姜黄素的高效液相检测方法与流程

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种姜黄素的高效液相检测方法。

背景技术：

姜黄素(itraconazole)最早是在1870年从姜黄中首次分离出来一种低相对分子质量多酚类化合物，1910年阐明了其双阿魏酰甲烷的化学结构，随后有关其生理，药理作用的研究取得了明显的进展。随着对姜黄素研究的日益深入，已发现其具有抗炎、抗氧化、调脂、抗病毒、抗感染、抗肿瘤、抗凝、抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化等广泛的药理活性，且毒性低、不良反应小。吸引研究人员的不仅是姜黄素作为一种非甾体类抗炎药物，而因为其所具有的化学预防特性，姜黄素对疾病具有广泛的预防特性。鉴于现代医学研究发现人体众多疾病的发生与自由基的形成、炎症反应的参与有关，姜黄素抗氧化活性与抗炎作用已引起国内外学者的广泛关注，开发姜黄素的高效液相检测方法对于姜黄素的药用研究具有重要的意义。

关于姜黄素的含量测定，现有技术已有报道：雷云霞，孙立立，杨树斌，王娇，中国药师.2007.10，其检测方法是：采用agilent1100series高效液相色谱仪，lichrospherodsc18(150mm*4.6mm,5μm)色谱柱，流动相为乙腈-水(5％冰醋酸)(45:55)，流速：1ml/min，进样量20ul，在420nm波长处检测；该方法主要是对郁金饮片中姜黄素的含量测定。发明人按该方法对姜黄素含量进行测试，发现预处理过程复杂，进样体积较大，化合物损耗大，且检测需要15min以上，耗时长。

本发明针对现有技术中的检测方法进行了改进与优化，与现有技术中的方法相比，本发明的检测方法不仅分离效果好，精密度和准确度高，而且操作安全简易，处理方便快捷，适合高通量筛选及精准定量。该方法对姜黄素的原料、制剂质量研究以及相关药动学定量研究等方面均具有重要研究价值。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，提供一种检测时间短、分离效果好、精确度和准确度更高的姜黄素的高效液相检测方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的姜黄素的高效液相检测方法，其中，

色谱柱采用反相c18色谱柱；

检测器采用pda检测器；

流动相包括流动相a和流动相b；流动相a是甲酸-醋酸铵的水溶液和乙腈的混合溶液，水溶液中甲酸体积浓度为0.01～0.03％，水溶液中醋酸铵浓度为0.5～1.5mm，水溶液与乙腈的体积比为100～95：0～5；流动相b是甲酸-醋酸铵的乙腈溶液和水的混合溶液，乙腈溶液中甲酸体积浓度为0.01～0.03％，乙腈溶液中醋酸铵浓度为0.5～1.5mm，乙腈溶液与水的体积比为100～95：0～5；

采用梯度洗脱，梯度洗脱程序按以下程序进行：流动相a+流动相b＝100％，0～0.01min，流动相b保持体积百分比为50％；0.01～2.10min，流动相b体积百分比由50％递增至60％；2.10～2.11min，流动相b体积百分数由60％递减至50％；2.11～3.00min，流动相b保持体积百分数为50％。

在一个优选的实施例中，流动相a是甲酸-醋酸铵的水溶液和乙腈的体积分数为95：5的混合溶液，流动相b是甲酸-醋酸铵的乙腈溶液和水的体积分数为95：5的混合溶液。

在一个优选的实施例中，流动相a中，水溶液中甲酸体积浓度为0.025％；流动相b中，乙腈溶液中甲酸体积浓度为0.025％。

在一个优选的实施例中，流动相a中，水溶液中醋酸铵浓度为1mm；流动相b中，乙腈溶液中醋酸铵浓度为1mm。

在一个优选的实施例中，色谱柱柱长为100mm。

在一个优选的实施例中，流速为1.0～2.0ml/min，更优选为1.4ml/min。

在一个优选的实施例中，检测波长为250-270nm，更优选为254nm。

在一个优选的实施例中，柱温控制在35～40℃，更优选为40℃。

在一个优选的实施例中，进样量为2～8μl，更优选为3～5μl。

本发明还提供一种测定姜黄素含量的高效液相方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液及供试品溶液的制备：精密称取适量姜黄素对照品，用甲基亚砜溶解并定容成具有一定浓度梯度的多个对照品溶液；精密称取适量姜黄素供试品，用甲基亚砜溶解并定容得到供试品溶液；

2)色谱条件：

色谱柱采用反相c18色谱柱；

检测器采用pda检测器；

流动相包括流动相a和流动相b；流动相a是甲酸-醋酸铵的水溶液和乙腈的混合溶液，水溶液中甲酸体积浓度为0.025％，水溶液中醋酸铵浓度为1mm，水溶液与乙腈的体积比为95：5；流动相b是甲酸-醋酸铵的乙腈溶液和水的混合溶液，乙腈溶液中甲酸体积浓度为0.025％，乙腈溶液中醋酸铵浓度为1mm，乙腈溶液与水的体积比为95：5；

采用梯度洗脱，梯度洗脱程序按以下程序进行：0～0.01min，流动相b保持体积百分比为50％；0.01～2.10min，流动相b体积百分比由50％递增至60％；2.10～2.11min，流动相b体积百分数由60％递减至50％；2.11～3.00min，流动相b保持体积百分数为50％。

(3)测定方法：

将所述多个对照品溶液以及供试品溶液按所述(2)色谱条件依次进样，记录色谱图，根据多个对照品溶液的图谱数据和浓度数据制备线性相关工作曲线，代入供试样品的图谱数据计算并得出供试品溶液浓度，完成了姜黄素含量的测定。

在一个优选的实施例中，对照品溶液的浓度依次为6.25、12.5、25、50、100、200μg/ml，流速为1.4ml/min。检测波长为254nm，柱温为40℃，进样量为3～5μl。

本发明提供的姜黄素的高效液相检测方法的技术优势在于：

1.本发明的方法能够有效检出姜黄素及其有关物质，并且分离度r能达1.5以上，分离效果好。

2.本发明的方法检测时间短，只需3min即可完成高效液相检测过程，大大提高了检测效率，适合高通量筛选。

3.本发明的方法测定hplc谱基线平稳，不发生漂移。

4.本发明的方法能节省溶剂，降低成本，操作安全简易，处理方便快捷。

5.本发明的方法用于姜黄素的含量测定，具有良好的线性关系，重现性高，实现了快速分离检测的目的，在原料药、制剂质量研究以及相关药动学定量研究等方面具有重要研究价值。

附图说明

图1为采用本发明的方法测定姜黄素供试品的hplc图谱一。

图2为采用本发明的方法测定姜黄素供试品的hplc图谱二。

图3为采用本发明的方法测定姜黄素供试品的hplc图谱三。

图4采用本发明的方法绘制的姜黄素工作曲线。

具体实施方式

本申请的发明人经过广泛的研究和大量的实验，摸索得到了一种姜黄素的高效液相检测方法，该方法提供了能够有效分离姜黄素及其有关物质的流动相体系及梯度洗脱程序，可以将现有技术中难以有效分离的姜黄素及其有关物质实现很好的分离效果，分离度r可达1.5以上。

发明人采用的姜黄素的高效液相检测方法，其色谱条件如下：

色谱柱采用反相c18色谱柱，比如以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的watersxbridge色谱柱；

检测器采用pda检测器；

流动相包括流动相a和流动相b；流动相a是甲酸-醋酸铵的水溶液/乙腈(100～95/0～5；v/v)的混合溶液，水溶液中甲酸体积浓度为0.01～0.03％，水溶液中醋酸铵浓度为0.5～1.5mm；流动相b是甲酸-醋酸铵的乙腈溶液/水(100～95/0～5；v/v)的混合溶液，乙腈溶液中甲酸体积浓度为0.01～0.03％，乙腈溶液中醋酸铵浓度为0.5～1.5mm；

采用梯度洗脱，流动相a+流动相b＝100％，梯度洗脱程序按以下程序进行：0～0.01min，流动相b保持体积百分比为50％；0.01～2.10min，流动相b体积百分比由50％递增至60％；2.10～2.11min，流动相b体积百分数由60％递减至50％；2.11～3.00min，流动相b保持体积百分数为50％。

本发明的一个优选的实施例中，流动相a是甲酸-醋酸铵的水溶液和乙腈的体积分数为95：5的混合溶液，流动相b是甲酸-醋酸铵的乙腈溶液和水的体积分数为95：5的混合溶液。

本发明的一个优选的实施例中，流动相a中，水溶液中甲酸体积浓度为0.025％；流动相b中，乙腈溶液中甲酸体积浓度为0.025％。

本发明的一个优选的实施例中，流动相a中，水溶液中醋酸铵浓度为1mm；流动相b中，乙腈溶液中醋酸铵浓度为1mm。

本发明的一个优选的实施例中，色谱柱柱长为100mm。

本发明的一个优选的实施例中，流速为1.0～2.0ml/min，更优选为1.4ml/min。

本发明的一个优选的实施例中，检测波长为250-270nm，更优选254nm。

本发明的一个优选的实施例中，柱温控制在35～40℃，更优选为40℃。

本发明的一个优选的实施例中，进样量为2～8μl，更优选为3～5μl。

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中的实验条件如下：

仪器：高效液相色谱仪(lc-20ab)；

色谱柱：watersxbridgec18色谱柱，柱长为100mm；

供试品溶液：精密称取姜黄素供试品10mg，置于10ml容量瓶，用二甲基亚砜溶解并定容，得到供试品溶液；

流速：1.4ml/min；

检测波长：254nm；

柱温：40℃；

流动相：流动相a+流动相b＝100％；

梯度洗脱：0～0.01min，流动相b保持体积百分比为50％；0.01～2.10min，流动相b体积百分比由50％递增至60％；2.10～2.11min，流动相b体积百分数由60％递减至50％；2.11～3.00min，流动相b保持体积百分数为50％。

实施例1

流动相a是甲酸—醋酸铵的水溶液/乙腈(95/5；v/v)的混合溶液，水溶液中甲酸体积浓度为0.025％，水溶液中醋酸铵浓度为1mm；流动相b是甲酸—醋酸铵的乙腈溶液/水(95/5；v/v)的混合溶液，乙腈溶液中甲酸体积浓度为0.025％，乙腈溶液中醋酸铵浓度为1mm。

此方法下经过三针进样，hplc图谱如图1-3示，基线平稳，重复性好，3min能够全部出峰，姜黄素保留时间为2.183～2.185min，理论塔板数为9738；工艺杂质保留时间为0.741-0.744min和1.208-1.209min。

实施例2

流动相a是甲酸—醋酸铵的水溶液/乙腈(95/5；v/v)的混合溶液，水溶液中甲酸体积浓度为0.01％，水溶液中醋酸铵浓度为0.5mm；流动相b是甲酸—醋酸铵的乙腈溶液/水(95/5；v/v)的混合溶液，乙腈溶液中甲酸体积浓度为0.01％，乙腈溶液中醋酸铵浓度为0.5mm。

此方法下基线平稳，姜黄素保留时间为2.01min左右，且分离度为11.466。

实施例3

流动相a是甲酸—醋酸铵的水溶液/乙腈(95/5；v/v)的混合溶液，水溶液中甲酸体积浓度为0.03％，水溶液中醋酸铵浓度为1.5mm；流动相b是甲酸—醋酸铵的乙腈溶液/水(95/5；v/v)的混合溶液，乙腈溶液中甲酸体积浓度为0.03％，乙腈溶液中醋酸铵浓度为1.5mm。

此方法下基线平稳，姜黄素保留时间为2.21min左右，且分离度为11.470。

实施例4

流动相a是甲酸-醋酸铵的水溶液，水溶液中甲酸体积浓度为0.025％，水溶液中醋酸铵浓度为1mm；流动相b是甲酸-醋酸铵的乙腈溶液，乙腈溶液中甲酸体积浓度为0.025％，乙腈溶液中醋酸铵浓度为1mm。

此方法下基线平稳，姜黄素保留时间为2.11min左右，且分离度为11.413。

实施例5

流动相a是甲酸-醋酸铵的水溶液，水溶液中甲酸体积浓度为0.025％，水溶液中醋酸铵浓度为1mm；流动相b是甲酸-醋酸铵的乙腈溶液，乙腈溶液中甲酸体积浓度为0.025％，乙腈溶液中醋酸铵浓度为1mm。

流动相：流动相a+流动相b＝100％；

梯度洗脱：0～0.01min，流动相b保持体积百分比为40％；0.01～2.10min，流动相b体积百分比由40％递增至50％；2.10～2.11min，流动相b体积百分数由50％递减至40％；2.11～3.00min，流动相b保持体积百分数为40％；

此方法下出现基线不平稳、出峰位置偏后，无法达到3min内快速出峰的效果。

实施例6姜黄素的含量测定

基于上述的检测方法，发明人还提供一种测定姜黄素含量的高效液相方法，按以下步骤进行：

(1)对照品溶液及供试品溶液的制备：精密称取适量姜黄素对照品，用二甲基亚砜溶解并定容得到1mg/ml的储备液，准确吸取50μl储备液，用注射用水依次稀释定容得到6.25、12.5、25、50、100、200ug/ml的对照品溶液；精密称取适量姜黄素供试品，用二甲基亚砜溶解并定容得到供试品溶液；

(2)色谱条件：

色谱柱采用反相c18色谱柱；

检测器采用pda检测器；

流动相包括流动相a和流动相b；流动相a是甲酸—醋酸铵的水溶液/乙腈(95/5；v/v)的混合溶液，水溶液中甲酸体积浓度为0.025％，水溶液中醋酸铵浓度为1mm；流动相b是甲酸—醋酸铵的乙腈溶液/水(95/5；v/v)的混合溶液，乙腈溶液中甲酸体积浓度为0.025％，乙腈溶液中醋酸铵浓度为1mm；

采用梯度洗脱，梯度洗脱程序按以下程序进行：0～0.01min，流动相b保持体积百分比为50％；0.01～2.10min，流动相b体积百分比由50％递增至60％；2.10～2.11min，流动相b体积百分数由60％递减至50％；2.11～3.00min，流动相b保持体积百分数为50％。

(3)测定方法：

将所述6个对照品溶液和供试品溶液按所述色谱条件依次进样，记录色谱图，根据6个对照品溶液的姜黄素峰面积和浓度数据制备线性相关工作曲线(如图4所示)，该工作曲线线性关系良好，r＝0.9999994，r²＝0.9999988；代入供试样品的姜黄素峰面积计算并得出供试品溶液浓度，比较测定的供试品溶液浓度和定容的供试品溶液浓度以及进样时的稀释倍数，计算得出姜黄素的含量。

本发明的姜黄素的高效液相检测方法，能够快速高效检出姜黄素及其有关物质，并且分离度r能达1.5以上，而现有技术中的检测方法难以实现姜黄素及其有关物质的有效分离；本发明的检测方法的hplc谱基线稳定，不发生漂移；本发明的方法检测时间短，只需3min即可完成高效液相检测过程，大大提高了检测效率，适合高通量筛选；本发明的方法能节省溶剂，降低成本，操作安全简易，处理方便快捷；本发明的方法用于姜黄素的含量测定，具有良好的线性关系，r＝0.9999994，r2＝0.9999988，重现性高，精确度和准确度高，在原料药、制剂质量研究以及相关药动学定量研究等方面具有重要研究价值。

综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。