一种基于质谱技术的血液免疫抑制药物浓度定量检测方法与流程

文档序号:17918224发布日期:2019-06-14 23:55
本发明涉及分析化学
技术领域
,尤其涉及一种基于质谱技术的血液免疫抑制药物浓度定量检测方法。
背景技术
:器官移植是终末期器官衰竭的常见治疗手段。数据显示,中国每年约有1万例器官移植手术,累计移植量已超过10万例。其中,69%是肾脏移植,其次是肝脏、心脏、肺和胰腺等。受体免疫系统识别移植器官为外来组织而产生的排斥反应是移植术后最主要的挑战,也是移植物失功以及患者死亡的重要原因。有效抑制移植器官后免疫系统出现的各种排斥反应是提高患者移植手术成功率的关键。免疫抑制药物(ISDs)可用于阻断不同作用机制的免疫系统,从而减少对移植物的排斥反应。过去30年,ISDs已经有效地抑制了患者移植术后的器官排斥反应,很好地改善了器官移植受体的存活率。近60%的成人肾移植患者存活率超过10年,肝移植5年存活率可达70~75%。然而,免疫抑制药物的浓度必须保持在一个有效、安全的剂量范围内,才能起到对治疗的促进作用,ISDs浓度过高可导致机体严重的副反应,包括抑制患者对感染和肿瘤的免疫力下降;而ISDs药物浓度过低,则会产生器官排斥反应。此外,由于移植患者个体存在年龄、体重、胃肠道等功能差异,并受遗传因素、环境因素和药物间相互作用等诸多因素影响,造成药物在患者体内代谢过程存在较大的差异。免疫抑制药物通常在一个非常窄而且又多变的治疗浓度水平,在用药时,要根据移植患者个体指标,来选择恰当的免疫抑制药物,并依据监测的药物浓度调整免疫抑制剂的用量,还要根据药物在体内的代谢情况来选择服药时间和给药途径。因此,定期进行免疫抑制药物浓度监测,对于器官移植患者药物治疗策略的选择具有重要的指导意义,可以辅助医生在非常窄的治疗窗内优化给药剂量,从而确保有效预防器官排斥反应的剂量,又能避免剂量过高导致严重副反应的发生。技术实现要素:本发明的目的在于提供一种基于质谱技术的血液免疫抑制药物浓度定量检测方法,实现对免疫抑制药物的精确检测。为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:一种基于质谱技术的血液免疫抑制药物浓度定量检测方法,其特征在于,包括以下步骤:S1:配制混合工作液,配制包含待测免疫抑制药物的标准品工作液和同位素内标品工作液的混合工作液;S2:制备上清液,取不同浓度梯度的所述混合工作液,加入全血标本和甲醇后混匀,超声提取后离心取上清液;S3:获取峰面积,将所述上清液用高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测,获得标准品峰面积和各自内标品峰面积;S4:绘制标准曲线,以标准品工作液的浓度为横坐标,标准品峰面积和各自内标品峰面积的面积比为纵坐标绘制标准曲线;S5:计算浓度,取待测全血标本,加入所述同位素内标品工作液和甲醇后混匀,超声提取后离心取上清液按照步骤S3获取待测免疫抑制药物的峰面积与内标品峰面积,将两者的峰面积比代入标准曲线,对应的横坐标即为待测免疫抑制药物的浓度。进一步的,所述S1中,标准品工作液为含有CsA、FK506、RPM和MPA的混合储备液,浓度分别为15、0.3、0.3、150μg/mL;同位素内标品工作液为5.4.2含有CsA-d4、FK-506-d2、RPM-d3和MPA-d3的混合储备液,浓度分别为4、0.4、0.6、10μg/mL;以不同体积的标准品工作液、相同体积的内标品工作液、定容液配置不同浓度梯度的所述混合工作液。进一步的,所述S3中色谱条件如下:色谱柱为C18色谱柱,流动相A为10mmol/L的乙酸铵溶液,流动相B为甲醇,进样量为10μL,柱温为40℃,样品室温度:10℃,流速为0.3mL/min。进一步的,所述S3中质谱条件如下:离子源模式为ESI+模式,毛细管电压为3.5kV,离子源温度:150℃,脱溶剂温度为350℃,脱溶剂气流量为800L/min,锥孔反吹气流量为50L/h。进一步的,所述标准曲线由Masslynx软件自带定量软件Targetlynx绘制。进一步的,所述S2中超声提取的时间为10min。进一步的,所述S2中离心的具体操作为:在5000g离心力下离心10min。与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明线配置不同浓度梯度的混合工作液,再经高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测,绘制标准曲线。最终将待测全血标本的检测结果代入标准曲线,获得其中对应的免疫抑制药物的浓度。本发明的检测方法抗干扰能力、稳定性、准确性良好。具体实施方式下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。本发明提供一种基于质谱技术的血液免疫抑制药物浓度定量检测方法,其特征在于,包括以下步骤:S1:配制混合工作液,配制包含待测免疫抑制药物的标准品工作液和同位素内标品工作液的混合工作液;标准品工作液为含有CsA、FK506、RPM和MPA的混合储备液,浓度分别为15、0.3、0.3、150μg/mL;同位素内标品工作液为5.4.2含有CsA-d4、FK-506-d2、RPM-d3和MPA-d3的混合储备液,浓度分别为4、0.4、0.6、10μg/mL;以不同体积的标准品工作液、相同体积的内标品工作液、定容液配置不同浓度梯度的所述混合工作液。S2:制备上清液,取不同浓度梯度的所述混合工作液,加入全血标本和甲醇后混匀,超声提取10min后,在5000g离心力作用下离心10min,取上清液;S3:获取峰面积,将所述上清液用高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测,获得标准品峰面积和各自内标品峰面积;其中,色谱条件如下:色谱柱为C18色谱柱,流动相A为10mmol/L的乙酸铵溶液,流动相B为甲醇,进样量为10μL,柱温为40℃,样品室温度:10℃,流速为0.3mL/min。质谱条件如下:离子源模式为ESI+模式,毛细管电压为3.5kV,离子源温度:150℃,脱溶剂温度为350℃,脱溶剂气流量为800L/min,锥孔反吹气流量为50L/h。S4:绘制标准曲线,以标准品工作液的浓度为横坐标,标准品峰面积和各自内标品峰面积的面积比为纵坐标绘制标准曲线;所述标准曲线由Masslynx软件自带定量软件Targetlynx绘制。S5:计算浓度,取待测全血标本,加入所述同位素内标品工作液和甲醇后混匀,超声提取后离心取上清液按照步骤S3获取待测免疫抑制药物的峰面积与内标品峰面积,将两者的峰面积比代入标准曲线,对应的横坐标即为待测免疫抑制药物的浓度。为了本领域一般技术人员更好地理解本发明的技术方案,以下结合具体实例进一步介绍。本实施例适用于EDTA抗凝全血中环孢霉素A(以下简称CsA)、他克莫司(以下简称FK506)、雷帕霉素(以下简称RPM)和霉酚酸(以下简称MPA)的定量测定。抗凝全血的定量限分别是150ng/mL、3ng/mL、3ng/mL、1500ng/mL。试验之前需要进行全血标本、检测设备及检测试剂的准备工作,如下:全血标本:标本的采集:全血标本采集前,要消除病人的紧张心理,采血时要规范操作,并及时混匀。标本类型与标本量:送检标本选用EDTA抗凝的真空管抽取患者2mL血液。标本容器选择:无菌的一次性真空采血管(积水医疗科技(中国)有限公司)检测设备:检测设备采用AQCUITYUltraPerformanceLCTQDetector(WATERS,USA),检测环境要求湿度为20~80%;温度为15~28℃,最佳温度范围19~22℃,短期(1.5h)波动不得大于±2℃。检测试剂(如无特殊要求,下列试剂均为分析纯):氮气:纯度98%;甲醇:纯度99.9%、HPLC级(货号:JA052130,Merck,USA);乙腈:纯度99.9%、HPLC级(货号:1880707710、Merk,USA);乙酸铵:度99.0%、HPLC级(货号:17836-50G,SIGMA-ALDRICH(Fluka),USA)。CsA标准品:纯度,≥99%(货号:C988900,TRC,Canada);FK506标准品:纯度,≥99%(货号:F370000,TRC,Canada);RPM标准品:纯度,≥99%(货号:R124000,TRC,Canada);MPA标准品:纯度,≥99%(货号:M831500,TRC,Canada);CsA-d4同位素内标:纯度:分析纯(货号:C988902,TRC,Canada);FK506-d2同位素内标:纯度:分析纯(货号:F370002,TRC,Canada);RPM-d3同位素内标:纯度:分析纯(货号:R124202,TRC,Canada);MPA-d3同位素内标:纯度:分析纯(货号:M831502,TRC,Canada)。S1:配制混合工作液乙酸铵水溶液(10mmol/L):称取0.77g乙酸铵,溶于1000mL超纯水,超声混匀。甲醇水溶液(甲醇:水体积比,7:3):取35mL甲醇和15mL超纯水,超声混匀。标准品工作液:配制含有CsA、FK506、RPM和MPA的混合储备液,使其浓度分别为15、0.3、0.3、150μg/mL。同位素内标品工作液:配制含有CsA-d4、FK-506-d2、RPM-d3和MPA-d3的混合储备液,使其浓度分别为4、0.4、0.6、10μg/mL。按下表1配置不同浓度梯度的混合工作液。表1:混合工作液配制表序号标准品工作液[μL]内标品工作液[μL]定容液[μL]1010290221028834102864610284581028261010280S2:制备上清液取2mL环氧树脂管,加入全血标本100μL,再加入10μL上述混合工作液,再加入190μL甲醇,涡旋混匀60s,超声提取10min后,于5000g离心力作用下离心10min,取上清液待测。在混匀过程中,由于甲醇溶液会使全血标本中的蛋白质凝结,若凝结块过大,有可能封锁了混合工作液(同位素内标品工作液和标准品工作液)及血液中其他物质,超声提取可以打碎其中体积较大的蛋白凝结块,使其中的溶液回到上清液。S3:获取峰面积将所述上清液用高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测,获得标准品峰面积和各自内标品峰面积;其中,色谱条件如下:色谱柱:ACQUITYUPLCBEHC182.1mm×100mm1.7μm(货号:186002352WATERS,USA)流动相A:10mmol/L乙酸铵溶液流动相B:甲醇进样量:10μL柱温:40℃样品室温度:10℃流速:0.3mL/min流动相的梯度表格如下表2。表2流动相梯度表时间(min)流动相A(%)流动相B(%)0.0060402.0001003.0001003.0560404.006040质谱条件如下:离子源模式:ESI+模式毛细管电压:3.5kV离子源温度:150℃脱溶剂温度:350℃脱溶剂气流量:800L/min锥孔反吹气流量:50L/hMRM参数设置请参照下表3。表3MRM参数设置表经上述色谱和质谱分析后,获得标准品峰面积和各自内标品峰面积。S4:绘制标准曲线在Masslynx软件自带定量软件Targetlynx内,以标准品工作液的浓度为横坐标,标准品峰面积和各自内标品峰面积的面积比为纵坐标绘制标准曲线。S5:计算浓度取待测全血标本,加入所述同位素内标品工作液和甲醇后混匀,超声提取后离心取上清液按照步骤S3获取待测免疫抑制药物的峰面积与内标品峰面积,将两者的峰面积比代入标准曲线,对应的横坐标即为待测免疫抑制药物的浓度。本发明可以同时检测四种免疫抑制药物的浓度。方法学验证1.1抗干扰实验1.1.1实验目的考察全血样品基质、预处理试剂对质谱检测影响。1.1.2实验方法选取20支健康人全血标本,分别取100μL健康人全血于2mLEP管中,加入10μL同位素内标品工作液,再加入190μL甲醇沉淀蛋白,涡旋混匀60s后超声5min高速离心10min,取上清液进样。1.1.3实验结果表4:抗干扰实验1.1.4实验结论全血基质和本实验所用试剂对检测无干扰影响。1.2批间精密度1.2.1实验目的考察实验方法的稳定性1.2.2实验方法取三支试管,分别加入20μL、50μL、100μL标准物质工作液,然后分别加入健康人血液980μL、950μL、900μL,涡旋混匀,分别作为低浓度、中浓度和高浓度加标样品分别取100μL加标样品,加入10μL混合内标,涡旋混匀后再加入190μL甲醇,涡旋混匀60s后超声5min,高速离心10min,取上清液进样。每批次每份样本平行五次。1.2.3实验结果表5:MPA批间精密度实验表6:CsA批间精密度实验表7:RPM批间精密度实验表8:FK506批间精密度实验1.2.4实验结论实验结果RSD≤15%,满足美国美国临床实验室标准协会CLSIC62-A的相关要求。1.3准确度/回收率实验1.3.1实验目的通过对加标样品的回收率测试来考察实验结果的准确性。1.3.2实验结果表9:MPA回收率实验表7:CsA回收率实验表8:FK506收率实验表9:RPM回收率实验1.3.3实验结论由实验结果可知三个加标浓度的回收率均为80~120%之间,且相对标准偏差RSD<15%,满足美国美国临床实验室标准协会CLSIC62-A的相关要求。1.4标准曲线1.4.1实验目的验证本方法的线性范围1.4.2实验方法按照本发明所述方法建立标准曲线,进样分析,一共分析4批。1.4.3实验结果表10:标准曲线验证结果序号线性(r2)曲线方程序号线性(r2)曲线方程MPA-10.9979y=1.283*X+3.862CsA-10.9979y=1.283*X+3.862MPA-20.9989y=1.208*X-3.510CsA-20.9989y=1.208*X-3.510MPA-30.9957y=1.227*X+0.025CsA-30.9957y=1.227*X+0.025MPA-40.9965y=1.277*X+0.720CsA-40.9965y=1.277*X+0.720FK506-10.9979y=1.283*X+3.862RPM-10.9979y=1.283*X+3.862FK506-20.9989y=1.208*X-3.510RPM-20.9989y=1.208*X-3.510FK506-30.9957y=1.227*X+0.025RPM-30.9957y=1.227*X+0.025FK506-40.9965y=1.277*X+0.720RPM-40.9965y=1.277*X+0.7201.4.4实验结论标准曲线线性r2均大于0.99,满足美国临床实验室标准协会CLSIC62-A的相关要求。1.5定量下限1.5.1实验目的考察样品在定量下限附近时的检测准确度1.5.2实验方法向990μL健康人血液中加入10μL标准物质工作液,涡旋混匀。分别取100μL加标样品,加入10μL混合内标,涡旋混匀后加入190μL甲醇,涡旋混匀60s后超声5min高速离心10min,取上清液进样。每批次每份样本平行五次。表11:实验结果1.5.3实验结论由实验结果可知在定量下限附近加标浓度的回收率均为80-120%之间,且相对标准偏差RSD<15%,满足美国美国临床实验室标准协会CLSIC62-A的相关要求。对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。当前第1页1 2 3 
再多了解一些
当前第1页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1