一种活细胞内检测CLK3激酶活性的生物探针及其应用的制作方法

一种活细胞内检测clk3激酶活性的生物探针及其应用
技术领域
[0001]
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于荧光共振能量转移的在活细胞内检测clk3激酶活性的生物探针，以及其在检测clk3激酶活性方面的应用。


背景技术：

[0002]
clk3激酶，又称双特异性激酶即它既能磷酸化自身序列中的酪氨酸又可以磷酸化底物蛋白序列中的丝氨酸和苏氨酸。clk3激酶定位于细胞核，其主要功能是通过磷酸化剪切相关的丝氨酸/精氨酸重复蛋白来调控基因pre-mrna的选择性剪接，一旦失调则可能会引起疾病的发生。同时研究表明，在肝癌患者组织中clk3表达量显著升高，并且与肝癌患者的tnm分期以及不良预后相关。敲低clk3后可以显著抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移。另外，clk3还在胆管癌、红白血病等多种癌症中表达上调，提示clk3可作为癌症治疗的靶点进行研究。近年来，以激酶作为靶点开发高度特异的小分子抑制剂作为临床药物已然愈发成为一种趋势，迄今为止fda批准上市的激酶抑制剂类药物高达百种。目前关于clk3激酶结构域的高分辨率晶体结构已经被解出，这就为clk3激酶抑制剂类药物的开发提供了良好的基础，进一步的筛选就依赖于clk3激酶活性的高通量且特异性的检测。
[0003]
目前对于clk3激酶活性的检测多依赖于传统的生化检测方法，理论基础为蛋白激酶以atp为磷酸基团供体并将其γ-磷酸基团转移到底物蛋白特定位点的羟基上。市面上的检测试剂盒如碧云天的kinase-lumi
tm
化学发光法激酶活性检测试剂盒、普洛麦格的adp-glo
tm
激酶检测试剂盒等，它们或检测体外酶反应过程中atp的剩余量，或检测酶反应过程中adp的生成量，借助atp依赖的萤光素酶催化的萤光素发光反应通过测定化学发光来定量激酶的活性。此类方法缺点在于操作复杂且需体外纯化激酶与激酶底物，使得酶的稳定性无法保证，而且体外无法完全模拟细胞内复杂的微环境，激酶反应所依赖的温度、ph、缓冲体系等都会影响酶反应。因此，体外实验的准确性有待考量。此外，酶活检测还涉及质谱分析、放射性同位素标记和蛋白免疫印迹法等检测方法。其中在质谱检测过程中，对样品纯度要求较高，而且因为质谱检测本身存在覆盖率较低的问题，再加上磷酸肽与非磷酸化的肽相比占比低，故而覆盖不到的可能性极大；在放射性同位素标记法中，不仅耗费贵而且产生的放射性同位素垃圾存在较大的安全隐患；蛋白免疫印迹法则仅适用于检测已存在磷酸化抗体的多肽底物，但是并不是所有的磷酸化多肽底物都有现成的抗体，专一抗体的生产需要耗费大量时间，代价较高。由于clk3目前仅能体外检测酶活，针对体外各种检测技术的不足，基于荧光共振能量转移的体内检测clk3激酶活性的方法有着良好的应用前景。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的在于克服现有技术的不足，填补活细胞内检测clk3酶活方法的空白，提供一种特异性强、廉价高效的活细胞内实时定量检测clk3激酶活性的fret生物探针及其用途。
[0005]
为实现上述目的，本发明制备了一种活细胞内检测clk3激酶活性的fret生物探
针，所述生物探针包括一对能发生荧光共振能量转移的荧光供体mtfp和荧光受体eyfp、能识别磷酸化标记的fha2结构域、氨基酸序列为ggsgg的柔软构象的连接子以及能被clk3激酶磷酸化的多肽底物片段。
[0006]
进一步地，所述mtfp表示青色荧光蛋白的一种变体，在亮度上超越ecfp，所述eyfp表示增强型黄色荧光蛋白。当这对荧光基团距离足够近时，用445nm的激发光去激发mtfp时，其发射光可以激发eyfp进而产生荧光共振能量转移现象，计算eyfp荧光强度/mtfp荧光强度所得到的荧光强度比值可以对这一过程进行量化。
[0007]
进一步地，所述能被clk3激酶磷酸化的多肽底物片段的氨基酸序列为rsrsrswtrsrsrsr。
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进一步地，所述生物探针的dna序列为seq id no:1，其核苷酸全长1980bp，编码659个氨基酸。
[0009]
进一步地，所述生物探针的氨基酸序列为seq id no:2。
[0010]
进一步地，所述生物探针的5’端包括核输入序列nls(基因序列seq id no:6，氨基酸序列seq id no:7)。
[0011]
进一步地，所述生物探针的5’端包括srsf2蛋白全长序列(基因序列seq id no:8，氨基酸序列seq id no:9)。
[0012]
另一方面，本发明提供一种表达载体，其包含上述的活细胞内检测clk3激酶活性的fret生物探针。
[0013]
另一方面，本发明提供一种细胞，其包含上述的活细胞内检测clk3激酶活性的fret生物探针的表达载体。
[0014]
进一步地，所述细胞选自由hela细胞、293t细胞、u2os细胞、a549细胞、mda-mb-231细胞、mcf7细胞组成的组中。
[0015]
再一方面，本发明提供了上述活细胞内检测clk3激酶活性的fret生物探针在clk3抑制剂分子的筛选中的用途。
[0016]
再一方面，本发明提供了上述的活细胞内检测clk3激酶活性的fret生物探针在活细胞内检测clk3激酶活性中的用途。
[0017]
再一方面，本发明提供了上述的活细胞内检测clk3激酶活性的fret生物探针在活细胞内检测clk3激酶活性的试剂或试剂盒的制备中的用途。
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此外，本发明提供一种活细胞内检测clk3激酶活性的方法，主要步骤包括：
[0019]
(1)基因编码的clk3激酶荧光探针真核表达质粒的构建：首先将该探针在dna水平上构建到商品化的真核表达载体中形成融合质粒，主要步骤包括1)获得各部分基因的核苷酸序列，利用snapgene
tm
1.1.3软件将各部分按附图1所示的顺序依次连接起来在5’和3’端分别加上起始密码子和终止密码子构成一个完整的开放阅读框(open reading frame,orf)，继而交由生物公司进行基因合成；2)将真核表达载体进行双酶切线性化，将探针的基因序列片段经pcr或者酶切线性化后利用分子克隆技术(连接法或者重组法)与线性化载体连到一起构建成封闭环状真核表达质粒；
[0020]
(2)将基因编码的clk3激酶荧光探针真核表达质粒转染至活细胞：首先进行细胞爬片，将适宜密度的细胞接种至六孔细胞培养板中铺上多聚赖氨酸包被的18mmx18mm的盖玻片，放入含5％co2的37℃恒温培养箱静置培养过夜；第二天待细胞爬片完成后且密度达
70-80％即可进行转染操作；每孔转染0.5μg基因编码的clk3激酶荧光探针真核表达质粒；
[0021]
(3)显微观察及荧光强度比值的计算：转染时间超过24h便可利用配有37℃恒温装置的共聚焦显微镜进行荧光检测，在该检测中利用445nm的激光器激发mtfp，mtfp所产生的发射光激发eyfp，显微镜fret双通道可以同时收集mtfp和eyfp的发射荧光，每张细胞爬片约取20个左右的细胞图像收取数据；继而联合使用图像处理软件imagej和数据计算软件metalab来计算相应的eyfp的荧光强度比上mtfp的荧光强度的值并以此值作为评估clk3激酶活性高低的标准。
[0022]
进一步地，为了更好的检测活细胞内具体位置的clk3的酶活大小，在构建好的真核表达质粒探针部分前加不同的定位蛋白序列。
[0023]
进一步地，将核输入序列nls克隆到探针基因5’端以使探针定位至细胞核。
[0024]
进一步地，将srsf2蛋白全长序列克隆到探针基因5’端以使探针定位至核斑点处。
[0025]
进一步地，活细胞是各种离体贴壁培养的真核细胞，包括但不限于hela细胞、293t细胞、u2os细胞、a549细胞、mda-mb-231细胞、mcf7细胞。
[0026]
有益效果
[0027]
本发明提供的检测clk3激酶活性的方法的优势在于：1)基于荧光共振能量转移的方法，灵敏度高，通过eyfp/mtfp计算得到的荧光强度比值能够量化clk3激酶活性，使酶活高低变得直观；2)与体外酶反应相比能在活细胞内实时监测clk3激酶活性，更能反映细胞内的真实酶活水平；3)特异性强，廉价高效；4)无需体外纯化激酶和底物蛋白，操作简单。积极效果在于可以作为一种筛选clk3激酶特异性抑制剂分子的有效方法，同时也能为临床或科学研究工作提供一种有效的检测clk3活性的方式。
附图说明
[0028]
图1为本发明的clk3激酶探针组成结构示意图。
[0029]
图2为本发明的clk3激酶探针工作原理示意图。
[0030]
图3为clk3激酶探针响应clk3激酶活性的高低的示意图。
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图4为clk3激酶探针对clk3激酶活性突变体的响应的示意图。
[0032]
图5为clk3激酶探针特异性验证的示意图。
具体实施方式
[0033]
以下结合附图及具体实施例对本发明进行具体描述。本发明包括但不限于如下实施方式。
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实施例1 clk3激酶探针的设计及原理
[0035]
本发明设计并构建了一种基于fret的能检测clk3激酶活性的生物探针，图1展示了该生物探针的组成，包括供体荧光基团青色荧光蛋白mtfp(1-1)、能识别底物磷酸化标记的fha2结构域蛋白(1-2)、具有柔性结构的氨基酸序列为ggsgg的连接子(1-3)、能被clk3修饰的rsrsrswtrsrsrsr底物多肽(1-4)以及受体荧光基团增强型黄色荧光蛋白(1-5)。在此需要强调的是供体荧光基团青色荧光蛋白mtfp(1-1)与受体荧光基团增强型黄色荧光蛋白(1-5)部分的荧光基团对可以是能发生荧光共振能量转移的任何一对荧光蛋白对。同时如果想在活细胞内靶向具体位置时，可在该探针前加一个靶向定位蛋白序列，以期达到更好
的检测效果。探针检测原理如图2所示，该探针在底物序列未被磷酸化时，荧光基团距离较近，当用445nm激发光激发mtfp时其发射光能激发eyfp，这样便产生较强的荧光共振能量转移，此时eyfp/mtfp计算得到的荧光强度比值较大。当clk3激酶活性较高时，底物序列可以被磷酸化从而使得打上的磷酸化标记被fha2所识别，两者紧密结合后使得原本靠近的荧光基团对距离变远，此时荧光共振能量转移的效应也大大减弱进而使得到的荧光强度比值相应降低。因此，由荧光强度比值的变化便可反映出clk3激酶活性的高低即比值越小，clk3活性越低，反之比值越大，clk3活性越高。
[0036]
实施例2基因编码的clk3激酶生物探针真核表达质粒的构建
[0037]
本发明提到的一种能够检测活细胞内clk3激酶活性的方法，基于基因编码的clk3激酶生物探针真核表达质粒的构建。在ncbi获得mtfp、eyfp蛋白以及fha2的核苷酸序列，经snapgene
tm
1.1.3软件将各部分按mtfp、fha2、连接子序列、底物序列、eyfp的顺序将其对应核苷酸序列依次连接起来，并在5’和3’端分别加上起始密码子和终止密码子构成一个完整的开放阅读框(open reading frame,orf)，继而交由生物公司(安徽通用生物有限公司)进行基因合成(seq id no:1)。进一步通过nheⅰ和kpn2ⅰ双酶切的方法将商品化的真核表达载体pegfp-c1(购自安徽通用生物有限公司)的egfp去除并得到线性化的载体片段，酶切体系如表1。
[0038]
表1酶切体系
[0039][0040]
于37℃水浴酶切1h，继而核酸电泳并切胶回收载体片段。分别以5
’-
tgaaccgtcagatccgctagcaagcttcgccaccatggtga g-3’(seq id no:3),
’-
cactcgagatctgagtccggacttgtacagctcgttcatgcc ttc-3’(seq id no:4)为上下游引物(合成自安徽通用生物有限公司)经pcr扩增得到线性化的探针序列片段，以同源重组的方式将线性化的载体片段与探针序列片段重组连到一起构成一个封闭环状融合质粒。重组反应使用商品化试剂盒(购自诺维赞)完成，具体重组体系如表2。
[0041]
表2重组体系
[0042][0043][0044]
重组产物转化到感受态细胞dh5α中，涂布到含有卡那霉素的平板中筛选阳性克隆，经抗性筛选长出的克隆点便是我们想要的重组产物，进一步再经测序公司测序双重验证后便得到构建成功的基因编码的clk3激酶生物探针真核表达质粒，大量扩增后测量浓度备用。
[0045]
实施例3clk3激酶探针能响应活细胞内clk3激酶活性的高低
[0046]
为了验证clk3激酶探针在活细胞内活性是否具有响应磷酸化水平升高或磷酸化水平降低的能力，我们过表达外源clk3激酶以提高细胞内激酶活性来观察eyfp/mtfp荧光强度比值是否降低，敲低内源clk3降低激酶活性后eyfp/mtfp荧光强度比值是否升高来判定。
[0047]
外源过表达clk3激酶具体操作方法:1)首先构建与探针具有不同颜色荧光标记的clk3真核表达质粒，在这里我们选取红色荧光蛋白mcherry(基因序列seq id no:18，氨基酸序列seq id no:19)并将它们整合到真核表达载体pcdna3.1上得到pcdna3.1-mcherry质粒，继而将clk3基因克隆到pcdna3.1(+)-mcherry的载体上得到pcdna3.1-mcherry-clk3质粒。2)将hela细胞接种到底部铺有多聚赖氨酸包被的18mmx18mm盖玻片的六孔板中使细胞爬片，当细胞汇合度达80％时便可进行转染操作，转染试剂选取lipofectamine
tm 3000脂质体转染试剂(购自invitrogen)，转染方法完全参照说明书所提供的步骤。一孔将clk3激酶探针质粒与对照pcdna3.1-mcherry质粒各0.5μg共同转染，另一孔将clk3激酶探针质粒与pcdna3.1-mcherry-clk3质粒各0.5μg共同转染。3)转染时间超过24h便可进行显微观察，仪器采用尼康ti转盘共聚焦显微镜，同时配有37℃恒温配置故可提供活细胞观察，将细胞爬片取出放在显微镜专用的champer小室中，加约1ml的不含酚红的l-15培养基。445nm激发光激发mtfp，mtfp的发射光激发eyfp，显微镜fret双通道可以同时收集mtfp和eyfp的发射光，每张爬片取约20个细胞收取数据。4)数据处理:联合使用图像处理软件imagej和数据计算软件metalab来计算对应的eyfp的荧光强度比上mtfp的荧光强度的值。
[0048]
敲低clk3激酶具体操作方法：通过敲低内源clk3蛋白量来降低细胞内clk3的激酶活性水平。从生物公司(吉玛基因)订购序列为aagagaaugcagccaaugc(seq id no:5)的clk3的小干扰rna。并同时购入了该公司配套的sirna-mate转染试剂。将sirna粉末用depc水配置成20μm的贮存液，分装存储，由于本实验sirna终浓度为50nm故而要稀释使用，即每孔2ml
的培养基中要加入5μl的sirna。步骤如下：1)细胞爬片：在六孔板中放入清洗干净且无菌的18mmx18mm的盖玻片，多聚赖氨酸包被，每孔接种适量密度的hela细胞，放置37℃恒温培养箱培养过夜；2)转染sirna：当细胞密度达50％-60％时，便可利用sirna-mate转染试剂进行siclk3的转染(全程使用无rna酶的枪头、ep管、培养基、depc水等)同时转染公司配备的sicontrol作为空白对照，具体转染方法参照说明书所述。3)转染探针质粒：待sirna转染24h后，进行clk3探针质粒的转染，使用lipofectamine
tm 3000脂质体转染试剂每孔转染0.5μg。4)显微观察及数据处理同上。
[0049]
结果：图3(a)所示细胞图的颜色代表eyfp/mtfp荧光强度比值的高低，当在活细胞内过表达clk3时，其激酶活性升高比值降低；当敲低clk3使激酶活性降低时比值升高。图3(b)的柱状统计图显示了siclk3后与sicontrol相比eyfp/mtfp荧光强度比值显著升高，学生t检验p<0.001。图3(c)的柱状统计图显示了过表达clk3激酶后与对照相比eyfp/mtfp荧光强度比值显著降低，学生t检验p<0.0001。因此，可以认为clk3激酶探针在活细胞内能够很好的响应激酶活性水平的变化，并能动态检测细胞内clk3激酶活性水平，以eyfp/mtfp荧光强度比值的大小量化酶活水平的高低，相对传统酶活检测技术来讲，更加的便捷直观，同时活细胞水平实时的检测也更具真实性与可信性。
[0050]
实施例4clk3激酶探针对clk3激酶活性突变体的响应
[0051]
为了进一步验证clk3激酶探针对活细胞内激酶活性水平的响应，经文献调研发现当clk3蛋白的第186位赖氨酸突变为精氨酸时，便不再具有激酶活性，因为该位点为atp结合位点，突变后不能结合磷酸基团供体atp所以也就不能行使磷酸化功能。我们将pcdna3.1-mcherry-clk3质粒中的clk3第186位点的赖氨酸突变为精氨酸得到pcdna3.1-mcherry-clk3-k186r质粒，进一步以pcdna3.1-mcherry质粒为空白对照分别将pcdna3.1-mcherry-clk3质粒和pcdna3.1-mcherry-clk3-k186r质粒与clk3激酶探针共转染到hela细胞中，显微观察并计算eyfp/mtfp荧光强度比值，具体操作同实施例3。图4结果表明与对照mcherry组相比野生型clk3的比值显著降低，学生t检验p<0.05。而激酶活性突变体与对照mcherry组相比比值无显著差异。结果提示当激酶活性突变体在活细胞内过表达后，atp不能结合激酶，活性功能被抑制，此时clk3激酶探针检测不到其激酶水平的变化，因此与实施例3双重验证了clk3激酶探针在活细胞中对clk3激酶活性的检测灵敏度极高。
[0052]
实施例5 clk3激酶探针特异性验证
[0053]
clk家族包含clk1/2/3/4，四者的激酶结构域具有高度同源性，为了验证clk3激酶探针仅对clk3激酶具有特异性，将clk1/2/3/4基因(clk1基因序列seq id no:10，氨基酸序列seq id no:11；clk2基因序列seq id no:12，氨基酸序列seq id no:13；clk3基因序列seq id no:14，氨基酸序列seq id no:15；clk4基因序列seq id no:16，氨基酸序列seq id no:17)分别克隆到pcdna3.1-mcherry的载体上。同实施例3，我们将pcdna3.1-mcherry空载质粒以及构建成功的pcdna3.1-mcherry-clk1/2/3/4四种质粒分别与clk3激酶探针共转染到hela细胞中，经显微观察根据eyfp/mtfp荧光强度比值的大小来判定响应情况。结果如图5所示，我们发现与对照相比clk3激酶探针对clk1激酶和clk4激酶是没有任何响应的，对clk2激酶有部分响应，学生t检验p<0.05，但是对clk3激酶的响应效果最为显著，学生t检验p<0.0001。因此，在一定程度上我们可以认为clk3激酶探针对clk3激酶活性的检测是特异性的，它在细胞内仅感知clk3激酶活性的变化。
[0054]
综上所述，本发明提供了一种活细胞内检测clk3激酶活性的fret生物探针，其在活细胞内检测clk3激酶活性时灵敏度高，通过eyfp/mtfp计算得到的荧光强度的比值能够量化clk3激酶活性，使酶活高低变得直观；与体外酶反应相比能在活细胞内实时监测clk3激酶活性，更能反映细胞内的真实酶活水平；特异性强，廉价高效；无需体外纯化激酶和底物蛋白，操作简单。