本发明属于生物技术分子检测领域，具体涉及一种还原剂缓冲液及其制备方法和应用，尤其涉及一种用于检测乙型肝炎病毒核心抗体的还原剂缓冲液及其制备方法和应用。
背景技术：
乙型肝炎(简称乙肝)是由乙型肝炎病毒(hbv)引起的能导致肝性炎症及肝功能损害的一种传染性疾病。乙型肝炎病毒核心抗原(hbcag)是乙肝病毒的核心部分，存在于dane颗粒的核心，可刺激人t淋巴细胞产生乙型肝炎病毒核心抗体。
目前乙肝病毒血清学检查项目一般包括hbsag、anti-hbs、hbeag、anti-hbe、anti-hbc，即俗称的“乙肝两对半”。hbv感染者发病不久后便会产生hbcag抗体，这种抗体常常终身携带。在hbv感染康复者，anti-hbc可持续存在，因此anti-hbc筛查可用于确定既往感染的个体。anti-hbc检测联合其它乙型肝炎检测有助于hbv感染的诊断和监测。在其他乙型肝炎标志物缺乏的情况下，anti-hbc可能是提示存在hbv感染的唯一指标。
主流的检测anti-hbc的方法有酶联免疫(elisa)、胶体金法、化学发光(glia)、电化学发光(ecl)和时间分辨荧光免疫分析(trfia)等。由于存在大量标本在没有其他肝炎标记物的存在、也没有疾病症状的情况下只对anti-hbc呈阳性，而且该标志物和疾病之间的流行病学联系不强，因此在进行anti-hbc检测时容易导致误判。因此，区分样本是否是假阳性标本是很重要的。
为了提高检测结果的特异性和灵敏度，在样品检测前需要使用还原剂缓冲液对样品进行处理，以消除样品中的干扰物质的非特异性结合，避免出现假阳性结果，提高检测结果的准确性，现有的还原剂缓冲液抗氧化能力弱，易被空气氧化，而且部分带有刺激性气味，具有一定的毒性。
cn102146487a公开了一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，该试剂盒中用于除去干扰物质的溶液配方为1mm乙二胺四乙酸、0.5％sds、10mm，ph8.0的tris-hcl和0.1％乙基苯基聚乙二醇(np-40)；同时该发明采用实时荧光定量pcr技术定量检测乙型肝炎病毒核酸，具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。然而所述配方的溶液抗氧化能力弱，处理样品时样品容易被氧化，导致结果不准确。
因此，提供一种安全无毒、性质稳定且能够消除样本中干扰物质的还原剂缓冲液是检测乙型肝炎病毒核心抗体时急需解决的问题。
技术实现要素：
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种稳定性好、对环境友好的还原剂缓冲液，所述还原剂缓冲液稳定性较好，不仅可以消除样本中的干扰物质，提高免疫试剂的特异性，增加检测结果的准确性和可靠性。为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种还原剂缓冲液，包括：10-100mm三(2-羧乙基)膦、2-10mm螯合剂和10-100mm缓冲剂。
本发明提供的还原剂缓冲液，使用三(2-羰基乙基)磷(tcep)、螯合剂与缓冲液以合理的配比进行制备，其中tcep毒性较小且易溶于水，对还原二硫键选择性极强，使用tcep配制的还原剂缓冲液在处理目标样品时更容易操作；同时tcep与特定的螯合剂配合使用，会使缓冲液具有较高的稳定性，使其受温度和浓度的影响小，且能够在更宽的ph值范围包括酸性条件(例如ph为3)下使用，从而有效减少酰胺键的水解，进而减少目标样品中干扰物质的影响，因此使用本发明提供的还原剂缓冲液，能够使检测结果更加灵敏和准确。
本发明中，所述三(2-羧乙基)膦的浓度为10-100mm，例如可以是10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm或100mm等。
所述螯合剂浓度为2-10mm，例如可以是2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm等。
所述缓冲剂浓度为10-100mm，例如可以是10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm或100mm等。
作为本发明优选的技术方案，所述螯合剂选自乙二胺四乙酸、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、柠檬酸、酒石酸或葡萄糖酸中的任意一种或两种以上的组合，优选为乙二胺四乙酸和/或葡萄糖酸，进一步优选为葡萄糖酸。
本发明中使用乙二胺四乙酸或葡萄糖酸为螯合剂时，制备得到的还原剂缓冲液受温度和浓度的影响更小，说明tcep与乙二胺四乙酸或葡萄糖酸配合使用时，两者之间存在协同作用，能够明显提高缓冲液的稳定性。
优选地，所述缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷(tris)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)、3-(n-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(mopso)、3-吗啉丙磺酸(mops)或脂肪酸甲酯磺酸盐(mes)中的任意一种或两种以上的组合。
优选地，所述还原剂缓冲液的ph为6-8，例如可以是6、6.2、6.4、6.5、6.8、7、7.2、7.4、7.5、7.8、7.9或8等。
作为本发明优选的技术方案，所述还原剂缓冲液还包括0.1-200mm(例如可以是0.1mm、1mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、50mm、80mm、100mm、120mm、140mm、160mm、180mm、190mm或200mm等)的无机盐。
优选地，所述无机盐选自磷酸氢二钾、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾、氯化钠、氯化钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾中的任意一种或两种以上的组合。
作为本发明优选的技术方案，所述还原剂缓冲液中还包括质量浓度为0.1-0.5％(例如可以是0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％等)的表面活性剂。
优选地，所述表面活性剂选自吐温(tween)，十二烷基硫酸钠(sds)或曲拉通(triton)中的任意一种或两种以上的组合。
作为本发明优选的技术方案，所述还原剂缓冲液中还包括质量浓度为0.1-0.5％(例如可以是0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％等)的防腐剂。
优选地，所述防腐剂选自proclin300、叠氮钠二唑烷基脲、咪唑烷基脲、钠羟甲基甘氨酸、二羟甲基脲、2-溴-2-硝基-1,3-二醇、恶唑烷、钠羟甲基甘氨酸或金刚烷季铵中的任意一种或两种以上的组合。
作为本发明优选的技术方案，所述还原剂缓冲液包括：10-100mm三(2-羧乙基)膦、2-10mm乙二胺四乙酸和/或葡萄糖酸、10-100mm缓冲剂、0.1-200mm无机盐、质量浓度为0.1-0.5％的表面活性剂和质量浓度为0.1-0.5％的防腐剂。
第二方面，一种如第一方面的还原剂缓冲液的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将配方量的缓冲剂、螯合剂和水混合均质，得到均质液；
(2)将三(2-羧乙基)膦盐酸盐加入所述均质液中乳化并调节ph；
(3)加入防腐剂和表面活性剂后搅拌均匀，出料，得到所述还原剂缓冲液。
优选地，步骤(1)所述混合均质时的温度为20-30℃，例如可以是20℃、22℃、24℃、25℃、26℃、28℃或30℃等；时间为30-45min，例如可以是30min、32min、35min、38min、40min、42min或45min等。
优选地，步骤(1)所述混合均质时的转速为1000-1200rpm，例如可以是1000rpm、1050rpm、1080rpm、1100rpm、1120rpm、1150rpm或1200rpm等。
优选地，步骤(2)所述乳化时转速为1000-1200rpm，例如可以是1000rpm、1050rpm、1080rpm、1100rpm、1120rpm、1150rpm或1200rpm等。
本发明中可以使用6mol/l的naoh调节还原剂缓冲液的ph。
第三方面，本发明提供一种检测试剂盒，包含如第一方面所述的还原剂缓冲液。
优选地，所述检测试剂盒为乙型肝炎病毒核心抗体检测试剂盒。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的还原剂缓冲液使用tcep和螯合剂以合理的配比进行制备，所得缓冲液抗氧化能力强，受温度等外界环境影响较小，稳定性较好便于长时间存储；
(2)本发明提供的还原剂缓冲液使用方法简单，毒性较小，在处理目标样品时能够有效地消除样品中的干扰物质，避免出现假阳性结果，所得到的检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种还原剂缓冲液，所述还原剂缓冲液的配方为：
制备方法为：
(1)将0.02molmes、0.005mol乙二胺四乙酸、0.15molnacl和1000ml水混合均质，得到均质液；
(2)将0.04mol三(2-羧乙基)膦盐酸盐加入所述均质液中乳化并调节ph；
(3)加入1g防腐剂proclin300和5g表面活性剂tween-20后搅拌均匀，出料，得到所述还原剂缓冲液，所得缓冲液的ph为6.70。
实施例2
本实施例提供一种还原剂缓冲液，所述还原剂缓冲液是将实施例1中的还原剂缓冲液在37℃放置10天得到，所得缓冲液的ph为6.75。
实施例3
本实施例提供一种还原剂缓冲液，所述还原剂缓冲液是将实施例1中的还原剂缓冲液在4℃下放置180天得到，所得缓冲液的ph为6.72。
实施例4
本实施例提供一种还原剂缓冲液，所述还原剂缓冲液的配方为：
制备方法同实施例1，所得缓冲液的ph为6.68。
实施例5
本实施例提供一种还原剂缓冲液，所述还原剂缓冲液的配方为：
制备方法同实施例1，所得缓冲液的ph为7.42。
对比例1
本对比例提供一种还原剂缓冲液，所述还原剂缓冲液的配方为：
制备方法为：
(1)将0.005mol乙二胺四乙酸、0.15mol无机盐和1000ml水混合均质，得到均质液；
(2)加入1g防腐剂和5g表面活性剂后搅拌均匀，出料，得到所述还原剂缓冲液，所得缓冲液的ph为6.72。
对比例2
制备方法同实施例1，所得缓冲液的ph为6.70。
对比例3
制备方法同实施例1，所得缓冲液的ph为6.70。
对比例4
制备方法同实施例1，所得缓冲液的ph为6.72。
对比例5
制备方法同实施例1，所得缓冲液的ph为6.68。
性能测试
以100份正常人血清中为检测样本，使用实施例1-5与对比例1-5测定并统计检测样本的阴阳性，假阳性样本均复检2次，大于等于2次阳性结果则判定为假阳性，阳性结果与雅培和罗氏方法学比较符合率(雅培检测仪器为i2000sr，罗氏检测仪器为cobas411)。
以实施例1和对比例1为例，使用实施例1和对比例1提供的缓冲液检测100份正常人血清时，出现20份样本(编号为2、4、5、8、9、10、15、20、22、32、34、46、57、62、63、66、68、75、78和89)结果不一致，实施例1判断为阴性，对比例1判断为阳性，而雅培和罗氏方法学检测以上样本时均判定为阴性，因此实施例1的判定结果与雅培和罗氏方法学的判断结果一致，具体结果统计如表1所示：(s/co＜1判定为阳性)。
表1
实施例2-5以100份正常人血清为检测样本，测定并统计阴阳性，阳性结果与其他方法学(如雅培、罗氏等)比较符合率，发现与雅培，罗氏检测结果一致，并没有出现假阳性结果，说明本发明的还原剂缓冲液准确度较高，且稳定性较好。
而对比例2-5均出现假阳性结果：对比例2检测时2份样品(编号为4和32)出现假阳性结果，hbcabs/co均值分别为0.85和0.91；因此，由实施例1与对比例2比较可知，相比于dtt，本发明采用的tcep能够使还原剂缓冲液的准确度更高。
对比例3检测时8份样品(编号为4、22、32、46、62、68和89)出现假阳性结果，hbcabs/co均值分别为0.75、0.84、0.81、0.77、0.86、0.92和0.89；因此，由实施例1与对比例3比较可知，本发明采用的tcep与乙二胺四乙酸配合，产生协调作用，能够明显提高检测结果的准确度。
对比例4检测时5份样品(编号为4、32、46、68和89)出现假阳性结果，hbcabs/co均值分别为0.82、0.87、0.91、0.95和0.84；对比例5检测时2份样品(编号为32和46)出现假阳性结果，hbcabs/co均值分别为0.87和0.89。因此，由实施例1与对比例4和5比较可知，当溶液中tcep与乙二胺四乙酸的含量不在本发明的范围内时，其准确度也会降低。
综上所述，本发明的还原剂缓冲液能很好地降低非特异性反应，提高试剂的特异性，降低临床样本检测假阳性概率，同时本发明提供的还原剂缓冲液稳定性较好，能够长期存储。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。