基于毛细管尖端的纳米单孔及其制备方法和应用

本发明属于纳米孔技术领域，具体涉及一种基于毛细管尖端的纳米单孔及其制备方法和应用。

背景技术：

纳米孔分析技术在单分子检测上有着极其重要的应用，并有望应用于dna测序、蛋白质测序。纳米孔单分子电化学检测技术在单分子行为检测上发展快速，但很难直接通过分子或者离子穿过纳米孔的时候产生的离子流特征电信号来准确地判断分子结构信息。特别是在分子尺寸很小的情况下，离子电流堵塞事件也难以被仪器捕捉。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供一种基于毛细管尖端的纳米单孔，该纳米单孔孔径可控，可达10nm以下，且毛细管后端为宏观尺寸，方便与各种机械、电子设备结合。当纳米孔是由某些金属构成的等离子体纳米孔时，分析物分子在定向电场的驱动下穿过此等离子体纳米孔，由于表面等离子体增强效应，可生成信号较强的分子动态光谱，实际反映较为精确的分子结构信息。通过这样的动态表面增强拉曼检测，既可实现对于单分子过孔的检测，还能进一步提供分子取向和氧化还原状态等结构信息。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种基于毛细管尖端的纳米单孔，所述毛细管尖端的内侧壁上具有沉积层，所述沉积层向毛细管外延伸出中空的锥形结构，所述纳米单孔位于所述锥形结构的尖端，优选的，所述单孔的孔径为150nm以下。

优选的，所述锥形结构为金属，更优选的，所述锥形结构为金、银、铜或铂。所述锥形结构与所述沉积层可以是相同或不同的材质。

优选的，所述沉积层的材质为金属，优选的金属为金、银、铜或铂。

所述的毛细管为石英或玻璃毛细管，尾部为宏观尺寸，截面为圆形或多边形，优选圆形。毛细管中可包含引流管。毛细管的总长度为1～15cm，优选2～10cm。毛细管的制备为现有技术，本发明对此不做特别限定。

所述的毛细管尖端直径为20～200nm，优选直径为60nm。

优选的，所述锥形结构的长度为500nm以下。

本发明还提供上述基于毛细管尖端的纳米单孔的制备方法，包括如下步骤：

向内侧壁上具有沉积层的毛细管尖端内注入前驱体的第一溶液，之后将所述毛细管尖端浸入前驱体的第二溶液中，然后对所述毛细管尖端的内、外施加电压，所述前驱体获得电子在所述毛细管尖端生长，形成所述锥形结构，所述纳米单孔位于所述锥形结构的尖端。所述前驱体为可以还原获得目标材质的离子或化合物。所述前驱体的第一溶液和所述前驱体的第二溶液，浓度可以不同也可以相同。

优选的，所述的前驱体为金属离子，优选为金离子、银离子溶液、铜离子或铂离子。

优选的，所述前驱体的第一溶液或所述前驱体的第二溶液的浓度为5～200mm，最优选为100mm。

优选的，所述施加电压的方法为：在所述毛细管尖端的内、外侧溶液中各插入一根电极，之后在两根电极之间通过线性扫描伏安法或者恒电压的电流-时间法施加电压。出现特征的电流降(线性扫描伏安法)或电流急剧减小(恒电压的电流-时间法)后即可停止。

优选的，所述线性扫描伏安法的扫描范围为0～-5v，最优选的扫描范围为0～-1.5v，扫速为2～200mv/s，最优选为5mv/s。

优选的，所述恒电压的电流-时间法的电压范围为-0.1v～-5v，最优选电压为-1v，电压施加时间范围为1800s以内，最优选时间为300s。

沿毛细管尖端内侧壁上具有的沉积层、插入毛细管内部的电极作为双极电极，在沉积层的尖端对前驱体进行电化学还原，生长出锥形结构。在电化学还原中，特征的电流降或电流急剧减小出现后，终止电化学还原，即可在毛细管尖端得到较为均匀的、孔径较小的纳米单孔。

所述内侧壁上具有沉积层的毛细管尖端由化学还原法或其他现有技术制得。所述化学还原法包括如下步骤：

将前驱体的溶液作为沉积溶液注入所述毛细管尖端内，之后将所述毛细管尖端浸入还原剂溶液中即得。前驱体与对应的沉积层材质和相应的还原剂种类为现有技术，例如氯金酸作为金的前驱体，采用硼氢化钠的无水乙醇溶液还原。

优选的，所述化学还原法中前驱体的浓度为5～200mm，最优选为100mm，还原剂的浓度为1～10mm，最优选为5mm。

优选的，所述化学还原法的反应时间为1～10min，最优选的反应时间为0.5～2min。

本发明第三个目的在于提供上述基于毛细管尖端的纳米单孔在化学分析或生物分析中，尤其是在拉曼检测中的应用。该纳米单孔有着较强的拉曼增强效应。

本发明所制备的纳米单孔主要作为一种电化学器件与拉曼光谱进行联用，检测单分子过孔信号。因此包括两个部分：

其电化学分析步骤：两根同样材质的金属丝分别作为工作电极和对电极，工作电极插入装有电解液的毛细管内部后使用，而对电极则直接插入外部电解液中，通过线性扫描伏安法测试其i-v曲线，在电化学检测单分子过孔时通过时间-电流法来施加恒定电压，使用电流放大器(可采用axopatch200b)来放大电流信号，使用转换器(可采用digidata1550ba/d)来将电流转换成数据。并在与拉曼光谱联用的过程中，通过时间-电流法来施加恒定电位。

拉曼光谱测量方法：采用正置共聚焦拉曼显微镜，633nm激光照射，所用激光强度为6mw(功率100％)。为了只测到尖端金属纳米孔的信号，需保证金属仅沉积在毛细管尖端3微米以内。

基于毛细管尖端的纳米单孔在单分子拉曼领域有很好的应用价值。

应用一：在恒定电压的控制下，低浓度的待测物(罗丹明6g，10^-9m)小分子定向穿过金属纳米孔，可被动态拉曼光谱记录，并被捕捉到罗丹明6g单分子过孔时不同的分子取向信息。

应用二：用于检测血红蛋白单蛋白分子的过孔，可以检测到血红蛋白单分子过孔时的不同的蛋白氧化还原状态。

从上述技术方案以及结果可知，本发明创新性地制备了基于毛细管尖端的纳米单孔，将电化学与拉曼联用，成功实现了电压驱动下单分子过孔的动态拉曼检测。其优势在于原材料简单、廉价、易得，条件温和，器件结构稳定，可重复使用。且毛细管后端为宏观尺寸，方便与各种机械、电子设备结合，潜在的应用价值很大。

附图说明：

图1是实施例1制备纳米单孔的方法示意图。

图2是实施例1中化学还原法制备沉积层的方法示意图。

图3是实施例1中施加电压的i-v曲线图。

图4是实施例1中毛细管尖端及其化学还原、电化学还原后的电镜图。其中a为未反应的毛细管尖端；b为化学还原后的毛细管尖端的侧视图；c为电化学还原后的毛细管的直视图；d为电化学还原后，用聚焦离子束切割后，毛细管尖端内侧的侧视图。

图5是实施例1中锥形结构及单孔生成前后的i-v曲线图(a)、电化学阻抗图(b)、功率谱密度图(c)、拉曼增强效应图(d)。

图6是实施例1中电化学与拉曼联用的装置示意图。

图7是-1v电压下驱动10^-3m和10^-9m罗丹明6g通过锥形金纳米单孔的特征拉曼谱图。

图8是-0.3v电压下驱动10^-9m血红蛋白(溶液为1mlino3，ph7.2的pbs)通过金纳米单孔的特征拉曼谱图。

图9是10^-5m和10^-9m血红蛋白分子(溶液为1mlino3，ph7.2的pbs)过孔电流信号轨迹图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图说明对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：

实施例1

本发明制备纳米单孔的方法，包括如下步骤：

(1)制备毛细管尖端：所用的仪器为美国sutter公司p-2000拉针仪，毛细管为sutter公司的石英毛细管(qf:100-70-10,od:1.00mm,id:0.70mm)，总长度为10cm。设置参数为heat＝750,filament＝3,velocity＝40,delay＝175,pull＝190。

用此规格的毛细管在上述条件下制备出的毛细管尖端直径为60nm，如图4a所示。毛细管总长为2cm，后端为宏观尺寸。

(2)化学还原法制备沉积层：将100mm氯金酸溶液注入毛细管中，在室温(25±1℃)下，将毛细管尖端浸没于5mmnabh4纯乙醇溶液中进行化学还原，反应1～2min，在毛细管尖端内部沉积一层锥形的金沉积层。

(3)制备纳米单孔：向毛细管内注入100mm的氯金酸溶液，然后将毛细管尖端浸入100mm的氯金酸溶液中，管内外各插入一根浸入氯金酸溶液的金电极，分别作为工作电极和对电极，所述工作电极和所述对电极直接通过线性扫描伏安法施加电压0至-1.5v，扫速为5mv/s(所用仪器为chi-830b,chinstrumentins)。化学还原形成的金沉积层作为双极电极，出现特征电流降后终止电化学还原，i-v曲线图如图3所示，最终在尖端还原得到较为均匀的孔径较小的单孔金。过程中对于毛细管尖端的纳米孔的表征如图4所示。其中锥形结构的长度在500nm以下。单孔的孔径约13nm左右。

(4)性能测试。

对制备的纳米单孔进行了电化学及拉曼测试，图4a是在1mnano3溶液中锥形结构金纳米单孔生成前后的i-v曲线图。在高盐浓度下，生成后表现出明显的离子整流现象。图4b是锥形结构金纳米单孔生成前后的电化学阻抗谱图。低频区，纳米孔生成后阻抗增加，说明了小孔径的形成。图4c是锥形结构金纳米单孔生成前后的功率谱密度图。虽然纳米单孔生成后噪音有所增加，但与现有的其他固态纳米孔相比，该纳米孔在高频测量时功率谱密度更低，表现出更小的噪音，在电化学检测上有良好的应用基础。图4d是锥形结构金纳米孔生成前后的拉曼增强效应图。以罗丹明6g作为拉曼信号分子，用来计算拉曼增强因子，金生成后的纳米单孔表现出优越的拉曼增强效应，拉曼增强因子达到了1.1×10⁸。

(5)电化学-拉曼联用

制备的锥形结构金纳米单孔在电化学与拉曼联用的应用中，采用10^-9m罗丹明6g溶液作为待测物，负电压驱动罗丹明6g过孔，示意图如图5所示。当待测的罗丹明6g溶液浓度为10^-9m时，特征拉曼谱图出现了闪烁的信号，根据罗丹明6g溶液的浓度及过孔的离子电流计算可得，每秒钟通过纳米孔的分子数不到一个。如图6所示，同10^-3m浓度下标准的罗丹明6g溶液拉曼谱图相比，10^-9m罗丹明6g溶液的拉曼谱图中的特征峰出现不均一，且会有区别于标准谱峰的“新峰”出现，这些新峰是由单个r6g分子在穿过金纳米孔时取向不同形成的，近一步验证了单分子检测，说明测得的是单分子的罗丹明6g。

实施例2

(1)通过调节参数，制得长度为10cm，尖端直径为20nm的石英毛细管。

(2)化学还原法制备沉积层：将200mm氯金酸溶液注入毛细管中，在室温(25±1℃)下，将毛细管尖端浸没于100mm抗坏血酸溶液中进行化学还原，反应10min，在毛细管尖端内部沉积一层锥形的金沉积层。

(3)制备纳米单孔：向毛细管内注入200mm的硝酸银溶液，然后将毛细管尖端浸入5mm的硝酸银溶液中，管内外各插入一根铂丝电极，分别作为工作电极和对电极，所述工作电极和所述对电极直接通过恒电压的电流-时间法施加电压-1v。化学还原形成的金沉积层作为双极电极，出现电流的急剧下降(约300s)后终止电化学还原，最终在尖端还原得到较为均匀的孔径较小的单孔银。单孔的孔径约8nm左右。

(4)单分子血红蛋白的检测：如图7所示，此锥形的银纳米单孔同样也能在激光照射下，检测到血红蛋白分子的拉曼特征峰，而部分峰的位移对应于单个血红蛋白过孔时的不同氧化还原状态。

实施例3

(1)通过调节参数，制得长度为15cm，尖端直径为200nm的玻璃毛细管。

(2)采用电子束蒸镀技术，在毛细管尖端内壁沉积银层。

(3)制备纳米单孔：向毛细管内注入100mm的氯金酸溶液，然后将毛细管尖端浸入20mm的氯金酸溶液中，管内外各插入一根铂丝电极，分别作为工作电极和对电极，所述工作电极和所述对电极直接通过线性扫描伏安法施加电压0至-5v，扫速为200mv/s(所用仪器为chi-830b,chinstrumentins)。银沉积层作为双极电极，出现特征电流降后终止电化学还原，最终在尖端还原得到较为均匀的单孔金。单孔的孔径约30nm。

(4)单分子的血红蛋白过锥形金纳米单孔：如图8所示，每当有单分子的血红蛋白过孔时，离子电流会有所上升。

实施例4

(1)通过调节参数，制得长度为5cm，尖端直径为100nm的玻璃毛细管。

(2)化学还原法制备沉积层：将5mm氯金酸溶液注入毛细管中，在室温(25±1℃)下，将毛细管尖端浸没于5mmnabh4纯乙醇溶液中进行化学还原，反应0.5min，在毛细管尖端内部沉积一层锥形的金沉积层。

(3)制备纳米单孔：向毛细管内注入20mm的硝酸铜溶液，然后将毛细管尖端浸入5mm的硝酸铜溶液中，管内外各插入一根铂丝电极，分别作为工作电极和对电极，所述工作电极和所述对电极直接通过恒电压的电流-时间法施加电压-5v。金沉积层作为双极电极，1200s后终止电化学还原，最终在尖端还原得到较为均匀的单孔铜。单孔的孔径约100nm。

实施例5

(1)通过调节参数，制得长度为1cm，尖端直径为50nm的石英毛细管。

(2)化学还原法制备沉积层：将5mm氯金酸溶液注入毛细管中，在室温(25±1℃)下，将毛细管尖端浸没于5mmnabh4纯乙醇溶液中进行化学还原，反应0.5min，在毛细管尖端内部沉积一层锥形的金沉积层。

(3)制备纳米单孔：向毛细管内注入100mm的氯铂酸溶液，然后将毛细管尖端浸入10mm的氯铂酸溶液中，管内外各插入一根铂丝电极，分别作为工作电极和对电极，所述工作电极和所述对电极直接通过线性扫描伏安法施加电压0至-1.5v，扫速为2mv/s(所用仪器为chi-830b,chinstrumentins)。化学还原形成的金沉积层作为双极电极，出现特征电流降后终止电化学还原，最终在尖端还原得到较为均匀的孔径较小的单孔铂。单孔的孔径约10nm左右。