专利名称：马传贫病马与接种弱毒疫苗马的血清抗体鉴别诊断试剂的制作方法
技术领域：
本发明是一种含有不明结构抗原或抗体的医用配制品，用于马传贫病马与接种弱毒疫苗马的血清抗体的鉴别诊断试剂。
马传染性贫血病(简称马传贫)是各国养马业的大敌之一，为世界广泛存在的马的传染病。为了预防本病，我国首创马传贫驴白细胞弱毒疫苗，用于马匹免疫预防。但是患本病马匹与接种过弱毒疫苗的马匹均可出现血清学反应。如依各国现行的免疫扩散试验法、中和试验法、补体结合法检查，则两者无法区分，使诊断工作无法进行。
本发明的目的是采用现代高技术中的淋巴细胞杂交瘤技术，研制出仅对马传贫驴白细胞弱毒株系特异的单克隆抗体(McAb)，并制成酶联McAb试剂，以免疫斑点(DB)试验法鉴别诊断马传贫病马与接种弱毒疫苗马匹。
下面详细说明马传贫病马与接种弱毒疫苗马的血清抗体鉴别诊断试剂的制造方法。
一、杂交瘤细胞株的建立用马传贫驴白细胞弱毒免疫BALB/C鼠，以免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞，采用杂交瘤细胞融合法进行细胞融合。对杂交瘤细胞生长孔上清液，用ELISA和IF法进行分泌McAb的检测，对培养上清液抗体检测阳性孔的细胞，再用96孔细胞培养板以有限稀释法作三次克隆化培养和增殖，然后转入细胞培养瓶中传代培养，并连续培养60代，以此获得了分泌抗马传贫驴白细胞弱毒株系特异McAb的杂交瘤细胞株。
二、McAb的制备和纯化1、McAb的制备取杂交瘤细胞(1×107/ml)0.5ml接种到预先腹腔注射0.5ml降值烷的BALB/C鼠的腹腔内，经10-14天，BALB/C鼠的腹部膨大后，无菌抽取腹水，再接种到第二代BALB/C鼠的腹腔，如此在BALB/C鼠腹腔传三代后，大批接种第四代小鼠，无菌收集腹水，经200g离心力离心，10分钟后，收集上清液备用。
2、McAb的纯化(1)硫酸铵沉淀法将所获得腹水以50%的饱和硫酸铵反复沉淀3次，用PH7.2、0.02M的PBS透析，至无铵离子为止。
(2)柱层析用SephadexG200凝胶过滤，收集第一个峰，用蔗糖浓缩，冻干后置-20℃条件下存用。
三、酶联McAb试剂的制备采用过碘酸氧化法1、称取辣根过氧化物酶5mg溶于1ml、0.3M碳酸氢钠溶液中，电磁搅拌下加入0.1ml、1%的二硝基氟苯无水乙醇溶液，室温避光搅拌1小时。
2、加入1ml、0.06M过碘酸钠溶液，室温避光电磁搅拌30分钟。
3、加入1ml、0.16M乙二醇溶液，室温避光电磁搅拌1小时。
4、对1000ml、0.01MPH9.5碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜，中间换液三次。
5、加入5mgMcAb(以0.1MPH9.5碳酸盐缓冲液稀释至1ml)室温避光搅拌3小时。
6、加5mg硼氢化钠4℃作用3小时。
7、装透析袋，以0.02MPH7.4的PBS透析，4℃下放置24小时，中间换液2-3次。
8、电磁搅拌下逐滴加入等体积100%饱和硫酸铵4℃静置1小时，400G离心力离心15分钟，弃上清液，沉淀物用50%饱和硫酸铵洗二次，按前方法离心，沉淀溶于少量灭菌的0.02MPH7.4PBS中，4℃下对0.02MPH7.4PBS透析过夜，换液数次至无铵离子为止。用紫外分光光度计测OD403nm和OD280nm。
9、计算酶标记抗体的McAb量、酶量、克分子比值。
10、酶标记抗体，以灭菌的0.02MPH7.4PBS稀释成一定浓度(200μg/ml)分装安瓶，-20℃低温保存。
四、使用方法采用免疫斑点试验法。
应用硝酸纤维素膜或混合纤维素脂膜作固相载体。
操作步骤(1)点样将阳性、阴性对照及受检血清用微量进样器或玻璃棒沾约2.5ml，点在膜的指定位置上，室温干燥15分钟。
(2)用含0.05%Tween-20的0.02MPBS(PH7.2)漂洗三次，每次3-5分钟。
(3)将膜浸入抗原-酶联McAb试剂溶液中，室温下1小时，抗原-酶联McAb试剂用(2)项溶液稀释。
(4)重复(2)项(5)将膜浸入底物溶液(PH7.6的0.05M Tris-HCl 20ml;DAB 3mg;30%H2O260ml)30分钟。
(6)用蒸馏水漂洗。终止反应，判读结果，显红棕色为阳性，即马传贫驴白细胞弱毒疫苗免疫马。这样就区分开了马传贫病马与接种过马传贫驴白细胞弱毒疫苗马。
用本发明的试剂鉴别诊断马传贫病马与接种过弱毒疫苗的马，结果准确，方法简单。
权利要求
1.一种马传贫病马与接种过弱毒疫苗马的鉴别诊断试剂，其特征在于，采用淋巴细胞杂交瘤技术，研制出的仅对马传贫驴马白细胞弱毒株系特异的单克隆抗体(McAb)并制成酶联单克隆抗体(McAb)试剂，以免疫斑点(DB)试验法鉴别诊断马传贫病马与接种过驴白细胞弱毒疫苗马。
全文摘要
本发明是一种马传贫病马与接种弱毒疫苗马的血清抗体鉴识诊断试剂，这种试剂是利用淋巴细胞杂交瘤技术，获得了分泌抗马传贫驴白细胞弱毒株系特异的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株，再对单克隆抗体(McAb)进行制备和纯化。采用过碘酸钠氧化法，制备出了酶联单克隆抗体(McAb)试剂，以免疫斑点(DB)试验法来鉴别诊断马传贫病马与接种弱毒疫苗马。
文档编号G01N33/577GK1042940SQ8810808
公开日1990年6月13日 申请日期1988年12月1日 优先权日1988年12月1日
发明者芦景良, 孔宪刚, 宁希德, 张日阔, 褚桂芳, 相文华 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所