基于分散液液微萃取技术的测定大米中荧光增白剂的高效液相色谱串联质谱法的制作方法

本发明涉及大米中荧光增白剂的分析方法，具体涉及一种基于分散液液微萃取技术的测定大米中荧光增白剂的高效液相色谱串联质谱法。

(二)

背景技术：

食品安全一直是关乎民生的一项重大议题，随着国家对食品安全问题的越来越重视，百姓的饮食安全得到了更可靠的保障。但同时，食品安全事件仍不可避免地时有发生：2011年，北京多家影院爆米花桶被检出荧光增白剂超标；同年，肯德基全家桶纸容器被指含有荧光增白剂；2012年，国际食品包装协会发布报告称多款知名品牌所使用的纸质包装外层材料荧光物质超标；2018年陕西省食药监局检出部分批次香菇、鸡腿菇、杏鲍菇含有荧光增白剂；与此同时，市场上总有新闻报道出不法商家为了利益制造出“荧光”粉丝、猪肉、面条等。可以注意到这些食品安全问题都不约而同地指向了一类物质——荧光增白剂，其带来的潜在危害也越来越受到人们的关注，也对分析检测工作提出了新的要求。

荧光增白剂是一类可以吸收紫外线并发出蓝紫色荧光的增白剂，被广泛应用于纺织品、纸张、合成洗涤剂等生产领域，一旦与人体中的某些蛋白结合就很难通过正常的代谢排出体外，同时荧光增白剂会削弱人体抵抗力，并具有致癌性。目前，荧光增白剂的检测方法主要包括紫外分光光度法、荧光分光光度法、液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法等。现代分析工作中，样品前处理扮演着至关重要的角色，尤其对于复杂基质，科学的前处理方法不仅能减小基质效应、提高富集倍数，甚至可以极大地简化分析流程，直接影响到分析方法的优劣性。上述所提检测手段主要涉及光谱分析技术、色谱分析技术、质谱分析技术。光谱分析技术往往难以实现多目标定性定量，但操作简单、设备条件相对较低，在简单阳性鉴别和总量测定中有一定优势。色谱技术可实现目标物的分离，结合紫外检测器、荧光检测器等基本满足复杂基质中荧光增白剂的分析，但检测限相对质谱检测器较高。质谱选择性高、分析速度快、灵敏度高，结合高效液相色谱后可对荧光增白剂进行更准确、快速的分析。在前处理方法上，主要使用最为广泛的是超声辅助萃取，对于水溶性fwas，往往采用水浴或浸泡的方式提取。对于非水溶性fwas，往往采用大量有机溶剂如氯仿、dmf、丙酮、乙腈和甲醇等超声提取，最后通过氮吹换相，已备进一步仪器分析。在荧光增白剂的提取方法中还有固相萃取、微波辅助，固相萃取适用的目标物有限，通常为水溶性fwas，微波辅助也仅仅是类似超声辅助的促进传质的辅助方式，并不能改变整个前处理过程操作繁琐、有机试剂消耗较大等现状。新型前处理技术在荧光增白剂检测中的应用研究显得非常有意义，建立快速、简单、高效、绿色的荧光增白剂分析方法以应对广受关注的食品安全问题显得迫切重要。

(三)

技术实现要素：

针对现有技术中存在的不足，本发明旨在建立一种新型的基于分散液液微萃取技术的测定大米中荧光增白剂的高效液相色谱串联质谱法。该方法集净化与富集于一体，将样品基质、萃取溶剂、分散剂和水置于离心管内，通过振荡辅助加速提取过程，然后通过离心的方式分离微量有机相，快速氮吹并定容后即可进入高效液相色谱串联质谱仪进行分析。

本发明前处理方法所需设备简单，操作简便且操作时间短，可以适用于不同大米样品的前处理操作，同时具有批量样品同时进行操作的优点。

本发明的技术方案如下：

一种基于分散液液微萃取技术的测定大米中荧光增白剂的高效液相色谱串联质谱法，所述荧光增白剂为下列化合物中的至少一种：fwa162、fwa199、fwa135、fwa185、fwa393、fwa367、fwa368、fwa184；

所述方法包括如下步骤：

(1)样品前处理

将干燥大米样品粉碎(用粉碎机或研磨仪均匀至粉末状)，加入水、萃取剂、分散剂，摇匀(摇床匀速振荡15min)，离心(5000rpm，3min)，取上层有机相，氮吹至干，再用有机溶剂复溶，过0.22μm孔径的有机膜，得到样品溶液；

所述水的体积用量以大米样品的质量计为10ml/g；

所述萃取剂为甲苯或氯仿，所述萃取剂的体积用量以大米样品的质量计为300μl/g；

所述分散剂为甲醇或乙腈，所述分散剂的体积用量以大米样品的质量计为2ml/g；

所述有机溶剂为甲醇，所述有机溶剂的体积用量以大米样品的质量计为1ml/g；

(2)样品检测

将步骤(1)所得样品溶液注入高效液相色谱串联质谱系统进行分析，采取部分进样、梯度淋洗、多反应监测模式，通过一级质谱扫描获得母离子，通过二级质谱扫描选取2组目标物特征离子对进行定性定量，最终得到样品的高效液相色谱质谱总离子流图与选择离子流图；

高效液相色谱条件：色谱柱c18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)，梯度淋洗：a-体积分数0.1％甲酸水，b-甲醇，0.00～1.50min，60～80％b；1.50～3.00min，80～98％b；3.00～6.00min，98～98％b；6.00～6.50min，98～60％b；6.50～8.00min，60～60％b；

质谱条件为：perkinelmerqsight系列三重四级杆质谱装配esi电离源，采用正源模式；离子化电压5000v；离子源温度400℃；反吹干燥气100μl/min；雾化气180μl/min；入口电压、碰撞能量、特征离子对见下表，“*”为定量离子对；所用气体均为高纯氮(99.999％)；

荧光增白剂母离子及定性定量离子对(母离子/定性离子/定量离子*)如下：fwa162242.0/127.0/185.0*；fwa199333.0/217.0/116.0*；fwa135291.0/158.0/107.0*；fwa185318.6/199.9/226.2*；fwa393415.0/207.0/321.0*；fwa367363.0/244.0/270.0*；fwa368429.0/321.0/221.0*；fwa184431.0/399.0/415.0*；

(3)建立标准曲线

取fwa162、fwa199、fwa135、fwa185、fwa393、fwa367、fwa368、fwa184的标准物质，加入溶剂(氯仿、n,n-二甲基甲酰胺或水)，配制混合标准储备液，再用去离子水将所得混合标准储备液稀释至系列浓度并加入阴性大米样品粉末浸泡24h，以制备标准曲线工作基质；将所得标准曲线工作基质按照步骤(1)的前处理方法进行前处理之后，再于步骤(2)中的检测条件下进行分析，得到标准物质的高效液相色谱质谱总离子流图和选择离子流图，以选择离子流图中定量离子对峰面积为纵坐标，标准曲线工作基质中的标准物质浓度为横坐标，绘制标准曲线；

各标准物质在标准曲线工作基质中的浓度范围如下：

fwa1620.5～125μg/l；fwa1990.5～125μg/l；fwa1350.3～150μg/l；fwa1850.3～150μg/l；fwa3930.3～150μg/l；fwa3670.1～50μg/l；fwa3680.3～150μg/l；fwa1840.1～50μg/l；

各标准物质在高效液相色谱串联质谱总离子流图中特征峰如下：

fwa1621.97min；fwa1993.03min；fwa1353.59min；fwa1853.63min；fwa3934.36min；fwa3674.50min；fwa3684.64min；fwa1845.34min；

(4)获取样品中农药残留的定性和定量结果

通过样品中目标物定性离子对和标准物质定性离子对的对照，对样品中所含荧光增白剂进行定性；

将步骤(2)所得样品高效液相色谱串联质谱选择离子流图中的目标物定量离子对特征峰面积值代入步骤(3)所得标准曲线中，计算获得样品中荧光增白剂的含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明提供了提取大米中荧光增白剂残留的有效方法；

2、本发明将分散液液微萃取技术运用于大米基质中荧光增白剂的检测，简化了前处理过程，节省了处理时间；

3、采用微量低毒甲苯作为萃取剂，大大减少了有毒有害试剂的使用，减少对环境的污染。

(四)附图说明

图1为本发明建立的基于分散液液微萃取技术的测定大米中荧光增白剂的高效液相色谱串联质谱法过程示意图；

图2a、2b、2c、2d为实施例1中萃取剂类型、萃取剂体积、萃取方式、萃取时间的优化结果；

图3为实施例1中加标大米中各荧光增白剂定量离子对的选择离子流图，具体加标浓度如下：fwa16250μg/kg；fwa19950μg/kg；fwa13530μg/kg；fwa18530μg/kg；fwa39330μg/kg；fwa36710μg/kg；fwa36830μg/kg；fwa18410μg/kg；

图4为实施例1中阳性样品中8种荧光增白剂选择离子流图。

(五)具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：大米中荧光增白剂的检测

(1)样品前处理及检测

将大米样品于粉碎机或研磨仪均匀至粉末状，称取1.0g大米样品于50ml离心管，静置后依次加入10ml去离子水、2ml甲醇、300μl甲苯，匀速振荡15min后离心，提取有机液体(约150μl)，氮吹至干，1ml甲醇定容后过有机膜即完成前处理过程。

(2)样品检测

高效液相色谱条件：色谱柱c18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)。梯度淋洗：a-体积分数0.1％甲酸水，b-甲醇，0.00～1.50min，60～80％b；1.50～3.00min，80～98％b；3.00～6.00min，98～98％b；6.00～6.50min，98～60％b；6.50～8.00min，60～60％b；

质谱条件为：perkinelmerqsight系列三重四级杆质谱装配esi电离源，采用正源模式；离子化电压5000v；离子源温度400℃；反吹干燥气100μl/min；雾化气180μl/min；入口电压、碰撞能量、特征离子对见表1(“^a”为定量离子对)；所用气体均为高纯氮。

表1.化合物hplc-ms/ms参数优化结果

(3)建立标准曲线

取fwa162、fwa199、fwa135、fwa185、fwa393、fwa367、fwa368、fwa184的标准物质，加入溶剂(氯仿或n,n-二甲基甲酰胺)配制混合标准储备液，将所得混合标准储备液稀释至系列浓度加入阴性大米样品粉末浸泡24h以制备标准曲线工作基质，将所得标准曲线工作基质按照步骤(1)所述前处理方法进行前处理之后，再于步骤(2)中的检测方法下进行分析，得到标准物质的高效液相色谱质谱总离子流图和选择离子流图，以选择离子流图中定量离子对峰面积为纵坐标，标准曲线工作基质中的标准物质浓度为横坐标，绘制标准曲线，具体结果见表2。

表2.方法线性方程和定量参数

(4)获取样品中农药残留的定性和定量结果

通过样品中目标物定性离子对和标准物质定性离子对的对照，对样品中所含荧光增白剂进行定性；

将步骤(2)所得样品高效液相色谱串联质谱选择离子流图中的目标物定量离子对特征峰面积值代入步骤(3)所得标准曲线中，计算获得样品中荧光增白剂的含量。

(5)方法评估

在上述方法的各条件下对方法加标回收率、日间精密度、日内精密度进行了考察，以评价方法的准确性和重现性，结果显示各目标物的回收率在83-105％，日内精密度小于9.5％，日间精密度小于10.4％，表现出方法良好的准确性和重现性，具体结果见表3。

表3.方法准确性和重现性验证结果