一种外膜蛋白酶T酶解组蛋白并进行质谱分析的方法与流程

文档序号:17917796发布日期:2019-06-14 23:54

技术特征:

1.一种外膜蛋白酶T酶解组蛋白并进行质谱分析的方法,其特征在于,利用底物特异性识别的外膜蛋白酶T直接与组蛋白进行一步酶切,产生适合于质谱分析长度的肽段,经过除盐以后进入液相色谱-质谱分析,对发生修饰的肽段进行定性和定量分析;具体步骤为:

(1)核心组蛋白提取:基于组蛋白的碱性特性,提取细胞核后用盐酸裂解提取核心组蛋白;

(2)蛋白纯化:经步骤(1)酸提后的组蛋白样品进行超滤置换溶液,用水置换后换成酶解缓冲液,去除盐酸和其他杂质;使组蛋白处于酶解液环境;

(3)蛋白酶解:向经步骤(2)处理后的蛋白中加入外膜蛋白酶T,外膜蛋白酶T和组蛋白的质量比1:(20-50),充分混合,25-37摄氏度酶切12-16小时,使蛋白质完全酶解成氨基酸长度在6-20之间的肽段;

(4)质谱分析:对上一步得到的酶解产物酸化中止并高速离心,通过除盐柱富集上清中的肽段,冻干,然后进行质谱检测。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中所述提取核心组蛋白的操作过程为:对蛋白样品,首先用缓冲液提取细胞核;采用盐酸裂解液提取细胞核:在细胞核沉淀中加入终浓度为0.1M-0.4M的盐酸,在4-10摄氏度下过夜慢摇孵育,使细胞中的核心组蛋白充分溶解在盐酸溶液里。

3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述蛋白纯化的操作过程为:将过夜提取后的粗蛋白10000g-12000g高速离心后,将上清转入3KDa的超滤管,用双蒸水洗涤2-3次,去除盐酸及其他杂质,最后用酶解缓冲液置换。

4. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中所述蛋白酶解的操作流程为:先用BCA对核组蛋白进行蛋白定量,补充酶解缓冲液至蛋白浓度为0.5μg/μL -2 μg/μL ;然后加入外膜蛋白酶T,进行酶解。

5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)的操作流程为:对上一步得到的酶解产物进行6000g-12000g离心,取上清,然后除盐、冻干;再重溶于0.05-0.2%FA中;最后进行LC-MS/MS分析。

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