专利名称：：从人的血浆中分离α1-抗胰蛋白酶及其检测系统的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种纯化人的α1-抗胰蛋白酶(一种肝细胞癌的潜在性肿瘤生化标记物)以及构建用于检测血清中α1-抗胰蛋白酶含量的检测体系的方法。肿瘤标记物在与放射性理疗法相结合的恶性癌肿早期诊断、甄别方法中变得越来越重要。除α-胎儿蛋白外，α1-抗胰蛋白酶被认为是一种检测肝细胞癌的新的生化肿瘤标记物。于是建立起一种有效的操作方法，用于提纯α1-抗胰蛋白酶为同质形式，并构建一种很容易用于测量血清α1-抗胰蛋白酶水平的检测系统。在建立纯化步骤时，考虑下面几点1)整个方法应是简单的且在一短时间内能完成。2)仔细地设计步骤，以使在纯化过程中蛋白质不会变性。下面是早期建立的分离α1-抗胰蛋白酶的方法、该方法效率低且利用该法分离出的蛋白质不纯。对于分离血清蛋白，可利用聚丙烯酰胺(Anal.Biochem.，21∶57-67，1967)、琼脂糖(Scand.J.Clin.Lab.Invest.，124∶71-82，1972)和SDS-聚丙烯酰胺(Anal.Biochem.，109∶76-86，1980)凝胶。但是由于难于从这些凝胶上回收完整形式的蛋白质，这些方法仅适用于分析目的。围绕这个问题，人们一直利用各种层析柱为纯化血清蛋白质。例如，Crawfortetal.(Arch.Biochem.&Biophys.，156∶215-222，1973)用DEAE-纤维素，QAE-交联葡聚糖凝胶和交联葡聚糖凝胶150柱，Saklatvala(Biochem，J.，157∶339-351，1976)用DEAE-纤维素和ConA-琼脂糖柱纯化α1-抗胰蛋白酶。亲和性-琼脂糖凝胶蓝和其他离子交换剂和分子筛柱也由Travis(Med.Enz.80∶754-765，1981)和Kang(Kor.Biochem.J.，21∶485-490，1988)用于纯化α1-抗胰蛋白酶。但是，这些操作相当复杂和花费时间，从而也就降低了纯化酶产量。一般地说，建立一种检测某种蛋白质的方法，应考虑下面几点1)测量应是精确的。2)操作应是简单的。易于掌握和花费时间短。3)如果可能，该方法最好不用任何有害化学试剂，危险的器械或昂贵的工具。在这方面，Ouchterlony(InProgressinAllergy，5∶1，1958)，Lieberman(Chest.，62∶557，1972)，Kew(Br.J.Cancer，37∶635，1978)，Stockley(Am.Rev.RespiratoryDis.，120∶1981)，Fragion(Clin.Genet.，19∶134，1981)，Kim(Kor.J.InternalMed.，24222，1981)和Sparos(Br.J.Cancer，49∶567，1984)曾使用过的放射性免疫扩散(RID)法程序是无效的，因为该方法不灵敏，不能够测量十分之一μg的某种血清蛋白质。而在巴比妥钠缓冲液中进行的火箭免疫电泳(RIE)显示血清蛋白含量的可信数据。通过利用RIE，Laurell(Anal.Biochem.，15∶45，1966)，Eriksson(ActaMed.Scand.，195∶451，1974)，Vaughan(B.B.A.，701∶339，1982)，Choi(Cancer，43∶596，1979)，和Bernacka(Cancer，62∶1188，1988)检测出α1-抗胰蛋白酶和其他蛋白质的含量。Gaiclulis(Clin.Chem.，29(10)1983)和Carlson(Scand.J.Gastroenterol.，20∶835，1985)也分别利用比浊法和ELISA法测出血清中α1-抗胰蛋白酶的含量。正如上面所述，事实上，以前报道的大多数方法均使用RID或RIE。但是，这两种方法有各自的缺点。RID是相当费时间(＞48小时)且仅得出近似值。RIE检定时间较短(3-6小时)，但是电泳需要一个冷却系统(Anal.Biochem.，15∶45，1966)且需要巴比妥作缓冲液，它是一种能使人产生癖好和毒瘾的药剂。对附图的简单描述下面借助附图描述本发明，如下图1表示用于纯化人的α1-抗胰蛋白酶的各柱的连接。图2表示在含有1mMEDTA的40mMTris-醋酸盐缓冲液(PH8.0)中的火箭免疫电泳的结果。本发明的一个目的是建立纯化人的α1-抗胰蛋白酶的有效程序以及提供一个检测系统的方法，利用该检测系统可在不使用毒品和成瘾药或如ELISA读数器的昂贵仪器的情况下检测血清α1-抗胰蛋白酶的含量。为了将α1-抗胰蛋白酶纯化为同质形式，进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，再通过一系列柱色谱分析。直接连接的亲和性-凝胶蓝和DEAE-纤维素柱在一个短时间期间内产生同质型的α1-抗胰蛋白酶。为了以简便快速方法检测血清α1-抗胰蛋白酶含量，修改了RIE(17)方法。以Tris-醋酸盐缓冲液代替巴比妥用于电泳。经修改的方法不需要一个冷却系统且可在室温下进行。在RIE实验中实际的测量距离(凝胶上火箭高度)通常接近100mm，而RID实验中扩散区域直径不足10mm。因此，事实证明RIE比RID显示出更精确蛋白质的血清含量值。表1中概括了RID和RIE之间的差异。下面是该纯化人α1-抗胰蛋白酶方法的概要。将人血清冷却到0-4℃。在该血清中加入硫酸铵，最终达到50%饱和度。将该样品在4℃保持30-60分钟后，离心该溶液，重新收集上清液。在上清液中再加入硫酸铵，使最终浓度达到80%饱和度。再次将该样品在4℃保持30-60分钟且离心。然后将沉淀重新悬浮，在TAE(40mMTris-醋酸盐，PH8.0，1mMEDTA)或磷酸盐(20mM磷酸钠，PH8.0，1mMEDTA)缓冲液中透析。将样品蛋白质在0.9-1.5%琼脂糖或8-12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。电泳后，切割下与二甲苯苯胺一起迁移的蛋白质带且在液氮中用研钵将该谱带研成粉状。图1进一步说明各步骤。将该冻干粉转移到样品柱上，加入一直保存在4-8℃的TAE缓冲液，使研成粉的凝胶解冻。柱Ⅰ和柱Ⅱ用亲和性-凝胶蓝装填柱Ⅲ用DEAE-纤维素填充。从凝胶中洗提到的蛋白质按顺序依次通过这三个相连接的柱。这个步骤所用缓冲液含有10-50mMTris，PH6.5-8.5，1mMEDTA，和1mMβ-巯基乙醇。将该缓冲液收集于F3(图1)中，直至体积达到样品柱床体积的10倍时，关闭阀门8。收集1-10ml馏分，在280nm处测量每一馏分的光密度值。汇集含有α1-抗胰蛋白酶的馏分。上面介绍的方法是一种不为公众所知的新技术，预期这种技术广泛地用于纯化α1-抗胰蛋白酶和其他蛋白质。实际的纯化工作在实施例1)中进一步详述，本发明的方法所得的产品的纯度和实验所需时间与已知方法所得的相关数据一起分别概括于表2和表3中。从上述实验纯化的每一种同质α1-抗胰蛋白酶中各取100-150μg分别注射入每只兔子。得到α1-抗胰蛋白酶的单特效抗血清，将该抗血清加入45-55℃的琼脂糖溶液(50-100mMTris-醋酸盐，PH8.0，2mMEDTA，0.8-1.2%琼脂糖)中，使最终浓度为0.5-3.0%，将该含有抗血清的琼脂糖溶液倾倒至凝胶平板上。在含有2mMEDTA的50-100mMTris-醋酸盐缓冲液(PH8.0)中以10-20伏/cm进行水平凝胶电泳1-3小时。电泳后，通过比较试验样品与已知量的标准样品的火箭高度计算出α1-抗胰蛋白酶的血清含量。该试验中进行的实际过程在实施例2)中进一步说明。上面介绍的方法具有以下几方面的优点1)可精确地测定血清α1-抗胰蛋白酶含量。2)以Tris-醋酸盐缓冲液代替巴比妥缓冲液(一种毒品和成瘾药)，电泳可以正常方式操作。3)电泳可在室温下进行，不需任何冷却系统，且在3小时内完成。实施例1通过在Tris-醋酸盐缓冲液中的火箭免疫电泳和三个相连接的亲和-凝胶蓝和DEAE-纤维素柱，从人血浆中分离同质型α1-抗胰蛋白酶。将粉末状硫酸铵加到人血清中，直至浓度达到50%饱和度。将该样品在4℃放置60分钟，离心后，回收上清液。将额外的粉状硫酸铵再加到上清液中，使最终浓度达80%。再次在4℃保持60分钟后，回收沉淀且重新悬浮于缓冲液(40mMTris-醋酸盐，PH8.0，2mMEDTA)。在相同缓冲液中透析该样品。将该蛋白质溶液加到1%琼脂糖凝胶上，电泳3个小时。切下与二甲苯苯胺一起移动的带，在液氮中用研钵研磨。将冻干胶粉加到样品柱上，如图1所示。然后将缓冲液(20mMTris-HCl，PH7.4，1mMEDTA，1mMβ-巯基乙醇)加到样品柱，依次通过亲和性-凝胶蓝Ⅰ，亲和性-凝胶Ⅱ，和DEAE-纤维素柱。在F3中收集足够体积的缓冲液后，一个线性NaCl梯度(0.0-0.3M)加到DEAE-纤维素柱上。该实验结果概括于表2。最后产率为62%，纯化α1-抗胰蛋白酶的比活性是817个单位/mg。一个酶单位表示在一分钟内将O.D410琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-P-硝基酰苯胺还原所需的蛋白质的量。实施例2通过在Tris-醋酸盐缓冲液中进行火箭免疫电泳检测α1-抗胰蛋白酶。每隔10天，取100～150μg经过纯化的α1-抗胰蛋白酶注射兔子。第4次注射后，回收抗血清。将该抗血清加到50℃的琼脂糖溶液(1%)中，使最终抗血清浓度为1.5%。然后将该琼脂糖溶液倾倒至凝胶板上，制成3mm厚的凝胶板。待胶冷却后，每种样品血清各取1μl加到凝胶板的每一孔中。在含有2mMEDTA的40mMTris-醋酸盐缓冲液中，以15伏/cm在室温下电泳3小时。测量火箭高度，且与已知标准样品的火箭高度相比较，结果显示于图2。表1.放射性免疫扩散(RID)和火箭免疫电泳(RIE)之间的比<p>表2.通过本发明使用的方法纯化α1-抗胰蛋白酶</tables>＊一个胰肽酶E-抑制活性单位定义为每分钟将△A410降低1.0吸收单位的蛋白质量。测试混合物含有0.2MTris-Cl，PH8.0，1.2×10-6mol胰肽酶E和9.97×10-4mol琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-P-硝基酰苯胺。表3.纯化α1-抗胰蛋白酶的每个步骤所需时间常规方法时间(hr)本发明所用方法时间(hr)硫酸铵分馏2硫酸铵分馏2透析3透析3QAE-交联葡聚糖5凝胶电泳2凝胶A-50硫酸铵沉淀1凝胶洗提和5连续柱层析透析3亲和性-凝胶蓝Ⅰ2亲和性-凝胶蓝Ⅱ2硫酸铵沉淀1透析3伴刀豆球蛋白A柱5层析总计27总计12附图的进一步描述图1栓Ⅰ亲和性-凝胶蓝Ⅰ栓Ⅱ亲和性-凝胶蓝Ⅱ栓ⅢDEAE-纤维素B缓冲液V阀门F馏分收集器图2.在含有1mMEDTA的40mMTris-酸盐缓冲液(pH8.0)中进行的火箭免疫电泳的结果。室温下，以15伏/Cm的电压将已纯化的α1-抗胰蛋白酶和健康人血清在含有1.5免抗血清的1%琼脂糖凝胶上，在TAE(40mMTris-酸酸盐，1mMEDTA，pH8.0)缓冲液中电泳3小时，用酰胺黑10B染色凝胶A、该图表示火箭高度和α1-抗胰蛋白酶浓度之间的相关性B、孔2，3，4和5含有0.6，1.5，3.0和6.0μg的抗α1-抗胰蛋白酶。孔1和6仅含有TAE缓冲液、孔7和8含有1μl健康人体人血供体的血清。权利要求1.纯化α1-抗胰蛋白酶为同质型的方法，包括通过硫酸铵分馏(50～75%之间)和琼脂糖凝胶电泳部分纯化后，再通过三个相连接的柱子(亲和性-凝胶蓝I，亲和性-凝胶Ⅱ和DEAE-纤维素)纯化。2.测量血清α1-抗胰蛋白酶的检测系统，该检测系统使用含1-3%α1-抗胰蛋白酶的抗血清的琼脂糖凝胶，且将该检测系统设计成在室温，不含任何成癖和毒瘾药的TAE缓冲液(100mMTris-醋酸盐，PH8.0，1mMEDTA)或其他缓冲液中进行火箭免疫电泳。全文摘要本发明涉及一种纯化人的α文档编号G01N30/46GK1053445SQ9011032公开日1991年7月31日申请日期1990年11月30日优先权日1989年12月21日发明者南永祐申请人:国际药品工业株式会社