试剂盒、制备方法及其在检测动物旋毛虫病中的应用

1.本发明涉及生物检测领域，尤其涉及试剂盒、制备方法及其在检测动物旋毛虫病中的应用。


背景技术：

2.旋毛虫病是一种危害非常严重的人兽共患病，其不但可给畜牧业生产造成巨大的经济损失，而且对人类身体健康也构成巨大威胁，人或动物主要通过生食或半生食含有旋毛虫的肉类(主要为猪肉)而发病。
3.对于屠宰动物旋毛虫病的检验，国际动物卫生组织(oie)的法规检验方法为镜检法及集样消化法，目前我国也在延用这两种方法。然而以上两方法均存在一定的弊端，镜检法费时费力而且敏感性差，其敏感性为肉中虫体密度达到每克3条虫体时方可检出。集样消化法虽可大大提高检出率，将虫体检出率提高至每克肉1条虫体，但该方法仍十分繁琐，在发现阳性样品时仍需对阳性组采用消化法进行逐头检测。从敏感性的角度来看，由镜检法和集样消化法所造成漏检的肉类均存在安全隐患并可引起人类的感染(摄入75条虫体即可引起人的感染)。国内外学者对旋毛虫检测的方法进行了大量的研究，如应用间接荧光免疫试验，免疫酶染色试验，免疫印迹试验，免疫吸附试验(elisa)等技术来检测旋毛虫抗体，但这些方法操作较复杂，常需要2-3个小时检测出结果，而且需要昂贵的仪器和专业技能人员在实验室完成，不能应用于现场和基层单位进行猪旋毛虫病的检测。目前，旋毛虫肌幼虫排泄分泌物es抗原是oie及国际旋毛虫委员会推荐的用于血清学抗体检测的标准抗原。然而es抗原成分复杂，制备繁琐、生产周期长、批次质量不均，而且存在严重的诊断盲区(感染后19d前无法检出)和交叉反应等问题，因而阻碍了其实际应用。
4.自1996年dna介导的金纳米颗粒的组装技术被报道，金纳米颗粒凭借其极好的生物相容性，易于表面功能化修饰的特性，加上适配体技术的迅猛发展和dna合成的商业化制备日趋成熟，功能核酸结合了金纳米颗粒的灵敏、稳健的分析方法正越来越多的应用于免疫生物传感的研究中。由于生物酶依赖的核酸扩增技术，例如pcr、lamp等，常常需要较为严格的缓冲液体系、反应温度和特殊金属离子或二价离子环境。因而，非生物酶依赖的核酸扩增策略逐渐成为备受关注的研究领域。杂交链式反应由于其高度的可编程性、碱基互补配对原则限制的高度特异性以及非酶依赖的恒温高效的扩增速率，让核酸扩增反应以简单的方式进行，不需要复杂的仪器，从而降低了实验成本。但是，功能核酸生物传感器的应用领域依赖于适配体的研究进展，其对于非核酸类靶标的应用范围受到了较为严格的限制。进而，单纯地依靠适配体的杂交链式反应生物传感器无法满足日益增长的病原感染血清学抗体检测需求。因此，开发一种新型的功能核酸免疫生物传感器，对旋毛虫病的诊断方法的改进具有重要的意义。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了试剂盒、制备方法及其在检测动物旋毛虫病中的应用。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了试剂盒，包括：金纳米颗粒探针；
8.上述金纳米颗粒探针包括：单克隆抗体ts-wn10-1h9和寡核苷酸链i1偶联的金纳米颗粒；
9.上述单克隆抗体ts-wn10-1h9由杂交瘤细胞株wn10-1h9分泌；
10.上述杂交瘤细胞的保藏编号为：cgmcc no.18316。
11.在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒还包括，兔抗ts-wn10多克隆抗体偶联的磁珠探针。
12.在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒还包括：杂交链式反应试剂和/或竞争反应试剂中的一种或多种；
13.上述杂交链式反应试剂包括：寡核苷酸h1、寡核苷酸h2和hoechst 33342染料；
14.上述竞争反应试剂包括：旋毛虫ts-wn10重组抗原和探针洗涤液。
15.在本发明的一些实施方案中，将待检测血清、上述ts-wn10抗原和上述金纳米颗粒探针体外混合进行竞争反应后，加入上述磁珠探针进行捕获。磁性分离后的产物中加入两条寡核苷酸链h1和h2，利用杂交链式反应和荧光染料hoechst 3342实现检测信号的最终放大，通过对反应体系及反应条件的优化，建立了一种基于单克隆抗体ts-wn10-1h9作为竞争单抗的旋毛虫病功能核酸免疫生物传感器。
16.本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
17.s1：取sh-i1 dna冻干粉与tcep溶液混合，避光静置，获得上述寡核苷酸链i1后，与金纳米颗粒混合，得到上述寡核苷酸链i1偶联的金纳米颗粒；
18.s2：取上述单克隆抗体ts-wn10-1h9吸附于上述寡核苷酸链i1偶联的金纳米颗粒，得到上述金纳米颗粒探针。
19.在本发明的一些实施方案中，利用金-硫键反应将硫醇化的上述寡核苷酸链i1修饰在金纳米颗粒表面，同时利用静电吸附将上述单克隆抗体ts-wn10-1h9与金纳米颗粒进行偶联，构建双功能化金纳米颗粒探针。
20.在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
21.s1：取sh-i1 dna冻干粉与tcep溶液混合，避光静置，获得上述寡核苷酸链i1后，与金纳米颗粒混合，得到上述寡核苷酸链i1偶联的金纳米颗粒；
22.s2：取上述单克隆抗体ts-wn10-1h9吸附于上述寡核苷酸链i1偶联的金纳米颗粒，得到上述金纳米颗粒探针；
23.s3：取bl21(de3)-pet28a-ts-wn10表达，纯化，获得上述旋毛虫ts-wn10重组抗原；
24.s4：取上述旋毛虫ts-wn10重组抗原免疫兔，收获血清经protein g纯化，获得上述兔抗ts-wn10多克隆抗体；
25.s5：取上述兔抗ts-wn10多克隆抗体与磁珠探针混合，获得兔抗ts-wn10多克隆抗体偶联的磁珠探针。
26.在本发明的一些实施方案中，利用酰胺键的形成将上述兔抗ts-wn10多克隆抗体修饰在磁珠表面，构建上述磁珠探针。
27.在本发明的一些实施方案中，上述制备方法s1中上述sh-i1 dna冻干粉的浓度为2od，上述tcep溶液的浓度为10mm。
28.在本发明的一些实施方案中，上述制备方法s3中上述旋毛虫ts-wn10重组抗原的质量为0.1μg，s5中上述磁珠探针的质量为25μg。
29.本发明还提供了上述试剂盒和/或上述制备方法制得的试剂盒在制备检测动物旋毛虫病产品中的应用。
30.在本发明的一些实施方案中，上述应用中检测样品与上述试剂盒中金纳米颗粒探针的体积比为3:1。
31.本发明提供了试剂盒，包括：金纳米颗粒探针；
32.上述金纳米颗粒探针包括：单克隆抗体ts-wn10-1h9和寡核苷酸链i1偶联的金纳米颗粒；
33.上述单克隆抗体ts-wn10-1h9由杂交瘤细胞株wn10-1h9分泌；
34.上述杂交瘤细胞的保藏编号为：cgmcc no.18316。
35.本发明制备的试剂盒具有操作简单、灵敏度高等elisa不具备的优点，可同时检测猪和人血清样本，不受宿主物种限制。同时在检测时不与其他寄生虫阳性血清发生交叉反应，特异性及灵敏度高，具有市场开发价值。
36.生物保藏证明
37.生物材料：wn10-1h9；分类命名：杂交瘤细胞株；于2019年08月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号：cgmcc no.18316。
附图说明
38.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
39.图1示本发明试剂盒检测原理示意图；
40.其中：双功能化金纳米颗粒探针(au@mcab-i1 probe)的构建(图1a)、磁珠探针(mnp-pcab probe)的构建(图1b)、竞争反应过程和杂交链式反应(hcr)过程(图1c)；
41.图2示双功能化金纳米颗粒探针的鉴定图片；
42.从左到右依次为：13nm金纳米颗粒(aunps)、双功能化金纳米颗粒探针(au@mcab-i1 probe)的电镜图片、双功能化金纳米颗粒探针及其制备中间产物的uv-vis光谱扫描结果；
43.图3磁珠探针的鉴定图片；
44.从左到右依次为：磁珠(mnps)、磁珠探针(mnp-pcab probe)、ts-wn10抗原与双探针复合物的电镜图片；
45.图4杂交链式反应鉴定图片；
46.其中：左图示3条寡核苷酸链i1、h1和h2进行杂交链式反应的凝胶电泳图片；
47.右图示双功能化金纳米颗粒探针(mnp-pcab probe)进行杂交链式反应后荧光光谱扫描结果；
48.图5本发明试剂盒在猪血清中对ts-wn10抗体的标准曲线；
49.从左到右依次为：本发明试剂盒在猪血清中pi值分布及cut-off值划定、发明试剂盒在猪血清中对ts-wn10抗体的标准曲线测定、对照试剂盒es elisa(qiagen)在猪血清中
对ts-wn10抗体的标准曲线测定；
50.图6本发明试剂盒在人血清中敏感性和特异性测定结果；
51.其中：左图示本发明试剂盒在人血清中pi值分布；
52.右图示人血清样本roc分析结果。
具体实施方式
53.本发明公开了试剂盒、制备方法及其在检测动物旋毛虫病中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
54.本发明提供的试剂盒、制备方法及其在检测动物旋毛虫病中的应用。其中ni纯化柱histraphp购自美国ge公司；胎牛血清、1640培养基购自biological industries公司；hat培养基(50
×
)、ht培养基(50
×
)和抗体亚类鉴定试剂盒购自sigma公司；soluble tmb substrate solution购自tiangen公司；辣根过氧化物酶(hrp)标记山羊抗鼠igg抗体购自北京博奥森公司；预染蛋白marker购自fermentas公司；限制性内切酶ecori和xhoi、反转录酶、ex taq dna聚合酶、t4dna连接酶购自宝生物(大连)有限公司。ecl发光底物购自北京索莱宝公司。haucl4
·
3h2o、柠檬酸三钠购自美国默克公司。羧基磁珠(50mg/ml)购自百迈格生物有限公司。三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(tcep)、hplc级纯化的寡核苷酸链均由上海生工生物有限公司合成。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基磺基琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)、6-巯基-1-己醇、2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物(mes)和hoechst 33342(10mg/ml)均购自赛默飞世尔科技。
55.实验动物：
56.6周龄balb/c小鼠由长春亿斯实验动物技术有限公司提供。
57.新西兰兔由长春亿斯实验动物技术有限公司提供。
58.其他试剂或仪器设备如无特殊说明均可通过商业化途径购买获得。
59.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
60.实施例1竞争性单克隆抗体ts-wn10-1h9的制备
61.用微生物保藏号为cgmcc no.18316的杂交瘤细胞株wn10-1h9制备小鼠腹水，收获腹水经protein g纯化，获得竞争性单克隆抗体ts-wn10-1h9，然后进行量子点荧光微球偶联标记。具体方法如下：
62.给12周龄左右健康的balb/c小鼠腹腔注射石蜡油，0.5ml/只，1周后腹腔注射1
×
106个杂交瘤细胞wn10-1h9(微生物保藏号是：cgmcc no.18316)，7～10天后当小鼠腹腔极度膨胀时抽取腹水，隔2天抽取一次，将抽取的腹水10000rpm离心10min去除上层油脂和沉淀，上清分装保存于-20℃。akta蛋白纯化仪抗体纯化流程参考ge healthcaare手册antibody purification 125内容。纯化柱采用hitrap protein g hp 1ml。
63.实施例2硫醇化寡核苷酸链i1二硫键的还原
64.取2od订购合成的sh-i1 dna冻干粉，加入400μl 10mm tcep溶液，充分溶解后避光静置10min，用于后续进行金纳米颗粒偶联标记。
65.设计sh-修饰的寡核苷酸链i1，序列如下：
66.i1:5
’‑
agtctaggattcggcgtgggttaatttt-(ch2)3-sh-3’(如seq id no.1所示)
67.实施例3 13nm金纳米颗粒的制备
68.用柠檬酸还原法控制还原剂的加入量和反应条件，制备13nm金纳米颗粒，并通过uv-vis吸收光谱对其进行尺寸和浓度表征，用于后续进行金纳米颗粒偶联标记。具体方法如下：
69.称取0.228g二水合柠檬酸三钠置于50ml无菌离心管中，加入20ml去离子水充分溶解，配制38.8mm的柠檬酸三钠溶液。向已硅化的250ml锥形瓶中加入126.9ml的氯金酸溶液，在电磁炉上将液态加热至沸腾。边摇晃边向锥形瓶中迅速地加入10ml柠檬酸三钠溶液，继续加热和摇晃锥形瓶。溶液从明黄色变成酒红色后，继续加热使其沸腾10min，冷却至室温后于4℃保存。
70.实施例4双功能化金纳米颗粒探针的制备
71.将实施例2中还原的i1 dna与1ml实施例3中的金纳米颗粒溶液混合，利用au-s键将i1 dna标记到金纳米颗粒表面。然后静电吸附作用将实施例1制备的单克隆抗体标记到金纳米颗粒表面，具体方法如下：
72.取1ml金纳米颗粒溶液于13600
×
g 4℃离心40min后用150μl核苷酸偶联缓冲溶液重悬。向该溶液中加入实施例2中制备的100μl i1 dna产物，于4℃翻转过夜偶联，偶联时间为16h；
73.所得溶液于13600
×
g 4℃离心40min后用500μl抗体偶联缓冲溶液重悬。向该溶液中加入4.0μg单克隆抗体ts-wn10-1h9，于室温震荡偶联30min。
74.所得溶液于13600
×
g 4℃离心40min后用500μl稳定液重悬；
75.向其中分步加入盐溶液，每次12.5μl，时间间隔30min，共计10次，使nacl终浓度达0.6m，该步骤在室温震荡条件下进行。待盐溶液加入完毕，将混合物于4℃翻转过夜，孵育时间为16h；
76.产物用探针洗涤液洗涤3次，最终用100μl探针洗涤液重悬。制备的双功能化金纳米颗粒探针置于4℃保存，金纳米探针鉴定结果如图2所示。
77.各缓冲液配制方法如下：用1m k2co3溶液调节无菌去离子水的ph值为9.2，即为核苷酸偶联缓冲溶液；称取0.229g na2hpo4·
12h2o(8mm)和0.0192g nah2po4(2mm)溶于60ml去离子水中，再加入8.0g peg20000，用naoh溶液调节ph至9.2，定容至80ml，即为抗体偶联缓冲溶液；称取0.229gna2hpo4·
12h2o(8mm)和0.0192g nah2po4(2mm)溶于60ml去离子水中，再加入8.0g peg20000，用naoh溶液调节ph至7.2，定容至80ml，即为稳定液；称取0.229g na2hpo4·
12h2o(8mm)、0.0192g nah2po4(2mm)和13.91g nacl(3m)溶于80ml去离子水中，用naoh溶液调节ph至7.2，即为盐溶液；称取0.229g na2hpo4·
12h2o(8mm)和0.0192g nah2po4(2mm)溶于60ml去离子水中，再加入0.6955g nacl，用naoh溶液调节ph至7.2，定容至80ml，即为探针洗涤液。
78.实施例5旋毛虫ts-wn10重组抗原制备
79.将重组大肠杆菌bl21(de3)-pet28a-ts-wn10诱导表达后经ni柱一步柱上复性纯化，获得旋毛虫ts-wn10重组抗原。具体方法如下：
80.1)引物设计
81.根据genbank中已登录的ts-wn10基因序列(登录号：eu263325)，设计pcr扩增引物，序列如下：
82.ts-wn10-ecori-atg:5
’‑
taacgaattcatgcagatacttggtga-3’(如seq id no.2所示)
83.ts-wn10-xhoi-tta:5
’‑
gacgctcgagttaacattcaaca-3’(如seq id no.3所示)
84.下划线部分为引入的ecori、xhoi酶切位点，预计扩增产物长度为1187bp。
85.2)旋毛虫t1(t.spiralis)rna的提取及反转录
86.取本实验旋毛虫t1(t.spiralis)保种小鼠1只，断颈处死后去皮、尾、内脏及爪，将胴体洗净后绞碎，置于300ml含有1％hcl和1％胃蛋白酶的消化液中于37℃温箱内搅拌消化2h。用80目滤网过滤消化液及残渣，滤液于分液漏斗中沉淀2h后收集约500ml。沉淀30min后用20ml注射器轻轻吸去上层液体，加入生理盐水再次沉淀，弃上清，反复洗涤至无杂质。将虫体移至ep管中，1000rpm离心3min吸去多余液体。收获的虫体加入1ml trizol混匀，室温静置5min，加入0.2ml氯仿，用力振摇15s，室温孵育2～3min，12000g 4℃离心15min，小心取上层液体，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后室温孵育10min，12000g 4℃离心10min，弃上清，沉淀加入1ml75％乙醇(depc水配制)轻振15s，7500g 4℃离心5min，小心弃上清，沉淀室温风干3～5min，加入20～30μldepc水溶解，-20℃保存。
87.用提取的总rna进行反转录合成cdna，体系如下：
[0088][0089]
3)pet28a-ts-wn10表达载体的构建
[0090]
以反转录获得的cdna为模板扩增ts-wn10基因，pcr反应体系(50μl)如下：
[0091]
10
×
ex taq buffer5μl10mm dntps1μlex taq0.5μl10pm上游引物2μl10pm下游引物2μlcdna模板3μl灭菌ddh2o36.5μl
[0092]
反应条件为95℃预变性5min，95℃45s，53℃45s，72℃45s，循环30个，72℃终延伸10min。扩增产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检测显示，在1161bp左右出现一条亮带，与理论上目的条带的大小一致。测序结果显示成功得到了ts-wn10蛋白的基因编码片段。对pcr产物胶回收。
[0093]
ts-wn10基因的克隆的结果表明，克隆得到ts-wn10基因特异性引物扩增片段，去
掉信号肽获得基因序列1161bp。
[0094]
将胶回收得到的ts-wn10基因以及原核表达载体pet28a分别进行双酶切，酶切体系如下：
[0095]
10
×
h buffer2μlecori2μlxhoi2μlwn10基因10μl灭菌ddh2o4μl
[0096]
同时，对原核表达载体pet28a进行双酶切，酶切体系如下：
[0097]
10
×
h buffer2μlecori2μlxhoi2μlpet28a载体10μl灭菌ddh2o4μl
[0098]
将酶切反应体系置37℃水浴静置2h，之后进行胶回收。将双酶切后的wn10基因和pet28a载体进行连接，体系为：10
×
t4dna ligase buffer 1μl，酶切后wn10基因4μl，酶切后pet28a 1.5μl，t4dna连接酶1μl，ddh2o2.5μl。16℃连接过夜。将连接产物全部转化ecoli dh5a感受态细胞，挑取单菌落进行双酶切鉴定。阳性重组质粒转化bl21(de3)感受态细胞。
[0099]
4)取1ml重组菌bl21(de3)-pet28a-ts-wn10加入到100ml的lb培养基中37℃震荡培养至od600nm约为0.5～1小时，加iptg至终浓度为1mmol/l，37℃诱导6～8h。诱导后菌液离心后用30ml重悬缓冲液(20mm tris-hcl ph8.0)重悬。冰上超声破碎，离心收获沉淀用30ml预冷的包涵体洗涤液(2m尿素、20mm tris-hcl、0.3m nacl ph8.0)重悬，冰上超声破碎，离心收获沉淀。此步骤重复3次。离心收获沉淀用30ml预冷的pbs洗涤液(含4m尿素的0.01m pbs)重悬，冰上超声破碎，离心收获沉淀。此步骤重复2次。离心收获沉淀用5ml binding buffer(8m尿素、20mm tris-hcl、0.3m nacl、5mm咪唑ph8.0)重悬，4℃溶解过夜。离心收上清，上清过滤后准备上样。akta蛋白纯化仪柱上复性流程参考ge healthcaare手册purifying challenging proteins 77～79内容。纯化柱采用histraphp 1ml。注射上样后柱上复性时间为2h。100％置换至refolding buffer(20mm tris-hcl、0.3m nacl、5mm咪唑、1mm 2-巯基乙醇ph8.0)溶液后，更换至elution buffer(20mm tris-hcl、0.3m nacl、500mm咪唑、ph8.0)洗脱目的蛋白。
[0100]
实施例6兔抗ts-wn10多克隆抗体的制备
[0101]
用实施例5制备得到的ts-wn10重组抗原免疫新西兰兔，收获血清经protein g纯化，获得兔抗ts-wn10多克隆抗体。
[0102]
实施例7磁珠探针的制备
[0103]
利用edc活化磁珠上的羧基，活化后的羧基与实施例6制备的兔抗ts-wn10多克隆抗体蛋白上的氨基结合，促使其偶联上蛋白。具体方法如下：
[0104]
取200μl羧基磁珠放入到硅化处理过的玻璃小瓶中，用500μl磁珠偶联反应缓冲液清洗3遍。将清洗后的磁珠磁性分离去掉上清，将500μl磁珠活化剂加入到磁珠中混匀。加入5.5mg nhs粉末后室温震荡孵育15min，磁性分离移除上清。用500μl磁珠偶联液清洗磁珠3
次。将2.4mg实施例6制备的兔抗ts-wn10多克隆抗体稀释到500μl磁珠偶联液中，加入到磁珠中，室温震荡孵育4h。将上述偶联后的磁珠磁性分离去掉上清，加入500μl磁珠封闭液，室温震荡孵育30min。将上述封闭后的磁珠磁性分离去掉上清，用pbs清洗磁珠3次，加入2ml pbs保存于4℃，磁珠鉴定结果如图3所示。
[0105]
各缓冲液配制方法如下：称取1.06625g mes和2.922g nacl溶于80ml去离子水中，调节ph至6.0，定容至100ml，即为磁珠偶联反应缓冲液；称取4mg edc溶于8ml磁珠偶联反应缓冲液中，现用现配，即为磁珠活化剂；称取1.4206g无水磷酸钠和0.8766g nacl溶于80ml去离子水中，调节ph至8.0，定容至100ml，即为磁珠偶联液；称取7.507g甘氨酸溶解于100ml磁珠偶联液中，调节ph至8.5，即为磁珠封闭液。
[0106]
实施例8竞争反应
[0107]
将75μl待检血清与25μl实施例4制备的双标记金纳米颗粒探针(2.0nm)混合，加入实施例5获得的0.1μg ts-wn10重组抗原，与室温反应15min。向溶液中加入实施例7制备的25μg磁珠探针，于室温反应20min。
[0108]
各缓冲液配制方法如下：取0.229g na2hpo4·
12h2o(8mm)和0.0192g nah2po4(2mm)溶于60ml去离子水中，再加入0.6955g nacl，用naoh溶液调节ph至7.2，定容至80ml，即为探针洗涤液。
[0109]
实施例9杂交链式反应
[0110]
将实施例8获得的混合物磁性分离去除上清，向其中加入探针洗涤液100μl，以及终浓度均为6.25μm的h1和h2 dna，于室温扩增反应1.5h。混合物磁性分离后去除上清，向其中加入探针洗涤液100μl和10ng hoechst 33342染料，于室温染色2min，在351nm激发光下记录451nm处荧光值。具体方法如下：
[0111]
1)引物设计
[0112]
寡核苷酸链h1和h2的序列如下：
[0113]
h1:5
’‑
ttaacccacgccgaatcctagactcaaagtagtctaggattcggggtg-3’(如seq id no.4所示)
[0114]
h2:5
’‑
agtctaggattcggcgtgggttaacacgccgaatcctagactactttg-3’(如seq id no.5所示)
[0115]
2)寡核苷酸链h1和h2的预处理
[0116]
取合成的寡核苷酸干粉于10600
×
g离心10min，用灭菌去离子水溶解干粉，配制成100μm母液。将配制的母液在37℃震荡孵育2h，转速为400rpm。将母液分装冻存于-20℃备用。使用前，将不同浓度的h1和h2 dna放入pcr仪中，95℃作用10min再4℃孵育10min，备用；
[0117]
3)杂交链式反应
[0118]
将实施例8获得的混合物磁性分离去除上清，向其中加入探针洗涤液100μl，以及终浓度均为6.25μm的h1和h2 dna，于室温扩增反应1.5h。混合物磁性分离后去除上清，向其中加入探针洗涤液100μl和10ng hoechst 33342染料，于室温染色2min，在351nm激发光下记录451nm处荧光值，杂交链式反应鉴定结果如图4所示。
[0119]
实施例10试剂盒cut-off值的测定
[0120]
用本发明试剂盒分别测定270头份正常猪血清，读取单克隆抗体对照孔荧光值a.u.mcab，正常猪血清检测孔荧光值a.u.mcab，计算抑制率pi％＝(1-a.u.sample/
a.u.mcab)％。
[0121]
将270份正常猪血清的pi％进行统计学分析，计算平均值和标准差，以平均值加2倍标准差为试剂盒的cut-off值，经计算得到该试剂盒在猪血清中的cut-off值为49.45％。即当待测样品pi％≥49.45％时，则判定为阳性；当待测样品pi％＜49.45％时，则判定为阴性；对102份健康志愿者血清和67份旋毛虫病患者血清进行检测，pi％进行roc统计学分析，经计算得到该试剂盒在人血清中的cut-off值为39.42％。即当待测样品pi％≥39.42％时，则判定为阳性；当待测样品pi％＜39.42％时，则判定为阴性。
[0122]
实施例11试剂盒检测旋毛虫病抗体方法
[0123]
样品稀释：将75μl待检血清与25μl实施例4制备的双标记金纳米颗粒探针(2.0nm)混合，加入实施例5获得的0.1μg ts-wn10重组抗原，用移液器混匀，室温反应15min。向溶液中加入实施例7制备的25μg磁珠探针，混匀，室温反应20min。磁性分离去除上清。向其中加入探针洗涤液100μl，以及终浓度均为6.25μm的h1和h2 dna。混匀，室温扩增反应1.5h。磁性分离去除上清。向其中加入探针洗涤液100μl和10ng hoechst 33342染料，混匀，室温染色2min。在351nm激发光下记录451nm处荧光值；
[0124]
结果判定应在30min内进行；
[0125]
读取单克隆抗体对照孔荧光值a.u.mcab，待检血清荧光值a.u.sample，计算抑制率pi％＝(1-a.u.sample/a.u.mcab)％。在猪血清样本中，当待测样品pi％≥49.45％时，则判定为阳性；当待测样品pi％＜49.45％时，则判定为阴性。在人血清样本中，当待测样品pi％≥39.42％时，则判定为阳性；当待测样品pi％＜39.42％时，则判定为阴性。
[0126]
实施例12旋毛虫病抗体检测试剂盒的最低检出限
[0127]
采用旋毛虫病抗体检测试剂盒检测270份健康猪血清。pi值均值mean
±
sd为30.11％
±
9.67％，因此mean+2sd为49.45％。该试剂盒在猪血清中阈值cut-off为pi值＝49.45％，pi值≥49.45％时判为血清学阳性，pi值《49.45％时判为血清学阴性。采用ts-wn10抗原免疫长白猪，用饱和硫酸铵沉淀法粗提高免猪血清中的ts-wn10抗体，纯化后的ts-wn10抗体用bca蛋白测定试剂盒进行定量。后续作为标准品，通过定量添加实验分别测定旋毛虫病抗体检测试剂盒、商品化的酶联免疫吸附抗体检测方法es elisa(qiagen)的标准曲线。将两种方法各自的cut-off阈值与各自拟合的线性函数的交点定义为该方法的最低检出限(lod)。
[0128]
es elisa(qiagen)试剂盒数据所的函数为y＝0.0037x
–
0.3472，相关系数(r2)为0.9855，该方法的cut-off阈值为s/p值＝0.30，因此es elisa(qiagen)试剂盒的lod为174.95ng/ml。
[0129]
结果如图5所示，本发明试剂盒所得数据的函数为y＝0.07108x
–
47.73，相关系数(r2)为0.9872，该方法的cut-off阈值为pi值＝49.45％，因此本发明试剂盒的lod为24.20ng/ml。两种方法相比较而言，本发明试剂盒的最低检出限相较于es elisa(qiagen)试剂盒降低了150.75ng。具有更低的最低检出限，具有更高的敏感性，极具市场前景。
[0130]
实施例13旋毛虫病抗体检测试剂盒在猪血清样本中的敏感性和特异性检测
[0131]
采集小规模猪场养殖的待出栏猪920头份血清和相应的全部膈肌组织(膈肌重量≥100g)，同时使用实施例11的试剂盒检测方法、es elisa(qiagen)试剂盒方法和消化法检测。
[0132]
结果如图5所示，cohen’s kappa分析显示，本发明试剂盒方法检出抗体阳性5头份，抗体阴性915头份。本发明试剂盒方法与es elisa(qiagen)试剂盒方法有极好的一致性(κ＝0.7963)。依据国际旋毛虫委员会的推荐意见，用消化法确认每一头猪的真实感染状态，即以消化法检出与否为金标准，判定本发明试剂盒方法对920头份田间样品的敏感性和特异性。本发明试剂盒方法检出的4头份阳性样本中1份对应的膈肌样本检出虫体阳性。本发明试剂盒方法的敏感性为100％，特异性为99.56％，诊断效果基本满意。
[0133]
实施例14旋毛虫病抗体检测试剂盒在人血清样本中的敏感性和特异性检测
[0134]
对102份健康志愿者血清和67份旋毛虫病人血清进行检测，对pi值采用roc分析，其约旦系数最大为0.9603，划定cut-off为39.42％。因此该方法的敏感性为97.01％，特异性为99.02％。曲线下面积auc为0.9985，表示该方法取cut-off为39.42％时对于区分健康志愿者和旋毛虫病患者有较高的准确性(0.9《auc《1.0)。采用商品化的酶联免疫吸附抗体检测方法es elisa(abcam)测得67份旋毛虫病患者血清的od值，与所得pi值进行相关关系分析。两个方法对旋毛虫病患者血清的测定值之间存在强相关性(r2＝0.7701)，如图6所示。
[0135]
实施例15旋毛虫病抗体检测试剂盒的交叉反应性
[0136]
在猪血清样品中，使用实施例11的试剂盒检测方法对弓形虫、隐孢子虫、猪绦虫、猪蛔虫和猪鞭虫感染的猪血清不存在交叉反应。同时，对经猪伪狂犬病毒疫苗、猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗、猪圆环病毒疫苗、猪瘟病毒疫苗和口蹄疫病毒疫苗免疫的猪血清不存在交叉反应。以上结果与参比的es elisa(qiagen)试剂盒结果一致。
[0137]
在人血清样品中，本发明试剂盒方法对蛔虫、鞭虫、钩虫、弓形虫、并殖吸虫、肝片吸虫、日本血吸虫、华支睾吸虫和脑囊虫感染的患者血清不存在交叉反应。同时，对肠道病毒(ev 71)和柯萨奇病毒(ca 16)感染的患者血清不存在交叉反应。但是，参比的es elisa(abcam)试剂盒与华支睾吸虫病患者血清出现了2例交叉反应。因而，本发明试剂盒方法相比于与es-ielisa试剂盒具有更高的特异性，如表1所示。
[0138]
表1本发明试剂盒方法交叉反应测定结果
[0139]
[0140][0141]
实施例16旋毛虫病抗体检测试剂盒的稳定性检测
[0142]
将试剂盒各组分置于4℃保存，每隔一周分别检测猪阳性和阴性血清各10份，共检测10次，试剂盒结果敏感性和特异性均为100％，且终产物荧光强度均不存在明显的差异。表明4℃环境下可保存至少4个月。证明本发明具有长期稳定的特点，容易保存，具有市场开发价值，如表2所示。
[0143]
表2本发明试剂盒方法稳定性测定结果
[0144][0145][0146]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。