一种肝纤维化或肝硬化的诊断试剂盒的制作方法

本发明属于疾病诊断试剂领域。

背景技术：

肝纤维化是一种肝脏结构被损坏后组织再生期间的细胞外基质积累导致纤维结节产生的病理过程；其发展的最终阶段是肝硬化，是临床常见的慢性进行性肝病和主要致死疾病之一。我国每年有2％～3％的肝纤维化患者会发展至肝硬化，占内科住院病人总数的4.3％～14.2％，死于肝硬化及其并发症的人数高达30万，给国家和人民带来沉重的经济和社会负担。因此，对肝纤维化早期诊断筛查，对遏制肝纤维化进一步发展成肝硬化具有十分重要的意义。

肝纤维化通常的检测手段包括血生化检测(血常规、凝血功能、肝功能、apri评分、fib-4指数等)、影像学检测(超声、ct和磁共振成像)和病理学检测(肝脏穿刺活检)。血生化检测中缺乏特异性的肝纤维化指标，单一指标对肝纤维化评估作用小，需检测多个项目，才能有限地提高其诊断价值。影像学检测通常只能检测到重度肝纤维化、肝硬化以及肝脏占位性病变，对早期纤维化评估意义不大。病理学检测是肝纤维化诊断的金标准，但很容易出现假阴性，因为很多疾病导致的肝纤维化分布不均匀，若肝脏穿刺未取到纤维化部位的样品，则会漏诊；另外，肝脏穿刺对患者损伤较大，检测周期也较长。

因此，积极开发新的检测肝纤维化的工具，是21世纪人类健康重大课题之一。

技术实现要素：

本发明的目的是，提供一种肝纤维化或肝硬化的诊断试剂盒。

本发明的技术方案包括：

一种肝纤维化或肝硬化的诊断试剂盒，其特征在于：它包括检测ceacam1+csf1r+外周血单核细胞的试剂；所述ceacam1+指细胞表面带有ceacam1(即cd66a；uniprot：p13688[人]，p31809[小鼠])；csf1r+指细胞表面带有csf1r(uniprot：p07333[人]，p09581[小鼠])蛋白。

如前述的试剂盒，所述检测ceacam1+csf1r+外周血单核细胞的试剂包括检测ceacam1和csf1r蛋白的荧光标记抗体。

如前述的试剂盒，所述试剂盒是流式细胞术检测试剂盒。

如前述的试剂盒，所述试剂盒是免疫组化检测试剂盒。

如果不是以外周血为检测样品，需要鉴定mac-1蛋白，以确认其单核细胞是否来源于外周血；若单核细胞表面有mac-1蛋白，则可确认其来源于外周血。因此，前述的试剂盒，它还可以包括检测位于单核细胞表面的mac-1蛋白(即cd11b；uniprot：p11215[人]，p05555[小鼠])的试剂。

如前述的试剂盒，检测mac-1蛋白的试剂包括抗mac-1蛋白的荧光标记抗体。

如前述的试剂盒，检测mac-1蛋白的试剂是流式细胞术检测用试剂。

如前述的试剂盒，检测mac-1蛋白的试剂是免疫组化或免疫荧光检测用试剂。

检测外周血单核细胞表面ceacam1、csf1r蛋白的试剂在制备肝纤维化或肝硬化的诊断试剂盒中的用途。

如前述的用途，所述试剂还包括检测单核细胞表面mac-1蛋白的试剂。

进一步地，若检测样品为外周血，该试剂盒还包括检测mac-1+单核细胞的试剂；所述mac-1+指细胞表面带有mac-1(即cd11b；uniprot：p11215[人]，p05555[小鼠])蛋白。

为了方便表述，本发明将ceacam1+csf1r+外周血单核细胞定义为：外周血促纤维化单核细胞(peripheralblood-containingfibrotic-drivermonocytes)，简称pfdm。另外，mac-1是本领域公知的外周血单核细胞的标志物，本发明中“mac-1+ceacam1+csf1r+单核细胞”等同于“ceacam1+csf1r+外周血单核细胞”。

本发明不同于现有的任意一种肝纤维化或肝硬化的检测技术，具有如下有益效果：

本发明的试剂盒用法简单，只需检测外周血单核细胞表面的ceacam1和csf1r蛋白，与健康人群比较即可；

本发明的试剂盒形式多样，可以是外周血检测试剂盒，伤害较小，简单快捷；也可以是免疫组化检测试剂盒，适用于不同需求。

本发明试剂盒十分灵敏，其与传统的肝功能指标(ast/alt)相比，灵敏度显著更高，且能检测后者不能检测到的代偿期肝硬化。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：肝纤维化和健康小鼠的肝组织免疫荧光检测图。

图2：流式细胞术检测结果。

图3：肝硬化病人与正常人之间pfdm水平。

图4：代偿期肝硬化和失代偿期肝硬化病人血清中alt与pfdm水平的比较。

图5：代偿期肝硬化和失代偿期肝硬化病人血清中ast与pfdm水平的比较。

具体实施方式

实施例1本发明试剂盒(流式细胞仪检测试剂盒)

1.试剂盒组成

核心组分：ceacam1、csf1r的荧光标记抗体(荧光一抗)。

其它组分(可自备)：单核细胞分离提取试剂盒(市售产品)。

2.使用方法

1)取待检对象的外周血，分离外周血单核细胞(可使用单核细胞分离提取试剂盒)；

2)将单核细胞悬浮于pbs，加入荧光一抗孵育；

3)使用流式细胞仪检测抗体荧光，若ceacam1和csf1r对应标记荧光均被检测到，且强度显著高于健康人群对应的荧光强度，则表明待检对象患有肝纤维化。

本试剂盒不检测mac-1，因为所取样本是外周血，mac-1是本领域公知的外周血单核细胞的标志物，无需对mac-1进行检测。

实施例2本发明试剂盒(肝组织石蜡切片免疫荧光检测试剂盒)

1.试剂盒的组成

核心组分：mac-1、ceacam1、csf1r的荧光标记抗体(荧光一抗)。

其它组分(可自备)：抗原修复液(epitoperetrievalsolution)、封闭液(山羊血清)、洗涤缓冲液(免疫组化市售产品)。

2.使用方法

1)取肝组织石蜡切片依次放入二甲苯-二甲苯-二甲苯-100％乙醇-95％乙醇-85％乙醇-75％乙醇-70％乙醇-双蒸水进行脱蜡水化(每个溶剂3min)；

2)抗原修复：将脱蜡水化后的肝组织切片放入容器，加入抗原修复液，微波炉8min，2次；

3)封闭：自然降到室温，双蒸水洗3遍，5％山羊血清封闭10min；

4)孵抗体：山羊血清回收，流水冲洗2-3min，双蒸水洗3遍，洗涤缓冲液洗一次，加荧光一抗，室温孵育1h；

5)封闭和拍照：使用含dapi的封闭液封片后显微镜下拍照；

6)结果判读：若出现mac-1、ceacam1和csf1r对应荧光一抗的颜色信号，且强度显著高于健康人群对应的荧光强度，则表明待检对象患有肝纤维化。

为了进一步说明本发明的有益效果，本发明提供如下实验例：

实验例1纤维化小鼠肝脏内pfdm的检测

1.方法

使用免疫荧光检测肝纤维化小鼠肝组织和健康对照小鼠肝组织内pfdm分布，步骤如下：

1)取对照/肝纤维化小鼠肝脏组织进行福尔马林固定24h；

2)脱水透明后石蜡包埋并切片，得石蜡切片；

3)按实施例2对mac-1、ceacam1、csf1r进行检测。

2.结果

结果显示正常小鼠肝脏无pfdm，而纤维化小鼠肝脏纤维间隔分布大量pfdm(图1)。

结论：肝脏内出现pfdm，与肝纤维化相关；人们可以通过检测肝脏内的pfdm来检测肝纤维化。

实验例2以外周血为样品检测pfdm

1.方法

以肝纤维化小鼠和健康对照小鼠外周血为样品，分离单核细胞，使用实施例1的方法对ceacam1、csf1r进行检测。

2.结果

结果显示，健康对照小鼠外周血中ceacam1+csf1r+单核细胞占比为2.45％(图2a)；而肝纤维化小鼠外周血中ceacam1+csf1r+单核细胞占比为35.3％(图2b)，比健康对照小鼠显著要高。

结论：外周血中pfdm的含量与肝纤维化有关，人们可以通过检测外周血中pfdm来检测肝纤维化。

实验例3临床检测

失代偿期肝硬化为终末期肝纤维化，肝损伤明显，伴随alt、ast等急剧升高；代偿期肝硬化主要为肝纤维化，肝损伤程度较低，alt和ast升高不明显。本实验例的目的是评价pfdm对人肝纤维化/肝硬化的指示作用。

1.方法

1.1pfdm含量比较

收集临床肝硬化病人外周血，检测pfdm水平，与正常人的pfdm水平对比。

1.2比较pfdm与肝功能指标的灵敏度

检测肝硬化代偿期病人和失代偿期病人的肝功能指标(alt和ast)，并比较正常与失常肝功能指标对应肝纤维化病人的pfdm水平差异。

2.结果

2.1肝硬化病人与正常人之间pfdm水平比较

如图3所示，临床肝硬化病人pfdm显著高于于正常人。表明pfdm可以作为临床上肝硬化诊断的标志物。

2.2比较pfdm与肝功能指标的灵敏度

如图4和5所示，无论是代偿期肝硬化病人(alt/ast正常)还是失代偿期病人(alt/ast失常)的pfdm均显著上升。而检测肝功能指标alt和ast水平无法对代偿期肝硬化进行诊断。由此可见，pfdm相比肝功能指标alt和ast在诊断肝硬化时灵敏度更高。

综上，本发明提供了一种高效、简便、灵敏的肝纤维化和肝硬化诊断试剂盒，它与现有的检测肝纤维化和肝硬化的试剂盒的原理不同，可以进一步完善肝纤维化/肝硬化检测工具库，具有良好的应用前景。