激光共聚焦显影观测定量葡萄籽物料中油脂的方法

本发明构建了一套通过激光共聚焦显影观测葡萄籽油在提取物料颗粒中的三维空间分布的方法，包括对物料内容物的特异性染色、荧光观测及精确定量等，该法可用于油脂提取及反应机理的辅助研究。

背景技术：

近年来随着光电子、图像加工处理等技术的迅猛发展，使得对微细颗粒形态结构进行可视化显影成为可能，在食品加工、生物分离及植物生理等领域均有广泛应用。以电子束为介质的扫描电子显微镜技术，可在纳米尺度上来研究微观结构的变化。进一步结合染色技术对物料内部特定物质染色后，借助荧光观测进行定位分析，尤其是借助于以激光为光源的激光共聚焦显微镜对物料内部聚焦成像，能够以非破坏性的方式观察到内部三维空间结构中目标物质的动态变化和传质过程，如蓖麻籽粉中的脂质体形态变化、莴苣嫩茎中的果胶从细胞壁分解至细胞间隙、刺梨果皮中的甜菜素和酚类化合物从细胞内部释放到细胞间隙。葡萄籽是一种理想的油脂提取原料，富含油脂，不饱和脂肪酸含量高达85％，其主要成分是人体必需脂肪酸亚油酸。由此可见，微观显影技术可作为一种直观的分析方法引入到油脂提取过程的研究中，追踪目标成分在物料内部的空间分布，监测传质过程中的释放机制，从而阐明提取机理，为传统动力学、热力学理论研究提供参考依据。

二氧化碳膨胀乙醇(cxe)和超临界二氧化碳等加压流体属于环境友好型的绿色溶剂，但提取机制相对比较复杂，需要构建一套激光共聚焦观测定量技术，考察在加压流体提取过程中物料颗粒中油的空间分布，对其释放过程进行动态分析，初步阐明提取机理，并从微观角度直观地比较不同方法的提取能力。现代食品工业已进入依托大数据和人工智能的自控化发展阶段，非常需要引入一些前沿的显微成像技术来监测加工处理过程中食品物料的基质特性及主要成分变化，追踪目标成分在空间上的分布和迁移，最终有望形成一套实时准确的原位监测方法，为理论研究提供依据，并促进实际的生产操作，例如可用于观测加工处理过程中食品物料的基质特性及主要成分变化。

目前，一般采用普通光学显微镜观测油料内部的油脂分布状况，此方法的缺陷是：只能观测切片上二维平面的油滴，无法了解油脂在整个油料颗粒内部的空间分布及定量分析。

技术实现要素：

本发明要解决的问题是构建一套激光共聚焦显影观测定量葡萄籽物料中油脂的方法，可用于油脂提取及反应机理的辅助研究，并促进实际的生产操作。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种激光共聚焦显影观测定量葡萄籽物料中油脂的方法，包含以下步骤：

1)、预处理：

先用32目的标准筛分器对葡萄籽颗粒进行粒度分级，将满足上述分级条件的葡萄籽颗粒进行提取(加压提取)；

在提取葡萄籽油过程中的不同时刻进行取样，从而分别得不同时刻对应的葡萄籽颗粒(粒径约为0.5mm)；

2)、切片：

使用冷冻切片机在-20℃(冷箱温度-20℃，冷台温度-20℃)，切片厚度设置为50μm的条件下，将步骤1)所得到的提取过程中的葡萄籽颗粒从边缘向中心处进行冷冻切片，选择第一个切片作为外表区域切片，选择第3个切片作为浅表区域切片，选择第5个切片作为中心区域切片；

将外表区域切片、浅表区域切片、中心区域切片这3个葡萄籽切片分别放置于载玻片上；

3)、染色：

配制浓度为5±0.5ug/ml的尼罗红乙醇溶液；将步骤2)制得的3张带切片的载玻片放置于尼罗红乙醇染液中避光反应10±1min；

4)、观测油脂的三维空间分布：

将步骤3)所得的装有染色物料的载玻片(盖玻片在下，载玻片在上)放置于激光扫描共聚焦显微镜的载物台上；根据所得图像，观测葡萄籽颗粒油脂的三维空间分布(利用相应软件进行观测)；

5)、油脂的荧光定量：

标记步骤4)所得的三维复合荧光图像的荧光，计算荧光面积比(faf)，并计算获得油含量(sof)。

作为本发明的激光共聚焦显影观测定量葡萄籽物料中油脂的方法的改进：

所述步骤5)为：

使用imagej图像数据分析软件标记步骤4)得到的三维复合荧光图像200μm×150μm视野范围内的荧光，计算荧光面积比(faf)；

利用下式来计算荧光法得到的油含量(sof)：

sof＝0.14faf+0.1。

作为本发明的激光共聚焦显影观测定量葡萄籽物料中油脂的方法的进一步改进：

所述步骤1)的加压提取包括超临界co2提取、cxe提取。

作为本发明的激光共聚焦显影观测定量葡萄籽物料中油脂的方法的进一步改进：

所述步骤4)为：

将步骤3)所得的装有染色物料的载玻片(盖玻片在下，载玻片在上)放置于激光扫描共聚焦显微镜的载物台上；分辨率设置为512×512分辨率，频率设置为400hz，探测器负高压值设置为603；打开激光光源，选择xyz三维扫描(z-stack)模式，使用莱卡激光扫描共聚焦显微镜图像处理软件(las-af)处理样品图像；选择20倍水浸物镜或63倍水浸物镜，在连续扫描模式下获得2d图像，在最大强度模式下利用las-af软件生成三维复合荧光图像，此图像可观测葡萄籽颗粒油脂的三维空间分布。

作为本发明的激光共聚焦显影观测定量葡萄籽物料中油脂的方法的进一步改进：

所述步骤3)中：取5mg尼罗红溶于5ml乙醇中，得到质量浓度为1mg/ml的尼罗红母液，将母液置于4℃避光保存；使用移液枪吸取尼罗红母液0.5ml，用乙醇定容至100ml容量瓶中，得到5ug/ml的尼罗红溶液，现配现用；将步骤2)制得的3张载玻片放置于尼罗红乙醇染液中避光反应10min。

本发明表明新构建的荧光定量方法能够较好地应用于后续的显微摄影技术中。

本发明中，尼罗红是一种苯并吩恶嗪类的疏水性染料，能与脂类等极性物质特异性结合而发出金黄色荧光。利用尼罗红对葡萄籽粉进行染色，可以用来监测提取过程中物料内部油脂的存在。发明中的5ug/ml的尼罗红溶液是1ug/ml～10ug/ml尼罗红溶液中染色效果最佳的浓度。

本发明中，基于尼罗红对葡萄籽油的特异性染色的特性，进一步探讨了荧光定量油脂的可行性。结果表明新构建的荧光定量方法能够较好地应用于接下来的显微摄影技术中，为直观地观察葡萄籽油提取的动态过程提供新的思路。

本发明中，激光扫描共聚焦显微镜以激光为光源，可以以非破坏性的方式观察到内部三维空间结构中目标物质的动态变化和传质过程。利用激光扫描共聚焦显微镜考察了葡萄籽油提取不同阶段中的油的空间分布及量的变化，进而可对油释放过程进行动态分析。

本发明的激光共聚焦显影观测定量葡萄籽物料中油脂的方法，具有以下技术优势：

1)、了解葡萄籽物料内部的微观结构及存在的内容物外，能进一步辨识内容物的化学组成；

2)、通过构建特异性染色方法，可用于检测提取过程中物料内部油脂的存在；

3)、构建油脂定量方法应用于激光共聚焦显影技术，为直观地观察葡萄籽油提取的动态过程提供新的思路；

4)、可用于考察葡萄籽提取过程中油的空间分布，进而可对油释放过程进行动态分析；

5)、能直观地显示不同方法下油被溶剂提取的程度及过程，进而分析溶剂的极性、渗透能力等相关影响因素。可用于油脂提取及反应机理的辅助研究，为理论研究提供依据，并促进实际的生产操作。

综上所述，本发明涉及观测油脂的三维空间分布及油脂的荧光定量方法，能够以非破坏性的方式观察到内部三维空间结构中目标物质的动态变化和传质过程，本发明带来的技术优势是追踪目标成分在油料内部的空间分布，监测油脂在传质过程中的释放机制。采用本发明的方法，在各类食品加工、生物分离等领域中，用于观测油脂在物料颗料中的分布，可以准确测定提取物料中油脂的含量及监测目标物的迁移，该项技术可广泛应用于加工工艺的优化及相关传质动力学的研究。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为切片示意图；

a：中心区域，b：浅表区域；c：外表区域。

图2为激光扫描共聚焦显微镜观测葡萄籽物料cxe提取的阶段过程图像，标尺统一为25μm。

图3为激光扫描共聚焦显微镜观测葡萄籽物料cxe提取120min得到的三维空间分布图像，标尺统一为100μm。

图4为激光扫描共聚焦显微镜观测葡萄籽物料正己烷索氏提取360min得到的三维空间分布图像，标尺统一为100μm。

图5为激光扫描共聚焦显微镜观测葡萄籽物料超临界co2提取180min得到的三维空间分布图像，标尺统一为100μm。

图6为葡萄籽粉末颗粒内部微观结构sem显影图，标尺统一为40μm。

图7为荧光显微镜观测cxe提取葡萄籽物料三阶段图像，标尺统一为100μm。

图8为普通光学显微镜观测超临界co2提取葡萄籽物料图像。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

本发明中，没有明确告知的，均为在常规室温下进行。

实施例1、激光扫描共聚焦显微镜观测定量cxe提取葡萄籽中的油脂

1)、称取30g葡萄籽粉末(用32目标准筛分器进行筛分所得的葡萄籽粉末，颗粒大小约为0.5mm)与等体积玻璃珠混匀后，装入超临界天然产物萃取装置，将超临界co2(7.4mpa、314k)和乙醇混合形成cxe流体(摩尔分率0.3，即，co2与乙醇的摩尔比为0.3：1)，对物料进行提取，该提取方法为现有技术，例如可参照已公开发表于《greenchemistry》的二氧化碳膨胀液体萃取法。

提取120min，每隔30min进行取样(取样量约为5g)，对取样所得的样品先旋转蒸发除去乙醇，从而得到粒径约为0.5mm的葡萄籽物料颗粒；

第一次取样对应的是恒速期，第二次取样对应的是减速期，第三次取样对应的是扩散期。

cxe提取呈现出三阶段过程：恒速期、减速期、扩散期。

将步骤1)不同提取时间得到的提取过程中的葡萄籽颗粒分别各自进行以下步骤2)～步骤4)：

2)、切片：

使用冷冻切片机在冷箱温度-20℃，冷台温度-20℃，切片厚度设置为50μm的条件下；将步骤1)所得到的提取过程中的葡萄籽颗粒从边缘向中心处进行冷冻切片，选择第一个切片作为外表区域切片，选择第3个切片作为浅表区域切片，选择第5个切片作为中心区域切片；

将外表区域切片、浅表区域切片、中心区域切片这3个葡萄籽切片分别放置于载玻片上；

3)、染色：

取5mg尼罗红溶于5ml乙醇中，得到浓度为1mg/ml的尼罗红母液，将母液置于4℃避光保存。使用移液枪吸取尼罗红母液0.5ml，用乙醇定容至100ml容量瓶中，得到5ug/ml的尼罗红溶液，现配现用。将步骤2)制得的3张载玻片放置于尼罗红乙醇染液中避光染色反应10min。

4)、观测油脂的三维空间分布：

将染色好的葡萄籽切片盖上盖玻片用激光扫面共聚焦显微镜进行观测，即，将装有染色物料的载玻片(盖玻片在下，载玻片在上)放置于激光扫描共聚焦显微镜的载物台上；分辨率设置为(512×512)分辨率，频率设置为400hz，探测器负高压值设置为603；

打开激光光源，选择xyz三维扫描(z-stack)模式，使用488nm氩激光激发尼罗红，在发射光为500～600nm之间收集图像。在连续扫描模式下，使用400hz的扫描频率获得2d图像和z-stack。

即，选择20倍水浸物镜或63倍水浸物镜，在连续扫描模式下获得2d图像，在最大强度模式(最大强度投射)下利用las-af软件生成三维复合荧光图像。此图像可观测葡萄籽颗粒油脂的三维空间分布。

观测葡萄籽颗粒油脂的三维空间分布的目的/用途是：追踪目标成分在物料内部的空间分布，监测传质过程中的释放机制，从而阐明提取机理，为传统动力学、热力学理论研究提供参考依据。

5)、油脂的荧光定量：

使用imagej图像数据分析软件标记步骤4)得到的三维复合荧光图像200μm×150μm视野范围内的荧光，计算荧光面积比(faf)。

分别取步骤1不同提取时间(恒速期、减速期、扩散期)后的葡萄籽颗粒进行正己烷索氏提取，得到的葡萄籽油称重，计算油含量(sow)。将油含量(sow)与荧光面积比(faf)进行相应的相关性分析，两组数据的相关系数高达0.982，葡萄籽粉末油含量与faf值呈线性相关，可由下式来计算荧光法得到的油含量(sof)：sof＝0.14faf+0.001。

说明：正己烷索氏提取法为常规技术，例如可参照已公开的《溶剂提取法提取葡萄籽油的工艺研究》进行提取。

图2为激光扫描共聚焦显微镜观测葡萄籽物料cxe提取的阶段过程图像，由图像计算原料的中心区、浅表区和外表区的faf值都接近100％；恒速阶段的中心区、浅表区和外表区的faf值分别为60.1％、24.8％、18.9％；减速阶段的中心区、浅表区和外表区的faf值分别为50.2％、13.1％、8.9％；扩散阶段的中心区、浅表区和外表区的faf值分别为8.5％、7.9％、7.9％；通过图像可观测葡萄籽物料油脂的三维空间分布以及对油释放过程进行动态分析。

取减速阶段三个区域的faf值进行计算。经过计算，中心区域切片、浅表区域切片和外表区域切片的油含量(sof)分别为7.128％、1.934％、1.346％。

本发明经过多次实验验证得知：扩散期时，中心区域切片、浅表区域切片和外表区域切片的faf值基本一致。

图3为葡萄籽物料cxe提取120min观测得到的三维空间分布图像，由图像计算得知：外表区域faf值为5.3％。经过计算，提取120min后的葡萄籽物料外表区域油含量(sof)为0.842％。经过本行业公认的检测正确性高的有机溶剂称重法所得的油含量(sof)为0.874％。因此，能证明本发明结论的正确性。

实施例2、激光扫描共聚焦显微镜观测定量正己烷索氏提取葡萄籽中的油脂

1)、称取50g葡萄籽物料(用32目标准筛分器进行筛分所得的葡萄籽粉末，颗粒大小约为0.5mm)置于索氏提取装置中，萃取温度75℃，按照料液比1g：10ml的料液比，加入500ml正己烷提取360min，旋转蒸发除去正己烷溶剂，得到粒径约为0.5mm的葡萄籽物料颗粒。

说明：提取360min后处于扩散期。

步骤2)～步骤4)，同实施例1的步骤2)～步骤4)；

5)、使用imagej图像数据分析软件标记步骤4)得到的三维复合荧光图像200μm×150μm视野范围内的荧光，计算荧光面积比(faf)。

代入公式sof＝0.14faf+0.001。

图4为葡萄籽物料正己烷索氏提取360min观测得到的三维空间分布图像，由图像计算得到外表区域切片faf值约为7.9％。经过计算，正己烷索氏提取360min葡萄籽物料外表区域切片的油含量(sof)为1.21％。经过有机溶剂称重法所得的油含量(sof)为1.23％。

实施例3、激光扫描共聚焦显微镜观测定量超临界co2提取葡萄籽中的油脂

1)、准确称取30g葡萄籽物料(用32目标准筛分器进行筛分所得的葡萄籽粉末，颗粒大小约为0.5mm)于提取容器中，在压力为25mpa，温度为313k，co2流速为2l/min的条件下，提取时间180min，从而分别得到葡萄籽油和粒径约为0.5mm的葡萄籽物料颗粒。

说明：提取180min后处于扩散期。

步骤2)～步骤4)，同实施例1的步骤2)～步骤4)；

5)、使用imagej图像数据分析软件标记步骤4)得到的三维复合荧光图像200μm×150μm视野范围内的荧光，计算荧光面积比(faf)。

代入公式sof＝0.14faf+0.001。

图5为葡萄籽物料超临界co2提取180min观测得到的三维空间分布图像，由图像计算得到外表区域切片faf值约为27％。超临界co2虽然也是加压流体，但因其溶剂极性范围并不适合提取葡萄籽油，因而提取得率低于其它两种方法。

经过计算，超临界co2提取180min的葡萄籽物料外表区域切片油含量(sof)为3.88％。而经过有机溶剂称重法所得的油含量(sof)为4.036％。

对比例1、扫描电子显微镜观察葡萄籽粉末内部结构

将激光扫描共聚焦显微镜观测改成如同现有技术所述的扫描电镜观测。

称取30g葡萄籽粉末，以250ml正己烷为溶剂，在75℃下索氏提取300min后，取出葡萄籽粉样品55℃真空干燥。

说明：提取300min后处于扩散期。

使用冷冻切片机对索氏提取得到的葡萄籽粉样品进行切片，厚度为100μm，从葡萄籽颗粒从边缘向中心处进行冷冻切片，选择第1个切片作为外表区域切片，选择第3个切片作为中心区域切片；固定至导电胶，表面镀金，采用场发射扫描电镜对葡萄籽粉微观结构进行观测。

图6为葡萄籽粉末颗粒内部微观结构sem显影图。虽然从图像中可以了解葡萄籽物料内部的微观结构及存在的内容物，但并不能辨识内容物的化学组成。

而本发明的使用激光扫描共聚焦显影观测定量油脂的方法能以非破坏性的方式观察到内部三维空间结构中目标物质的化学组成、动态变化和传质过程。即，按照本发明的方法，利用尼罗红染色，在荧光显微镜里根据是否发出荧光即可辨别里面是否含有油脂。用别的显微镜观察得用破坏性的方法才能得到葡萄籽颗粒三维空间结构。

对比例2、二维荧光显微镜观测cxe提取葡萄籽中的油脂

将实施例1中的激光扫描共聚焦显微镜观测改成如同现有技术所述的二维荧光显微镜观测。

即，将实施例1步骤3)染色好的葡萄籽切片盖上盖玻片使用荧光显微镜进行扫描观察，目镜为10倍，物镜为20倍，在荧光场下，激发波长为488nm，吸收波长为528～600nm。

图7为荧光显微镜观测cxe提取葡萄籽物料三阶段图像。

根据图7可得知：荧光显微镜无法了解油脂在物料内部的空间分布及状态，更不能解释在不同提取阶段葡萄籽油的释放速率的差异。

而使用本发明的激光扫描共聚焦显影观测定量油脂的方法，能追踪目标成分在物料内部的空间分布，监测传质过程中的释放机制，进而可对油释放过程进行动态分析，从而阐明提取机理，为传统动力学、热力学理论研究提供参考依据。

对比例3、普通光学显微镜观测超临界co2提取葡萄籽中的油脂

采用超临界天然产物萃取装置进行超临界co2提取葡萄籽油。准确称取30g葡萄籽物料于提取容器中，在压力为25mpa，温度为313k，co2流速为2l/min的条件下，提取时间180min。

使用冷冻切片机对超临界co2提取得到的葡萄籽颗粒进行切片，厚度为15μm，任选一个切片放置于载玻片上，并用3μg/ml的油红染液避光染色10min。将染色好的葡萄籽切片盖上盖玻片用普通光学显微镜进行观测。

图8为通光学显微镜观测超临界co2提取葡萄籽物料图像。普通光学显微镜只能观测切片上二维平面的油滴，无法了解油脂在整个油料颗粒内部的空间分布及定量分析。

而本发明使用激光扫描共聚焦显影观测定量油脂的方法，能追踪目标成分在物料内部的空间分布，监测传质过程中的释放机制，进而可对油释放过程进行动态分析，从而阐明提取机理，为传统动力学、热力学理论研究提供参考依据。

对比例4、将实施例2中的尼罗红乙醇溶液浓度由5ug/ml改成1ug/ml或者改成10ug/ml；其余等同于实施例2。

所得结果为：尼罗红浓度太低会导致物料的荧光显色非常微弱，无法进行定量分析；尼罗红浓度太高会导致荧光过强干扰观察，也无法进行定量分析。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。