本发明属于酶联免疫吸附检测领域，涉及一种羊包虫病elisa抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。
背景技术：
包虫病是由棘球绦虫的幼虫寄生于人或动物体内引起的人兽共患病，我国将其列为二类动物疫病，oie将其列为b类动物疾病。棘球蚴可寄生在宿主体内的任何器官，压迫周围组织造成萎缩和功能障碍，蚴囊破裂还会引起继发性感染或休克，甚至死亡。目前已确认的棘球属绦虫有5种，其中由细粒棘球绦引起的囊型包虫病集中在我国西北畜牧大省，以绵羊、牛、猪感染尤为严重，对公共卫生安全和畜牧业生产造成威胁。
目前诊断包虫病的“金标准”是剖检法，该法对可疑病灶或包囊有时无法鉴定。我国相关的农业行业标准包括间接血球凝集实验、酶联免疫吸附试验和聚合酶链式反应。间接血凝试验是以细胞为载体与抗原抗体特异性结合，准确性高，耗时少，易受环境影响，临床使用性差；聚合酶链式反应特异性好、灵敏度、重复性好，但对实验室硬件条件要求较高，基层兽医实验室难以推广。
酶联免疫吸附法是近年来检测包虫病较为常用的免疫学方法之一。具有快速、简便、费用低廉、可同时检测大量样本等优点，被广泛应用于包虫病的实验室诊断和群体流行病学调查。抗原b（antigenb,agb）是细粒棘球蚴囊液的主要抗原成分，占粗抗原的90%，被认为是免疫诊断试验中具有高度敏感性和特异性的抗原。其中egagb1、egagb2和egagb4是血清检测的主要反应亚基。细粒棘球蚴-原头蚴钙结合蛋白1（epc1）对囊性包虫病具有很强的诊断潜力。故本发明通过利用epc1重组抗原、egagb1重组抗原、egagb2重组抗原和egagb4重组抗原组成细粒棘球蚴鸡尾酒抗原，建立一种操作简便、快速、特异的羊包虫病elisa抗体检测试剂盒。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种羊包虫病elisa抗体检测试剂盒，包括细粒棘球蚴鸡尾酒抗原预包被酶标板、阳性对照液、阴性对照液、酶标记物浓缩液、酶标记物稀释液、样本稀释液、底物a液、底物b液、终止液、洗涤液、血清稀释板；所述细粒棘球蚴鸡尾酒抗原是由epc1重组抗原、egagb1重组抗原、egagb2重组抗原和egagb4重组抗原组成。
上述抗体检测试剂盒中，所述酶标板材质为96孔固相酶标板nunc-468667。
上述抗体检测试剂盒中，细粒棘球蚴鸡尾酒抗原中表达的epc1重组抗原、egagb1重组抗原、egagb2重组抗原和egagb4重组抗原的浓度比为2:1:2:1。
本发明还提供了上述羊包虫病elisa抗体检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1）细粒棘球蚴鸡尾酒抗原的制备：以细粒棘球蚴cdna文库为模版，针对epc1、egagb1、egagb2和egagb4基因序列设计特异性引物，通过pcr扩增目的片段并克隆至表达载体pet28a，将成功构建的重组表达质粒pet28a-epc-1、pet28a-egagb1、pet28a-egagb2和pet28a-egagb4转化至大肠杆菌bl21（de3）中，iptg诱导表达，经亲和层析和分子筛层析高度纯化后得到epc1重组蛋白、egagb1重组蛋白、egagb2重组蛋白和egagb4重组蛋白。
2）细粒棘球蚴鸡尾酒抗原预包被酶标板的制备：将囊液蛋白用碳酸盐缓冲液稀释成浓度为5μg/ml的抗原包被液，每孔100μl，2-8℃包被16h后洗板；然后每孔加入200μl封闭液，37℃、湿度30-40%封闭2h，37℃、湿度30-40%恒温干燥2h。所述细粒棘球蚴鸡尾酒抗原中由epc1重组抗原、egagb1重组抗原、egagb2重组抗原和egagb4重组抗原，终浓度分别为2.8mg/ml、1.4mg/ml、2.8mg/ml和1.4mg/ml；
3）阳性对照液的制备：试验用羊攻虫270日血清1:100倍稀释。
4）阴性对照液的制备：健康绵羊血清1:100倍稀释。
5）酶标记物浓缩液的制备：辣根过氧化物酶标记的hrp-mouseanti-goatigg1:30000倍稀释。
6）酶标记物稀释液的制备：0.01mph7.4的pbst溶液。
7）样品稀释液的制备：0.01mph7.4的pbs溶液。
8）底物a液的制备：含0.08%过氧化脲、0.025%peg-2000、3.58%十二水合磷酸氢二钠、0.96%一水合柠檬酸水溶液，调ph值至7.4。
9）底物b液的制备：含1.03%一水合柠檬酸、0.04%tmb、0.0008%硫代硫酸钠、0.1%光稳定剂292、3%dmf水溶液，调ph值至5.0。
10）终止液的制备：含0.1%10%sds、5.56%硫酸水溶液。
11）洗涤液的制备：0.25mph7.4的pbst溶液。
其中，步骤1）中所述epc1重组抗原制备时所用的引物如序列表的序列1-2所示，epc1重组抗原核酸序列可如序列表的序列3所示；egagb1重组抗原制备时所用的引物如序列表的序列4-5所示，egagb1重组抗原核酸序列可如序列表的序列6所示；egagb2重组抗原制备时所用的引物如序列表的序列7-8所示，egagb2重组抗原核酸序列可如序列表的序列9所示；egagb4重组抗原制备时所用的引物如序列表的序列10-11所示，egagb4重组抗原核酸序列可如序列表的序列12所示。
本发明还提供了上述羊包虫病elisa抗体检测试剂盒在包虫病检测中的应用。
上述抗体检测试剂盒中采用间接elisa法，待检样品中的包虫病特异性抗体与包被板上抗原结合，加入酶标记物，催化底物显色，显色的深浅与样本中的抗体含量成正比，显色深，含量多，显色浅，含量少。
本发明利用细粒棘球蚴鸡尾酒抗原建立的羊包虫病elisa抗体检测试剂盒具有较高的敏感性和特异性，且操作简单、快速，便于同时检测大量样本，实用性较强。在羊包虫的抗体水平检测、流行病学调查方面提供了重要方法。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、羊包虫病elisa抗体检测试剂盒的制备
1、羊包虫病elisa抗体检测试剂盒的组成
羊包虫病elisa抗体检测试剂盒由细粒棘球蚴鸡尾酒抗原预包被酶标板、阳性对照液、阴性对照液、酶标记物浓缩液、酶标记物稀释液、样本稀释液、底物a液、底物b液、终止液、洗涤液、血清稀释板组成。
2、羊包虫病elisa抗体检测试剂盒的制备
1）细粒棘球蚴鸡尾酒抗原的制备
a.引物设计
根据genebank中epc-1（登录号af481884）、egagb1（登录号z26336.1）、egagb2（登录号jn050887.1）、egagb4（登录号ay871031.1）序列设计引物：
epc-1-f：ggatccgccgtactatgagtcttca
epc-1-r：aagctttctaggcttaattcgccgtc
egagb1-f：ggatcccctcgacgtcgaggagtgtg
egagb1-r：aagctttctgaggtgggacttaagtg
egagb2-f：ggatccgcacacatggggcaagtggta
egagb2-r：aagcttcatctttttcttccaccaaa
egagb4-f：ggatccagatgcaagtgcctcataatg
egagb4-r：aagcttcttcttcttccagcaaatc
下划线部分为引入的bamhi和hindiii酶切位点。
提取细粒棘球蚴总rna
按rnaisoplus（totalrna）提取试剂盒说明书进行提取，简单如下：
①样品的研磨和匀浆：将原头蚴约100mg放入研钵，加1mlrnaisoplus溶液充分研磨1min，将匀浆液转移至离心管中，室温（20-25℃）静置5min；12000g4℃离心5min；小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）；
②totalrna的提取：向上述匀浆裂解液中加入0.2ml氯仿，混合至溶液乳化呈乳白色；室温静置5min；12000g4℃离心15min。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液（含rna）、中间的白色蛋白层（大部分为dna）及带有颜色的下层有机相，吸取上清液转移至另一新的离心管中（切勿吸出白色中间层）；
③rna沉淀的清洗：向上清中加入1ml的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10min。12000g4℃离心10min，试管底部会出现rna沉淀。小心弃去上清,切勿触及沉淀。加入与1ml的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7500g4℃离心5min后小心弃去上清，切勿触及沉淀；
④rna的溶解：打开离心管盖，室温干燥沉淀5min。沉淀干燥后，加入50μl的rnase-free水溶解沉淀；
1％琼脂糖凝胶电泳鉴定提取总rna的完整性，核酸蛋白测定仪检测其纯度。稀释各组样品总rna浓度至100ng/μl，-70℃保存备用。
逆转录反应获得cdna
取原头蚴总rna0.3μg，加入如下反应体系：5×m-mlv反应缓冲液5μl，dntp1μl，m-mlv逆转录酶1μl，rna酶抑制剂0.5μl，oligo(dt)1μl，加入rnaase-free水至25μl。混匀42℃水浴60min。
表达载体的构建
①pcr扩增epc-1、egagb1、egagb2和egagb4抗原基因片段：pcr反应体系：ddh2o36.5μl，10×pcr反应冲液5μl，dntp1μl，taqdna聚合酶0.5μl，上、下游引物各2μl，cdna模板3μl。95℃预变性5min，95℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸45s，经30个循环后72℃终延伸10min；胶回收pcr产物。
②双酶切目的基因和质粒dna：目的基因酶切反应体系：目的基因10μl，bamhi酶2μl，hindiii酶2μl，10×双酶切反应缓冲液2μl，ddh2o4μl。pet28a质粒酶切反应体系：pet28a质粒dna(pet28a)10μl，bamhi酶2μl，hindiii酶2μl，10×双酶切反应缓冲液2μl，ddh2o4μl。37℃水浴120min，胶回收酶切产物。
③连接双酶切后的目的基因片段与pet28a质粒片段：连接反应体系：目的基因片段4μl，pet28a质粒片段1.5μl，t4dna连接酶1μl，10×连接反应缓冲液1μl。16℃连接过夜。
④转化dh5a感受态细胞：将连接产物采用低温氯化钙共沉淀法转化ecolidh5a感受态细胞，取单菌落进行pcr鉴定和测序。
⑤转化bl21（de3）感受态细胞：将测序正确菌株，提取pet28a-epc-1、pet28a-egagb1、pet28a-egagb2和pet28a-egagb4表达载体，采用化学转化法转化bl21（de3）感受态细胞，取单菌落进行pcr鉴定和保种。
重组蛋白诱导表达与纯化
对验证正确转入质粒pet28a-epc-1、pet28a-egagb1、pet28a-egagb2和pet28a-egagb4的4个表达菌分别进行扩大培养，取10ml表达菌株菌液接种于新鲜lb（50μg/ml，kana）培养液中，于37℃摇床180r/min振荡培养至菌液od600为0.4～0.6时，加入终浓度为1mm的iptg，37℃诱导表达6h。将iptg诱导后的1l菌液收集，5000rpm4℃离心20min，弃去上清，沉淀用40mlpbs悬起，8000rpm4℃离心30min，吸取上清。
高度纯化epc-1、egagb1、egagb2及egagb4重组蛋白：
采用亲和层析和分子筛层析高度纯化epc-1、egagb1、egagb2和egagb4重组蛋白，具体的方法如下：
缓冲液：50mmph7.4的pbs缓冲液（19ml0.5mnah2po4，81ml0.5mna2hpo4，29.3gnacl，溶于水，定容至1000ml）。
①亲和层析纯化：镍琼脂糖凝胶装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；用缓冲液平衡2-5个床体积，流速为2ml/min；将20ml大肠杆菌细胞破碎液（50mmpbs，ph7.4，0.5mnacl）0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min；用缓冲液再洗2-5个床体积，流速为2ml/min；用分别含30、80、120、500咪唑的缓冲液进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰；纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4~8℃环境中保存；sds-page检测不同浓度咪唑洗脱液中目的蛋白的大小、纯度，分装后，-80℃保存备用。
②分子筛纯化：使用美国gehealthcare公司的aktapurifier100系统预装sephadexg-75柱进一步纯化表达蛋白。将sephadexg-75柱与akta系统连接，流速为1ml/min，用5-10个柱体积的0.02mol/l磷酸缓冲液（ph6.5）平衡sephadexg-75柱至紫外吸收曲线平稳；紫外吸收峰调零后用0.1ml上样环进行蛋白上样，使用0.02mol/l磷酸缓冲液（ph6.5）进行洗脱，调节流速为0.2～0.5ml/min，打开收集器每10min收集一管（3ml/管）。sds-page验证大小和纯度，将相似管进行合并；依次经透析及3kda超滤管浓缩后即得到epc-1重组蛋白、egagb1重组蛋白、egagb2重组蛋白和egagb4重组蛋白，经sds-page检验纯化结果。
2）细粒棘球蚴鸡尾酒抗原预包被酶标板的制备
取纯化的鸡尾酒抗原用碳酸盐缓冲液（0.795g碳酸钠，1.465g碳酸氢钠溶于水，定容至500ml，调ph值至9.6）稀释并制成浓度为5μg/ml的抗原包被液，移取100μl抗原包被液分别注入至96孔酶标板的各孔中，2-8℃包被16h后，弃去孔中的包被液用0.01mpbst溶液进行洗涤。准确移取封闭液（7g蔗糖，4.5g酪蛋白，30ml小牛血清，500μlproclin300溶于0.01mpbst溶液，定容至1000ml）200μl分别注入96孔已包被好的酶标板各孔中，37℃、湿度为30-40%封闭2h，弃去封闭液。将弃去封闭液的包被板放至恒温干燥箱中，37℃、湿度为30-40%恒温干燥2h。
3）阳性对照液的制备
检验合格的试验用羊感染羊包虫虫卵，1000枚虫卵/只，攻虫270日采血分离血清，将血清1:100倍稀释，无菌过滤后加入终浓度为0.05%的proclin300，1ml/管无菌分装。
4）阴性对照液的制备
检验合格的健康绵羊静脉采血分离血清，将血清1:100倍稀释。无菌过滤后加入终浓度为0.05%的proclin300，1ml/管无菌分装。
5）酶标记物浓缩液的制备
辣根过氧化物标记的mouseanti-goatigg-hrp20μl加入酶结合物稀释液至6ml，过滤，0.12ml/管无菌分装。
6）酶标记物稀释液的制备
磷酸二氢钾0.45g、十二水合磷酸氢二钠3.125g、氯化钠0.65g、氯化钾0.04g、30μl吐温-20、150μl的proclin300溶于水，定容至500ml，调ph值至7.4，过滤，无菌分装，12ml/瓶无菌分装。
7）样品稀释液的制备
磷酸二氢钾1.485g、十二水合磷酸氢二钠10.313g、氯化钠2.145g、氯化钾0.132g、495μl的proclin300溶于水，定容至1650ml，调ph值至7.4，过滤，40ml/瓶无菌分装。
8）底物a液的制备
过氧化脲0.216g、peg-20000.0675g、十二水合磷酸氢二钠9.666g、一水合柠檬酸2.592g溶于水，定容至270ml，调ph值至7.4，过滤，6ml/瓶无菌分装。
9）底物b液的制备
一水合柠檬酸2.781g、tmb0.108g、硫代硫酸钠0.0226g、0.27g光稳定剂292、8.1mldmf溶于水，定容至270ml，调ph值至5.0，过滤，6ml/瓶无菌分装。
10）终止液的制备
取250ml纯化水至烧杯中，再缓慢加入15.012ml硫酸，边加边搅拌，加入0.27ml的10%sds，定容至270ml，过滤，6ml/瓶无菌分装。
11）洗涤液的制备
磷酸二氢钾31.50g、十二水合磷酸氢二钠17.50g、氯化钠45.50g、氯化钾2.80g、2.1ml吐温-20、420μl的proclin300溶于水，定容至1400ml，调ph值至7.4，过滤，30ml/瓶无菌分装。
12）组装
a）细粒棘球蚴鸡尾酒抗原预包被酶标板：1块（8孔×12条）
b）阳性对照液：1管（1ml）
c）阴性对照液：1管（1ml）
d）酶标记物浓缩液：1管（0.12ml）
e）酶标记物稀释液：1瓶（12ml）
f）样品稀释液：1瓶（40ml）
g）底物a液：1瓶（6ml）
h）底物b液：1瓶（6ml）
i）终止液：1瓶（6ml）
j）洗涤液：1瓶（25×，30ml）
k）血清稀释板：1块
l）盖板膜：1张
3、羊包虫病elisa抗体检测试剂盒性能验证
1）敏感性：分别使用3个批次羊包虫病elisa抗体检测试剂盒与间接血凝试验同时检测5份羊包虫阳性质控品以及15份检测为阳性的临床血清样品，比较检测结果。
间接血凝试验检测方法（iha）
稀释被检血清：用0.15mol/lpbs稀释液（ph=7.2）将待检样品稀释为1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128和1:256七个滴度，加至加样孔；阳性参考血清稀释为1:4、1:16、1:64、1:256、1:1024、1:4096和1:16384七个滴度，加至对照孔；阴性参考血清稀释同待检血清，加至对照孔，稀释液对照孔将稀释液加至对照孔，每孔加样量均为25μl；
加诊断液：将抗原摇匀后，每孔滴加敏化红细胞25μl；
血凝反应：试验微量板振荡1-2min，取下，盖玻璃板，室温反应2-3h；
试验成立条件：稀释液对照不出现凝集、阴性参考血清不高于1:16以及阳性参考血清抗体效价为产品规定值（1:1024-1:4096）；
判定标准：“++++”100%的血球在孔壁下形成呈均质膜样凝集，边缘整齐，致密；“+++”75%的血球在孔壁下形成呈膜样凝集，但不凝集的血球在孔底中央集中成很小的圆点；“++”50%血球在孔壁更下部形成稀疏凝集，不凝集的血球在孔底中央集成较大圆点；“+”25%血球在孔底凝集，不凝集的血球在孔底中央集中成大圆点；“-”所有红细胞均不凝集，集中于孔底中央成最大圆点。
结果判定：使用v型板，以“++”为阳性终点，待检样品抗体滴度等于或高于阳性规定值（1:64）时，判为阳性；待检样品抗体滴度低于1:64即第三孔（1:64）为“+”或“-”者，判为阴性。
羊包虫病elisa抗体检测试剂盒与间接血凝试验检测结果如表1所示，均为阳性，与间接血凝试验结果一致，敏感性100%。
表1敏感性检验结果
2）特异性：使用3个批次羊包虫病elisa抗体检测试剂盒检测5份羊包虫阴性质控品、1份布鲁氏菌抗体阳性样品、1份小反刍兽疫病毒抗体阳性样品、1份绵羊肺炎支原体抗体阳性样品、1份细颈囊尾蚴病抗体阳性样品、1份脑多头蚴病抗体阳性样品以及15份检测为阴性的临床血清样品。如表2所示，上述样品检测结果均为阴性，特异性100%，且与布鲁氏菌抗体阳性样品、小反刍兽疫病毒抗体阳性样品、绵羊肺炎支原体抗体阳性样品、细颈囊尾蚴病抗体阳性样品、脑多头蚴病抗体阳性样品没有交叉。
表2特异性检验结果
3）重复性：使用同一个批次的羊包虫病elisa抗体检测试剂盒检测5份羊包虫阳性质控品、5份羊包虫阴性质控品、1份布鲁氏菌抗体阳性样品、1份小反刍兽疫病毒抗体阳性样品、1份绵羊肺炎支原体抗体阳性样品、1份细颈囊尾蚴病抗体阳性样品、1份脑多头蚴病抗体阳性样品以及15份临床血清样品，比较检测结果，计算批内重复性；使用3个批次的羊包虫病elisa抗体检测试剂盒检测上述样品，比较检测结果，计算批间重复性。羊包虫病elisa抗体检测试剂盒重复检测结果如表3、表4所示，批间批内变异系数均小于10%，试剂盒重复性良好。
表3批内重复性检验结果
表4批间重复性检验结果
4）稳定性：对羊包虫病elisa抗体检测试剂盒各组分及试剂盒成品进行长期稳定性试验和加速稳定性试验，长期试验条件为2~8℃，频率为0个月、1个月、2个月、3个月、6个月、12个月、15个月、18个月，结果显示试剂盒各组分和成品在18个月od450nm值未见明显变化；加速试验条件为37℃，频率为0日、1日、2日、3日、6日、12日、15日、18日，结果显示试剂盒各组分和成品在18日od450nm值未见明显变化；综合长期试验和加速试验，羊包虫病elisa抗体检测试剂盒保存期定为2~8℃保存15个月。
5）符合率：分别使用3个批次羊包虫病elisa抗体检测试剂盒与间接血凝试验同时检测100份临床血清样品，比较检测结果。羊包虫病elisa抗体检测试剂盒符合率验证结果如表5所示，本研究建立的三批羊包虫病elisa抗体检测试剂盒与间接血凝试验检测结果符合率均大于95%。
表5符合率验证结果
实施例2、羊包虫病elisa抗体检测试剂盒检测包虫病
1、试剂配制
浓缩的洗涤液应恢复至室温，并摇动使沉淀溶解，然后用去离子水作25倍稀释，混匀，稀释好的洗涤液4℃可存放7日。
2、样品前处理
取全血，待血液凝固后，4000rpm离心10min，收集上清。也可以自然凝固析出血清，无溶血；在血清稀释板中按1:99的体积稀释待检血清样本，充分混匀。
3、检测
1）取细粒棘球蚴鸡尾酒抗原预包被酶标板，将稀释好的待检血清取100μl加至预包被酶标板中。同时设阴性对照2孔、阳性对照2孔，取阴性、阳性对照液100μl分别加入反应孔中，轻轻振匀孔中样品，盖上盖板膜，置37℃温育30min。
2）弃去孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液300μl，静置3min后，弃去洗涤液，洗涤3次后在吸水纸上拍干。
3）配制酶结合物工作液：按体积比1:99（1份酶结合物浓缩液+99份酶结合物稀释液）混匀备用。
4）每孔加酶结合物工作液100μl，盖上盖板膜，37℃避光反应30min。
5）弃去孔中的溶液，洗涤3次，方法同步骤2。
6）将底物a液与底物b液按1:1混合，加入孔中，100μl/孔，盖上盖板膜，37℃避光反应15min。
7）每孔加入终止液50μl，5min内用酶标仪于450nm读取各孔od值。
4、结果判定
1）试验成立的条件：阴性对照平均od450nm值≤0.20，且阳性对照平均od450nm值＞1.0，试验结果才有效；否则，应进行重复试验。
2）计算方法：
3）阴阳性判断：s/p＜0.35时，判为阴性；s/p≥0.35时，判为阳性。
序列表
<110>北京维德维康生物技术有限公司
<120>一种检测羊包虫病elisa抗体检测试剂盒及其应用
<160>12
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
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<213>epc-1(echinococcusgranulosus)
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agtcgggcaagattagctgtgccgagcttaaatccgcactacagtcgtgctcagcagagc120
ctctcgatgacgaccatgtgaaggctttcttagataagctcgactccaacaaggacggcg180
aattaagcctag192
<210>3
<211>26
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