一种基于荧光纳米传感的DEHP快速检测方法

本发明涉及增塑剂检测技术领域，具体为一种基于荧光纳米传感的dehp快速检测方法。

背景技术：

邻苯二甲酸酯(简写为paes)作为塑化剂被广泛应用在食品包装材料、服装、洗涤剂、电子设备、医疗设备皮肤护理产品、玩具、药物涂层、涂料和建筑材料等领域，以提高其弹性和耐用性。邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(简写为dehp)是最常用的paes之一，是全球用量最大的塑化剂。研究表明dehp是一种具有毒性作用的塑化剂，其作用于雄激素拮抗剂有关，具有生殖发育毒性，dehp的暴露可导致内分泌紊乱，降低人体免疫力，影响孕妇儿童的身体健康，危害人体生殖能力且促使儿童性早熟，长期大量摄取会导致肝癌。由于dehp具有可迁移性，能从食品包装迁移到饮用水等，导致其已在各种环境基质和食品样品中被检出，严重影响了食品质量安全。因此，对dehp进行检测且监管尤为重要。

目前dehp的检测方法主要有分析仪器法、免疫分析法和生物传感器法。最常用的方法是分析仪器法，其中包括高效液相色谱法(hplc)、高效液相色谱-质谱法(hplc-ms)、气相色谱-质谱法(gc-ms)和质谱法等。然而，目前塑化剂常用的检测方法需要大型仪器、特定实验室和专业的分析操作人员，成本高且检测周期长，不适用于现场大量样品的快速筛查。因此，快速检测方法以其快速、低成本和适用于现场快速筛查等优点成为dehp检测方法的关注热点，其中包括酶联免疫吸附法(elisa)、电化学传感器法、荧光光谱法、表面增强拉曼光谱法(sers)等。

然而，目前上述那些快速检测方法存在一些缺点，如酶联免疫吸附法等方法中所需的单克隆抗体制备时间长，多克隆抗体质量不均匀。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于荧光纳米传感的dehp快速检测方法，测量结果准确、快速、低成本，可适用于现场快速筛查。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于荧光纳米传感的dehp快速检测方法，包括如下步骤：

步骤1，在cuno3溶液中加入三磷酸尿苷、nano3-mops缓冲液、已知浓度的dehp溶液和超纯水，cu²⁺和三磷酸尿苷的摩尔比为3：2，得到混合体系a；

步骤2，将混合体系a孵育后，加入超支化聚乙烯亚胺-铜纳米簇溶液孵育，得到混合体系b；

步骤3，测混合体系b的荧光光谱，得到该dehp浓度下对应的荧光强度变化率；

步骤4，改变步骤1中dehp溶液的浓度，重复步骤1～3，得到若干组dehp浓度和对应的荧光强度变化率，通过线性拟合得到荧光强度变化率和dehp浓度的关系式；

步骤5，将步骤1中已知浓度的dehp溶液和超纯水替换为待测液，然后重复步骤1～3，根据得到的荧光强度变化率代入步骤4得到的关系式中，得到待测液中dehp的浓度。

优选的，步骤1中cu²⁺和nano3-mops缓冲液的比例为0.24mmol：40μl。

优选的，步骤1中已知浓度的dehp溶液、超纯水和cu²⁺的比例为40μl：80μl：0.24mmol。

优选的，步骤2将混合体系a孵育10～25min。

优选的，步骤2加入超支化聚乙烯亚胺-铜纳米簇溶液孵育5～15min，得到混合体系b，超支化聚乙烯亚胺-铜纳米簇溶液和超纯水的体积比为2:1。

进一步，所述的超支化聚乙烯亚胺-铜纳米簇溶液按如下步骤制得：

用乙酸溶液调节超支化聚乙烯亚胺水溶液的ph至4.5～5.5，之后加入cu(no3)2溶液反应5-15min后，加入抗坏血酸反应6～10h，cu(no3)2、抗坏血酸和超支化聚乙烯亚胺的比例为2μmol：7mg：120mg，得到超支化聚乙烯亚胺-铜纳米簇溶液。

进一步，在搅拌的条件下加入抗坏血酸。

优选的，步骤3测混合体系b的荧光光谱时，激发波长设置为385nm。

优选的，步骤4所述若干组dehp浓度范围为0～40mg/kg。

进一步，若干组dehp浓度范围为1～7mg/kg。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明一种基于荧光纳米传感的dehp快速检测方法，先将cu²⁺与三磷酸尿苷、dehp混合，再使用nano3-mops缓冲液调节混合体系的ph后孵育，这样可使dehp在三磷酸尿苷作用下与cu²⁺充分进行反应，cu²⁺被dehp消耗，之后加入超支化聚乙烯亚胺-铜纳米簇溶液孵育，剩余的cu²⁺与超支化聚乙烯亚胺-铜纳米簇反应，经测其荧光光谱，可得到一定dehp浓度下对应的荧光强度变化率，这样通过改变最初dehp溶液的浓度重复操作可得到若干组dehp浓度和对应的荧光强度变化率，因此通过线性拟合可得到荧光强度变化率和dehp浓度的关系式，最后将最初的dehp替换为未知浓度的待测液重复操作，可得到其荧光强度变化率，最终代入上述关系式中，得到待测液中dehp的浓度。

进一步的，铜纳米簇具有高荧光量子产率、优异生物相容性、强抗光漂白能力的优点，且其荧光发射波长在紫外、可见和红外范围内可调，广泛应用于荧光光谱快速检测中，因此本发明以超支化聚乙烯亚胺为模板，合成超支化聚乙烯亚胺-铜纳米簇，利用其较好的荧光性能，以其作为荧光输出信号，构建turnon型荧光传感器对dehp进行检测。

附图说明

图1为本发明所述hpei-cuncsturnon型纳米荧光传感器对dehp进行检测的原理图；

图2为本发明所述dehp与cu²⁺在三磷酸尿苷(utp)作用下的反应过程图。

图3为本发明实施例1所得hpei-cuncs的荧光光谱图。

图4a为本发明实施例1所得hpei-cuncs的形貌图。

图4b为本发明实施例1所得hpei-cuncs的粒径分布图。

图5为本发明不同dehp浓度下所得的荧光光谱图。

图6为本发明dehp浓度在0～40mg/kg范围内的荧光强度变化率与dehp浓度的曲线。

图7为本发明dehp浓度在1～7mg/kg范围内的荧光强度变化率与dehp浓度的线性关系图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明一种基于荧光纳米传感的dehp快速检测方法，如图1所示，在发绿色荧光的hpei-cuncs中加入cu²⁺，cu²⁺与hpei形成铜氨配体，cuncs的荧光被猝灭；当同时存在cu²⁺和dehp时，根据文献报道cu²⁺和dehp在utp的作用下可形成复杂的螯合物，cu²⁺无法猝灭hpei-cuncs的荧光，从而达到检测dehp的目的，cu²⁺和dehp的具体反应过程如图2所示。

具体地，

本发明一种基于荧光纳米传感的dehp快速检测方法，包括如下步骤：

步骤1.合成超支化聚乙烯亚胺-铜纳米簇(hpei-cuncs)

步骤1a，将120mghpei溶解在2ml的超纯水中，并搅拌10min帮助其溶解，所得溶液用乙酸溶液调节其至ph，使其ph调节至4.5～5.5。

步骤1b，边搅拌边加入2ml1mm的cu(no3)2，cu(no3)2和hpei反应5～15min中后，将7mg抗坏血酸(简写为aa)加入其溶液中，在搅拌下反应6～10小时，得到hpei-cuncs。

上述反应均在室温下进行，hpei-cuncs以溶液的形式保存，上述反应完成后的溶液即为hpei-cuncs溶液。

步骤1c，将hpei-cuncs溶液放置在4℃冰箱中保存，以备后续操作使用。

步骤2.对hpei-cuncs进行表征

利用f-7000fl荧光分光光度计(hitachi公司，日本)对hpei-cuncs进行荧光光谱表征。

如图3所示，随着激发波长的改变，hpei-cuncs的发射波长也随着发生变化。当选择激发波长为385nm时，hpei-cuncs在510nm处荧光峰最强。利用em-2010透射电子显微镜(日本电子珠式会社，日本)对hpei-cuncs进行形态表征。如图4所示，hpei-cuncs呈现很好的分散性，没有团聚的现象产生，为后续的操作提供稳定的荧光探针。hpei-cuncs的tem结果显示其平均粒径在1.3±0.3nm。

步骤3.dehp的检测

在40μl6μmcu²⁺溶液中加入40μl4mm的utp，40μl10×nano3-mops缓冲液，再加入40μl不同浓度的dehp溶液和80μl超纯水，混合溶液在常温孵育10～25min后，加入160μl的hpei-cuncs溶液孵育5～15min，得到孵育后的混合溶液。

10×nano3-mops缓冲液为ph等于7.0的nano3和3-(4-吗啉基)-2-羟基丙烷磺酸的混合溶液，其中nano3的浓度为500mm，3-(4-吗啉基)-2-羟基丙烷磺酸的浓度为200mm。

将孵育后的混合溶液加入荧光分光光度计的微量比色池中，激发波长设置为385nm，扫描其发射波长，用荧光分光光度计测其荧光光谱。

如图5所示，曲线1～曲线11分别是dehp浓度为0mg/kg，1mg/kg，1.5mg/kg，2.0mg/kg，3.0mg/kg，4.0mg/kg，5.0mg/kg，6.0mg/kg，7.0mg/kg，10mg/kg，40mg/kg时，hpei-cuncs的荧光光谱曲线。如图6可以看出，dehp浓度在0～40mg/kg的范围内能被此hpei-cuncs荧光传感器检测，当信噪比为3时计算出最低检出限约为0.4mg/kg。如图7所示，荧光强度变化率(i-i0)/i0与dehp浓度在1～7mg/kg的范围内呈现良好的线性关系。

将上述40μl不同浓度的dehp溶液和80μl超纯水替换为待测液，然后重复操作，根据得到的荧光强度变化率代入图7得到的关系式中，得到待测液中dehp的浓度。

本发明在实际样品中对dehp检测时，包括如下步骤：

步骤1.合成超支化聚乙烯亚胺-铜纳米簇(hpei-cuncs)

步骤1a，将120mghpei溶解在2ml的超纯水中，并搅拌10min帮助其溶解，所得溶液用乙酸溶液调节其至ph，使其ph调节至5。

步骤1b，边搅拌边加入2ml1mm的cu(no3)2，cu(no3)2和hpei反应10min中后，将7mg抗坏血酸(简写为aa)加入其溶液中，在搅拌下反应8小时，得到hpei-cuncs。

上述反应均在室温下进行，hpei-cuncs以溶液的形式保存，上述反应完成后的溶液即为hpei-cuncs溶液。

步骤1c，将hpei-cuncs溶液放置在4℃冰箱中保存，以备后续操作使用。

步骤2.dehp的检测

在40μl6μmcu²⁺溶液中加入40μl4mm的utp，40μl10×nano3-mops缓冲液，再加入待测液，混合溶液在常温孵育15min后，加入160μl的hpei-cuncs溶液孵育10min，得到孵育后的混合溶液。

将孵育后的混合溶液加入荧光分光光度计的微量比色池中，激发波长设置为385nm，扫描其发射波长，用荧光分光光度计测其荧光光谱，得到的荧光强度变化率代入图7得到的关系式中，得到待测液中dehp的浓度。

本发明方法的验证

采用标准加入法对空白白酒中的dehp的浓度进行检测，即在白酒样品中加入不同浓度的dehp标准品进行加标回收率实验，检测出的dehp含量回收率如表1所示，说明hpei-cuncsturnon型纳米荧光传感器有望用于实际样品中dehp的检测。

表1白酒中dehp的检测