测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的高效液相色谱方法与流程

本发明属于农药分析
技术领域：
，具体涉及一种测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的高效液相色谱方法。
背景技术：
：丙炔氟草胺，英文名称为flumioxazin，商品名为sumisoya，速收等，化学名称为n-(7-氟-3,4-二氢-3-氧-(2-丙炔基)-2h-1,4-苯并噁嗪-6-基)环己-1-烯-1,2-二羧酰亚胺，是一种肽酰亚胺类除草剂，能溶解于大多数有机溶剂中，在环境中易降解，具有低毒高效、除草广谱性好等特性，被广泛的应用于农业生产中。丙炔氟草胺的结构如下：丙炔氟草胺通常以2,4-二氟硝基苯为起始原料，在催化剂的存在下，经过硝化、醚化、加氢、关环、炔化、酰胺化，最后得到目标产物。丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺的含量测定方法除《农药分析手册》(陈铁春等主编，化学工业出版社，第1版，p479～481)中的测定方法外，尚无其他文献报道，为了保证丙炔氟草胺制剂研发及生产的质量，需要对原药的含量进行控制。因此，研究获得一种丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量测定方法，对农药制剂研发、生产企业来说显得尤为迫切。技术实现要素：本发明为了弥补目前丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量测定的空白，提供了一种准确度高、精密度高、线性好的测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的高效液相色谱方法，该方法包括以下步骤：(1)丙炔氟草胺标准曲线的建立：a、标准品溶液的制备：取丙炔氟草胺标准品，加乙腈配制成系列浓度的标准品溶液；b、标准品溶液的测定：将系列浓度的标准品溶液，分别注入高效液相色谱仪检测，测定色谱峰面积，得到丙炔氟草胺的标准曲线；色谱条件如下：色谱柱：c18色谱柱；检测波长：254±10nm；流动相：流动相a为体积浓度0.1～0.3％磷酸水溶液；流动相b为乙腈；流动相a与流动相b的体积比为55～40：45～60，洗脱方式为等度洗脱；(2)待测样品中丙炔氟草胺的含量测定：c、供试品溶液的制备：取待测样品，加乙腈配制成供试品溶液；d、供试品溶液的测定：取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，以步骤b相同的色谱条件检测，根据步骤b所得标准曲线得到待测样品中丙炔氟草胺的含量。优选的，上述所述的测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的高效液相色谱方法中，所述检测波长为254nm。其中，上述所述的测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的高效液相色谱方法中，所述色谱条件中，柱温为25℃～45℃。优选的，上述所述的测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的高效液相色谱方法中，柱温为35～45℃。更优选的，上述所述的测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的高效液相色谱方法中，柱温为40℃。优选的，上述所述的测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的高效液相色谱方法中，所述流动相a为体积浓度0.2％磷酸水溶液。优选的，上述所述的测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的高效液相色谱方法中，所述流动相a与流动相b的体积比为48：52。其中，上述所述的测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的高效液相色谱方法中，所述色谱条件中，流动相流速为1.0～2.0ml/min。优选的，上述所述的测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的高效液相色谱方法中，流动相流速为1.3ml/min。优选的，上述所述的测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的高效液相色谱方法中，所述色谱柱为tc-c18色谱柱。更优选的，上述所述的测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的高效液相色谱方法中，所述色谱柱的规格为：填料粒径为5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm。其中，上述所述的测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的高效液相色谱方法中，所述标准曲线的线性范围为：0.4～1.6mg/ml。其中，上述所述的测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的高效液相色谱方法中，所述供试品溶液的浓度为0.4～1.6mg/ml。其中，上述所述的测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的高效液相色谱方法中，丙炔氟草胺样品溶液(标准品和待测样品)的进样量为5～10μl。优选的，上述所述的测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的高效液相色谱方法中，丙炔氟草胺样品溶液进样量为5μl。本发明的有益效果是：本发明方法填补了目前丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量测定的空白，经过对高效液相色谱测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的大量条件试验筛选，对流动相体系、柱温等进行优化，从而能够准确测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量；本发明方法精密度高，线性和回收率好，含量测定结果准确，可用于丙炔氟草胺原药的质量控制，以满足研发和生产的需求，为丙炔氟草胺质量评价提供了必要的技术支持。附图说明图1为实施例1.1中乙腈：0.2％磷酸水＝45：55(v/v)的分离效果图。图2为实施例1.1中乙腈：0.2％磷酸水＝52：48(v/v)的分离效果图。图3为实施例1.1中乙腈：0.2％磷酸水＝60：40(v/v)的分离效果图。图4为实施例1.1中乙腈：0.2％磷酸水＝65：35(v/v)的分离效果图。图5为实施例1.2中0.1％磷酸水溶液(v/v)作为流动相a的分离效果图。图6为实施例1.2中0.2％磷酸水溶液(v/v)作为流动相a的分离效果图。图7为实施例1.2中0.3％磷酸水溶液(v/v)作为流动相a的分离效果图。图8为实施例1.3中柱温为25℃的分离效果图。图9为实施例1.3中柱温为30℃的分离效果图。图10为实施例1.3中柱温为35℃的分离效果图。图11为实施例1.3中柱温为40℃的分离效果图。图12为本发明方法检测丙炔氟草胺原药的分离效果图。图13为《农药分析手册》测定方法的分离效果图。图14为优选条件下，丙炔氟草胺含量测定方法的空白谱图。图15为优选条件下，丙炔氟草胺含量测定方法的标样谱图。图16为优选条件下，丙炔氟草胺含量测定方法的原药谱图。其中，优选条件为：以十八烷基键合硅胶为填充剂(tc-c18，5μm，250×4.6mm)，检测波长254nm，柱温40℃，流动相为乙腈(b)：0.2％磷酸水溶液(a)＝52：48(v/v)，流动相流速1.3ml/min，洗脱方式为等度洗脱，进样量5μl。具体实施方式发明人首先对《农药分析手册》中的测定方法进行了验证，发现采用该方法，杂质未能均达到基线分离，2min左右还出现倒峰，个别杂质未能检测出来，分离效果不理想，不适用于丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺的含量准确测定；因此发明人进行了大量试验，以期能够准确测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量。具体的，测定丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的高效液相色谱方法，该方法包括以下步骤：(1)丙炔氟草胺标准曲线的建立：a、标准品溶液的制备：取丙炔氟草胺标准品，加乙腈配制成系列浓度的标准品溶液；b、标准品溶液的测定：将系列浓度的标准品溶液，分别注入高效液相色谱仪检测，测定色谱峰面积，得到丙炔氟草胺的标准曲线；色谱条件如下：色谱柱：c18色谱柱；检测波长：254±10nm；流动相：流动相a为体积浓度0.1～0.3％磷酸水溶液；流动相b为乙腈；流动相a与流动相b的体积比为55～40：45～60，洗脱方式为等度洗脱；(2)待测样品中丙炔氟草胺的含量测定：c、供试品溶液的制备：取待测样品，加乙腈配制成供试品溶液；d、供试品溶液的测定：取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，以步骤b相同的色谱条件检测，根据步骤b所得标准曲线得到待测样品中丙炔氟草胺的含量。为了进一步提高检测结果的准确性，发明人对各检测条件进行了更深入的探索。分析丙炔氟草胺的紫外吸收光谱图可知，丙炔氟草胺在254nm附近吸收强度适宜，各成分均能达到基线分离，并且能检测出更多的杂质，因此进一步确定检测波长为254nm。本发明方法中，流动相的参数控制对检测结果影响较大，因此发明人进一步对流动相溶液选择进行筛选，获得了高效液相色谱检测丙炔氟草胺原药含量的最优条件：以体积浓度0.2％磷酸水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，主峰出峰时间适宜，杂质分离效果好；控制流动相a与流动相b的体积比为48：52，流动相的流速为1.3ml/min，等梯度洗脱，主峰与主峰前的杂质出峰较快，并且各成分均能达到基线分离，主峰后杂质能够全部显现。柱温同样影响样品分离效果和分离效率，温度过低时，主峰后的个别杂质未能检测出来；当柱温逐渐增加时，主峰的出峰时间越快；经试验，当柱温为40℃，主峰与主峰后杂质分离效果最好，检测结果更准确，并能体现本发明方法的高效性。本发明方法中，色谱柱规格为：填充剂粒径为5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm；优选tc-c18色谱柱。本发明方法中，发明人为了尽可能提高理论塔板数，适宜的峰面积，使分离效果更好，通过线性测试项对丙炔氟草胺标准样品浓度在0.4～1.6mg/ml的范围进行筛选；在线性范围为0.4～1.6mg/ml内绘制标准曲线，线性回归方程r2＝1，结果准确。本发明方法中，丙炔氟草胺样品的进样量为5～10μl，优选为5μl。发明人经过大量试验，最终确认了丙炔氟草胺原药中丙炔氟草胺含量的高效液相色谱测定方法的最优色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(tc-c18，5μm，250×4.6mm)，检测波长254nm，柱温40℃，流动相体系：体积浓度0.2％磷酸水溶液：乙腈＝48：52(v：v)，流动相的流速为1.3ml/min，等度洗脱，样品进样量为5μl，进行高效液相色谱，分析样品中丙炔氟草胺的含量。本发明中磷酸水溶液中磷酸含量为体积浓度。以下通过实例形式对本发明涉及的丙炔氟草胺的含量测定方法做进一步说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。实例中主要实验仪器及色谱条件：agilent1260infinityⅱ高效液相色谱仪。色谱柱选用的是c18柱，5μm，250×4.6mm(i.d.)，流动相为乙腈(a)：0.2％磷酸水溶液(b)＝52：48(v/v)，流速：1.3ml/min，柱温：40℃，检测波长：254nm，进样量：5μl。试剂与药品：丙炔氟草胺对照品(99.5wt％)；丙炔氟草胺原药(＞97wt％)；乙腈：hplc级；磷酸：分析纯；实验中用水均为超纯水。实施例1：高效液相色谱条件的选择1.1、流动相比例的选择将不同体积比(乙腈比例分别为45％、52％、60％和65％)的流动相组成进行试验，当乙腈比例为60％、65％时，主峰与主峰前的杂质出峰较快，不能达到很好的分离，乙腈比例越高，主峰出峰越快，但分离效果越差，分别见图3，图4；当乙腈比例为45％时，主峰与主峰前的杂质分离效果好，但主峰出峰时间较慢，分析效率低，而且主峰后有杂质未出完，见图1；当乙腈比例为52％时，主峰与主峰前的杂质出峰较快，并且各成分均能达到基线分离，主峰后杂质能够全部显现，见图2。综上所述，选出乙腈体积比例为52％为最优条件。1.2、流动相的选择将不同磷酸含量(磷酸含量分别为0.1％、0.2％和0.3％)的水相作为流动相a进行实验，当流动相a为0.1％～0.3％磷酸水(v/v)时，主峰出峰时间差异不大，分离效果好，但流动相a为0.1％磷酸水(v/v)时，个别杂质峰面积太小，峰高太低，未能检测出；流动相a为0.3％磷酸水(v/v)时，个别杂质峰出现裂分现象，分别见图5～7。综上所述，选出0.2％磷酸水为最优条件。1.3、柱温的选择选择不同柱温(柱温分别为25℃、30℃、35℃和40℃)进行实验，当柱温逐渐增加时，主峰的出峰时间越快，体现出本发明方法的高效性；当温度过低时，主峰后的个别杂质未能检测出来，分别见图8～11。综上所述，选出40℃为最优条件。实施例2：丙炔氟草胺含量测定方法的对比《农药分析手册》丙炔氟草胺含量测定方法：色谱柱：zorbaxsb-c18,250mm×4.6mm，粒径5um，流动相为乙腈：水＝60：40(v/v)，流速：1.0ml/min，柱温：30℃，检测波长：292nm，进样量：5μl。使用相同色谱柱，将丙炔氟草胺原药用本发明“测定方法”与《农药分析手册》上的测定方法进行对比。《农药分析手册》上的测定方法虽然主峰出峰时间较快，但杂质未能均达到基线分离，2min左右还出现倒峰；且波长选用292nm，个别杂质未能检测出来，见图13。相比较，本发明测定方法虽然主峰出峰时间稍慢一点，但各成分均能达到基线分离，并且波长选用254nm，能检测出更多的杂质，见图12。说明本发明方法在测定丙炔氟草胺原药含量时，具有更大的优势。实施例3：丙炔氟草胺含量的高效液相色谱法测定。标准溶液与样品溶液的配制：准确称取丙炔氟草胺标准品0.0500g，精确至0.0001g，置于50ml容量瓶中，用乙腈超声溶解并稀释至刻度线，摇匀，配制浓度为1mg/ml的标准溶液，备用；同法配制成丙炔氟草胺样品溶液。对含量测定方法的以下项目进行了验证：1、线性准确称取梯度质量的丙炔氟草胺于50ml容量瓶中，用乙腈超声溶解并稀释至刻度线，摇匀，得到不同质量浓度的丙炔氟草胺供试液。进样5ul，记录色谱图。以峰面积对质量浓度作图，绘制回归曲线，计算回归系数。由表1可知道，在丙炔氟草胺浓度为0.41mg/ml～1.6mg/ml的范围内，质量浓度与峰面积呈线性关系，线性回归方程为：y＝3634.7x+9.4911，r2＝1。表1工作标准溶液系列浓度(mg/ml)0.4100.6000.7981.0041.2141.4061.600峰面积1492.321942904.93665.544345123.35811.92、回收率采用标样加入法测定方法的回收率。共称取5份对照品50mg于50ml容量瓶中(样品1～5)，按照“样品溶液的配制”及“测定方法”进行测定，并根据加入量、测定量计算回收率。结果如表2所示。表2回收率实验结果样品编号加入量/g测定值/g回收率/％样品-10.049650.0496099.90样品-20.049350.04942100.14样品-30.049750.0497199.92样品-40.049250.04929100.08样品-50.051940.05197100.06从表2结果可以看出，丙炔氟草胺回收率在99.90％～100.14％之间，说明本方法回收率好，结果准确可靠。3、精密度采用外标法测定方法的精密度。准确称取丙炔氟草胺原药(约98％)50mg于50ml容量瓶中(样品6～10)，按照“样品溶液的配制”及“测定方法”进行测定，根据测定量计算精密度，结果如表3所示。表3精密度实验结果从表3结果可知，丙炔氟草胺原药的rsd＝0.28％，说明该方法的精密度好。当前第1页12