专利名称：检测和治疗人类免疫缺陷病毒的方法和物质的制作方法
技术领域：
本发明总的来说是涉及人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的诊断和治疗所用的方法和物质，更具体地说，本发明涉及具有免疫活性的多肽，最好是抗体或抗体片段，尤其是单克隆抗体，它们对人类淋巴细胞T4蛋白的基因型抗体具有活性，并且以可供体内和体外中和HIV感染的方式与HIV的病毒粒子起反应。此外，本发明还涉及在疫苗组合物中有用的免疫活性多肽，该疫苗组合物对HIV的感染产生保护性应答。
下述文献对人类爱滋病病因的流行病学和免疫学方面的已有技术作了很好的总结Laurence，“The Immune System in AIDS”，1985年12月的Scientific Ameri Can第84-93页;Gallo，“The First Human RetroVirus”1986年12月的Scientific American第88-98页;Gallo，“The AIDS Virus”1987年1月的Scientific AmeriCan第47-56页;Levy等人1984年225期Science 840-842页;“Mobilizing Against AIDS”，Institute of Medicine，National Academy of Sciences，Harvard University Press(Cambridge，Mass.1986);以及Lane等人1985年第3期Ann.Rev.Immunol.第477-500页。在HIV感染中人类T淋巴细胞的T4表面糖蛋白(有时称为“CD4蛋白或决定子)的作用已被广泛地研究，如Dalgleish等人1984年312期Nature763-767;Klatzman等人1986年312期Science767-768页;Klatzman等人1984年第225期Science59-62页;MCDougal等人1985年第135期J.Immunol.3151-3162页;以及Maddon等人1986年Cell第47期338-348页。还可参见Marrack等人“TheTCellanditsReceptor”1986年2月SCientificAmerican36-45页;以及McDougal等人1986年Science第231期382-385页。
近来，可溶形式的CD4在治疗HIV感染中可能具有治疗实用性已在具体化，见Fisher等人1988年Nature第331期76-77页;Hussey等人，Ibid，78-81页;Deen等人，Ibid，82-83页;以及Traunecker等人，Ibid，84-86页，所有这些都涉及用可溶性CD4在体外中和HIV感染。计划使用可溶性CD4治疗剂的潜在缺点是CD4与存在于其它免疫细胞，包括B细胞、巨噬细胞、单核白细胞表面的Ⅱ级主要组织相容性复合物(“MHC”)分子的已知反应性，这意味着将CD4用于治疗之前可能需要修饰(例如，通过截断)。
文献中已有许多报道涉及抗体在体内和体外中和HIV感染的能力，特别是涉及为了形成保护性免疫而进行的活性免疫的尝试。参见Matthews等人1986年Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)83期9709-9713页;Norman，“AIDSTherapyANewPushForClinicalTrials”，1985年Science230期1355-1358页以及这一系列以前的文章;Newmark，1986年Nature324期304-305页;以及出现在1987年2月ScientificAmerican86-88页在标题“AIDSHoPe……AndWarnings”下的注释，以及在1986年12月18日NewScientist中在标题“CanproteinTThwarttheAIDSVirus……？”下的注释。还可参见Mitsuya等人，1987年Nature325期773-778页;Kennedy等人1986年Science231期1556-1559页;Chanh等人1986年EMBO.Journal第5(11)期3065-3071页;Chanh等人1986年Eur.J.Immunol.16期1465-1468页;Putney等人1986年Science234期1392-1395页;以及Matshushita等人1987年6月1-5日的“ⅢInternationalConferenceonAcquiredImmunodeficiencySyndrome(AIDS)”106页的文献W.3.2。
已公开的抗-基因型免疫作用研究的结果是本发明的重要背景技术。参见Kennedy等人“Anti-IdiotypeandImmunity”1986年7月ScientificAmerican48-56页;Jerne，“TheImmuneSystem”，1973年7月ScientificAmerical52-60页;Marx，“MakingAntibodiesWithoutTheAntigens”，1985年Science228期162-165页;Finberg等人1987年CRCCritiCalReviewsinImmunology第7期269-284页;以及Kennedy等人1986年ScienCe232期220-223页。还参见Norman，Supra有关抗-HIV-免疫治疗和产生对HIV表面蛋白的抗基因型抗体之间潜在的相关性。
本发明的特别有意义的背景技术是MCDougal等人1986年J.Immunology 137期2937-2944页所报道的工作，其中指出“……产生抗四种候选CD4单克隆抗体〔OKT4A，OKT4D，OKT4F和Leu3a(有时称为“抗-Leu3a”)〕的家兔抗-基因型血浆不与(HIV)病毒反应或者不能抑制病毒接合到CD4+T细胞上。这一报道应与Ronald C.Kennedy 1987年3月1-4日在旧金山的第7次DNA/杂化体年度会议(the 7 th Annual DNA/Hybridoma Congress)上的报告(报道在1987年Bio/Technology第5期第421-422页)以及1987年6月1-5日在华盛顿的第三届获得性免疫缺陷综合症(AIDS)国际会议上的报告(见文献TH.9.5，并报道在1987年6月11日New Scientist第26页)相比较。这些报告指出了对抗抗-T4抗体的多克隆抗血清的发展以及这样的抗血清识别HIV和在体外部分中和HIV感染的能力。后一个报告还提到了单克隆抗-基因型抗体的制备方法，这一发展在Chanh等人1987年6月Proc.Nat′l.Acad.sci.(USA)第84期第3891-3859页也作了介绍。
在该技术里，确实需要能用于诊断生物体液和组织样本中存在的HIV粒子和HIV感染细胞的新方法和材料，并需要对体内中和HIV感染的新手段和发展能赋予抗HIV感染的免疫性保护的疫苗接种程序。
本发明提供了经纯化和分离的免疫活性多肽，较好的是抗体或嵌合体或它们的片段，最好是单克隆抗体，它们对人类淋巴细胞T4蛋白的基因型抗体(最好是单克隆抗体)具有活性。本发明的这些产品具有与HIV病毒粒子的那部分进行特异性免疫结合的能力，那部分是指在HIV感染诸如人类T淋巴细胞和人类神经系统细胞这样的宿主细胞时必然与T4表面蛋白相互作用的部分。本发明这些产品的特征尤其在于它们的菌株在体外具有中和HIV感染的独特能力，在于与具有大约从60000在80000分子量(由SDS-PAGE测定)的HIV蛋白的特异反应性以及它们对与人类免疫细胞表面有关的第Ⅱ级主要组织相容性分子的不反应性。
因此，本发明的一个实例中，免疫活性产品是通过与HIV粒子及HIV感染细胞表面特异结合“应答”而生成的，即使它们的生成对这些表面蛋白没有直接免疫学关系。
本发明提纯和分离的多肽特别适用于对生物体液中HIV的检测和定量的分析过程，该检测过程以HIV粒子和本发明反应性多肽(例如抗体)之间的免疫结合为基础。而且，本发明形成的抗体、嵌合抗体和它们的片段是选择性地与HIV感染细胞的表面起免疫反应的，于是提供了用于在体液和组织样本中检测HIV感染细胞以及从包括感染与非感染细胞二者的细胞群体中分离HIV感染细胞时有用的试剂。因此，本发明的产品可用于诊断和治疗过程，包括分离和/或选择性地消灭HIV感染细胞。
本发明提纯和分离的免疫活性物质也特别适用于对易为HIV感染的动物、特别是人类进行抗HIV治疗。按这样的一种方法，给已经感染了HIV的病人或处在HIV感染危险中的病人施用免疫有效量的例如本发明的单克隆抗体以产生对HIV感染的被动免疫性。按照另一种办法，受HIV感染的细胞例如在体外与病人未感染的细胞分离并可将后者送回给病人。
如下详细陈述中指出，本发明的与抗体有关的多肽最好最初形成人淋巴T4糖蛋白(CD4决定子)的单一特异抗体(最好单克隆抗体)，接着制备在该初始形成步骤中形成的抗体的T4基因型区域的抗体(最好单克隆抗体)。
嵌合抗体和它们的片段，尤其是双特异抗体也属于本发明的产品蛭窃谖⑸锼拗鳎ɡ缭谂嘌械脑讼赴驼婧松锵赴┲胁挠肟固逵泄氐牟罚庵炙拗饔镁哂兴瓒嚯牟繁嗦氲腄NA序列转化或转染。
作为一个例子，在掌握有关本发明抗体的基因型区域的结构资料时，就可能利用在培养基中的诸如大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞这样的真核生物细胞来产生有用的抗体片段(如fab′和f(ab′)2片段)。此外，用转化的鼠骨髓瘤细胞或杂化瘤细胞(特别是重链缺失突变细胞)作为生产宿主来制备嵌合抗体(例如鼠/人抗体)也在本发明范围内。人们期望杂化的杂化瘤细胞会产生具有诊断和治疗用途的双特异抗体。也可用重组体方法生产HIV亚群疫苗材料。例如，预计本发明的单克隆抗体能极好的适用于在转化或转染的小管或原核细胞中筛选出HIV DNA的表达产品，可以分离出编码了天然产生的免疫有效的HIV蛋白(包括糖蛋白)的全部或部分氨基酸序列的DNA。在适宜的宿主中，存在这样的DNA可以高水平地生产疫苗物质。
在一种优选的方案中，本发明提供了与特征为单克隆的抗-单克隆-抗人淋巴T4抗体的抗体有关的多肽，最好是单克隆的抗-oKT4和抗-oKT4A抗体，两者均与60-80kd HIV蛋白有反应活性。目前，最好是单克隆的抗-okT4A抗体，它具有很强的在体外中和多种HIV菌株的HIV感染的能力，并参与HIV感染细胞的补体-中介溶胞作用。
在另一个实例中，本发明第一次提供了对人淋巴T4蛋白的单克隆抗体以抗原/抗体反应进行特异免疫反应的“抗-基因型”单克隆抗体的杂化细胞系。例如，本发明提供了新的鼠衍生的杂化细胞系，JT4C8，JT4C12和JT4C16，JT1-1F3，JT1-1F3-E5，JT1-1D7和JT2-N15，它们每一个以在培养基中生长的上清液组份形式产生一种与抗-T4基因型特异反应的单克隆抗体，而且这种单克隆抗体以在体内和体外中和HIV感染的方式与HIV病毒粒子蛋白反应。
杂化细胞系JT4C8于1987年2月18日寄存在美国农业部机构美国普通培养物收集中心(Rockville，Maryland)，寄存号为HB9385。杂化细胞系JT4C12在1987年2月18日寄存在上处，寄存号为HB9387。杂化细胞系JT4C16于1987年2月18日寄存在上处，寄存号为HB9386。杂化细胞系JT1-1F3于1987年6月25日寄存在动物细胞培养物欧洲寄存中心ECACC(Salisbury，Wiltshive，U.K)，寄存号为87062501。杂化细胞系JT1-1F3-E5也于1987年6月25日寄存在动物细胞培养物欧洲寄存中心ECACC，寄存号为87062502。杂化细胞系JT1-1D7于1988年1月29日寄存在发酵研究所(日本Ibaragi-Ken)，寄存号为FERMBP-1685，杂化细胞系JT2-N15于1988年1月29日寄存在日本发酵研究所，寄存号为FEMBP-1684。
在另外一个实例中，本发明提供了用众所周知的亲和性纯化来生产HIV亚群疫苗物质的方法，从而通过用由本发明抗体制备的选择性免疫吸附剂分离出HIV的蛋白组份(分子量范围约为60000至80000，尤其是65000至67000)。
通过下述对本发明实施例和附图的详细说明，对本发明的其他目的和优点将会一目了然，附
图1、2和3表示本发明的抗体与HIV和未感染细胞蛋白的免疫试验结果;图4和5提供了与本发明抗体和HIV蛋白有关的免疫斑检测结果;而图6A至6E提供了对感染和未感染的细胞使用本发明抗体的免疫荧光染色检测的照片结果。
下列实施例说明本发明生产的包括JT4C8，JT4C12，JT4C16，JT1-1F3，JT1-1F3-E5，JT1-1D7和JT2-N15的一些杂化细胞系、从中分离出抗-CD4的单克隆抗体，以及这样的单克隆抗体的扩大及其特征。
更具体地说，实例1涉及到刺激鼠宿主来产生市场上有的抗-T4单克隆抗体、“oKT4”的抗体、脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，杂化细胞的筛选、克隆并从中分离出单克隆抗体。实例2涉及用荧光免疫分析法、分析与HIV蛋白反应活性的Western斑检测法以及通过在体外具有中和HIV感染的能力所产生的单克隆抗体的特性。实例3涉及能在生长介质中提供市场上有的抗体“oKT4A”的单克隆抗体的杂化细胞系的第一种生成方法。实例4涉及通过免疫荧光分析、Werstern斑检测、体外中和检测、ELISA检测以及荧光细胞染色分析产生的单克隆抗体的特性。实例5涉及形成杂化细胞系的第二种方法，该杂化细胞系能在它们生长的介质中提供市场上有的抗体“oKT4A”的单克隆抗体，以及由Western斑检测、体外中和检测产生的单克隆抗体的特性。
实例1按本发明的一个实施方案，用诸如Oi和Herzenberg在Selected Methods Cell Immunology 351-372(1979)及Godding在“Antibody Production By Hybridomas”1980年J.Immunol.Meth.39期285-308页上描述的标准免疫学技术产生杂化肿瘤细胞系。用单克隆抗-T4超免疫的鼠的脾细胞在聚乙二醇存在下与鼠骨髓瘤细胞进行融合。检验生长每个“杂化瘤”细胞培养物的上清液是否存在所需要的抗体活性。把选出的杂化瘤细胞进行克隆以成增殖细胞系，这种细胞系在其生长培养物的上清液中产生具有高度特异抗-抗-T4活性的抗体。
A免疫作用用单克隆的抗-人淋巴细胞T4抗体(oKT4，ortho Diagnostics，Rahway，N.J)给每个BALB/C鼠进行脾注射。
将1微克冻干的oKT4物质放入1毫升蒸馏水中，用50mM MES缓冲液(Sigma化学公司)，PH6.0进行透析以除去和置换有机磷酸盐缓冲剂。然后在FPLC(注册商标)仪器上(Pharmacia，Laboratory Separation Division，Piscataway，N.J.08854)进行高压液相层析分离。用一个单Q柱以推荐的方法(其中盐的梯度为0至0.5M NaCl)进行分离。每0.5毫升组份的等分试样(20微升)用新鲜采集的人淋巴细胞(105个细胞/毫升)来分析活性。更具体地说，将HPLC组份与细胞混合并离心，将细胞清洗几次并悬浮在磷酸盐缓冲过的盐水(PBS)中。将5微克用FITC标记的兔抗-鼠IgG与该细胞一起培养，离心后将细胞片再悬浮在PBS中并用荧光细胞计数器读出结果。汇集显示最高活性的组份，在SDS-PAGE上进行分析，结果表明纯度高于90%。
四只小鼠每个最初脾注射总计约100微升的接种剂(每只鼠大约1.5微克的okT4)。十四天和廿八天后对每只鼠进行100微升接种剂的增强注射。
在最后一次增强注射后四天杀死这些小鼠，无菌地取出脾脏，放在盛有Dulbecoo氏改良的Eagle氏介质(Gibco)的Petri氏培养皿(在冰中)中，去除脾的脂肪和结缔组织，将其通过100目的不锈钢筛，得到的各个脾细胞通过在1000转/分下离心10分钟形成片丸，用介质(如上)清洗这种细胞片丸两次，并重新悬浮在RPMI1640中，在有0.2%锥虫兰存在的情况下在血细胞计数器中计数测定细胞浓度。
在含有15%热-失活的马血清(Pel-Freeze)的RPMI1640介质中培养生长由Balb/c株得到的鼠骨髓瘤细胞Ns1/1.Ag4.1。在1000转/分下离心10分钟，使该细胞成为片丸，用不含抗菌素的RPMI1640洗涤。在重新悬浮到相同介质中后由计数确定细胞浓度。
以4∶1的比例混合脾细胞和NS1/1细胞，并在1000转/分下离心10分钟。抽去上清液，在37℃下用分子量为500-600的聚乙二醇(PEG)1500进行细胞融合，在不断的缓和搅动下，在指定的时间内加入以下物质在1分钟的时间内加入1毫升含50%PEG的RPMI1640，搅拌1分钟，在1分钟内加入1毫升含有15%马血清的RPMI1640;在1分钟内加入1毫升含15%马血清的RPMI1640，在2分钟内加入8微升含15%马血清的RPMI1640。
在1000转/分下将得到的融合细胞离心10分钟，重新悬浮在含有15%马血清、还含有青霉素G和链霉素分别为每毫升100单位和100毫克的RPMI1640中，在预先用5%CO2平衡的96板上以每孔0.1毫升将这些细胞沉积在孔板上，该板在37℃下和5%的CO2中培养过夜。
第二天，在每个孔中加入0.1毫升含有15%马血清RPMI1640的HAT介质(13.6微克/毫升的次黄嘌呤，0.176微克/毫升的氨基喋呤和3.88微克/毫升的胸苷)。这种介质选择性地允许脾细胞NS1/1杂化体存活，筛除未融合的NS1/1细胞或与其它细胞融合了的NS1/1细胞。从成年鼠得来的未融化的原始脾细胞在两天之后不能在培养基中存活。
在第3、4、6、9和12天，从每个孔中取出0.1毫升的介质，并加入0.1毫升含有15%马血清的RPML1640的新鲜HAT。在第15、19、23和27天，从每个孔中取出0.1毫升的介质，并加入0.1毫升含有15%马血清和只有如上同样浓度的次黄嘌呤和胸苷的RPMI1640。在第28天，对每个孔的培养物上清液进行筛选以检测对oKT4特异的抗体。
用荧光结合免疫吸收分析法ā癋LISA”)检测产生oKT4抗体的杂化瘤。用100微升含3.0微克/毫升的抗-鼠IgGFC的碳酸盐-碳酸氢盐溶液涂敷96孔板的孔中，在37℃下过夜，用含0.05%吐温20的PBS将孔清洗10次。用20%马血清在37℃下将这些孔阻断1小时，用上述的PBS/吐温20洗两次，去除阻断剂。
每个杂化瘤孔中的培养液的20微升的等分试样与80微升PBS在被涂敷的孔中，在室温下培养1小时，然后在4℃下过夜。用含0.05%吐温20的PBS将这些孔洗涤10次，并用150微升/孔的鼠血清(8微克/毫升)阻断，在37℃下培养3小时，然后在4℃下培养2小时。
在每个孔里将100微升的FITC-标记的okT4(0.3微克/毫升)在黑暗中和4℃下培养过夜，然后用上述的PBS/吐温20溶液将孔洗涤10次，每个孔里加入200微升5×10-5N的N NaoH和5.6×10-4N的NH4oH溶液。将此板在室温下保持15分钟，然后摆动1分钟。在转移到Titertek微滴定1×8板上后，用Corona Electric型MTP 100F微板读数器对这些孔进行荧光测定(激发490微米，散射530微米)。
在被筛选的2710个孔中，有19个对oKT4反应呈现显著的阳性，这19个阳性的克隆被命名为JT4C1至JT4C19。
以每3个孔大约一个细胞的比例将这些细胞稀释剂到另外许多孔中，正式对由这些阳性孔得到的杂化瘤细胞进行克隆。一般，由一个活性孔进行正式的克隆产生出似乎是该同一杂化瘤细胞亚克隆的正式克隆，实际上，在三代以上显示出不同的克隆群体。来自同一孔的亚克隆用其亲本的编号再加上一个号命名(例如由孔JT4C7得到的克隆被标记为JT4C7-1JT4C7-2等)。
实例2为了描述由实例1所述的那些阳性克隆产生的抗体的特性，进行一些测试以确定单克隆抗体与原始免疫原的相对亲和性，该抗体还通过Western斑检测法筛选对HIV病毒粒子蛋白的免疫反应活性，还对抗体中和HIV病毒感染的能力进行筛选。
A、相对亲和滴定除了将各种兔的抗-鼠IgGFc的稀释液置于试验孔中外，按照实例1中所采用的常规筛选抗体的方法进行荧光结合检测。从克隆JT4C1到JT4C-13和JT4C-16得到的抗体的荧光结果列于表1中。各种JT4C7亚克隆的荧光结果列于表2中。
表1中的数据表明，克隆JT4C1，JT4C2和JT4C4的抗体具有较高的亲和力。由克隆JT4C11和JT4C13得到的抗体具有较低的亲和力，而其余试验克隆得到的抗体具有中等的亲和力。
相应地，表2表明JT4C7的亚克隆，JT4C7-12和JT4C7-9分别具有该试验中最高和最低的亲和力。
BWestern斑分析由所有在实例1中鉴别为阳性的19个克隆得到的抗体用Western斑分析来测定与HIV病毒粒子蛋白的免疫反应活性。更具体地说，用SDS(0.1%)和二硫苏糖醇(0.003M)使HTLV-IIIB颗粒崩解，并将该物质放在7.5%聚丙烯酰胺凝胶中，用标准方法对该凝胶进行电泳，将该物质转移到硝基纤维素过滤纸上。最初用含20%热失活马血清的PBS液将滤纸培养1小时，用PBS洗涤。然后用每个克隆的抗体上清液在室温和轻度摇动下将滤纸培养3小时，再在4℃和轻度摇动下过夜。在用PBS/吐温20洗涤后，如上所述用20%的马血清阻断一小时，加入10微克表1浓度克隆编号抗-鼠抗体01234567(μg/ml)(空白)10-27288227992511291325292435160132718778038239387236887631372012002361281781331990.324311710637991091420.120514-11232349531030.0339221-82766866551200.013011523105548846850.00317-8-4386-1411642115浓度克隆编号抗-鼠抗体891011121316(μg/ml)102395252324631003228111512203361775171640583049762018498112922151922720.33888761013971852630.119496116117701570.034343125761041072020.01-51401033180601980.003-2729126265165136
过氧化物酶标记的兔抗-鼠IgG，在室温下培养该混合物4个小时，用PBS/吐温20洗涤10次后，用标准方法显色。由克隆JT4C8、JT4C12和JT4C16得到的抗体都与分子量为60000至80000的HIV蛋白强烈地反应。这些抗体与HIV蛋白免疫反应的能力(而他们的后代中没有这种能力)强烈预示了这些抗体在体内和体外实现中和HIV的能力。
对于在Western斑检测中有反应性的上述抗体进行同型分析揭示了JT4C12和JT4C16抗体是IgG3同型抗体。
C、HIV中和以下述方法测试杂化瘤培养物上清液的HIV中和能力。把培养3天的上清液以1∶5的比例用完全培养介质〔500毫升RPMI 1640;6毫升100×青霉素/链霉素;6毫升100×L-介酰胺;100毫升FCS;和1.2毫升Polybrene stock(1mg/ml)〕进行稀释，取200微升该介质稀释试样加到24孔微量滴定板除了二个孔外的所有孔中，二个孔只加入等量的介质。在一个“只加入介质”的孔中加入补充介质，其余每个孔中加入200微升高滴定度的HIV病毒，将这些板密封在塑料袋中，在4℃下培养1-1 1/2 小时，然后回到17℃保持15分钟。将H9细胞以1×106细胞/毫升的密度在完全介质中于37℃下培养30分钟，然后进行离心，并以5×106细胞/毫升的密度悬浮在新鲜的完全介质中，将200微升的细胞悬浮液加到每个孔中(使其总体积为600微升)，然后将这些微滴定板于37℃下保温1小时，随后将150微升转移到每孔含有2.0毫升新鲜的完全培养介质的一个完全相同的板上。将培养物在CO2培养箱中于37℃下进行培养，4天后，分出培养物，加入新鲜的完全培养介质，在培养的第7天，制备用IFA和逆向转录酶法中和筛选的样品(见Guroff等人1985年Nature316期72-74页;Matthews等人1986年ProC.Nat′l.Acad.Sci(USA)，83期，9709-9713页;和Poiesz等人1980年Proc.Nat′l.Acad.Sci(USA)，77期7415-7419页)。在第一种中和筛选方法中，其结果基本上是阴性或没有结论，而在与第一种方法同时开始的第二种方法中，JT4C1-19系列中15个试验克隆中的12个得到的抗体在IFA或RT试验或同时在这两个试验中显示了中和活性，而被测试的6个JT4C7亚克隆的抗体中的5个显示了中和特性。与在这些检测中显示100%中和的人爱滋病(HTLV-IIIB)病人血清相比，所有这些中和都是“部分”的。
实例3将市场上可买到的称为okT4A的单克隆抗-人淋巴细胞T4(OrthoDiagnostics，Rahway，N.J.)用MonoS(比MonoQ更好)柱提纯，用它重复实例1中普通杂化瘤的形成和筛选程序。特异免疫法与实例1稍微有些不同，差别是初次注射是腹腔内注射，并含有大约15微克提纯的抗体。第二次腹腔接种是在七天之后，并由大约10微克的提纯抗体组成。13天后，通过脾注射施加5微克抗体以进行最后一次增强注射。在筛选的2090个槽中，34个对于与oKT4A的反应性呈明显阳性，其中的10个显示出高度的活性(对大约为200的“背景”，荧光值约为100或更高些)。这10个阳性克隆被命名为JT1-1D11，JT1-1F3，JT1-1G2，JT1-6E12，JT1-6F12，JT2-8E9，JT3-2C4，JT3-5A11，JT3-6D9，以及JT3-6E8。
实例4为了说明实例3所述的阳性克隆产生的抗体的特性，进行与实例2所述的基本相同的试验，简单地说，在Western斑检测法中，抗体上清液是与分子量约为60000至80000的HIV蛋白起反应的，该分析方法明显表示了与分子量约为67000的蛋白的反应性，一些抗体显示出与分子量为78000的蛋白的反应性。值得注意的是与通常被认为起重要免疫作用的HIV壳糖蛋白的41kd或120kd组份无反应性。在这些显示最强反应性的抗体中，二个(JT1-6E12和JT2-8E9)是IgM同型的，而克隆JT1-1F3的抗体是IgG1同型的。用JT1-1F3抗体进行荧光结合分析的结果列于表3中。
表3抗-鼠抗体浓度对照(μg/ml)空白(HAT)JT1-1F320μg/ml4754109310-3773810105-437568992.5-567599081.25-24546340.625-382913250.313233153100.15711340331
与实例2(C)同时进行的中和性研究也表示最初的阴性中和结果，在第2次试验中，在RT测试中只具有轻微的中和能力的迹象。尽管如此，选择IgG1-分泌JT1-1F3克隆用于腹水放大，并进一步进行与HIV蛋白反应性的抗体ELISA筛选。
在第一次ELISA筛选中，在一些微滴定板上涂上各种不同浓度的HTLV-IIIB蛋白(浓度分别为40，20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.313，0.156，0.078，0.039和0.020μg/ml)，阻断(20%马血清/PBS，在37℃下阻断2小时)并干燥过夜。将培养物上清液(20微升与80微升PBS)或HAT培养介质对照作为第一抗体加入，在室温下培养1小时，于4℃下贮存过夜。把过氧化物酶结合的兔抗-鼠IgG(0.3微克/毫升在5%的马血清/PBS中)作为第二抗体加入。在室温下培养2小时后，加入底物(0-苯二胺，0.5mg/ml在McIlvan氏缓冲液中，pH5.5;3%过氧化氢10毫升)。在室温下培养20分钟后，用50微升0.4M硫酸停止反应，并在入492-610处读出吸收度。试验结果表示在图1中，结果表明，在1.25微克的水平上HIV是可检测的，直到含40微克病毒时，反应活性逐渐增加。
对一开始涂以不同浓度的未感染的H9细胞膜制剂(106，6×105，4×105，2×105，6×104，4×104，2×104，1×104，6×103，4×103，2×103细胞/毫升)的滴定板重复ELISA程序，试验结果表示在图2中，结果表明与未感染的制剂无反应性。
最后，用各种同样浓度的由HTLV-IIIBHIV变异种，命名为AL1212C的Haitian HIV变异种(由马萨诸塞州，波士顿，Massachusetts General Hospital的DaVid Hall医生获得)和命名为906的African HIV变异种(由马萨诸塞州，波士顿的New England DeaConess Hospital的Jerone Groopman医生获得)得到的蛋白重复HIV蛋白的ELISA。如图3所示，JT1-1F3抗体可识别所有三种HIV变异种的一个共同的抗原决定部位。如上所述的RT分析法和Syncitium诱导指示的那样，再测试由JT1-1F3抗体得出的腹水体液的体外中和活性。在这一方法中，对各种水平的JT1-1F3抗体(腹水体液的IgG组分)、一种阴性对照(腹水/姥鲛烷(Pristane))和以一个HTLV-IIIB感染病人血清形式的阳性对照之间进行比较，按照这种方法，HIV菌株IIIB，AL1212C和906与Mab JR1-1F3，对照腹水或中和人血清(以1∶5的稀释度在磷酸盐缓冲过的盐水中)一起在4℃下培养90分钟。然后对每个孔加入H9细胞(5×106)，在37℃下培养1小时。从每个孔中取出等分试样(150微升)并加到2.0毫升的新鲜培养介质中。在第4天将培养物以1∶1分开。在第4天和第7天记录逆向转录酶活性和Syncytium诱导。该方法第7天的结果列于表4中，其中相对Syncytium诱导表示如下(-)，0/200细胞;(+/-)1-5/200细胞;(+)，＞10%细胞;(++)，＞细胞的25%;以及(+++)，＞细胞的50%。
表4所示结果清楚地表明了JT1－1F3抗体对所有三种试验的HIV变异种在体外的中和活性，与未感染的病人血清的中和活性相对照，它完全是变种一特异性的，这表明可用一种重要类型的公共的抗原决定部位来识别。
JT1－1F3抗体反应种的分子量由免疫斑(immunoblo－tting)来测定。用SDS－PAGE和Coomasie兰／银染色(图4，通道B和C)分析经纯化的HTLV－IIIB。用SDS－PAGE分析类似的一些等分试样，转移到硝化纤维素纸上，并分析与JT1－1F3抗体的反应活性。在大约67kd(图4，通道E和F)处可检测到一个单独的反应种。
将JT1－1F3抗体与HTLV－IIIB分离株的反应活性与对其它HIV株的反应性进行比较。用ELISA方法得到与HTLV－IIIB，AL1212C和906株的类似型式的反应活性。此外JT1－1F3抗体与三种HIB株中每一个的Western斑分析揭示了与相似分子量抗原的反应活性(图5)。这些发现表面，MAbJT1－1F3与各种HIV株中可检测到的有关的或相同的抗原反应。
上述对JT1－1F3抗体的发现启示了它在检测HTV病毒感染的细胞中也可能是有用的。关于这一点，对JT1－1F3抗体(腹水体液的IgG组分)结合到未感染的和HIV感染的H9细胞进行了监测，由荧光化的兔的抗－鼠IgG确定JT1－1F3结合的程度。如图6A所示，如果有的话，只有很少的可以检测到的抗体与未感染的H9细胞结合，相反，可检测到该抗体与HTLV－IIIB感染的H9细胞集中的和弥散的结合(图6B)。在用906和AL1212C株感染的H9细胞时获得类似的结论(图6C和D)。这一方法已被推广到爱滋病人的造血细胞上。通过Ficoll-Hypaque分离法从爱滋病人的外周血中收集单核细胞并检查与JT1-1F3的反应活性。如图6E所示，用这些细胞检测到一个集中和弥散的兔疫荧光染色图形，与用HIV感染的H9细胞得出的结果相似。
值得注意的是，筛选的JT1-1F3抗体与具有第Ⅱ级重要的组织相容性(“MHC”)表面成分(即人的B细胞系MD1和正常的外周血单核细胞)的反应活性不具有明显的反应活性。
由JT1-1F3的亚克隆而选出的亚克隆JT1-1F3-E5和JT1-1D7分别作为产生比JT1-1F3更高水平的IgG1抗体。JT1-1F3，JT1-1F3-E5和JT1-1D7相互比较的中和分析数据列于下表5中。这三个杂化瘤产生的抗体在ELISA分析中的反应活性列于下表6中。
表6在ELISA分析中3个杂化瘤的比较HIV-IIIB对照病毒蛋白JT1-1F3JT1-1E5JT1-1D7(培养介质)101.3371.1111.3920.03150.9140.8871.1180.0232.50.9960.8311.0810.0221.250.4990.2780.5230.0110.630.2210.1220.1760.0200.310.0700.0750.0600.0150.160.0480.0490.0360.0040.080.0270.0270.0310.012实例5用okT4A并在免疫方法中作如下变动来重复实例1和3的杂化瘤形成和筛选步骤，最初的免疫包括10微克MonoS提纯的okT4A抗体的腹腔注射;17天后进行第二次腹腔注射(7微克)，18天后进行最后一次7微克的腹腔注射。在融合和筛选后，选出一个命名为JT2-N15的产生IgG1阳性的克隆供进一步研究。象JT1-1F3和它的亚克隆JT1-1F3-E5和JT1-1D7一样，克隆JT2-N15产生一个在Western印迹分析中与具有分子量约为65000至67000的HIV蛋白起反应的单克隆抗体。JT2-N15生长的培养介质在ELISA分析中是阳性的，与HIV-IIIB感染性有关的初步中和分析结果列于下表7中。
表7JT2-N15对HIV-IIIB的中和作用RT活性和%中和作用1、未感染的H9157/-2、HIV12194/03、HIV+1.5mg/mlAb343/98.54、HIV+750μg/mlAb568/96.6在对由腹水法繁殖的抗-特异基因型抗体的中和活性作进一步筛选的过程中，已初步确定，下列方案可产生最大活性的腹水制剂。5至8周龄的小鼠首次注射0.5至1.0毫升的姥鲛烷，二周后注射2至8×106(最好约5×106)的杂化瘤细胞。接种二周后开始收集腹水体液，最初收集到的体液(约3-5毫升)显示出最高的中和活性。三天后进行第二次腹水体液的收集，得到8至10毫升活性稍低的体液。第三次从存活动物进行收集，一般给出3-5毫升的体液，它往往比第一次或第二次收集的物质具有更小的活性。表4和5中表示的中和作用数据是以汇集的三次收集物的腹水为基础的，而表6和7中的JT1-1F3-E5，JT1-1D7和JT2-N15的数据是以只汇集第一和第二次收集物的腹水为基础的。
虽然上述实例与市场上有的单克隆抗体制剂okT4和okT4A的方法有关，但是预料其它市售的抗体，如Leu3a(Becton-Dickenson，ImmunocytometrySystemMountainView，California，94039)也同样适用于产生本发明的抗一特异基因型抗体。用表达T4糖蛋白的人T细胞、人T淋巴细胞和重组体产生的人T4蛋白分离物作为原始免疫原通过已知的杂化瘤技术制备的非市售抗体(最好单克隆抗体)同样是适用的。此外，当由JT1-1F3和它的亚克隆和JT2-N15产生的抗体是IgG1同型时，可以预料，不同的同型抗体同样都是有用的。例如，IgG2同型抗体在涉及补体一中介溶胞反应的方法中将更为有用。
Chanh等人1987年6月P.N.A.S(USA)84期3891-3895页上的报道可证实本发明方法的切实可行性，其中报道了Leu3a(命名为HF1.7)的单克隆抗体能够在体外中和HIV-IIIB感染。然而，HF1.7的中和活性其特征为“弱”的(见Weiss1988年1月Nature331期15页)并且还没有证明可以扩大到HIV-IIIB以外的菌株。此外，与上述实例中的抗-okT4和okT4A单克隆抗体不同，Chanh等人的抗-Leu3a抗体如Chanh等人上文3894页图4所示那样，未指出与除gP120以外的任何HTV-衍生蛋白有反应性〔也参见Dalgleish等人1987年11月7日的TheLancetii1047-1050有关多克隆抗-Leu3a抗体的内容)。
虽然上述实例都涉及小白鼠衍生的杂化瘤细胞，但是生成和利用杂种杂化瘤(例如鼠/人和特别是例如用与Borrebaeck1986年1月的TIBTECH147-153;Abrams等人1986年MethodsinEnzymology121期107-119页;Kozbor等人1986年MethodsinEnzymology121期120-140页;Suresh等人1986年MethodsinEnzymology121期210-228页;以及Masuho等人1986年Biochem.&Biophys.Res.Comm.，135(2)495-500页一致的方法制备的人/人杂化瘤都在本发明的范围中。还参见Klausner“SingleChain′AntibodiesBecomeaReality”1986年Bio/Technology，4，1041-1042，Klausner，“StageSetFor′ImmunologicalStarWar′”1987年Bio/Technology，5，867-868页以及Marx，“AntibodiesMadeToOrder”1985年Science，229，455-456页。
因此，很容易理解到，上述生产杂化瘤和鉴别、分离单克隆抗体的具体方法不能限制本发明的实施范围，如MethodsinEnzy-mologyVo1.121中的许多报道和1986年纽约Academic出版公司出版的Langone等人编辑的“ImmunologicalTechniques，PartI”的报道，有许多可供选择的方法可达到同样的结果。
在培养物中转化或转染原核和真核生物宿主细胞表达具有其编码的DNA序列来形成用于本发明的诊断和治疗方法中的免疫活性多肽也在本发明范围中。
本发明的抗-HIV治疗方法将被理解为包括给感染HIV或处于HIV感染危险之中的病人服用有效量的本发明的抗体或抗体片段，以产生包含在体内中和HIV感染的被动免疫力。关于这一点，为了形成免疫活性的抗-HIV治疗组合物，预料本发明产品可与免疫学上可接受的稀释剂、辅助剂和载体相组合。
属于本发明范围内的抗-HIV治疗方法还包括用对单克隆抗-单克隆抗-人淋巴细胞有反应性的生物活性HIV蛋白进行的自动免疫法。这些产品可以直接由病毒制剂通过众所周知的亲和性提纯工艺，包括先形成HIV蛋白和本发明抗体之间的免疫反应混合物，接着分离所需蛋白而获得。作为一个例子，在实例4的方法中由JT1-1F3识别的分子量为60000到80000的HIV蛋白是最初的作疫苗用的选择物。同样可预料基于用本发明抗体免疫识别(和/或提纯的)的HIVDNA的重组体表达产品。
利用多肽产品来检测和确定诸如血液这样的生物体液中的HIV粒子量的本发明诊断方法预期在初步甄别从本发明的被动免疫法受益的病人和在监测本发明的治疗状况下，构成一个必不可少的部分。关于本发明抗体与HIV感染细胞表面选择性反应的结论指出了各种诊断和治疗的用途，包括不能用筛选抗体为基础的分析法检测的早期感染阶段，为了检测HIV感染进行组织(例如淋巴细胞)和体液(例如血液)样本的组织筛选。用本发明的抗体识别感染细胞允许从包含感染和未感染细胞两者的细胞群体中分离出感染细胞。因此，可以预料爱滋病人的血液可以用本发明的抗体在体外进行处理，以去除或选择性地杀死受感染的淋巴细胞。此外，用本发明的抗体结合辅助以循环补体来实现感染细胞的溶胞作用而进行体内处理也在本发明范围内。这种治疗方案对测试JT1-1D7抗体参与体内HIV感染的H9细胞的补体相关的溶胞作用提供了初步阳性结果。
抗体选择性反应活性的性质使它们成为体内药物或传送到受感染细胞的毒素以及用于发展包括可供例如聚集效应子T细胞活性的双决定子的双特异抗体的良好的选择物。参见例如Stearz等人1986年Proc.Nat′1.Acad.Sci.(USA)，83，1453-1457页。
基于这样一个事实，即本发明基于T4蛋白的免疫学特性-据信它对所有变异种(例如AL1212C，906，ARC.LAV，HTLV-IIIRF，HTLV-IIIB)提供共同的受体-而不是任何一个特定的HIV变种，所以，可以预料，本发明的诊断和治疗方法将适用于检测和治疗包含所有HIV变种的感染。利用本发明的多肽作为诊断和研究的工作预料可提供深入到HIV和宿主细胞之间相互作用的其它信息。作为一个例子，本发明的单克隆抗体将用于辨识HIV和宿主细胞的表面蛋白区域的准确的一级、二级和三级结构的形态中，这些表面蛋白在识别细胞的HIV感染和有关过程中必定是相互作用的。反之，用这种信息，将使合成的和重组体产生的多肽免疫原生成本发明的免疫活性物质。
上述详细说明只是为了能清楚地理解发明，而不是为了限制本发明，因为该技术中的专业人员可预料对本发明所作的各种修改和变更。
权利要求
1.一种经提纯和分离的免疫活性多肽，能与HIV病毒粒子的一部分进行特异免疫结合，所说的这部分HIV病毒粒子在HIV感染宿主细胞时必然与T4表面蛋白相互作用，其特征为在体外具有中和HIV感染的能力以及与对人淋巴细胞T4免疫特异的抗体具有特异免疫反应活性。
2.如权利要求1所述的一种多肽呈抗体或嵌合抗体或它们的片段形式。
3.如权利要求1所述的一种多肽其特征为与oKT4抗体有特异免疫反应活性。
4.如权利要求1所述的一种多肽其特征为与oKT4A抗体有特异免疫反应活性。
5.如权利要求1所述的一种多肽呈与由SDS-PAGE测定的分子量约为60000至80000的HIV蛋白具有特异免疫反应活性的抗体形式、嵌合抗体或它们的片段形式。
6.如权利要求5所述的一种多肽，它与由SDS-PAGE测定的分子量约为65000至67000的HIV蛋白具有特异免疫反应活性。
7.如权利要求1所述的一种多肽，它与第Ⅱ级组织相容性分子在免疫学上是无反应的。
8.如权利要求1所述的一种多肽呈鼠-衍生抗体或抗体片段形式。
9.如权利要求1所述的一种多肽呈人抗体或抗体片段形式。
10.如权利要求8或9所述的一种多肽呈单克隆抗体或单克隆抗体片段形式。
11.如权利要求10所述的一种多肽呈双决定子、双特异单克隆抗体的形式。
12.单克隆的抗-单克隆-抗-人淋巴细胞T4抗体。
13.单克隆的抗-oKT4抗体。
14.单克隆的抗-oKT4抗体。
15.一种能在其生长介质中产生权利要求12的一种单克隆抗体的杂化瘤细胞系。
16.如权利要求15所述的一种杂化瘤细胞系选自JT4C8，JT4C12，JT4C16，JT1-1F3，JT1-1F3-E5，JT1-1D7和JT2-N15。
17.一种能在其生长介质中产生权利要求11的一种多肽的杂化瘤细胞系。
18.一种抗-HIV治疗方法包括给易受HIV感染的动物施用免疫行Я康娜ɡ 所述的一种多肽。
19.一种抗-HIV治疗方法包括给易受HIV感染的动物施用免疫有效量的权利要求12所述的一种多肽。
20.一种用于对HIV感染产生保护性免疫应答的疫苗组合物含有免疫有效量的权利要求1所述的多肽。
21.一种用于对HIV感染产生保护性免疫应答的疫苗组合物含有免疫有效量的权利要求12所述的一种抗体。
22.一种基于HIV与对HIV具有特异免疫结合能力的免疫活性多肽之间的免疫反应，在生物体液中用于检测和/或确定HIV量的分析方法，其改进包括采用权利要求1所述的一种多肽作为免疫活性多肽。
23.一种基于HIV与对HIV具有特异免疫结合能力的免疫活性多肽之间的免疫反应，在生物体液中用于检测和/或确定HIV量的分析方法，其改进包括采用权利要求12所述的一种抗体。
24.一种用于检测和/或确定在体液或组织样本中HIV-感染宿主细胞量的分析方法，所说的方法包括所说样本与权利要求1所述的一种多肽形成一种免疫反应混合物，并检测所说多肽对感染细胞表面存在的免疫结合。
25.一种用于检测和/或确定在体液或组织样本中HIV-感染宿主细胞量的分析方法，所说的方法包括所说样本与权利要求12所述的一种抗体形成一种免疫反应混合物，并检测所说抗体对感染细胞表面存在的免疫结合。
26.如权利要求25所述的一种分析方法，其中所说的检测步骤包括确定结合到所说抗体上的可检测的标记。
27.如权利要求25所述的一种分析方法，其中所说的检测步骤包括确定结合到加至所说反应混合物中的抗-抗体上的可检测的标记。
28.如权利要求25所述的一种分析方法，其中所说的抗体选自抗-oKT4抗体或抗-oKT4A抗体。
29.一种在感染和未感染细胞的群体中分离HIV感染细胞的方法，该方法包括所说细胞群体和权利要求1所述的一种多肽形成一种免疫反应混合物，并根据所说多肽对感染细胞的选择性结合从未感染细胞中分离感染细胞。
30.一种在感染和未感染细胞群体中分离HIV感染细胞的方法，该方法包括所说细胞群体与权利要求12的一种抗体形成一种免疫反应混合物，并根据所说抗体对感染细胞的选择性结合从未感染细胞中分离感染细胞。
31.一种从体液样本中分离HIV蛋白的方法，该方法包括将所说样本与权利要求1的一种多肽接触以形成一种包括所说蛋白和所说多肽的免疫反应混合物，并从所说反应混合物中分离所说的蛋白。
32.一种从体液样本中分离HIV蛋白的方法，该方法包括将所说样本与权利要求12的一种抗体接触以形成一种包括所说蛋白和所说多肽的免疫反应混合物，并从所说反应混合物中分离所说的蛋白。
33.一种经提纯和分离的HIV蛋白，其特征在于(1)由SDS-PAGE确定其分子量约为60000-80000;以及(2)与单克隆的抗-单克隆-抗-人淋巴细胞T4抗体的特异免疫反应活性。
34.如权利要求33所述的一种经提纯和分离的HIV蛋白，其特征在于由SDS-PAGE确定分子量约为65000-67000。
35.如权利要求33所述的一种HIV蛋白，其另一特征为在一个敏感的宿主中能对HIV感染刺激起保护作用的体内免疫应答。
36.一种如权利要求33所述的HIV蛋白，其另一特征为采用包括单克隆抗-单克隆-抗-人淋巴细胞T4抗体的一种免疫吸附剂作为亲和性提纯法的一种产品。
37.一种用于对HIV病毒感染产生保护性免疫应答的疫苗组合物包括免疫活性量的权利要求33所述的一种HIV蛋白和免疫学上可接受的稀释剂、辅助剂或载体。
38.一种用于对HIV病毒感染产生保护性免疫应答的疫苗组合物，包括具有部分和全部的用SDS-PAGE测定分子量为60000至80000的HIV蛋白编码的DNA转化或感染的宿主细胞的表达产品，且该产品与单克隆的抗-单克隆-抗人淋巴细胞T4抗体具有特异免疫反应活性。
39.一种用编码了权利要求1的一种多肽的DNA序列转化或转染的微生物宿主细胞。
40.一种用编码了权利要求33的一种多肽的DNA序列转化或转染的微生物宿主细胞。
全文摘要
本发明公开了免疫活性多肽、最好是抗体或抗体片段，尤其是单克隆抗体，它们对人淋巴细胞T4蛋白的特异基因型抗体具有活性，并且以可供体内和体外中和HIV感染的方式与HIV病毒粒子起反应，并检测在生物体液中的HIV粒子。目前最好的实施方案包括用新的小白鼠杂化瘤细胞系JT4C8，JT4C12，JT4C16，JT1-1F3，JT1-1F3-E5，JT1-1D7和JT2-N15产生的单克隆的抗-单克隆-抗-人淋巴细胞T4抗体。还公开了自动和被动接种方法。
文档编号G01N33/569GK1030256SQ88101470
公开日1989年1月11日 申请日期1988年3月4日 优先权日1987年6月29日
发明者大野典也 申请人:日清食品株式会社