专利名称：用于诊断肝癌的组合物及诊断方法
技术领域：
本发明涉及一种用于诊断肝癌的组合物体系，一种用于诊断肝癌的制剂体系及诊断方法。
肝癌是世界性高发恶性肿瘤之一，人们进行了各种研究，以期能够尽早发现肝癌，尽早进行治疗，提高治愈率。
目前有许多诊断肝癌的方法，如B超、CT、核磁共振、γ-照相等定位诊断方法。但这些手段不仅难以鉴别良性与恶性占位性病变，而且设备昂贵，不便于普查。另外，作为主要定性诊断手段的众多甲胎蛋白(AFP)检测方法不仅对原发性肝癌的检出率较低(70%左右)，而且对肝外恶性肿瘤的肝转移不能做出诊断。在该方法中，同样存在设备昂贵，不便普及的缺点。
早在1913-1923年间，就有人注意到人体在发生癌变时，肝内的一些酶的活力不同于一般正常组织。近几十年来，由于新技术的建立和发展，肿瘤酶学的研究也在不断发展，已日益引起人们的重视〔参见PotterV.R.etal，CancerMedicine，136，1982〕。目前，以γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)作为肝癌标记物的研究很活跃。大量的基础研究和临床实验都表明，原发性肝癌和转移性肝癌患者血清中的γ-GT活性升高〔参见TsuchidaS.etal，J.Biochem.89，775，1981，JumG.etal，Clin.Chem.18，358，1972，
SelvarajP.etal，Enzyme30，21，1983及GoldbergD.M.，Crit.Rev.inClin.Lab，Sci.12(1)，1，1980〕。
组织学研究表明肝癌前期病变和肝癌组织中γ-GT显著增高，为最能反映肝脏癌变的指标，可作为肝癌的早期发现和肝癌细胞形成的标志(参见TsuchidaS.etal，CancerRes.39(10)，4200，1979，PttersT.J.etal，Clin.Chem.，23(11)，2034，1977〕。然而，长期以来，由于特异性不强，使γ-GT对肝癌的诊断受到限制。近年来，血清特异性γ-GT同功酶被受到高度重视，尽管自七十年代以来人们从不同角度作了不懈的努力，但由于方法的不同，其结果不相一致。
为克服上述肝癌诊断方法的不足，本发明提供了一种新的诊断肝癌的方法，该方法是基于这样的原理肝癌特异性γ-GT同功酶比其它γ-GT同功酶对特定温度的耐受力强，对特定量的某种激活剂的敏感性高。通过一定的实验条件，利用这些差异，以达到用γ-GT这一肝癌标志物诊断肝癌的目的。当然，本发明的范围不受这些理论的限制。
本发明的一个方面是提供一种新的诊断肝癌的方法，该方法包括下述步骤(a)用常规方法采集受试者的一滴血，吸入一盛血管内;
(b)将上述盛血管封口，分离出血清;
(c)将一种膜在试剂A中充分浸泡;
(d)将血清点在经试剂A浸泡的膜上;
(e)将点有血清的膜置于一容器中，封闭后将该容器恒温一定时间;
(f)将上述容器开盖，用滴管取少量试剂B滴于膜上;
(g)再将上述容器加盖，恒温一定时间后开盖，观察实验结果。
本发明的另一方面是提供一种新的用于诊断肝癌的组合物体系，该组合物体系含有组合物A和组合物B。其中组合物A主要由脱氧胆酸钠、缓冲剂、底物、复合激活剂及稳定剂组成;组合物B主要由乙酸和固紫兰组成。
本发明的另一方面是提供一种新的用于诊断肝癌的试剂体系，该试剂体系含有试剂A和试剂B。其中试剂A由上述组合物A及溶剂组成;试剂B由上述组合物B及溶剂组成。
本发明的新的诊断肝癌的方法具有操作简便易行、设备简单、成本低廉的优点，而且本发明的方法准确率高，特异性强。另外，本发明的试剂也很容易得到，无需复杂的合成。
本发明的一个方面是提供一种新的诊断肝癌的方法，该方法包括下述步骤(a)用常规方法采集受试者的一滴血，吸入一盛血管内;
(b)将上述盛血管封口，分离出血清;
(c)将一种膜在试剂A中充分浸泡;
(d)将血清点在经试剂A浸泡的膜上;
(e)将点有血清的膜置于一容器中，封闭后将该容器恒温一定时间;
(f)将上述容器开盖，用滴管取少量试剂B滴于膜上;
(g)再将上述容器加盖，恒温一定时间后开盖，观察实验结果。
在上述方法的步骤(a)中，采血的部位不限，如耳垂、指尖等部位。血样可为静脉、动脉血或静脉、动脉混合血。盛血管可为小塑料管、毛细玻璃管或试管。采血的量仅需一滴或几滴。采血的方法可为常规的采血方法，如点刺等。
在上述方法的步骤(b)中，分离血清的步骤一般在离心机上进行。离心机的转速一般约为1000rpm，操作时间一般为2-3分钟。但操作时间和转速都可以改变，只要能达到分离血清的目的。当然，可以采用任何其他达到上述目的的分离方法，如静置等。
在上述(a)、(b)的操作中，应当小心操作，以避免溶血，因为溶血会影响实验结果的判定。
在上述方法的步骤(c)中所述的膜可为吸水性较强、质地均匀、韧性好的任何膜，如醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜等。也可以采用聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶等。也可以采用滤纸等材料。优选的膜为醋酸纤维素膜。
步骤(c)中的试剂A将在下面详细描述。
膜在试剂A中的浸泡时间没有严格的限制，一般在10分钟左右。浸泡时间要根据膜的不同而变化，只要能够充分浸泡就可以。
因为在步骤(b)中已经将血清分离出来，所以在步骤(d)中，可直接将血清从盛血管中滴在经试剂A浸泡的膜上。这一操作可在室温下，于空气中进行。
在上述方法的步骤(e)中所述的容器为塑料、玻璃或金属盒，也可为任何有机或无机材料制成的容器，其形状不限。
步骤(e)中的恒温操作一般通过水浴实现。水浴温度一般为37-70℃，较好的是55-65℃。水浴时间为至少5分钟。该恒温操作也可通过其它方式实现，如恒温箱、油浴等。
在上述方法的步骤(f)中所用的试剂B将在下面详细描述。
在上述方法的步骤(g)中，恒温操作同样可在水浴中进行。恒温温度可以与上述步骤(e)中的恒温温度相同，也可以不同。恒温时间为至少3分钟。
恒温后将膜取出，用肉眼观察判定结果。如点血清处出现紫红色斑点，即为特异性γ-GT同工酶反应阳性，如点血清处的颜色与膜背景相同，即为特异性γ-G同工酶反应阴性。
在附
图1中，给出了典型的特异性γ-GT同工酶反应阳性和阴性的图样。在该图中，同时检测了多份血样，其中的小点为用铅笔所做的标记，以区别不同受试者的血清。
在上述方法的步骤(c)中所用的试剂A为组合物A的水溶液，该组合物A主要由下列组分组成脱氧胆酸钠、缓冲剂、底物、复合激活剂和稳定剂。其中所述的缓冲剂可为任何能够调节溶液pH值的试剂，如三羟甲基氨基甲烷等。在本发明中，所述缓冲剂包括缓冲对，如巴比妥与巴比妥钠、磷酸氢二钠与磷酸二氢钠、磷酸氢二钾与磷酸二氢钾等，其中，优选的缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷。所述的底物是指氨基酰氨基酸化合物，如甘氨酰甘氨酸、赖氨酰赖氨酸、组氨酰组氨酸等，其中，优选甘氨酰甘氨酸。所述的复合激活剂包括选自钠、镁、钙、铯盐中的至少二种。所述钠、镁、钙、铯盐的实例有氯化钠、硫酸钠、醋酸钠、磷酸钠、氯化镁、硫酸镁、氯化钙、硫酸钙、氯化铯等，只要能够在水溶液中电离出上述金属离子的盐都可以使用。在上述盐中，优选上述金属的盐酸盐。所述的稳定剂是指γ-L-谷氨酰化合物，如γ-L-谷氨酰-α-萘胺、γ-L-谷氨酰-硝基苯胺、γ-L-谷氨酰-β-萘胺等，其中，优选γ-L-谷氨酰-α-萘胺。
可用常规的方法(如用水溶解)酰制上述组合物的制剂。
为便于贮存，还可以在试剂A中加入防腐剂，如苯甲酸。
在试剂A中，脱氧胆酸钠的含量一般为0.5-1.8%，较佳的是0.9-1.5%。缓冲剂的含量一般为5-20%，较佳的是8-15%，最佳的是9-13%。底物的含量一般为1-10%，较佳的是3-9%，最佳的是4-6%。复合激活剂的含量一般为1.4-16.5%，较佳的是2.8-13%，最佳的是4-9.8%。稳定剂的含量一般为0.2-3.0%，较佳的是0.3-1.5%，最佳的是0.5-1.2%。如果在试剂A中加入防腐剂，则其含量一般为0.5-2.0%。上述含量范围均以该组分占整个溶剂的重量百分比表示。
在上述方法的步骤(f)中使用的试剂B为组合物B的水溶液，该组合物B主要由乙酸和固紫兰B组成。
可用常规的方法(如用水溶解)将上述组合物配制成制剂。
在试剂B中，还可以加入防腐剂，如苯甲酸等。
在试剂B中，乙酸的含量一般为5-30%，较佳的是10-25%，最佳的是15-20%。固紫兰B的含量一般为5-20%，较佳的是10-15%。
如果在试剂B中加入防腐剂，其含量一般为0.2-3%。上述含量范围均以该组分占整个溶剂的重量百分比表示。
经实验证明，组合物A和组合物B具有良好的稳定性，如于室温下避光贮存，至少三年内有效。试剂A和试剂B在室温条件下放置15天内有效，如于4℃冰箱内贮存，至少一个月内有效。
本发明的方法不仅对原发性肝癌具有较高的检出率，而且对转移性肝癌也具有一定的诊断意义;不仅对肝癌和非肝癌具有较好的鉴别诊断作用，而且对AFP假阴性和低浓度的原发性肝癌也有较好的补诊作用;不仅能评估原发性肝癌的疗效和监测肝外恶性肝癌的转移，而且对早期肝癌的发现有较大的价值;不仅能对当地患者就近进行检测，而且能对外地邮寄的样品邮报结果。
实施例试剂A的配制在一个100ml的烧杯中，加入1.8g脱氧胆酸钠、4g甘氨酰甘氨酸、3g氯化钠、3g氯化镁、1.5g氯化钙、0.5g氯化铯、2g苯甲酸、0.5gr-L-谷氨酰-α-萘胺，加入蒸馏水，使其体积达到100ml。搅拌后溶解，配得试剂A。
试剂B的配制在一个100ml的烧杯中，加入30ml乙酸(98wt%)、10g固紫兰B、2g苯甲酸，加入蒸馏水，使其体积达到100ml。搅拌后溶解，配得试剂B。
将尺寸为5×4cm的醋酸纤维素膜(市售)浸泡在试剂A中10分钟。用常规点刺法采集受试者一滴耳垂血，盛入内径为3mm、长为5cm的塑料小管，用火在一端加封。将小管放入离心机内，于1000rpm下离心3分钟，在管内分离出血清。将醋酸纤维素膜从试剂A中取出，铺放在滤纸上。将血清滴加在该膜上，然后将该膜盛入一塑料盒内。将该盒在水浴下于50℃恒温，然后取出小盒，在其中的膜上滴加数滴试剂B。再次于58℃下水溶恒温3分钟。将膜取出，观察结果。
进行了一系列的实验，来评价本发明方法的可靠性、敏感性和特异性。
实验1取30份不同血清，进行同次重复和非同次重复检测，结果如表1所示。
在表1中，“+”表示特异性γ-GT同工酶反应阳性(即在膜上呈现紫红色斑点)，“-”表示特异性γ-GT同工酶反应阴性(即膜的颜色与背景相同)。
实验2对15例受试者分别采取静脉血和毛细血管血(耳血)，其检测结果如表2所示。
实验结果表明，用静脉血与用毛细血管血进行检测，得到相同的结果。
实验3用本方法检测了233例原发性肝癌患者和27例转移性肝癌患者，得到的结果列于表3。
表3表明，本发明的方法对原发性肝癌和转移性肝癌的检出率都很高。
实验4对194例慢性肝病患者、116例肝外恶性肿瘤患者和28例肝内良性占位性病变患者用本发明方法进行检测，其结果如表4所示。
表4 非肝癌病例检测结果
<p>＊(手术例数)为经手术和/或病理诊断证实的病例数。
＊＊在肝硬化组中有12例经本法检测为γ-GT反应阳性(当时AFP均小于25ng/ml)，半年内有4例肝脏癌变。
对表3和表4中所得结果进行统计学处理(X2-检验)，所得结果如表5所示。
由表5可见，不论与手术和/或病理诊断结果比较，还是与手术和/或病理与临床诊断结果比较，本发明方法对原发性肝癌和转移性肝癌的检测结果分别与非肝癌比较均有非常显著的差异。
实验5共收集158例具有AFP检测结果的确诊的原发性肝癌。现将用本发明方法所得检测结果与用AFP方法所得检测结果列于表6。
表6 用本发明方法与AFP法对158例原发性肝癌的检测结果
<p>对上述结果的统计学比较(X2-检验)表明，本发明方法与AFP对原发性肝癌的检出率具有显著差异(P＜0.001)。
实验6共收集到16例癌块直径小于3cm的原发性小肝癌(经B超、CT或直接测量确定)，用AFP法对其中13例进行了检测，用本发明方法对其中16例进行了检测，所得结果如表7所示。
表7的结果表明，AFP法与本发明方法对小肝癌的检出率分别为53.85%和81.25%。
上述实验表明，本发明的方法具有很好的可靠性、敏感性和特异性。
(4)文件名称页行补正前补正后说明书12的制剂体系的试剂体系59、10同工酶同功酶11同工酶同功酶65酰制上述组合物制剂配制上述组合物试剂614溶剂的重溶液的重18配制成制剂配制成试剂最后溶剂的重量溶液的重量101、2同工酶同功酶
权利要求
1.一种用于诊断肝癌的组合物体系，该组合物体系含有组合物A和组合物B，其中组合物A主要由脱氧胆酸钠、缓冲剂、底物、复合激活剂及稳定剂组成，组合物B主要由乙酸、固紫兰B组成。
2.权利要求1所述的组合物体系，其中在组合物A中所述的缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷、巴比妥与巴比妥钠、磷酸氢二钠与磷酸二氢钠、磷酸氢二钾与磷酸二氢钾。
3.权利要求1所述的组合物体系，其中在组合物A中所述的缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷。
4.权利要求1所述的组合物体系，其中在组合物A中所述的底物为氨基酰氨基酸化合物。
5.权利要求1所述的组合物体系，其中在组合物A中所述的复活激活剂为选自钠、镁、钙、铯盐中的至少二种。
6.权利要求1所述的组合物体系，其中在组合物A中所述的复活激活剂为选自钠、镁、钙、铯盐酸盐中的至少二种。
7.权利要求1所述的组合物体系，其中在组合物A中所述的稳定剂选自γ-L-谷氨酰化合物。
8.权利要求1所述的组合物体系，其中在组合物A中所述的稳定剂选自γ-L-谷氨酰-α-萘胺。
9.一种用于诊断肝癌的试剂体系，该试剂体系含有试剂A和试剂B，其中试剂A主要由脱氧胆酸钠、缓冲剂、底物、复合激活剂、稳定剂及溶剂组成，试剂B主要由乙酸、固紫兰B及溶剂组成。
10.权利要求9所述的试剂体系，其中在试剂A中所述的缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷、巴比妥与巴比妥钠、磷酸氢二钠与磷酸二氢钠、磷酸氢二钾与磷酸二氢钾。
11.权利要求9所述的试剂体系，其中在试剂A中所述的缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷。
12.权利要求9所述的试剂体系，其中在试剂A中所述的底物为氨基酰氨基酸化合物。
13.权利要求9所述的试剂体系，其中在试剂A中所述的复合激活剂为选自钠、镁、钙、铯盐中的至少二种。
14.权利要求9所述的试剂体系，其中在试剂A中所述的复合激活剂为选自钠、镁、钙、铯盐酸盐中的至少二种。
15.权利要求9所述的试剂体系，其中在试剂A中所述的稳定剂选自γ-L-谷氨酰化合物。
16.权利要求9所述的试剂体系，其中在试剂A中所述的稳定剂选自γ-L-谷氨酰-α-萘胺。
17.权利要求9所述的试剂体系，其中所述的溶剂为水。
18.权利要求9所述的试剂体系，在其中所述的试剂A中，脱氧胆酸钠的含量为0.5-1.8wt%，缓冲剂的含量为5-20wt%，底物的含量为1-10wt%，复合激活剂的含量为1.4-16.5wt%，稳定剂的含量为0.2-3.0wt%。
19.权利要求9所述的试剂体系，在其中所述的试剂B中，乙酸的含量为5-30wt%，固紫兰B的含量为5-20wt%。
20.权利要求9所述的试剂体系，在其中所述的试剂A中，脱氧胆酸钠的含量为0.9-1.5wt%，缓冲剂的含量为9-13wt%，底物的含量为4-6wt%，复合激活剂的含量为4-9.8wt%，稳定剂的含量为0.5-1.2wt%。
21.权利要求9所述的试剂体系，在其中所述的试剂B中，乙酸的含量为15-20wt%，固紫兰B的含量为10-15wt%。
22.权利要求9-21所述的试剂体系，其中含有防腐剂。
23.权利要求22所述的试剂体系，其中的防腐剂为苯甲酸。
24.一种诊断肝癌的方法，该方法包括下述步骤(a)用常规方法采集受试者的一滴血，吸入一盛血管内;(b)将上述盛血管封口，分离出血清;(c)将一种膜在权利要求9-23中所述的试剂体系的试剂A中充分浸泡;(d)将血清点在经试剂A浸泡的膜上;(e)将点有血清的膜置于一容器中，封闭后将该容器恒温一定时间;(f)将上述容器开盖，用滴管取少量权利要求9-23中所述的试剂B滴于膜上;(g)再将上述容器加盖，恒温一定时间后开盖，观察实验结果。
25.权利要求24所述的诊断方法，其中所用的膜为醋酸纤维素膜。
26.权利要求24所述的诊断方法，其中的步骤(e)中的恒温操作是在55-65℃下进行的，恒温时间为至少5分钟。
27.权利要求24所述的诊断方法，其中的步骤(g)中的恒温操作是在45-65℃下进行的，恒温时间为至少3分钟。
全文摘要
一种新的诊断肝癌的方法，包括步骤(a)采集受试者的一滴血，吸入一盛血管内；(b)将盛血管封口，分离出血清；(c)将一种膜在试剂A中充分浸泡；(d)将血清点在上述膜上；(e)将膜置于一容器中，封闭后恒温一定时间；(f)开盖，取少量试剂B滴于膜上；(g)加盖，恒温一定时间后开盖，观察实验结果。本发明还涉及一种含有组合物A和B的用于诊断肝癌的组合物体系，其中组合物A主要由脱氧胆酸钠、缓冲剂、底物、复合激活剂及稳定剂组成；组合物B主要由乙酸和固紫兰B组成。
文档编号G01N33/50GK1043392SQ8810847
公开日1990年6月27日 申请日期1988年12月10日 优先权日1988年12月10日
发明者王映强 申请人:中国人民解放军兽医大学