)和Exo-GPC1+(外泌体GPC1蛋白表达量)的试剂。在另一优选例中,所述的试剂盒包含检测血清中CA19-9含量的试剂,和采用流式细胞术检测外泌体GPC1蛋白表达量、外泌体CD82蛋白表达量的试剂。在另一优选例中,所述的标签或说明书中注明以下内容:检测对象外周血中CA19-9含量为X3,Exo-GPC1+含量为X1,Exo-CD82+含量为X2,将X3、X1和X2数值代入式I所示的logistic回归方程:ln[p/(1-p)]=13.047*X1+4.344*X2+0.017*X3-5.797(I);计算样本P值,并与诊断点(P=0.2282)进行比较,P>0.2282,判读为胰腺癌阳性,P≤0.2282判读为阴性;CA19-9检测结果X3单位为U/mL,Exo-CD82+(X2)与Exo-GPC+(X1)的检测结果为小数,以%形式展现(例如某一样本检测结果:CA19-9含量:9.36U/mL,Exo-CD82+:9.95%,Exo-GPC+:3.62%,则X1=0.0362、X2=0.0995、X3=9.36代入式I得到P=-0.2192,P<0.2282,该样本判读为阴性)。在另一优选例中,所述的试剂盒包含检测血清中CA19-9含量的试剂,和采用流式细胞术检测外泌体CD82蛋白表达量的试剂。在另一优选例中,所述的标签或说明书中注明以下内容:检测对象外周血中CA19-9含量为X3,Exo-CD82+含量为X2,将X3和X2数值代入式Ⅱ所示的logistic回归方程:ln[p/(1-p)]=8.187*X2+0.021*X3-4.999(Ⅱ);计算样本P值,并与诊断点(P=0.5828)进行比较,P>0.5828,判读为胰腺癌阳性,P≤0.5828判读为阴性;CA19-9检测结果X3单位为U/mL,Exo-CD82+(X2)的检测结果为小数,以%形式展现。在另一优选例中,所述检测对象为胰腺疾病患者。在另一优选例中,所述检测对象为疑似胰腺疾病患者。在另一优选例中,所述的检测血清中CA19-9含量的试剂为采用UniCelDxI800自动微粒子发光Access免疫测定系统检测血清中CA19-9含量的试剂。在另一优选例中,所述的检测血清中CA19-9含量的试剂包括:a0)R1:AccessCA19-9试剂盒;b0)R1a:包被有生物素标记的羊抗CA19-9单克隆抗体磁性颗粒;c0)R1b:碱性磷酸酶标记的羊抗CA19-9单克隆抗体;d0)R2:中性洗涤液;e0)S1~S6:AccessCA19-9定标品包含S1,S2,S3,S4,S5,S6,其中含有的CA19-9浓度依次分别为0,30,90,300,900,2000U/ml。在另一优选例中,所述AccessCA19-9试剂盒购自贝克曼(Access®GIMonitor-2packsof50tests/packCat#387687)。在另一优选例中,所述用于外泌体分离纯化的试剂包括:a)密度梯度介-1(Densitygradientmedium-1);b)密度梯度介-2(Densitygradientmedium-2);c)密度梯度介-3(Densitygradientmedium-3);d)密度梯度介-4(Densitygradientmedium-4);e)任选地PBS缓冲液(PBSBuffer)。在另一优选例中,所述的采用流式细胞术检测外泌体GPC1蛋白表达量和外泌体CD82蛋白表达量的试剂包括:n)微球(优选invitrogen微球);o)BSA粉末(BullSerumAlbumin);p)甘氨酸(Glycine);q)GPC1抗体(GPC1antibody,Cat#PA5-28055);r)CD82抗体(CD82antibody,Cat#PA5-13228);s)兔抗荧光二抗(anti-rabbitantibodyFITC488nm,Cat#A-11078);t)任选地抗体稀释液(antibodyDiluent)。在另一优选例中,所述的采用流式细胞术检测外泌体CD82蛋白表达量的试剂包括:n)微球(优选invitrogen微球);o)BSA粉末(BullSerumAlbumin);p)甘氨酸(Glycine);r)CD82抗体(CD82antibody,Cat#PA5-13228);s)兔抗荧光二抗(anti-rabbitantibodyFITC488nm,Cat#A-11078);t)任选地抗体稀释液(antibodyDiluent)。在另一优选例中,所述的采用流式细胞术检测外泌体GPC1蛋白表达量的试剂包括:n)微球(优选invitrogen微球);o)BSA粉末(BullSerumAlbumin);p)甘氨酸(Glycine);q)GPC1抗体(GPC1antibody,Cat#PA5-28055);s)兔抗荧光二抗(anti-rabbitantibodyFITC488nm,Cat#A-11078);t)任选地抗体稀释液(antibodyDiluent)。在另一优选例中,所述试剂中,具体配比如下:CD82一抗溶液浓度0.3-1.8ul抗体原液(Cat#PA5-13228):20ul抗体稀释液;GPC1一抗溶液浓度0.8-2.0ul抗体原液(Cat#PA5-28055):20ul抗体稀释液;兔抗荧光二抗抗体使用浓度为6-9ug/ml;其中,抗体稀释液为含2%BSA的PBS溶液。在另一优选例中,所述的试剂盒包括:a)密度梯度介-1(Densitygradientmedium-1);b)密度梯度介-2(Densitygradientmedium-2);c)密度梯度介-3(Densitygradientmedium-3);d)密度梯度介-4(Densitygradientmedium-4);e)任选地PBS缓冲液(PBSBuffer);f)0.22μm过滤器(0.22μmfillter);g)任选地注射器;h)任选地超速离心管;i)任选地钢制针头(优选长细钢制针头);j)任选地无水乙醇;k)BSA标准浓度蛋白溶液;l)BCA工作液A液;m)BCA工作液B液;n)invitrogen微球(invitrogenbeads);o)BSA粉末(BullSerumAlbumin);p)甘氨酸(Glycine);q)任选的GPC1抗体(GPC1antibody);r)CD82抗体(CD82antibody);s)兔抗荧光二抗(anti-rabbitantibodyFITC488nm);t)任选地抗体稀释液(antibodyDiluent);u)任选地用于检测血清中CA19-9含量的试剂。本发明的第三方面,提供了一种胰腺癌诊断和/或疗效监控的方法,包括步骤:(1)提供一样品,所述样品包括来人体外周血的血液样品;(2)检测血清中CA19-9含量,单位为U/mL;(3)检测Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量),或检测Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)和Exo-GPC1+(外泌体GPC1蛋白表达量);(4)根据二指标联合检测的Logistic回归方程,将CA19-9含量、Exo-CD82+数值(X3、X2)代入式Ⅱ所示的方程,计算P值;ln[p/(1-p)]=8.187*X2+0.021*X3-4.999(Ⅱ);P>0.5828,判读为胰腺癌阳性或预后不良,P≤0.5828判读为阴性或预后良好;或根据三指标联合检测的Logistic回归方程,将CA19-9含量、Exo-CD82+及Exo-GPC1+数值(X3、X2、X1)代入式I所示的方程,计算P值;ln[p/(1-p)]=13.047*X1+4.344*X2+0.017*X3-5.797(I);P>0.2282判断为胰腺癌阳性或预后不良,P≤0.2282判断为胰腺癌阴性或预后良好。在另一优选例中,所述的诊断为早期诊断。在另一优选例中,所述方法采用UniCelDxI800自动微粒子发光Access免疫测定系统检测血清中CA19-9含量。在另一优选例中,所述方法采用流式细胞术检测Exo-GPC1+(外泌体GPC1蛋白表达量)和Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)。在另一优选例中,所述采用流式细胞术检测Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)包括下列步骤:(3a1)对外泌体进行分离纯化;(3b1)采用微球偶联外泌体并对外泌体进行免疫荧光标记的方法进行信号扩增;(3c1)对已进行免疫荧光标记的外泌体采用流式细胞术方法对Exo-CD82+荧光强度进行检测;(3d1)分析Exo-CD82+数值。在另一优选例中,所述采用流式细胞术检测Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)和Exo-GPC1+(外泌体GPC1蛋白表达量)包括下列步骤:(3a2)对外泌体进行分离纯化;(3b2)采用微球偶联外泌体并对外泌体进行免疫荧光标记的方法进行信号扩增;(3c2)对已进行免疫荧光标记的外泌体采用流式细胞术方法对Exo-CD82+、Exo-GPC1+荧光强度进行检测;(3d2)分析Exo-CD82+、Exo-GPC1+数值。在另一优选例中,所述步骤(3a1)、(3a2)中的分离纯化为运用密度梯度离心结合超速离心的方法进行外泌体分离纯化。在另一优选例中,所述方法使用如本发明的第二方面所述的试剂盒。应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。附图说明图1.实施例样本流式检测Exo-CD82+,Exo-GPC1+结果分析图。图2.健康人与胰腺癌患者外周血CA9-9含量、Exo-GPC1和Exo-CD82进行的ROC结果分析。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究,通过检测胰腺癌患者组外周血和健康组外周血中的CA19-9的含量和Exo-GPC1+和Exo-CD82+水平,首次意外地发现,胰腺癌患者外泌体中CD82蛋白表达量高于健康人,与组织中表达量呈相反的趋势。进一步地,发明人发现,Exo-CD82+、Exo-GPC1+和CA19-9联合检测显著提升了胰腺癌早期诊断检测的灵敏度和特异性。具体而言,本发明中单独采用CA19-9区分胰腺癌患者与健康人时AUC=0.724;Exo-CD82+单独使用时AUC=0.852;Exo-GPC1+单独使用时AUC=0.885;三者联合使用AUC=0.942,见图2。本发明在胰腺癌早期诊断方面具有明显优势,为胰腺癌早期诊断检测及疗效监控提供了一种强大的非侵入性方法。目前Exo-CD82+、Exo-GPC1+和CA19-9联合检测用于胰腺癌早期诊断及疗效监控的检测方法尚未有相关文献报道和临床应用。本发明通过检测CA19-9含量、Exo-GPC1+和Exo-CD82+,用于胰腺癌早期诊断检测,为胰腺癌辅助诊断提供了新的手段,以便实现临床胰腺癌早发现,及时进行治疗,防止病情进展,延长患者生存期,改善患者预后。在此基础上完成了本发明。术语如本文所用,术语“任选”、“任选的”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如,“任选地外泌体分离纯化系统”是指“外泌体分离纯化系统”可以有但不是必须有,可以是任意能够能用于外泌体分离纯化的系统。CA19-9作为一种肿瘤标记物,已被广泛应用于胰腺癌的检测。大部分胰腺癌患者血清中CA19-9水平明显高于正常人,尤其是胰腺癌晚期病人阳性率可达75%,是重要的辅助诊断指标。然而,早期胰腺癌患者中CA19-9含量并未显著升高。肝胆系癌、胃癌、结直肠癌患者及胰腺良性疾病患者的CA19-9水平也会升高。故而,CA19-9指标不能单独用于胰腺癌早期诊断。Exo-CD82+、Exo-GPC1+在本发明中,“Exo-CD82+”与“外泌体CD82蛋白表达量/含量”二者含义等同,可互换使用。在本发明中,“Exo-GPC1+”与“外泌体GPC1蛋白表达量/含量”二者含义等同,可互换使用。外泌体作为新兴的液体活检生物标志物备受关注。肿瘤来源的外泌体上含有肿瘤细胞特异性标志物,对肿瘤细胞相关信息具有富集作用,在肿瘤检测中具有重要意义。据报道,Exo-GPC1+(外泌体GPC1蛋白表达量)可用于区分慢性胰腺炎与胰腺癌患者,具有极高的特异性和敏感性。Exo-GPC1+在健康人与慢性胰腺炎患者中表达量极低,在胰腺癌患者中高表达,提示Exo-GPC1+或可以作为胰腺癌诊断指标之一。专利CN106950374A中采用纳米等离子体增强散射法检测GPC1蛋白阳性外泌体浓度用于胰腺癌诊断,其结果显示该方法对胰腺癌晚期有较好的诊断效果,但对胰腺癌早期诊断效果较差。CD82蛋白是TM4SF跨膜蛋白家族成员之一,主要参与细胞增生的调剂、肿瘤细胞的转移调控,对癌的发生转移有抑制作用,在多种癌组织中低(癌组织中低表达,但尚未有研究报道外泌体中CD82蛋白表达量与癌症的相关性)表达,有望作为癌症诊断和预后的分子标记物。本发明中胰腺癌患者外泌体中CD82蛋白表达量高于健康人,与组织中表达量呈相反趋势,其原因仍在进一步探究中。尽管如此,Exo-CD82+用于胰腺癌早期诊断及疗效监控尚未有相关研究。ROC曲线如本文所用,术语“ROC曲线”为受试者工作特征曲线,是以假阳性概率(1-特异性)为横轴,真阳性概率(敏感度)为纵轴所组成的坐标图,和受试者在特定刺激条件下由于采用不同的判断标准得出的不同结果画出的曲线。选择最佳的诊断界限值。ROC曲线越靠近左上角,试验的准确性就越高。最靠近左上角的ROC曲线的点是错误最少的最好阈值,其假阳性和假阴性的总数最少。两种或两种以上不同诊断试验对疾病识别能力的比较。在对同一种疾病的两种或两种以上诊断方法进行比较时,可将各试验的ROC曲线绘制到同一坐标中,以直观地鉴别优劣,靠近左上角的ROC曲线所代表的受试者工作最准确。亦可通过分别计算各个试验的ROC曲线下的面积(AUC)进行比较,哪一种试验的AUC最大,则哪一种试验的诊断价值最佳。胰腺癌诊断和/或疗效监控的方法本发明提供一种胰腺癌诊断和/或疗效监控的方法,包括步骤:(1)提供一样品,所述样品包括来人体外周血的血液样品;(2)检测血清中CA19-9含量,单位为U/mL;(3)检测Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量),或检测Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)和Exo-GPC1+(外泌体GPC1蛋白表达量);(4)根据二指标联合检测的Logistic回归方程,将CA19-9含量、Exo-CD82+数值(X3、X2)代入式Ⅱ所示的方程,计算P值;ln[p/(1-p)]=8.187*X2+0.021*X3-4.999(Ⅱ);P>0.5828,判读为胰腺癌阳性或预后不良,P≤0.5828判读为阴性或预后良好;或根据三指标联合检测的Logistic回归方程,将CA19-9含量、Exo-CD82+及Exo-GPC1+数值(X3、X2、X1)代入式I所示的方程,计算P值;ln[p/(1-p)]=13.047*X1+4.344*X2+0.017*X3-5.797(I);P>0.2282判断为胰腺癌阳性或预后不良,P≤0.2282判断为胰腺癌阴性或预后良好。一个典型的本发明方法包括:本发明对健康人、胰腺癌患者进行检查,并采集外周血。利用UniCelDxI800自动微粒子发光Access免疫测定系统对分离得到的血清进行CA19-9检测。采用密度梯度离心和超速离心的方法分离纯化血浆外泌体,微球偶联分离纯化后的外泌体,用间接免疫荧光法对外泌体GPC1蛋白、外泌体CD82蛋白进行标记,利用流式细胞术法测定Exo-GPC1+(外泌体GPC1蛋白表达量)及Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)。本发明通过检测26例健康人、24例胰腺癌治疗前患者血清中CA19-9含量、Exo-GPC1+(外泌体GPC1蛋白表达量)和Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量),通过logistic回归及ROC曲线分析发现,CA19-9、Exo-CD82+和Exo-GPC1+联合诊断胰腺癌效果显著AUC联合诊断=0.942,P<0.01。效果好于CA19-9单独诊断,AUCCA19-9=0.7340,P<0.01;Exo-CD82+和Exo-GPC1+单独诊断效果(AUCCD82=0.8518,P<0.01;AUCGPC1=0.8846,P<0.01)也优于CA19-9单独诊断。CA19-9、Exo-CD82+、Exo-GPC1+联合检测其敏感度为95.8%,特异性为65.38%,极大程度的提高了胰腺癌患者的检出率。本发明首次发现Exo-CD82+、Exo-GPC1+和CA19-9联合诊断对胰腺癌早期诊断的预测作用。胰腺癌诊断和/或疗效监控检测的试剂盒本发明还提供了一种胰腺癌诊断和/或疗效监控检测的试剂盒。通常,本发明试剂盒包括:(i)CA19-9检测系统,包括用于检测血清中CA19-9含量的试剂;(ii)任选地外泌体分离纯化系统,所述外泌体分离纯化系统包括用于外泌体分离纯化的试剂;(iii)Exo-CD82+检测系统,或Exo-CD82+和Exo-GPC1+检测系统,所述检测系统包括用于检测Exo-CD82+的试剂,或用于检测Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量)和Exo-GPC1+(外泌体GPC1蛋白表达量)的试剂;(iv)标签或说明书,所述标签或说明书注明所述试剂盒用于胰腺癌诊断和/或疗效监控检测。本发明的主要优点包括:(1)本发明方法显著提升了胰腺癌早期诊断检测的灵敏度和特异性;(2)本发明首次将新型外泌体蛋白标志物用于胰腺癌早期诊断及预后监控。(3)本发明对流式检测数据进行极值点去除处理,使流式检测数据分析更加客观规范。同时能批量处理数据,适合临床推广。下面结合具体实施例,进一步详陈本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法,通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译,北京:科学出版社,2002年)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件(例如商品说明书)。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得或可按文献方法制备。实施例1:制备本发明的试剂盒本发明的试剂盒组成如下:A)CA19-9检测包含试剂1)R1:AccessCA19-9试剂盒(AccessCA19-9试剂盒购自贝克曼(Access®GIMonitor-2packsof50tests/packCat#387687)):50个测试/盒;2)R1a:包被有生物素标记的羊抗CA19-9单克隆抗体磁性颗粒;3)R1b:碱性磷酸酶标记的羊抗CA19-9单克隆抗体;4)R2:中性洗涤液。5)S1~S6:AccessCA19-9定标品包含S1,S2,S3,S4,S5,S6:,其中含有的CA19-9浓度依次分别为0,30,90,300,900,2000U/ml。B)外泌体中GPC1、CD82蛋白表达量检测试剂:1)外泌体分离:密度梯度介-1(Densitygradientmedium-1)6ml2)密度梯度介-2(Densitygradientmedium-2)6ml3)密度梯度介-3(Densitygradientmedium-3)6ml4)密度梯度介-4(Densitygradientmedium-4)6ml5)PBS缓冲液(PBSBuffer)100ml6)0.22μm过滤器(0.22μmfillter)5个7)超速离心管(5.9mL)5个8)长细钢制针头1支9)5ml注射器15支10)BSA标准浓度蛋白溶液(0,0.05,0.1,0.25,0.5,1.0mg/ml)11)BCA工作液A液50ml12)BCA工作液B液2ml13)偶联:invitrogen微球(invitrogenbeads)100μl14)BSA粉末(BullSerumAlbumin)2.0g15)甘氨酸(Glycine)1g16)GPC1抗体(GPC1antibody)8μL17)CD82抗体(CD82antibody)5μL18)兔抗荧光二抗(anti-rabbitantibodyFITC488nm)2μL19)抗体稀释液(antibodyDiluent)1ml。实施例2:实施例1的试剂盒的检测方法1、采集血液样本及样本准备:由于外周血具有取材方便、无创伤性、连续检测的优点,利用外周血检测胰腺癌诊断生物标志物可以及早发现胰腺癌的发生,将临床胰腺癌早期诊断提高到了一个新的水平。血液样本在山西大同同煤医院、河北省人民医院、上海市第六人民医院收集:24例健康志愿者、26例胰腺癌患者。样品收集:收集约3~6ml病人的外周血放入真空促凝管中,颠倒数次以便充分结合,静置约半小时,1600g离心10min,上清转移到新管。上清二次进行12000g离心10min,取上清,加入新离心管中得到血清。收集2-8ml外周血放于专用的EDTA抗凝管(管盖为紫色)内,轻轻颠倒8次,防止凝块,得到无凝块、无溶血的全血,2h内3000g离心5分钟,上清转移到新管。、血清样本中CA19-9含量检测:采用UniCelDxI800自动微粒子发光Access免疫测定系统检测血清中CA19-9含量,具体步骤为:1)从主菜单进入测试要求屏幕。2)对每个样品,设置一个样品架上的位置,输入样品信息和需检测的测试名称。3)将样品管(杯)放入样品架中已设定的位置。4)按下运行键(Run)开始检测。5)仪器会提醒操作者运行所需的定标。6)系统会自动计算检测结果。、血浆外泌体中GPC1、CD82蛋白表达量检测:采用密度梯度离心和超速离心的方法进行外泌体分离纯化,利用微球偶联外泌体的方法增加检测颗粒的体积便于流式细胞术检测的应用。用GPC1抗体(GPC1-antibody)、CD82抗体(CD82-antibody)特异性捕获偶联后外泌体表面GPC1蛋白和CD82蛋白;最后用兔抗荧光二抗(anti-rabbitantibodyFITC488nm)对GPC1和CD82一抗进行抗体染色。采用流式细胞术检测外泌体表面GPC1和CD82蛋白荧光值。检测结果经极值去除率分析软件处理后对样本阳性率进行分析即可得到Exo-GPC1、Exo-CD82蛋白的表达量。检测结果代入logistic回归方程得到样本P值,与Cutoff值进行比较,P>cutoff值判断为胰腺癌,P≤cutoff值判断为健康。具体步骤包括:(1)血浆差速离心:血浆样本于4°C条件下,10000g离心30min;用移液器将上层血浆转移到新离心管A中,另准备一个新的离心管B,将A管中血浆经0.22μm过滤器滤入B管。(2)密度梯度介质制备:超速离心管C标记样本编号,用长细钢针头替换1ml注射器自带针头,将1ml密度梯度介质1缓慢注入离心管底;将1ml密度梯度介质2从离心管底缓慢注入,托起介质1;将1ml密度梯度介质3从离心管底缓慢注入,托起介质2和1;将1ml密度梯度介质4从离心管底缓慢注入,托起介质3、2和1。(3)血浆样本加样:用5ml注射器将B管中的血浆缓慢加入超速离心管中,若样本量不足,用PBS补充剩余体积,将超速离心管体积充满。采用热塑封仪进行离心管封口。注:加样时避免流速过快使样本冲散密度梯度介质分层。(4)分离纯化:根据采用的超速离心机转子设定转子参数,采用150,000g在4°C条件下离心10-20h。离心结束后弃上清,用2mlPBS悬浮沉淀,将外泌体悬液用5mL注射器转移至新的超速离心管(D)中,2mlPBS洗涤超速离心管C,洗涤液一并转移入D管中,剩余体积用PBS充满,热塑封仪进行封口。150,000g在4°C条件下离心2-4h,离心结束后弃上清,根据沉淀量加入适量PBS悬浮(100-700μL),并转移到新的1.5ml离心管(E)中。(5)外泌体溶液浓度测定:根据BCAkit说明书配制蛋白浓度梯度标准液(0,0.05,0.1,0.25,0.5,1.0mg/ml)。根据A液:B液=1ml:20μL的比例配置染色液(现用现配,避光存放)。将20μL蛋白标准液介入到酶标板中(A1-A6),添加平行样(B1-B6),20μL外泌体溶液加入到酶标板中(A7),添加平行样(B7)。每孔加入200μL染色液。37°C恒温箱内避光孵育30min,使用酶标仪读取562nm下的吸光度。根据蛋白标准液计算标准曲线方程,将样本管OD值代入标准曲线方程,计算出外泌体样本蛋白浓度值及30μg外泌体溶液的体积。(6)微球偶联外泌体:a)试剂配制:反应终止液:含100mMGly,2%BSA的PBS溶液;2ml洗涤液:含2%BSA的PBS溶液;1ml封闭液:含10%BSA的PBS溶液;0.8mlb)操作步骤:取2个1.5ml离心管标记为0号管,1号管;invitrogen微球(beads)超声5s,涡旋混匀。0号管,1号管各添加10μlbeads,0号管加入90μlPBS,使得终体积为100μl;1号管加入30μg外泌体溶液,添加PBS至总体积为100μl。室温旋转混匀15min;用PBS将上述溶液稀释至400μl,涡旋混匀,室温旋转孵育30min;14,800g离心5min,取出上清保留做BCA检测(参考BCA检测试剂盒);沉淀用1mL反应终止液悬浮,涡旋混匀,室温旋转孵育30min;用400μL含2%BSA的PBS溶液洗微球1次(14800g,5min);用400μL含10%BSA的PBS封闭液悬浮微球沉淀,混匀,室温旋转孵育30min;14800g离心5min,弃上清;用400μL含2%BSA的PBS溶液洗微球1次(14800g,5min);沉淀用100μL2%BSA的PBS溶液悬浮4℃保存或直接进行后续实验。c)外泌体偶联量分析:根据标准品的蛋白浓度及OD绘制标准曲线,列出标准曲线方程及R2值;标准曲线方程y=ax+b;根据标准曲线方程计算微球上外泌体偶联量(见表1)。表1微球上外泌体偶联量检测结果示例:样品OD偶联后上清浓度(mg/mL)偶联上量(ug)偶联效率原液添加量(ug)0号管0.09321号管0.12850.026917.5261.99%28.27偶联后上清浓度=(样本OD-背景管OD)/a;即偶联后上清浓度=(1号管OD-0号管OD)/a偶联上量=原液添加量-偶联后上清浓度*400(偶联时反应体系为400uL)偶联效率=偶联上量/原液添加量;偶联效率≥40%,即偶联成功可进行后续实验;若偶联效率过低,建议重新进行偶联。(7)外泌体表面GPC1、CD82蛋白检测(以1个样本为例):a)试剂配制:洗涤液:100mgBSA+5mLPBSGPC1一抗溶液:1.5μlGPC1一抗原液(Cat#PA5-28055)+20μl洗涤液;CD82一抗溶液:1μlCD82一抗原液(Cat#PA5-13228)+20μl洗涤液;按每管2μl损耗计算;二抗溶液:取兔抗荧光二抗(anti-RabbitantibodyFITC488nm)(原液稀释至100μg/mL)30μl+300μl洗涤液,充分混匀,避光保存;b)操作步骤:取3个1.5ml离心管,标记为0,GPC1,CD82;将偶联后的样本(每管约100μl),稀释至500μl,混匀;各管相应添加50μl偶联后微球,14800g离心5min;0号管添加20μl洗涤液;GPC1组各管添加20μlGPC1一抗溶液,CD82管添加20uLCD82一抗溶液;瞬离15s,转速达14800g;然后充分涡旋混匀,37℃恒温箱中静置孵育30min,每10min混匀一次;14800g离心5min弃上清;洗涤液洗1次;各管加入20μl二抗溶液,瞬离15s,转速达14800g;充分混匀,37℃恒温箱中静置避光孵育30min,每10min混匀1次;14800g离心5min弃上清,洗涤液洗1次,PBS洗1次。用100μlPBS悬浮沉淀,涡旋混匀,流式细胞仪进行检测(参考BD流式细胞仪使用方法)。c)流式检测结果分析:对Exo-CD82+、Exo-GPC1+的阳性率进行分析。通过流式分析软件获取Exo-GPC1、Exo-CD82的阳性率,在Excel中对流式结果进行整理分析,流式检测结果直方图拷贝(如图1所示)。收集26例健康人与24例胰腺癌患者外周血,用上述方法检测血清中CA19-9含量和Exo-GPC1、Exo-CD82表达量。实施例3:对健康人和胰腺癌患者外周血CA19-9含量、Exo-CD82+和Exo-GPC1+表达量进行logistic回归分析及ROC曲线分析本发明检测了26例健康人与24例胰腺癌患者血清中CA19-9含量和Exo-GPC1+、Exo-CD82+表达量,通过logistic回归及ROC曲线分析发现,CA19-9、Exo-GPC1+和Exo-CD82+联合诊断胰腺癌效果最为显著AUC联合诊断=0.942,P<0.01。三指标联合检测预测效果优于任意两指标Exo-CD82联合Exo-GPC1(AUC=0.8892)、Exo-CD82联合CA19-9(AUC=0.9212)、Exo-GPC1联合CA19-9(AUC=0.9267)检测效果。三指标联合检测预测效果优于单独指标Exo-CD82(AUC=0.8518)、Exo-GPC1(AUC=0.8846)、CA19-9(AUC=0.7340)。CA199单独诊断,AUCCA19-9=0.7340,P<0.01;Exo-GPC1、Exo-CD82表达量单独诊断效果(AUCGPC1=0.8846,P<0.01;AUCCD82=0.8518,P<0.01)也优于CA19-9单独诊断(表2)。表2健康人与胰腺癌患者外周血CA19-9、Exo-CD82+和Exo-GPC1+联合诊断的ROC分析实施例4:Exo-CD82+、Exo-GPC1+和CA19-9表达量联合检测方法用于胰腺癌早期诊断检测的验证本发明对入组的26例健康人、24例胰腺癌患者联合诊断的诊断点进行验证,及将CA19-9含量(X3)、Exo-GPC1+(X1)和Exo-CD82+(X2)数值代入logistic回归方程,计算样本P值。CA19-9、Exo-CD82+和Exo-GPC1+联合检测方法的ROC分析测定表明:根据“尤登指数”即敏感性-(1-特异性),该指数值取最大值处就是最佳的界值,可得到“尤登指数”最大值为R=0.95,即CA19-9、Exo-GPC1+、Exo-CD82+联合检测敏感度为95%;在此条件下,健康人与胰腺癌患者的最佳界值为P=0.2282,即所述样本P值与诊断点(P=0.2282)进行比较,P>0.2282,判读为胰腺癌阳性,P≤0.2282判读为阴性。本诊断方法验证结果假阴性率仅为4.17%,假阳性率为34.62%(统计结果见表3和表4)。极低的假阴性率可以确保本诊断方法在辅助临床胰腺癌早期诊断时的灵敏度,极大程度提高了胰腺癌患者的检出率,降低临床胰腺癌漏诊率,为患者及时接受正确的治疗方案提供帮助,延长患者生存期及预后。本发明首次发现CA19-9、Exo-CD82、Exo-GPC1联合诊断对胰腺癌早期诊断的预测作用。表3Exo-CD82+、Exo-GPC1+和CA19-9联合检测方法判断结果与临床诊断结果比较表4Exo-CD82+、Exo-GPC1+和CA19-9联合检测用于胰腺癌早期诊断验证另外,本发明对入组的26例健康人、24例胰腺癌患者,采用Exo-CD82+和CA19-9联合进行检测,将CA19-9含量(X3)和Exo-CD82+(X2)数值代入表6的logistic回归方程,计算样本P值。CA19-9和Exo-CD82+联合检测方法的ROC分析测定表明:根据“尤登指数”即敏感性-(1-特异性),该指数值取最大值处就是就是最佳的界值,可得到“尤登指数”最大值为R=0.762,即CA19-9、Exo-CD82+联合检测敏感度为76.2%;在此条件下,健康人与胰腺癌患者的最佳界值为P=0.5828,即所述样本P值与诊断点(P=0.5828)进行比较,P>0.5828,判读为胰腺癌阳性,P≤0.5828判读为阴性。本诊断方法验证结果假阴性率仅为20.83%,假阳性率为0%(统计结果见表5和表6)。结果表明,这两指标的联合用于临床诊断也能够取得良好的效果,结果见表5和表6。表5Exo-CD82+和CA19-9联合检测方法判断结果与临床诊断结果比较表6Exo-CD82+和CA19-9联合检测用于胰腺癌早期诊断验证在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页1 2 3 
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