用于检测D-阿洛酮糖以及酮糖3-差向异构酶的试剂盒

技术领域：

本发明涉及检测试剂领域，具体涉及一种用于检测d-阿洛酮糖以及酮糖3-差向异构酶的试剂盒，以及基于该试剂盒的检测方法。

背景技术：
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阿洛酮糖是稀有糖家族的重要成员，只存在于少数植物和某些细菌中，含量极低。d-阿洛酮糖因具有较高的甜度和较低的能量而被认为是一种理想的甜味剂和蔗糖的有效替代品，而且d-阿洛酮糖因其生理特性的多样性，已逐渐成为制药、保健和食品工业的潜在功能成分。

d-阿洛酮糖的制备方法主要有化学合成法和生物转化法。化学合成方法存在反应步骤多、反应条件苛刻、产率较低、副产物多和分离纯化困难等缺点。生物合成法生产d-阿洛酮糖是利用微生物所产特异性的酶催化底物合成d-阿洛酮糖。酶法合成d-阿洛酮糖目前已成为领域内首选的合成方法。目前为止，已经筛选并鉴定的酮糖3-差向异构酶(ketose-3-epimerase，kease)至少有20种，包括：d-塔格糖3-差向异构酶(dtease)、d-阿洛酮糖3-差向异构酶(daease)和l-核酮糖3-差向异构酶(lrease)等。但其中大多数的酶对d-果糖的催化活性较低且热稳定性较差，这大大的限制了生物酶法生产d-阿洛酮糖的工业实际应用。因此，新酶的挖掘以及酶的分子改造以获得高活性高热稳定性酶分子已成为科学研究领域和工业实际应用领域的迫切需求。对新酶的挖掘以及酶分子的改造的关键是建立方法使得能够快速有效地从大型酶数据库或酶突变体库中识别出改良的酶分子。目前定量分析d-阿洛酮糖的方法主要为色谱法，包括：薄层色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法、高ph阴离子交换色谱法、粒径排除色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳等，其中最常用的是高效液相色谱。这些方法虽然准确，但不适合对d-阿洛酮糖的高通量分析，而且由于测定过程需要消耗大量时间，不允许对在酶定向进化筛选运动中所产生的大规模变异体库进行高通量筛选。因此，开发一种高效、灵敏且适合高通量筛选的试剂及检测方法来定量检测样品中d-阿洛酮糖的浓度(含量)并筛选酮糖3-差向异构酶是当前迫切需要的。

技术实现要素：
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鉴于上述问题，本发明提供一种可检测d-阿洛酮糖以及酮糖3-差向异构酶的试剂盒及检测方法，具有高效高通量、高灵敏度、不易受其他糖类分子干扰的特点。

本发明技术方案如下：

一种d-阿洛酮糖定量测定试剂盒，其特征在于包括：试剂ⅰ、试剂ⅱ、试剂ⅲ以及试剂ⅳ；其中，试剂ⅰ为磷酸盐缓冲液，试剂ⅱ的主要成分为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)，试剂ⅲ的主要成分为核糖醇脱氢酶，试剂ⅳ的主要成分为d-阿洛酮糖。

进一步地，所述试剂ⅱ为溶解于试剂ⅰ中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为40～100mg/ml；所述试剂ⅲ为溶解于试剂ⅰ中的核糖醇脱氢酶，其中核糖醇脱氢酶的浓度为5～10mg/ml；所述试剂ⅳ为溶解于试剂ⅰ中的d-阿洛酮糖，其中d-阿洛酮糖的浓度为5～10mg/ml。

优选地，所述试剂ⅰ由如下浓度的组分组成：nacl3.0～10.0mg/ml，kcl0.05～1.0mg/ml，na2hpo40.3～2.0mg/ml，kh2po40.01～0.5mg/ml。

在此基础上，本发明提供一种基于上述试剂盒的d-阿洛酮糖的定量测定方法，包括如下步骤：

1)将试剂ⅰ的ph调至6.5～10.0，将试剂ⅱ和试剂ⅰ混合得到混合液，使混合液中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度所对应的吸光度值在可检测的范围内；

2)用试剂ⅰ对试剂ⅳ进行梯度或倍数稀释，得到一组具有不同d-阿洛酮糖浓度的稀释溶液；以摩尔浓度计算，稀释溶液中d-阿洛酮糖的浓度最高不超过混合液中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度；

3)将混合液分别与步骤2)获得的各稀释溶液等体积混合，测定每个混合后样品在340nm的吸光度值；之后向每个样品中加入适量试剂ⅲ，37℃反应15min后再次检测每个样品在340nm的吸光度值；

4)根据步骤3)反应前每个样品的d-阿洛酮糖浓度以及每个样品在反应前、后的吸光度值差值作d-阿洛酮糖浓度与吸光度值差值的标准曲线，同时将获得的吸光度值差值中以最大值和最小值为端点构成的区间作为参考区间；

5)用试剂ⅰ对待测样品进行梯度或倍数稀释，将混合液分别与稀释后的各样品等体积混合，测定每个样品在340nm的吸光度值；之后向每个样品中加入适量试剂ⅲ，37℃反应15min后再次检测每个样品在340nm的吸光度值；

6)计算每个样品在反应前、后的吸光度值差值，当有样品的吸光度值差值处于步骤4)获得的参考区间内时，则可根据该吸光度值差值参照步骤4)获得的标准曲线计算得到样品对应的d-阿洛酮糖浓度，最后根据步骤5)中样品对应的稀释梯度或倍数换算即可得到待测样品中d-阿洛酮糖的浓度；如果所有样品的吸光度值差值均不在步骤4)获得的参考区间内，则需重新执行步骤5)，其中对待测样品的稀释需采用新的稀释梯度或倍数，直至有稀释后的样品吸光度值差值处于步骤4)获得的参考区间内。

优选地，所述步骤1)获得的混合液中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为1.5～3.0mg/ml；所述步骤2)中，试剂ⅳ经梯度或倍数稀释得到的稀释溶液组中，d-阿洛酮糖的浓度在0.05～0.4mg/ml的浓度范围内分布；所述步骤3)及步骤5)中，试剂ⅲ的添加量应满足：每毫升反应体系中核糖醇脱氢酶的含量不低于0.1mg。

本发明的有益效果在于：

1)操作简单、检测快捷，相比现有定量检测方法，本发明检测时间更短，可在30分钟内完成96样本的检测，能够灵敏、准确、快速的反映出样品中d-阿洛酮糖的浓度或含量。

2)在独有的线性范围内具有良好的精密度和准确度，不受d-果糖及其他单糖等干扰物的影响，可应用于检测kease酶促反应过程中d-果糖至d-阿洛酮糖的转化量以及筛选kease酶变体。

3)本发明在检测过程中无需使用大型仪器设备，显著降低了检测成本。

附图说明：

图1为实施例1中采用本发明试剂盒得到的d-阿洛酮糖浓度与吸光度值差值δa340nm的标准曲线。

图2为实施例2获得的重组表达菌(细胞)的菌液量与吸光度值差值δa"340nm的标准曲线。

具体实施方式：

下面结合实施例及附图对本发明技术方案及效果做进一步说明。

实施例1

样品中d-阿洛酮糖的浓度测定：

在本实施例中，试剂ⅰ为磷酸盐缓冲液，其组成为：nacl3.0～10.0mg/ml，kcl0.05～1.0mg/ml，na2hpo40.3～2.0mg/ml，kh2po40.01～0.5mg/ml；试剂ⅱ为溶解于试剂ⅰ中的nadh，其中nadh的浓度为50mg/ml；试剂ⅲ为溶解于试剂ⅰ中的核糖醇脱氢酶，其中核糖醇脱氢酶的浓度为5mg/ml；试剂ⅳ为溶解于试剂ⅰ中的d-阿洛酮糖，其中d-阿洛酮糖的浓度为5mg/ml。

1)将试剂ⅰ的ph调至8.0，将试剂ⅱ和试剂ⅰ混合得到混合液，混合液中nadh的浓度为2.0mg/ml，本实施例采用infinitem200pro多功能酶标仪进行吸光度检测。

2)用试剂ⅰ对试剂ⅳ进行倍数稀释，得到一组具有不同d-阿洛酮糖浓度的稀释溶液，其中d-阿洛酮糖浓度的从小到大依次为：0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.3、0.35、0.4mg/ml。

3)在微孔板(96或384孔板)中分别加入50μl由步骤2)获得的不同浓度的稀释溶液，之后再向每种稀释溶液中加入50μl由步骤1)获得的混合液，采用infinitem200pro多功能酶标仪检测每个孔在340nm处的吸光度值；之后向每个孔中加入2μl试剂ⅲ，37℃反应15min后再次检测每个孔在340nm处的吸光度值。

4)根据步骤3)中每个样品在反应前的d-阿洛酮糖浓度以及每个样品在反应前、后的吸光度值差值δa340nm作d-阿洛酮糖浓度与吸光度值差值的标准曲线，结果如图1及表1所示，同时将获得的吸光度值差值中以最大值和最小值为端点构成的区间作为参考区间，根据表1，本实施例的参考区间为[0.391,1.603]，进一步地，根据标准曲线拟合得到的d-阿洛酮糖浓度及含量的计算公式分别为：

x＝[(y-0.2138)/3.2181]×稀释倍数，r²＝0.9834

x＝[(y-0.2138)/3.2181]×稀释倍数×v，r²＝0.9834

以上两个公式中，y为δa340nm，x为待测样品的d-阿洛酮糖的含量，v为待测样品体积。

表1一定浓度范围内的d-阿洛酮糖浓度与吸光度值差值的对应关系

5)将适量d-阿洛酮糖溶于pbs缓冲液中，配制成具有一定d-阿洛酮糖浓度的溶液作为待测样品。用试剂ⅰ对待测样品进行梯度或倍数稀释，在本实施例中采用稀释倍数为10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵，得到一组(6个梯度)待测样品的稀释溶液，各取50μl加入到微孔板(96或384孔板)中，再分别加入50μl由步骤1)获得的混合液；测定每个孔在340nm处的吸光度值；之后向每个孔中加入2μl试剂ⅲ，37℃反应15min后再次检测每个孔在340nm处的吸光度值。

6)计算步骤5)各稀释样品在反应前、后的吸光度值差值δa'340nm，其中稀释倍数为10⁰的样品吸光度值差值δa'340nm为0.523，处于参考区间[0.391,1.603]内，以该吸光度值差值参照步骤4)获得的标准曲线或计算公式，得到待测样品中d-阿洛酮糖浓度0.096mg/ml。如果步骤5)所有稀释样品的吸光度值差值均不在参考区间[0.391,1.603]内，则需重新执行步骤5)，对待测样品进行稀释以及稀释样品反应前、后的吸光度值测定，其中对待测样品的稀释需采用新的稀释梯度或倍数，直至有稀释样品的吸光度值差值处于上述参考区间内。

实施例2

对kease酶促反应中d-阿洛酮糖浓度的测定：

本实施例所用的试剂盒与实施例1相同，使用前将试剂ⅰ的ph调至8.0，将试剂ⅱ用试剂ⅰ进行稀释至nadh的浓度为2.0mg/ml。

1)根据球形节杆菌(arthrobacterglobiformism30)的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶(agdaease，可催化d-果糖转化为d-阿洛酮糖)基因序列采用化学转化法将全基因合成的agdae-pet-28a重组质粒转入大肠杆菌bl21(de3)中，通过硫酸卡那霉素抗性平板筛选转化子，构建大肠杆菌agdaease重组表达菌。

2)挑取重组agdaease重组表达菌单菌落接种于5ml含有50μg/ml硫酸卡那霉素的液体lb培养基中，于37℃、220r/min振荡培养至菌的od600达到0.6～0.8时加入终浓度为0.1mm的iptg，于16℃、100r/min诱导表达16～18h。诱导表达后进行菌体的离心收集，收集到的菌体用0.8％的生理盐水清洗两次后再用5ml试剂ⅰ重悬菌体。

3)分别取50、100、200、300、400μl重悬的菌液置于48孔板中，之后每孔分别加入终浓度为1mm的mgcl2和10mg/l的d-果糖，最后用试剂ⅰ将每个孔中的菌液补齐至500μl，于60℃催化反应5～60分钟，之后置于沸水中终止反应。

4)反应后的样品每种取10μl于96孔板或384孔板内，用试剂ⅰ分别补齐至50μl，之后加入50μl稀释后的试剂ⅱ(其nadh的浓度为2.0mg/ml)，测定每个孔在340nm处的吸光度值；之后向每个孔中加入2μl试剂ⅲ，37℃反应15min后再次检测每个孔在340nm处的吸光度值。

5)计算每个孔的反应体系在反应前、后的吸光度值差值δa"340nm，以步骤3)添加的菌液量为横坐标，以每个孔样品的δa"340nm为纵坐标得到如图2所示的标准曲线，根据标准曲线拟合得到的关系式如下：

y＝2.4494x+0.0306，r²＝0.9851

式中，y为吸光度值差值δa"340nm，x为重组表达菌菌液量。表2为吸光度值差值δa"340nm与重组表达菌菌液量的对应关系。从以上结果可以看出随着添加的agdae重组表达菌液量的增大，δa"340nm会相应增大，并且二者呈线性变化趋势，由于反应体系中酶的含量是随着菌液添加量的升高而增加，对应的δa"340nm越大，且表现出良好的线性关系(r²＝0.9851)，说明本发明所述试剂盒可以很准确的应用于kease的高通量筛选，用于筛选催化活性更高的酶分子或酶分子变体。

表2菌液添加量与吸光度值差值的对应关系