本发明涉及电致化学发光体系的构建技术领域，尤其涉及半导体纳米材料电极的制备及应用。
背景技术：
电致化学发光(ecl)是发光体在电极表面经由电化学和化学反应后，形成高能激发态经弛豫而产生发光的过程。因背景信号低、灵敏度高、时空可控性优异等优点，已成为一种重要的分析技术。近年来，半导体纳米材料(s-nms)如cds、cdse、cdte、tio2等，因具有良好的稳定性、抗光漂白、尺寸/表面缺陷控制等优点，已经成为一种新型的ecl发光体。
然而，基于s-nms的ecl传感器构建及发展最大的障碍是其有限的ecl效率。因为s-nms的ecl强度很难达到传统ecl试剂，如ru(bpy)32+，基于此，很多信号放大方法已经用于提高基于半导体纳晶的ecl传感器的灵敏度9，包括纳米粒子、酶、自组装和多重dna信号放大。bao将制备的cdse/znsncs用对氨基苯硫酚组装到玻碳电极表面构建了ecl传感器用于多巴胺的灵敏检测。jie利用自组装和金纳米粒子放大技术，设计了一个基于cdsncs的免疫传感器，用于低密度脂蛋白的检测。另外，早期研究工作表明，s-nmsecl性能对表面态非常敏感。对半导体表面钝化(稳定剂包裹)能够有效提高其ecl性能，原因有二：其一，能有效清除非辐射的表面状态，增强表面陷阱利于提高ecl效率；其二，稳定剂包裹的半导体纳米材料体利于电子和空穴的灌入过程，因此增强ecl发射。例如，zou利用双稳定剂包裹方法制备了巯基丙酸和六偏磷酸亚包裹的cdtencs，因其具有很强的ecl发射，在不需要任何放大技术的条件下，成功应用于实际样品中多巴胺的灵敏检测。
作为半导体材料，tio2是一种化学性质稳定、比表面积大、对生物体无毒的新型材料。与其他形态的tio2相比，tio2纳米管阵列(tio2nts)在光电化学领域、电催化领域的应用研究越来越多，但是其在ecl方面的应用研究相对较少。这是因为纳米tio2较宽的带隙(锐钛矿：～3.2ev；金红石：～3.0ev)，使其电子很难被激发，导致其ecl性能不理想。然而与窄禁带半导体复合，是有效改善tio2ecl性能的方法之一。窄禁带宽度的半导体与宽禁带半导体耦合时，因其具有更负的导带带边使电子从其导带注入更容易。cds作为窄禁带半导体，禁带宽度为ev，导带带边为0.5ev，比二氧化钛的更负，所以两者复合之后，cds获得的电子更容易注入到tio2的导带。早期已有很多工作表明，两者的耦合在可见光区具有非常优秀的光电化学特性。例如，对tio2纳米管表面进行连续化学水浴沉积cds，使得光电流在提升了6倍。就目前来说，cdsncs/tio2nts复合材料在ecl中的应用比较少。我们课题组曾采用连续化学水浴沉积法将cds纳米晶体沉积到tio2nts的表面，获得了高ecl性能的纳米复合材料，并对其发光机理进行了研究，且成功应用于前列腺癌抗原的检测。
细胞是生物体形态结构和生命活动的基本单元，在其代谢过程中会产生各种活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)。活性氧在细胞信号转导过程中起着重要作用，参与多种因子细胞生物学效应的启动。但它们也能与细胞内的生物大分子反应，从而引起细胞膜脂质过氧化、细胞内蛋白质和酶变性、dna损伤等。tio2是细胞中ros的重要代表，具有稳定性高、反应选择性专一及细胞膜渗透性强等特点，其浓度和超氧阴离子、羟基自由基等ros分子浓度密切相关。研究表明，h2o2是调节细胞凋亡过程的关键因素，在低浓度时，h2o2作为第二信使参与细胞信号转导，控制着细胞的增殖、分化和生存，并参与基因转录的调节；而在高浓度时，h2o2会破坏细胞内的平衡，引发氧化应激，导致细胞死亡、组织损伤、甚至心血管疾病、肿瘤及神经元退变等多种疾病。因此，对细胞中h2o2进行高灵敏的原位定量检测，对于理解h2o2在细胞病理学中的作用，提供可靠的相关疾病的诊断及预后信息具有极其重要的意义。准确且能够快速地检测过氧化氢在生物分析和环境领域具有重要的现实意义。尽管许多基于酶的生物传感器能够检测过氧化氢，甚至使用简单设计的电流型生物传感器，就能够获得纳摩尔级的检测限，然而由于酶自身固有的不稳定性使得其不能长时间维持稳定的催化性能。
技术实现要素：
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了半导体纳米材料电极的制备及应用，本发明制得的cdsncs/tio2nts电极可作为ecl探针用于检测h2o2浓度，且该探针的线性范围较宽为50nm到500μm，且重现性和稳定性良好。
本发明提出的半导体纳米材料电极的制备，方法步骤如下：
s11：tga稳定的cdsncs的制备：将cdcl2溶液和tga加入容器中，在氮氛搅拌20-40min，同时用naoh溶液调节混合液的ph至7-13，最后加入na2s溶液，在氮氛下105-115℃加热回流3-5h；
s12：cdsncs/tio2nts电极的制备：
(1)将剪裁好的钛片依次在乙醇和超纯水中超声清洗，除去表面吸附的杂质；
(2)将步骤(1)中的钛片在氢氟酸、硝酸和水混合液中超声清洗1-3min，除去表面的氧化层；
(3)将步骤(2)中酸洗后的钛片依次在乙醇和水中各超声4-6min，氮气吹干待用；
(4)将步骤(3)得到的干净的钛片浸入到含有0.4-0.6％wt的氢氟酸溶液中，在15-25v直流电压下，以钛片为阳极、铂片为阴极，两电极之间的距离控制在2-4cm，室温下阳极氧化1.5-3.5h；
(5)将步骤(4)氧化后的钛片在超纯水中超声清洗后，再氮气吹干，最后放入马弗炉中，在空气气氛中400-600℃下煅烧40-80min，制得排列整体的tio2nts电极；
(6)将步骤(5)中的tio2nts电极用pbs缓冲液冲洗后浸入ξ电势为6.27mv的2％pdda溶液中，静置4-6min，取出后用水洗涤；再放入ξ电势为-16.6mv的cdsncs溶液中4-6min，取出后用水洗涤；
(7)重复步骤(6)2-4次即得cdsncs/tio2nts电极；
s13：cdsncs/tio2nts电极的活化：将所述s2制备的cdsncs/tio2nts电极浸泡在活化液中，所述活化液通过0.2mna2hpo4溶液将ph调节至5.0左右，35-39℃轻微震荡14-18h，活化后用超纯水进行洗涤，即得到半导体纳米材料电极。
优选地，所述s11中cdcl2与tga的摩尔比为1:6-8，所述cdcl2与na2s的摩尔比为1:1-1.2。
优选地，所述s12中氢氟酸、硝酸和水的体积比为1:(3-5):(4-6)。
优选地，所述s13中活化液包括h2o2、柠檬酸和去离子水，且每升活化液中h2o2与柠檬酸的摩尔比为5:30-50-12。
本发明提出的半导体纳米材料电极发光体系中的应用，所述发光体系包括s13所述的活化后的电极和共反应剂h2o2。
本发明提出的半导体纳米材料电极在h2o2检测中的应用。
本发明提出的半导体纳米材料电极在细胞中h2o2检测中的应用。
优选地，所述细胞中h2o2的提取方法步骤如下：
s21：将hl-60肿瘤细胞在含8％-12％胎牛血清的dmem培养基中在35-40℃的加湿空气中进行培养；
s22：将处于指数生长期的hl-60肿瘤细胞用无菌pbs溶液离心并洗涤1-3次，弃去上层液体后加入pbs溶液(ph7.4)，同时加入10ng/mlpma刺激细胞(每1.6x105个肿瘤细胞添加1ngpma)，15-20s后离心得到含有h2o2的上清液。
优选地，所述s21中加湿空气包括93％-97％的空气和3％-7％的二氧化碳(体积百分含量)。
优选地，所述s22中的离心条件为在6000-10000r/min转速下离心3-7min。
作用机理：
(1)过氧化氢在电极表面发生还原生成的羟基自由基，具有向半导体纳米材料的价带灌入空穴的能力，而tio2可以作为空穴固定剂，当电极电势足够负时，cdsncs导带可以直接在电极表面获得电子，宽禁带的tio2半导体和窄禁带的cds相耦合，能够促进cds(e-)中的电子从cdsncs导带转移到tio2的导带，大大提高了电子-空穴的复合和tio2*的生成，最终ecl发射增强；
(2)tio2和cds的复合也会促进tio2(h+)中的h+从tio2的的价带传递给cdsncs价带，从而促进cds*的生成，从而进一步提高ecl的发射强度；
(3)稳定剂包裹的半导体纳米材料体不仅能有效清除非辐射的表面状态，而且有利于电子和空穴的灌入过程，提高了ecl效率，从而增强ecl发射；
(4)cdsncs和tio2nts的耦合能够增加彼此的ecl发射过程，也就是说ecl光强的增加是两者协同作用的结果，且活化后的电极，因cds纳晶的ecl性能提高使得其和tio2nts之间的协同作用更加明显，表现为ecl光强的再次提高。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明制得的cdsncs/tio2nts电极可作为ecl探针用于检测h2o2浓度，且该探针的线性范围较宽为50nm到500μm，且重现性和稳定性良好；
(2)本发明制得的cdsncs/tio2nts电极与过氧化氢组成的发光体系具有很强的发光强度，常用的半导体材料在同等条件下的发光强度为几百的光强，而本发明的光强可达到上万光强，其强度增强了70倍左右；
(3)本发明采用的过氧化氢作为发光体系的共反应剂向较于现有的过硫酸钾共反应剂来说污染更小。
本发明中的缩写的含义为：
tga-巯基乙酸；ncs-纳米晶；nts-纳米管；pdda-聚二烯丙基二甲基氯化铵；pma-佛波醇豆蔻酸醋酸盐。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
本发明中的电化学和ecl实验均于室温下在mpi-a多功能电化学和化学发光分析系(西安瑞迈分析仪器有限公司)上进行。测试过程中扫描速率为100mvs-1。实验中采用三电极体系，工作电极为制备的tio2nts电极或cds敏化的tio2nts电极，pt丝电极和饱和甘汞电极(sce)分别作为对电极和参比电极。细胞的凋亡情况利用流式细胞分析仪(bectondickinsonmedicaldevicescoltd.，美国)进行分析。
对于本发明中使用的试剂，其中聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda；20％，w/winwater，mw＝200000-350000)、钛片(99.7％纯度，0.25mm)、巯基乙酸(tga)和佛波醇豆蔻酸醋酸盐(pma)购于sigma-aldrich公司(st.louis，mo)；柠檬酸购买自江苏华康科技公司化学试剂厂；h2o2购自上海化学试剂公司，为分析纯；氢氟酸购自南京化学试剂有限公司。
实施例1
本发明提出的半导体纳米材料电极的制备，方法步骤如下：
s11：tga稳定的cdsncs的制备：将0.01mcdcl2溶液和tga加入容器中，配成50ml混合液，在氮氛搅拌20-40min，同时用1mnaoh溶液调节混合液的ph至8，最后加入0.1mna2s溶液，在氮氛下105℃加热回流3h，其中cdcl2与tga的摩尔比为1:6，所述cdcl2与na2s的摩尔比为1:1；
s12：cdsncs/tio2nts电极的制备：
(1)将剪裁好的钛片依次在乙醇和超纯水中超声清洗，除去表面吸附的杂质；
(2)将步骤(1)中的钛片在氢氟酸、硝酸和水混合液中超声清洗1min，除去表面的氧化层，其中氢氟酸、硝酸和水的体积比为1:3:4；
(3)将步骤(2)中酸洗后的钛片依次在乙醇和水中各超声4min，氮气吹干待用；
(4)将步骤(3)得到的干净的钛片浸入到含有0.5％wt的氢氟酸溶液中，在15v直流电压下，以钛片为阳极、铂片为阴极，两电极之间的距离控制在2cm，室温下阳极氧化1.5h；
(5)将步骤(4)氧化后的钛片在超纯水中超声清洗后，再氮气吹干，最后放入马弗炉中，在空气气氛中400℃下煅烧40min，制得排列整体的tio2nts电极；
(6)将步骤(5)中的tio2nts电极用pbs缓冲液冲洗后浸入ξ电势为6.27mv的2％pdda溶液中，静置4min，取出后用水洗涤；再放入ξ电势为-16.6mv的cdsncs溶液中4min，取出后用水洗涤；
(7)重复步骤(6)2次即得cdsncs/tio2nts电极；
s13：cdsncs/tio2nts电极的活化：将所述s2制备的cdsncs/tio2nts电极浸泡在1.5ml由h2o2、柠檬酸组成活化液中，35-39℃轻微震荡14-18h，活化后用超纯水进行洗涤，即得到半导体纳米材料电极，其中每升活化液中h2o2与柠檬酸的摩尔比为5:30。
实施例2
本发明提出的半导体纳米材料电极的制备，方法步骤如下：
s11：tga稳定的cdsncs的制备：将0.01mcdcl2溶液和tga加入容器中，配成50ml的混合液，在氮氛搅拌40min，同时用1mnaoh溶液调节混合液的ph至13，最后加入0.1mna2s溶液，在氮氛下115℃加热回流5h，其中cdcl2与tga的摩尔比为1:8，所述cdcl2与na2s的摩尔比为1:1.2；
s12：cdsncs/tio2nts电极的制备：
(1)将剪裁好的钛片依次在乙醇和超纯水中超声清洗，除去表面吸附的杂质；
(2)将步骤(1)中的钛片在氢氟酸、硝酸和水混合液中超声清洗1-3min，除去表面的氧化层，其中氢氟酸、硝酸和水的体积比为1:5:6；
(3)将步骤(2)中酸洗后的钛片依次在乙醇和水中各超声6min，氮气吹干待用；
(4)将步骤(3)得到的干净的钛片浸入到含有0.6％wt的氢氟酸溶液中，在25v直流电压下，以钛片为阳极、铂片为阴极，两电极之间的距离控制在4cm，室温下阳极氧化3.5h；
(5)将步骤(4)氧化后的钛片在超纯水中超声清洗后，再氮气吹干，最后放入马弗炉中，在空气气氛中600℃下煅烧80min，制得排列整体的tio2nts电极；
(6)将步骤(5)中的tio2nts电极用pbs缓冲液冲洗后浸入ξ电势为6.27mv的2％pdda溶液中，静置6min，取出后用水洗涤；再放入ξ电势为-16.6mv的cdsncs溶液中6min，取出后用水洗涤；
(7)重复步骤(6)2-4次即得cdsncs/tio2nts电极；
s13：cdsncs/tio2nts电极的活化：将所述s2制备的cdsncs/tio2nts电极浸泡在1.5ml由h2o2、柠檬酸组成活化液中，39℃轻微震荡18h，活化后用超纯水进行洗涤，即得到半导体纳米材料电极，其中每升活化液中h2o2与柠檬酸的摩尔比为5:50。
实施例3
本发明提出的半导体纳米材料电极的制备，方法步骤如下：
s11：tga稳定的cdsncs的制备：将0.01mcdcl2溶液和tga加入容器中，配成50ml的混合液，在氮氛下搅拌30min，同时用1mnaoh溶液调节混合液的ph至10，最后加入0.1mna2s溶液，在氮氛下110℃加热回流4h，其中cdcl2与tga的摩尔比为1:7，所述cdcl2与na2s的摩尔比为1:1.1；
s12：cdsncs/tio2nts电极的制备：
(1)将剪裁好的钛片依次在乙醇和超纯水中超声清洗，除去表面吸附的杂质；
(2)将步骤(1)中的钛片在氢氟酸、硝酸和水混合液中超声清洗2min，除去表面的氧化层，其中氢氟酸、硝酸和水的体积比为1:4:5；
(3)将步骤(2)中酸洗后的钛片依次在乙醇和水中各超声5min，氮气吹干待用；
(4)将步骤(3)得到的干净的钛片浸入到含有0.5％wt的氢氟酸溶液中，在20v直流电压下，以钛片为阳极、铂片为阴极，两电极之间的距离控制在3cm，室温下阳极氧化2.5h；
(5)将步骤(4)氧化后的钛片在超纯水中超声清洗后，再氮气吹干，最后放入马弗炉中，在空气气氛中500℃下煅烧60min，制得排列整体的tio2nts电极；
(6)将步骤(5)中的tio2nts电极用pbs缓冲液冲洗后浸入ξ电势为6.27mv的2％pdda溶液中，静置5min，取出后用水洗涤；再放入ξ电势为-16.6mv的cdsncs溶液中5min，取出后用水洗涤；
(7)重复步骤(6)3次即得cdsncs/tio2nts电极；
s13：cdsncs/tio2nts电极的活化：将所述s2制备的cdsncs/tio2nts电极浸泡在1.5ml由h2o2、柠檬酸组成活化液中，37℃轻微震荡16h，活化后用超纯水进行洗涤，即得到半导体纳米材料电极，其中每升活化液中h2o2与柠檬酸的摩尔比为5:40。
实施例4
对于本发明的半导体纳米材料电极在细胞中h2o2检测中的应用，半导体纳米材料电极的制备采用实施例3所得电极，待测细胞中h2o2的提取方法步骤如下：
s21：将hl-60肿瘤细胞在含8％胎牛血清的dmem培养基中在37℃的加湿空气中进行培养，其中加湿空气包括93％的空气和7％的二氧化碳(体积百分含量)。；
s22：将处于指数生长期的hl-60肿瘤细胞用无菌pbs溶液离心并洗涤2次，弃去上层液体后加入pbs溶液，同时加入pma刺激细胞，15s后离心得到含有h2o2的上清液，离心的条件为在6000r/min转速下离心3min。
实施例5
对于本发明的半导体纳米材料电极在细胞中h2o2检测中的应用，半导体纳米材料电极的制备采用实施例3所得电极，待测细胞中h2o2的提取方法步骤如下：
s21：将hl-60肿瘤细胞在含12％胎牛血清的dmem培养基中在37℃的加湿空气中进行培养，其中加湿空气包括97％的空气和3％的二氧化碳(体积百分含量)。；
s22：将处于指数生长期的hl-60肿瘤细胞用无菌pbs溶液离心并洗涤2次，弃去上层液体后加入pbs溶液，同时加入pma刺激细胞，20s后离心得到含有h2o2的上清液，离心的条件为在10000r/min转速下离心7min。
实施例6
对于本发明的半导体纳米材料电极在细胞中h2o2检测中的应用，半导体纳米材料电极的制备采用实施例3所得电极，待测细胞中h2o2的提取方法步骤如下：
s21：将hl-60肿瘤细胞在含10％胎牛血清的dmem培养基中在37℃的加湿空气中进行培养，其中加湿空气包括95％的空气和5％的二氧化碳(体积百分含量)。；
s22：将处于指数生长期的hl-60肿瘤细胞用无菌pbs溶液离心并洗涤2次，弃去上层液体后加入pbs溶液，同时加入pma刺激细胞，17s后离心得到含有h2o2的上清液，离心的条件为在8000r/min转速下离心5min。
对于实施例4-6中pma刺激细胞来说，其用量为每1.6x105个肿瘤细胞使用1ngpma。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。