一种醋甘遂饮片、汤剂HPLC特征图谱构建方法与流程

一种醋甘遂饮片、汤剂hplc特征图谱构建方法
技术领域
1.本发明涉及分析检测技术领域，尤其是涉及一种醋甘遂饮片、汤剂hplc特征图谱构建方法。


背景技术：

2.甘遂为大戟科植物甘遂euphorbia kansui t.n.liou ex t.p.wang的干燥块根，味苦，寒；有毒。有泻水逐饮，消肿散结之功效。醋甘遂标准汤剂是由甘遂药材经炮制后按固定的制备工艺水煎煮而成的冻干粉。特征图谱是一种体现中药化学成分整体特征的质量评价方法，对中药及其制剂的真实性和质量的一致性以及稳定性均可有效地加以检测和控制。
3.现有技术公开的醋甘遂特征图谱相关文献有：石典花,孙立立,张姗姗.甘遂及不同炮制品石油醚部位hplc特征图谱比较研究[j].四川中医,2013,31(9):47-49.该文献考察了甘遂生品及四种炮制品：单纯加热(清炒品)、先加醋再加热(醋炙品)、先加热(清炒品)再加入醋拌均自然晾干(清炒拌醋品)以及生品直接加醋(生拌醋品)等不同工艺的甘遂炮制品，采用hplc法对甘遂及不同炮制品的石油醚部位进行比较研究，考察各炮制因素对甘遂石油醚部位有何种影响，从而为进一步探讨甘遂醋炙减毒，缓和药性的炮制机理提供理论依据。采用的流动相是乙腈和0.2％磷酸梯度洗脱，供试品溶液制备方法是用石油醚索氏提取8h后回收溶剂，所得残渣用等体积比的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂溶解。该特征图谱方法供试品制备时间较长、只适用于石油醚提取出的甘遂及其炮制品中低极性的成分，不能对甘遂及其制剂中极性较大的成分进行特征图谱检测，如醋甘遂标准汤剂是由甘遂药材经炮制后按固定的制备工艺水煎煮而成的冻干粉，故标汤中大多为水提取出的极性较大的成分，无法用该特征图谱方法进行检测。
[0004]
针对现有的检测甘遂及其炮制品的特征图谱方法只适用于检测甘遂及其炮制品中低极性成分，而醋甘遂标准汤剂是由甘遂药材经炮制后按固定的制备工艺水煎煮而成的冻干粉，所含成分极性较大，现有方法无法对其进行检测。且现有特征图谱方法供试品制备方法时间过久、操作繁琐、指认特征峰也较少。无法对醋甘遂及其制剂的真实性和质量的一致性以及稳定性均可有效地加以检测和控制。因此，有必要建立一种快速鉴别醋甘遂及其标准汤剂的hplc特征图谱方法，为有效控制和较全面评价醋甘遂标准汤剂的质量提供依据。


技术实现要素：

[0005]
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种醋甘遂饮片、汤剂hplc特征图谱构建方法，本发明构建的醋甘遂饮片、汤剂hplc特征图谱方法稳定，可靠，可以对醋甘遂饮片、汤剂的质量进行控制。
[0006]
本发明提供了一种醋甘遂饮片、汤剂hplc特征图谱构建方法，包括：
[0007]
a)将醋甘遂原料采用溶剂溶解，得到待测液；
[0008]
b)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到醋甘遂原料的hplc特征图谱；
[0009]
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为c18柱；流动相a为甲醇，流动相b为水，梯度洗脱。
[0010]
优选的，还包括制备参照物溶液：分别取尿苷、鸟苷、色氨酸、腺苷，采用20％甲醇溶解，得到参照物溶液；
[0011]
将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对醋甘遂饮片、汤剂hplc特征图谱的成分进行定性测定。
[0012]
优选的，所述梯度洗脱具体为：
[0013]
0～12min，a相：3～5％、b相：97～95％；
[0014]
12～15min，a相：5％～10％、b相：95％～90％；
[0015]
15～20min，a相：10％～13％、b相：90％～87％；
[0016]
20～30min，a相：13％～20％、b相：87％～80％；
[0017]
30～35min，a相：20％、b相：80％。
[0018]
优选的，所述色谱柱为c18柱，规格为5μm，4.6
×
250mm；柱温20℃。
[0019]
优选的，所述流动相流速为1.0ml/min；检测波长为260nm；进样量为10μl。
[0020]
优选的，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对醋甘遂饮片、汤剂hplc特征图谱的相似度进行评价，得到由7个特征峰构成的醋甘遂饮片、汤剂hplc标准特征图谱，其中峰2为尿苷，峰5为鸟苷，峰6为色氨酸，峰7为腺苷。
[0021]
优选的，在所述标准特征图谱中，以腺苷为参照峰s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的
±
10％之内，所述规定值分别为：0.21-峰1、0.4-峰2、0.5-峰3、0.64-峰4、0.71-峰5、0.89-峰6。
[0022]
优选的，步骤a)所述溶剂为20％甲醇；所述提取方法为超声提取或加热回流提取；所述超声功率为600w，频率为40khz；所述提取时间为30～40min。
[0023]
优选的，步骤a)所述醋甘遂原料的质量g和溶剂的体积ml的比为(0.5～2)：(10～20)；
[0024]
优选的，步骤a)所述醋甘遂原料为醋甘遂药材、醋甘遂饮片或汤剂。
[0025]
与现有技术相比，本发明提供了一种醋甘遂饮片、汤剂hplc特征图谱构建方法，包括：a)将醋甘遂原料采用溶剂溶解，得到待测液；b)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到醋甘遂原料的hplc特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为c18柱；流动相a为甲醇，流动相b为水，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，以尿苷、鸟苷、色氨酸、腺苷为参照物，建立了醋甘遂饮片、汤剂hplc特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对醋甘遂饮片、汤剂的质量进行控制。
附图说明
[0026]
图1为本发明实施例1公开的醋甘遂标准汤剂对照特征图谱；
[0027]
图2为本发明实施例2的色氨酸紫外吸收光谱图；
[0028]
图3为本发明实施例2的腺苷紫外吸收光谱图；
[0029]
图4为本发明实施例2的鸟苷紫外吸收光谱图；
[0030]
图5为本发明实施例2的尿苷紫外吸收光谱图；
[0031]
图6为本发明实施例2的醋甘遂标准汤剂不同波长色谱图；
[0032]
图7为本发明实施例3的柱温考察结果图；
[0033]
图8为本发明实施例4的流速考察结果图；
[0034]
图9为本发明实施例5提取溶剂考察结果图；
[0035]
图10为本发明实施例6提取方法考察结果图；
[0036]
图11为本发明实施例6提取时间考察结果图；
[0037]
图12为本发明实施例7溶剂加入量考察结果图；
[0038]
图13为本发明实施例8色谱峰指认图；
[0039]
图14为本发明实施例8的耐用性考察结果图；
[0040]
图15为醋甘遂标准汤剂特征图谱；
[0041]
图16为醋甘遂标准汤剂特征图谱；
[0042]
图17为实施例9的标准汤剂对照特征图谱；
[0043]
图18为甘遂药材特征图谱；
[0044]
图19为23批甘遂药材的对照特征图谱；
[0045]
图20为本发明实施例11的醋甘遂饮片特征图谱；
[0046]
图21为本发明实施例11的醋甘遂饮片对照特征图谱；
[0047]
图22为对比例1的第一个梯度条件色谱图；
[0048]
图23为对比例1的第二个梯度条件色谱图；
[0049]
图24为对比例2色谱条件的色谱图。
具体实施方式
[0050]
本发明提供了一种醋甘遂饮片、汤剂hplc特征图谱构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0051]
本发明提供了一种醋甘遂饮片、汤剂hplc特征图谱构建方法，包括：
[0052]
a)将醋甘遂原料采用溶剂溶解，得到待测液；
[0053]
b)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到醋甘遂原料的hplc特征图谱；
[0054]
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为c18柱；流动相a为甲醇，流动相b为水，梯度洗脱。
[0055]
本发明提供的一种醋甘遂饮片、汤剂hplc特征图谱构建方法首先取醋甘遂原料，溶剂溶解，得到待测液。所述溶剂优选为20％甲醇。
[0056]
本发明采用上述提取溶剂色谱峰信息量大，效果好。
[0057]
具体为将醋甘遂原料采用溶剂溶解，提取，放冷，摇匀，滤过，即得。
[0058]
本发明所述提取方法为超声提取或加热回流提取；优选为超声提取；所述超声功率优选为600w，频率优选为40khz；所述提取时间优选为30～40min；更优选为30min。
[0059]
其中，所述醋甘遂原料的质量g和溶剂的体积ml的比优选为(0.5～2)：(10～50)；更优选为(0.5～2)：(10～20)；最优选为药材、饮片2：20、标汤0.5：10。
[0060]
所述醋甘遂原料为醋甘遂药材、醋甘遂饮片或汤剂。本发明对其不进行限定，上述原料皆可通过本发明的方法进行质量控制和定性检测。
[0061]
本发明还包括制备参照物溶液：分别取尿苷、鸟苷、色氨酸、腺苷，采用20％甲醇溶解，得到参照物溶液；
[0062]
将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对醋甘遂饮片、汤剂hplc特征图谱的成分进行定性测定。
[0063]
本发明所述流动相a为甲醇，流动相b为水溶液，梯度洗脱。
[0064]
本发明所述梯度洗脱优选具体为：
[0065]
0～12min，a相：3～5％、b相：97～95％；
[0066]
12～15min，a相：5％～10％、b相：95％～90％；
[0067]
15～20min，a相：10％～13％、b相：90％～87％；
[0068]
20～30min，a相：13％～20％、b相：87％～80％；
[0069]
30～35min，a相：20％、b相：80％。
[0070]
本发明在上述洗脱梯度下基线分离好，各个峰分离度好，基线平稳。
[0071]
c18柱，规格为5μm，4.6
×
250mm；柱温20℃。
[0072]
本发明色谱柱在上述20℃条件下色谱峰对称、分离度好。
[0073]
流动相流速优选为1ml/min。
[0074]
本发明发现流速1ml/min下各色谱峰分离较好，峰形较对称，作为最优选方案。
[0075]
本发明检测波长优选为260nm。
[0076]
本发明人发现，在260nm处色谱信息丰富，各成分均有较好吸收，响应值适中，各峰分离度较好，基线平稳。
[0077]
本发明进样量为10～15μl；优选为10μl。
[0078]
本发明的有益效果是，一个液相色谱条件下，以指纹图谱控制醋甘遂饮片、汤剂的物质群，以尿苷、鸟苷、色氨酸、腺苷对指纹图谱进行定位；能够大大降低检测的成本，实现定性检测。
[0079]
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对醋甘遂饮片、汤剂hplc特征图谱的相似度进行评价，得到由7个特征峰构成的醋甘遂饮片、汤剂hplc标准特征图谱，其中峰2为尿苷，峰5为鸟苷，峰6为色氨酸，峰7为腺苷。
[0080]
在所述标准特征图谱中，以腺苷为参照峰s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的
±
10％之内，所述规定值分别为：0.21-峰1、0.4-峰2、0.5-峰3、0.64-峰4、0.71-峰5、0.89-峰6。
[0081]
质量判断标准：取醋甘遂饮片、汤剂样品，按上述同法操作，得到醋甘遂饮片、汤剂特征图谱，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版对醋甘遂饮片、汤剂标准特征图谱和样品特征图谱进行分析，相似度大于0.90。
[0082]
采用本发明所提供的方法能有效的监控不同批次醋甘遂饮片、汤剂的质量，使其质量稳定，方法具有精密度高、重现性好等特点，有利于全面监控产品的质量。
[0083]
本发明建立的醋甘遂饮片、汤剂特征图谱以尿苷、鸟苷、色氨酸、腺苷，为参照物，注重各个特征峰的顺序和与药材及中间产品的相关性，能全面评价产品的整体质量面貌特征，方法科学可靠。
[0084]
本发明新建的特征图谱方法，可以检测醋甘遂及其标准汤剂中极性较大的成分。且供试品制备方法简单容易操作，指认特征峰相对较多。可对甘遂、醋甘遂及其制剂进行准确、可靠的特征图谱检测。对醋甘遂及其制剂的真实性和质量的一致性以及稳定性均可有效地加以检测和控制。为有效控制和较全面评价醋甘遂标准汤剂的质量提供依据。确保醋甘遂及其标准汤剂质量的均一、稳定。
[0085]
本发明提供了一种醋甘遂饮片、汤剂hplc特征图谱构建方法，包括：a)将醋甘遂原料采用溶剂溶解，得到待测液；b)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到醋甘遂原料的hplc特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为c18柱；流动相a为甲醇，流动相b为水，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，以尿苷、鸟苷、色氨酸、腺苷为参照物，建立了醋甘遂饮片、汤剂hplc特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对醋甘遂饮片、汤剂的质量进行控制。
[0086]
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种醋甘遂饮片、汤剂hplc特征图谱构建方法进行详细描述。
[0087]
高效液相色谱仪：安捷伦1260型高效液相色谱仪、waters e2695型高效液相色谱仪；
[0088]
电子天平：me204e/02、ms205du、xp26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
[0089]
超纯水机：细胞型1810a(上海摩勒科学仪器有限公司)；
[0090]
超声波清洗器：kq5200db型(600w，40khz；昆山市超声仪器有限公司)；
[0091]
色谱柱：agilent 5 tc-c18 250
×
4.6mm、phenomenex luna 5μm c18 100a 250
×
4.6mm、agilent 5-hc-c18 250
×
4.6mm；
[0092]
甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
[0093]
腺苷(中国食品药品检定研究院，批号：110879-201703，含量以99.7％计)。
[0094]
鸟苷(中国食品药品检定研究院，批号：111977-201501，含量以93.6％计)。
[0095]
色氨酸(中国食品药品检定研究院，批号：140686-201904，含量以99.9％计)。
[0096]
尿苷(中国食品药品检定研究院，批号：110887-201803，含量以99.5％计)。
[0097]
甘遂对照药材(中国食品药品检定研究院，批号121042-202006)。
[0098]
醋甘遂标准汤剂冻干粉(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：cgs-bt-210704、cgs-bt-210705、cgs-bt-210706、cgs-bt-210710、cgs-bt-210711、cgs-bt-210712、cgs-bt-210713、cgs-bt-210714、cgs-bt-210715、cgs-bt-210716、cgs-bt-210717、cgs-bt-210720、cgs-bt-210801、cgs-bt-210802、cgs-bt-210803、cgs-bt-210804、cgs-bt-210805、cgs-bt-210806、cgs-bt-210807、cgs-bt-210808、cgs-bt-210809、cgs-bt-210810、cgs-bt-210811)。
[0099]
实施例1
[0100]
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相a，以水为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为20℃；检测波长为260nm，理论板数按腺苷峰计算应不低于8000。
[0101][0102]
参照物溶液的制备取甘遂对照药材2g，置具塞锥形瓶中，加20％甲醇溶液20ml，密塞，超声处理(功率600w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
[0103]
另取尿苷、鸟苷、色氨酸、腺苷对照品适量，精密称定，加20％甲醇制成每1ml各含10μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
[0104]
供试品溶液的制备:
[0105]
药材、饮片：取本品粉末(过四号筛)约2g，置具塞锥形瓶中，加20％甲醇溶液20ml，密塞，超声处理(功率600w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0106]
标汤：取本品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加20％甲醇溶液10ml，密塞，超声处理(功率600w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0107]
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。结果如图1所示，图1为本发明实施例1公开的醋甘遂标准汤剂对照特征图谱。
[0108]
供试品特征图谱中应呈现7个特征峰(峰3醋制后生成)，并应与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，与腺苷参照物峰相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±
10％范围之内。规定值为0.21(峰1)、0.40(峰2)、0.50(峰3)、0.64(峰4)、0.71(峰5)、0.89(峰6)。
[0109]
实施例2波长选择
[0110]
在实施例1拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对腺苷、供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm波长下的色谱图。见图2～6；其中图2为本发明实施例2的色氨酸紫外吸收光谱图；图3为本发明实施例2的腺苷紫外吸收光谱图；图4为本发明实施例2的鸟苷紫外吸收光谱图；图5为本发明实施例2的尿苷紫外吸收光谱图；图6为本发明实施例2的醋甘遂标准汤剂不同波长色谱图。
[0111]
结果表明，在检测波长为260nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为260nm。
[0112]
实施例3柱温考察
[0113]
在实施例1拟定的实验条件基础上，分别对柱温为20℃、25℃、30℃时进行考察。见图7，图7为本发明实施例3的柱温考察结果图。
[0114]
柱温考察结果表明，当柱温为20℃时，色谱图峰形对称，分离度较好，故最终确定20℃作为醋甘遂标准汤剂特征图谱方法的柱温。
[0115]
实施例4流速考察
[0116]
在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时进行了考察。见图8，图8为本发明实施例4的流速考察结果图。
[0117]
结果表明，在流速为1.0ml/min时，色谱图峰形较好，分离度适中。故流速确定为
1.0ml/min。
[0118]
实施例5提取溶剂考察
[0119]
取本品(批号cgs-bt-210716)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入10ml的水、20％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、20％甲醇、50％甲醇、70％甲醇进行提取，超声处理(功率600w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图9，图9为本发明实施例5提取溶剂考察结果图。
[0120]
实施例6提取方法和时间考察
[0121]
取本品(批号：cgs-bt-210716)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入20％甲醇10ml，分别对供试品提取方法为回流、超声时进行考察，提取时间30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图10。图10为本发明实施例6提取方法考察结果图；结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时效果一致。因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取。
[0122]
取本品(批号cgs-bt-210716)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入20％甲醇10ml，超声处理(功率600w，频率40khz)，分别对供试品提取时间为20分钟、30分钟、40分钟时进行考察，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图11，图11为本发明实施例6提取时间考察结果图。
[0123]
结果表明，在提取时间为30分钟时，即可充分提取。故供试品提取时间确定为30分钟。
[0124]
实施例7溶剂加入量考察
[0125]
取本品(批号cgs-bt-210716)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入20％甲醇10ml、20ml、50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600w，频率40khz)30min，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图12，图12为本发明实施例7溶剂加入量考察结果图。
[0126]
实施例8方法学考察
[0127]
8.1色谱峰指认
[0128]
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备醋甘遂标准汤剂供试品溶液。
[0129]
参照物溶液的制备：取尿苷、鸟苷、色氨酸、腺苷对照品适量，精密称定，加20％甲醇制成每1ml各含10μg的溶液，作为对照品参照物溶液。取甘遂对照药材2g，置具塞锥形瓶中，加20％甲醇溶液20ml，密塞，超声处理(功率600w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
[0130]
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺醋甘遂标准汤剂阴性对照溶液。
[0131]
对醋甘遂标准汤剂特征图谱峰进行定位。见图13，图13为本发明实施例8色谱峰指认图。
[0132]
8.2精密度试验
[0133]
取醋甘遂标准汤剂(批号：cgs-bt-210716)供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。见表1-2。
[0134]
表1精密度考察-保留时间
[0135]
[0136][0137]
表2精密度考察-峰面积
[0138][0139]
结果表明，精密度各特征峰保留时间rsd为0.05％-0.15％，峰面积rsd为0.34％-1.9％。该仪器精密度良好。
[0140]
8.3重复性考察
[0141]
精密称取醋甘遂标准汤剂(批号：cgs-bt-210716)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表3-4。
[0142]
表3重复性考察-相对保留时间
[0143][0144]
表4重复性考察-相对峰面积
[0145]
[0146][0147]
结果表明，重复性各特征峰相对保留时间rsd为0％-2.13％，相对峰面积rsd为0％-4.88％。该方法重复性良好。
[0148]
8.4中间精密度考察
[0149]
在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取醋甘遂标准汤剂6份，制备供试品溶液，分别在安捷伦1260、waters e2695型高效液相色谱仪上进行测定。见表5-6。
[0150]
表5中间精密度-相对保留时间比值
[0151][0152]
表6中间精密度-相对峰面积比值
[0153][0154]
[0155]
结果表明，由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，方法稳定性较好。
[0156]
8.5耐用性考察
[0157]
在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为agilent5 tc-c18 250
×
4.6mm、phenomenexluna5μmc18 250
×
4.6mm、agilent-hc-c18 4.6
×
250mm。进行考察。见图14，图14为本发明实施例8的耐用性考察结果图；结果如表7-8所示。
[0158]
表7色谱柱耐用性考察-相对保留时间
[0159][0160]
表8色谱柱耐用性考察-相对峰面积
[0161][0162]
8.6稳定性考察
[0163]
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h时测定。见表9-10。
[0164]
表9稳定性考察-保留时间
[0165][0166][0167]
表10稳定性考察-峰面积
[0168][0169]
结果表明，其相对应的特征峰保留时间的rsd在0.09％～0.20％，样品溶液在24小时内较稳定。
[0170]
综上所述，各特征峰相对保留时间的rsd在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。
[0171]
实施例9特征峰的确定及对照图谱的建立
[0172]
9.1相对保留时间规定值限度的制定：方法学各考察项目及验证结果汇总见表11。
[0173]
表11方法学各项目结果rsd％汇总标准—保留时间-相对保留时间
[0174][0175]
在色谱柱耐用性考察项中，峰1至峰7的rsd范围为0％-4.65％，故将各峰的相对保留时间规定值暂定为
±
10％。
[0176]
最终规定：推荐使用agilent5tc-c18色谱柱进行分析，供试品特征图谱中应呈现7个特征峰，其中与腺苷参照物相应的峰为s峰。
[0177]
9.23批醋甘遂标准汤剂验证结果
[0178]
采用此方法，在23批样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间和相对峰面积比值。见图15～16和表12-13。
[0179]
其中，图15为醋甘遂标准汤剂特征图谱；图16为醋甘遂标准汤剂特征图谱。图15中从下到上批号依次为：cgs-bt-210704、cgs-bt-210705、cgs-bt-210706、cgs-bt-210710、cgs-bt-210711、、cgs-bt-210712、cgs-bt-210713、cgs-bt-210714、cgs-bt-210715、cgs-bt-210716、cgs-bt-210717、cgs-bt-210720；图16中从下到上批号依次为：cgs-bt-210801、cgs-bt-210802、cgs-bt-210803、cgs-bt-210804、cgs-bt-210805、cgs-bt-210806、cgs-bt-210807、cgs-bt-210808、cgs-bt-210809、cgs-bt-210810、cgs-bt-210811。
[0180]
表12 23批醋甘遂标准汤剂相对保留时间
[0181][0182]
表13 23批醋甘遂标准汤剂相对峰面积
[0183][0184]
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了7个重复性较好的峰作为特征峰。如图17，图17为实施例9的标准汤剂对照特征图谱；
[0185]
计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±
10％范围之内，规定值为0.21(峰1)、0.40(峰2)、0.50(峰3)、0.64(峰4)、0.71(峰5)、0.89(峰6)。
[0186]
实施例10 23批甘遂药材验证：
[0187]
参考醋甘遂标准汤剂特征图谱方法学考察结果，因醋甘遂标准汤剂中峰3为醋制后产生，故甘遂药材中无标准汤剂中的峰3，只有6个特征峰。确定甘遂药材的特征图谱分析方法如下；
[0188]
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相a，以水为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为20℃；检测波长为260nm，理论板数按腺苷峰计算应不低8000。色谱条件如实施例1。
[0189]
参照物溶液的制备取甘遂对照药材2g，置具塞锥形瓶中，加20％甲醇溶液20ml，密塞，超声处理(功率600w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。取尿苷、鸟苷、色氨酸、腺苷对照品适量，精密称定，加20％甲醇制成每1ml各含10μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
[0190]
供试品溶液的制备取本品粉末(过四号筛)约2g，置具塞锥形瓶中，加20％甲醇溶液20ml，密塞，超声处理(功率600w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0191]
测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0192]
23批甘遂药材特征图谱见图18，图18为甘遂药材特征图谱。
[0193]
图18中，峰2；尿苷；峰4；鸟苷；峰5；色氨酸；峰6(s)；腺苷(s1-s23分别为：xls202107260、xls202107261、xls202107262、xls202107266、xls202107267、xls202107268、xls202107269、xls202107270、xls202107271、xls202107272、xls202107273、xls202107276、xls202108001、xls202108002、xls202108003、xls202108004、xls202108005、xls202108006、xls202108007、xls202108008、xls202108009、xls202108010、xls202108012)。
[0194]
各特征峰相对保留时间、相对峰面积见表14、15。
[0195]
表14甘遂药材特征图谱相对保留时间
[0196]
[0197][0198]
表15甘遂药材特征图谱相对峰面积
[0199]
[0200][0201]
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了6个重复性较好的峰作为特征峰。最终规定：供试品色谱中应呈现6个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，其中与腺苷参照物相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±
10％范围之内。规定值为：0.21(峰1)、0.40(峰2)、0.64(峰3)、0.71(峰4)、0.89(峰5)。
[0202]
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对23批甘遂药材进行合成，建立了甘遂药材特征图谱的对照特征图谱。见图19，图19为23批甘遂药材的对照特征图谱：峰2：尿苷；峰4：鸟苷；峰5：色氨酸；峰6(s)：腺苷。
[0203]
实施例11
[0204]
色谱条件同实施例1。
[0205]
参照物溶液的制备取甘遂对照药材2g，置具塞锥形瓶中，加20％甲醇溶液20ml，密塞，超声处理(功率600w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。取尿苷、鸟苷、色氨酸、腺苷对照品适量，精密称定，加20％甲醇制成每1ml各含10μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
[0206]
供试品溶液的制备取本品粉末(过四号筛)约2g，置具塞锥形瓶中，加20％甲醇溶液20ml，密塞，超声处理(功率600w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0207]
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0208]
对23批醋甘遂饮片进行测定，23批醋甘遂饮片特征图谱见图20，图20为本发明实施例11的醋甘遂饮片特征图谱，峰7(s)；腺苷(s1-s23别为：cgs-210704、cgs-210705、cgs-210706、cgs-210710、cgs-210711、cgs-210712、cgs-210713、cgs-210714、cgs-210715、cgs-210716、cgs-210717、cgs-210720、cgs-210816、cgs-210817、cgs-210818、cgs-210819、cgs-210820、cgs-210821、cgs-210822、cgs-210823、cgs-210824、cgs-210825、cgs-210826)；各
特征峰相对保留时间、相对峰面积见表16、17。
[0209]
表16醋甘遂饮片特征图谱相对保留时间
[0210][0211][0212]
表17醋甘遂饮片特征图谱相对峰面积
[0213][0214][0215]
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了7个重复性较好的峰作为特征峰。最终规定：供试品特征图谱中应呈现7个特征峰，除峰3外其余峰与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，与腺苷参照物相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±
10％范围之内。规定值为：0.21(峰1)、0.40(峰2)、0.50(峰3)、0.64(峰4)、0.71(峰5)、0.89(峰6)。
[0216]
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对23批醋甘遂饮片进行合成，建立了醋甘遂饮片特征图谱的对照特征图谱。见图21，图21为本发明实施例11的醋甘遂饮片对照特征图谱：峰2：尿苷；峰5：鸟苷；峰6：色氨酸；峰7(s)：腺苷。
[0217]
对比例1
[0218]
1.色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相a，以水为流动相b，甲醇：水＝10:90；柱温为30℃；检测波长为260nm。参见色谱图22，图22为对比例1的第一个梯度条件色谱图。
[0219]
2.色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相a，以水为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；检测波长为260nm。
[0220]
表18
[0221][0222]
色谱图如23，图23为对比例1的第二个梯度条件色谱图；由图可知，色谱条件跑出的醋甘遂色谱峰均较少，且分离度较差，有包峰。
[0223]
对比例2
[0224]
按照实施例1分别对色谱柱为agilent5 tc-c18 250
×
4.6mm、phenomenexluna5μm c18 250
×
4.6mm、agilent-hc-c18 4.6
×
250mm进行对比考察。
[0225]
表19色谱柱耐用性考察-相对保留时间
[0226][0227]
表20色谱柱耐用性考察-相对峰面积
[0228][0229]
图24为对比例2色谱条件的色谱图；由图24可知，phenomenex的色谱图分离不好，有包峰存在，因此推荐使用agilent5tc-c18色谱柱。
[0230]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。