专利名称：使用3sr扩增法原位检测核酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用核酸探针检测核酸。
可使用特异性核酸探针，以其中探针与待检测RNA分子反应的杂交反应来检测引起感染其他疾病和遗传紊乱的细胞和病毒RNA。一个特别有用的方法是使用这样的原位杂交反应方法，即其中可使被分析的细胞或病毒保持完整并在细胞内发生杂交反应。然而通常被检测之RNA的拷贝数很小，甚至可能在给定的细胞中只存在单一拷贝。拷贝数目越小检测感兴趣的RNA分子就越困难。
解决小拷贝数问题的一种手段是使用扩增方法。已使用3SR扩增方法将在纯化的无细胞核酸群体中的RNA分子进行扩增(D.Y.Kwoh et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.86，1173-1177，(1988)。该反应是将单股分析物RNA分子酶促转化为具有扩增酶的结合区(即聚合酶的启动子)和一股该分析物分子的等同物的双股DNA分子。RNA聚合酶结合到启动子上并进而产生DNA分子之一条链的多个RNA转录本。使用该多个RNA转录本作为起始材料进行新轮次的扩增。
已报导了使用3SR来扩增纯化的已除去大部分或全部其他细胞材料的RNA分子。因此该报导尚待解决的问题是，是否3SR扩增可以在原位有效地完成，现实是3SR反应必须发生在基本上完整的细胞内，而且常常是为了保持细胞的形态学而已用交联剂和/或沉淀固定液对细胞进行了处理。原位杂交所面临的问题包括酶要进入细胞内，酶在细胞仍能发挥其功能，以及避免本不存在于纯化之RNA群体中的非特异性本底来源。虽然已向PCR扩增方法提出了这类性质的问题(M.J.Embleton et al.，Nucleic Acids Research，vol 20，pp3831-3837，(1992))，但因为PCR扩增法所使用的酶和所检测的靶分子均不同于3SR扩增，所以PCR所能解决的问题只是有限地预测3SR获得成功的程度。
感兴趣的RNA分子中，一种类型是哪些产生于已进行染色体易位的细胞中的RNA，特别是哪些转录原点处于或接近于由两个正常分离的染色体片段连接所产生之接合点的RNA。已有人使用核酸技术来检测由于染色体易位所产生的核酸(M.J.Embleton，et al，文献同上;Fritsch et al.，US Patent 4，725，536;Stephenson et al.，US Patent 4，681，840)。
在一特别有用的实施方案中，使用3SR原位检测只出现于已经进行染色体易位的细胞，特别是各种类型肿瘤细胞内的RNA分子。
为了提高原位3SR反应的总体速度和/或效率，本文公开了并与3SR结合使用的附加增强技术发明。这样的一个发明是使用对分析物RNA分子的易位接合区域特异的3SR探针或引物。本发明的其他方案涉及使用通透和信号增强剂，使用本底降低剂，以及使用改良的探针。
本发明一部分涉及原位检测RNA分子的3SR扩增方法。本发明还涉及使用下列的一种或多种发明以改善原位3SR方法的反应速度和/或敏感性在杂交期间使用的通透增强剂，增强荧光探针信号的信号增强剂，探针之荧光检测期间的本底降低剂，用于降低本底荧光的游离基清除剂，每个探针上的多个报道基团，以及用以降低杂交本底的报道基团类似物。本发明还使用了只与跨越得自己进行染色体易位之细胞中的RNA分子上易位接合点的顺序杂交的短探针。
“分析物RNA分子”是指所设计的检测法要检测的分子。
“扩增RNA分子”是指使用扩增方法产生的RNA分子。其具有互补于所有或部分RNA分析物分子的核苷酸顺序或具有等同于全部或部分分析物RNA分子的核苷酸顺序。
“探针”是指含有寡核苷酸并且通常还包含报道成分的分子，其中报导物是可检测的，寡核苷酸可与扩增RNA分子杂交。报导物部分可以是放射活性物质、荧光材料、化学发光剂、酶(如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或其他催化显色反应的酶)，或能与直接连接到可检测部分如放射活性物质、荧光材料、化学发光剂或酶上的配体特异性结合分子(如链霉抗生物素蛋白)发生特异性反应的配体。
如果按“Watson-Crick”碱基配对规则定义两条顺序的关系即一个顺序中有鸟嘌呤(G)，另一个顺序中便有胞嘧啶，而一个顺序中有腺嘌呤(A)，另一个顺序中便有胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)，此时即认为第一个核苷酸顺序互补于第二个核苷酸顺序。
“杂交体”是指由两个核酸分子形成的双股(或部分双股)分子，其中一个分子具有互补于另一个分子中之顺序的核苷酸顺序。
如果两个核苷酸顺序完全相同，或者除了一个顺序是DNA顺序而另一个顺序是其中由尿嘧啶代替胸腺嘧啶的RNA顺序外两顺序完全相同时，则认为第一个核苷酸是第一个核苷酸顺序的“等同物”。
当两个染色体片段因易位而接合在一起形成一个新的染色体时，则两片段接在一起的这一点即为“染色体易位接合点”。
“核苷酸顺序”这一术语也包括其中在正常情况下存在核苷间磷的某些位置上有某些磷以外之原子(如硫)的顺序。
“跨越易位接合点的RNA分子”是指包含从染色体易位接合点两侧上的部分染色体转录之核苷酸顺序的RNA分子(如hnRNA或mRNA分子)。例如，可通过细胞加工跨越易位接合点的hnRNA分子在细胞内产生跨越易位接合点的mRNA分子。
“跨越易位接合点的RNA片段”是指任何包含从染色体易位接合点两侧上的部分染色体转录之核苷酸顺序的RNA分子片段。
“跨越易位接合点的扩增RNA分子”是指其部分或全部核苷酸顺序互补或等同于跨越接合点之RNA分子或RNA片段的扩增RNA分子。
“引物”是指在3SR方法中借助反向转录酶延伸成较长分子的寡核苷酸。
“跨越易位接合点的引物”是指具有互补或等同于跨越接合点之RNA小片段的核苷酸顺序的引物。
“原位”是一个用来描述发生于基本上完整的细胞或病毒内之过程(如杂交或3SR)的术语;细胞或病毒常常是已用许多但并非所有本文定名的交联或沉淀固定剂处理的。
“跨越易位接合点的探针”本文所说的“生物实体”是细胞或病毒。
3SR方法是一种利用反向转录酶，DNA依赖性RNA聚合酶，RNaseH，寡核苷酸引物，三磷酸脱氧核糖核苷(5′-三磷酸脱氧腺苷、5′-三磷酸脱氧胞苷、5′-三磷酸鸟苷和脱氧胸苷;dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、三磷酸核糖核苷(5′-三磷酸腺苷，5′-三磷酸胞苷，5′-三磷酸鸟苷，5′-三磷酸尿苷;ATP，CTP，GTP，UTP)和适当的试剂如缓冲液，盐和二价阳离子，以便产生至少分析物RNA分子之一部分或全部分析物RNA之多个拷贝的方法。一个引物将是互补于有意义分析物RNA分子的一部分，而其他引物则将等同于有意义分析物RNA分子的一部分。至少引物之一具有一个不互补或等同于分析物RNA分子之一部分的部分，但更好的是DNA依赖性RNA聚合酶的双股启动子的一股。
该过程进行下去是由于引物之一与分析物RNA分子杂交，然后使用反向转录酶延伸该引物，从而形成至少一部分分析物RNA分子的cDNA拷贝。然后用RNaseH破坏分析物RNA分子。将第二个引物退火到cDNA分子上并用反向转录酶延伸引物以形成第二条互补于cDNA分子的DNA链。第二条DNA链将具有等同于原分析物RNA分子之一部分的核苷酸顺序。经上述步骤后即得到双股模板DNA分子。
经连续延伸两引物而形成的双股模板DNA分子将具有一个或两个DNA依赖性RNA聚合酶的启动子。如果第一个引物具有这样一个启动子的一条链，则当其延伸第二个引物时即可借助反向转录酶产生该启动子的经二条链。如果第二个引物具有这样一个启动子的一条链，则在其延伸第二个引物的同时反向转录酶进一步将cDNA分子延长直至得到完整的第二条启动子链。
用DNA聚合酶继续此3SR过程，即可使扩增RNA分子的每条链互补于模板DNA分子的链。借助于正如扩增分析物分子时所用的酶和引物来自身扩增如此形成的扩增分子。
原位3SR方法在总的方面，本发明涉及用来检测生物实体(特别是细胞且较好是真核细胞;尤其是人细胞)中分析物RNA分子的“原位3SR方法”，该方法包括以下步骤1)在反向转录酶DNA依赖性RNA聚合酶(较好是原核生物来源的)、RNaseH，各自由寡核苷酸组成的第一引物和第二引物(必要时也可以是三磷酸脱氧核糖核苷和三磷酸核糖核苷以及缓冲液、盐、二价阳离子等反应溶液试剂)存在下，保温生物实体，从而产生具有互补或完全相同于所说分析物RNA分子(扩增步骤)中核苷酸顺序之核苷酸顺序的扩增分子。
2)在所说的生物实体中形成探针分子和所说之扩增分子之间的杂交体(“杂交步骤”)，并3)检测所说的杂交体中的探针分子(“检测步骤”)，其中第一引物包括互补于分析物RNA分子之第一核苷酸顺序的核苷酸顺序，其中第二引物包括等同于分析物RNA分子之第二核苷酸顺序的核苷酸顺序，其中所说第一核苷酸顺序位于定位在所说第二核苷酸顺序和分析物分子之3′末端之间的分析物RNA分子中，其中所说的两个引物中至少有一个包含所说聚合酶的启动子核苷酸顺序，而且其中探针包括核苷酸顺序互补于所说扩增分子之一中的核苷酸顺序的寡核苷酸。
前述方法特别适于检测在已经进行染色体易位之细胞内跨越易位接合点的RNA分子。这是基于如果分析物分子含有互补于第一引物之核苷酸顺序的核苷酸顺序和等同于第二引物之核苷酸顺序的核苷酸顺序，则将发生分析物分子的扩增这一事实即如果选择这样两个分析物分子的核苷酸顺序，使得一个是在易位接合点的“3′侧”上，而另一个是在“该接合点的5′侧”上，正常细胞没有可被扩增的分子，在正常细胞中确实会有某些具有第一分析物分子核苷酸顺序的分子，以及具有第二分析物分子核苷酸顺序的分子，但不会存在具有这两种顺序的分子。只有在发生了染色体易位的情况下才会存在带有这两种顺序的分子。
在分析物分子具有易位接合点时，可通过选择其中一个探针(或报导物-探针)以使其包括的核苷酸顺序是跨越易位接合点的顺序而且相当短，从而改善该方法的特异性。如果后一顺序足够短，它必将完全稳定地杂交只有已经历染色体易位的细胞才会产生就核苷酸顺序来说跨越易位接合点的探针与之完全互补的分析物分子。
也可使用跨越易位接合点的引物来扩展使用跨越接合点之探针的战略。
在本发明的一个特定方案中，使报导物-探针杂交到经步骤(1)产生的扩增RNA分子上以完成步骤(2)，每个所说的报导物探针均包含可检测的报导物基团和含有互补于所说的扩增RNA分子的碱基顺序之碱基顺序的寡核苷酸。
引物是作为反向转录酶的引物使用的。启动子核苷酸顺序的启动子区，如果存在的话，将作为DNA依赖性RNA聚合酶启动子的一半，而另一半则是碱基顺序互补于该启动子区的DNA。引物也可以具有作为DNA依赖性RNA聚合酶启动子之一半的启动子区。
跨越接合点之探针或引物的设计在本发明中，当跨越接合点的引物或探针与细胞中跨越接合点的RNA分子杂交时，杂交是在其中探针不与非跨越接合点分子之分子杂交的条件(温度、时间、离子强度等)下完成的。杂交的这种选择性是通过适当地选择引物或探针的长度，以及按下述原则适当地选择杂交条件而实现的对于任何单股分子对来说，如果一个在其本身序列内具有互补于第二个分子中核苷酸顺序的核苷酸顺序，而且这两个顺序都有N个核苷酸长(每一分子的总长度可以大于N)，则这些分子将只在N大于某些临界值时才能形成杂交体。该临界值将部分地取决于杂交条件(温度、溶剂的选择等)，部分地取决于互补顺序的核苷酸组成。
可通过改变杂交条件和/或探针分子的碱基顺序来改变N的临界值。可借助常规实验来确定任何一组杂交条件的临界值，并从而完成本发明的方法。
N必须超过临界值这一事实为检测包括接合点的核酸顺序提供了基础。正常细胞的核酸将具有这两部分顺序，但这两个部分不会连接在一起。因此，如果探针互补于接合点一侧上不多于N-1个核苷酸的顺序(或较好不超过N-3个核苷酸的顺序)，并且互补于接合点另一侧上不多于N-1个核苷酸的顺序(或较好不多于N-3个核苷酸的顺序)，则其将不与正常细胞核酸杂交。
更可取的是，跨越易位接合点的探针或引物具有互补于长度为20至50个核苷酸(更好是20至35个核苷酸)之跨越易位接合点片段的顺序的核苷酸顺序。与探针或引物互补的跨越接合点的片段的一半序列最好是在含该片段之易位接合点的一侧上(这就意味着另一半将在该接合点的另一侧上)。
3SR原位方法的增强在本发明原位3SR方法的优选实施方案中，本发明还使用下列属于本发明内容的材料或方法来改善3SR原位方法的速度和/或敏感性杂交过程中的通透增强剂、增强荧光探针信号的信号增强剂、探针之荧光检测期间的本底降低剂、降低本底荧光的游离基清除剂，每个探针的多个报导物基团，以及降低杂交本底的报导基团类似物。下面将分别对这些增强因子作更详细描述。
通透增强剂的信号增强剂在3SR原位方法的另一个方案中，使用通透增强剂从而在含有选自二甲基亚砜(DMSO)，醇，脂族烷烃、烯烃，环糊精，脂肪酸酯、酰胺或内酰胺及有机硅烷这一组中的化合物的溶液内完成步骤(2)。
如将该组的化合物加入到检测溶液中即可最终观察到信号的增强这一事实，强有力地提示这样一种化合物即是通透增强剂。这些基础上，上述发明即在本文中称为“通透增强剂修饰的”方法。该命名可用来将本发明的这一个方案同“下文所述的”信号增强剂修饰的”方法区分开，其中在从检测溶液中除去细胞或病毒后加入增强化合物，特别是在作为该检测法之最后步骤的荧光检测期间存在增强化合物。
在通透增强剂修饰的方法的优选方案中，其中用于步骤(2)中的检测溶液包含核酸探针和DMSO(2-20%)及一种或多种选自醇(2-20%)、脂族烷烃(2-20%)、烯烃(2-20%)、环糊精(2-20%)，式R1(COO)R2的脂肪酸酯(2-20%)，式R3(NH)(CO)R4的酰胺或内酰胺(2-15%)，式(SiR5R6R7)N(SiR8R9R10)，(SiR5R6R7)-(SiR8R9R10)，(SiR5R6R7)O(SiR8R9R10)或(SiR5R6O)(SiR7R8O)(SiR9R10)的有机硅烷(2-20%)这一组中的化合物，且DMSO和选自该组中之化合物的合并体积不超过检测溶液的30%(v/v)。
在通透增强剂修饰的方法的组合方面，用于步骤(2)中的检测溶液包含核酸探针和DMSO(2-20%)及一种或多种选自由醇(2-20%)、脂族烷烃(2-20%)、烯烃(2-20%)、环糊精(2-20%)，式R1(COO)R2脂肪酸酯(2-20%)，式R3(NH)(CO)R4的酰胺或内酰胺(2-15%)，式(SiR5R6R7)N(SiR8R9R10)、(SiR5R6R7)-(SiR8R9R10)，(SiR5R6R7)O(SiR8R9R10)或(SiR5R6O)(SiR7R8O)(SiR9R10O)的有机硅烷(2-20%)组成的组中的化合物，DMSO和选自该组中之化合物的合并体积不超过检测溶液的30%(v/v)。
在通透增强剂修饰的方法的另一变化形式中，除了DMSO外，至少还使用选自该组中的烷烃或(较好)烯烃，以及另一种化合物。最好选自有上述优选结构的化合物。
在通透增强剂修饰的方法的一个特定实施方案中，检测溶液含有约10%(v/v)Triton X-100。
在通透增强剂修饰的方法的特别优选的实施方案中，选自该组中的化合物只是DMSO且DMSO的体积占检测溶液的2-20%(v/v);DMSO的体积最好约占检测溶液的10%(v/v)。
化合物浓度最好足够低，以使之不会从溶液中沉淀出来，而且溶液中的其他化合物也不致于形成沉淀。当加至10%或更高浓度时，烷烃特别是角鲨烷和结构上与之相似或大于角鲨烷的烷烃，以及醇特别是油醇和结构上与之相似或大于油醇的醇，可依赖所存在的其他成分，而从检测溶液中沉淀出来。
优选的化合物包括角鲨烷、十二烷醇、β-环糊精、棕榈酸异丙酯，1，2-丙二醇，六甲基二硅氧烷，以及油醇，吡咯烷酮(Pyr-rolidinone)和角鲨烷。优选的组合是使用大约10%DMSO加大约10%吡咯烷酮。另一优选的组合是大约10%DMSO加大约5%角鲨烷务5%吡咯烷酮。
在信号增强剂修饰的方法的另一个优选实施方案中，3SR原位方法的步骤(3)包括至少三个如下述的步骤3A、3B和3C，为此须在步骤3B之前完成3A，并在步骤3C之前或差不多同时完成步骤3B(3A)从检测溶液中除去细胞，(3B)向悬浮有细胞的溶液中内加入信号增强化合物，(3C)检测作为信号的直接或间接由靶结合的探针分子产生的光量子。
信号增强化合物选自醇、脂族烷烃、糖、脂肪酸酯、酰胺或内酰胺及有机硅烷。
由探针分子的荧光部分发射的光量子被看作是由靶结合的探针分子直接产生的光量子。由于裂解某化学发光基团中报导物基团(如异鲁米诺)内的化学键而发射的光量也被认为是直接由报导基团发射的光子。作为放射活性报导基团发射放射能的结果而由闪烁液发射出的光量子被认为是由报告基团间接产生的量子。
最好在进行信号检测，即步骤(4)期间将信号增强剂加到悬浮细胞的溶液(“检测溶液”)中。
将该组中化合物加入到检测溶液中可增强最终观察到的信号这一事实有力地表明所说的化合物即是信号增强剂。
在信号增强剂修饰的方法的优选实施方案中，检测溶液包含一种或多种选自醇(2-20%)、脂肪族烷烃(2-20%)、烯烃(2-20%)、环糊精(2-20%)、式R1(COO)R2的脂肪酸酯(2-20%)、式R3(NH)(CO)R4的酰胺或内酰胺(2-15%)，和式R5SiOSiR5的有机硅烷(2-20%)，其中DMSO和选自该组中的化合物的合并体积不超过检测溶液的30%(v/v)。
优选的化合物包括角鲨烷、β-环糊精、六甲基二硅氧烷、以及油醇、吡咯烷酮、角鲨烷，特别是棕榈酸异丙酯，1，2-丙二醇和十二烷醇。使用这些优选化合物，可使靶产生的信号对本底信号的比例增加达大约3至4倍。较好的组合是约10%DMSO加约10%吡咯烷酮。另一较好的组合是约10%DMSO加5%角鲨烷和5%吡咯烷酮。
使用的结构通式结构通式R1(COO)R2代表有下列结构的化合物。
R3(NH)(CO)R4代表有下列结构式的化合物
式(SiR5R6R7)N(SiR8R9R10)代表有下列结构式的化合物
式(SiR5R6R7)-(SiR8R9R10)代表有下列结构式的化合物
式(SiR5R6R7)O(SiR8R9R10)代表有下列结构式的化合物
式(SiR5R6O)(SiR7R8O)(SiR9R10O)代表有下列结构式的化合物
在本发明方法中使用这些化合物或合用如此规定的增强剂也是本发明的一部分。
因此，例如根据本发明的这一方面的药盒应包含探针分子和选自二甲基亚砜(DMSO)、醇、脂族烷烃、环糊精、脂肪酸酯、酰胺或内酰胺以及有机硅烷这一组中的化合物。此外，例如另一药盒包含探针分子和含有一种或多种选自DMSO、醇、脂族烷烃、环糊精、脂肪酸酯、酰胺或内酰胺，以及有机硅烷这一组中之化合物的溶液，其中化合物的总体积不超过溶液的20%(v/v)。
在前述方法，溶液和药盒中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10是烷烃结构。
R1和R2可以共价结合形成环结构。
R3和R4可以共价结合形成环结构。
在前述方法中，在化合物后面的括号中指定的百分数是指作为检测溶液的百分比(v/v)表示的化合物的浓度。
更优选的是，醇具有2至40个碳原子;脂族烷烃有10至60个碳原子;烯烃有10至60个碳原子;R1至2合在一起有3至20个碳原子，其中R1和R2不是共价结合以形成环时，R1和R2各有至少1个碳原子;R3加上R4一起有2至20个碳原子，且当R3和R4不是共价结合成环时，R3和R4各有至少1个碳原子;而且R5、R6、R7、R8、R9和R10各有至少1个碳原子，这样烷基碳结构R5、R6、R7、R8、R9和R10一起共有不超过20个碳原子。
在更为优选的方法实施方案中，醇有3到30个碳原子，脂族烷烃有20至40个碳原子，R1加上R2一起有3至10个碳原子，且其中R1和R2不是共价结合成环时，R1和R2各有至少3个碳原子;
R3和R4加在一起有3至10个碳原子，如当R3和R4不是共价结合成环时，R3和R4各有至少1个碳原子;而且R5、R6、R7、R8、R9和R10各有至少1个碳原子，六个烷基碳结构，R5、R6、R7、R8、R9和R10一起共有不超过10个碳原子。
用作通透增强剂的优选烯烃是其中碳-碳双键对碳-碳单链之比小于1比3的烯烃。最优选的比例是小于1比10。
降低本底化合物在3SR原位方法的特定实施方案中，步骤3至少包括如下述的3A、3B和3C这三个步骤，其中步骤3A发生在步骤3B之前，且步骤3B是在步骤3C之前或基本上是与步骤3C同时进行的，如下(3A)从完成步骤(2)的溶液中除去细胞(或病毒)，(3B)使细胞暴露于有荧光探针分子之吸收波长的光，并且(3C)检测以荧光探针的发射波长发射的光的量;
其中在步骤(1)开始后和步骤(3C)终止前的时间，在悬浮有细胞的溶液中存在降低本底化合物;
降低本底化合物包括带有结构不同于荧光探针之荧光染料部分的光吸收部分；降低本底化合物具有的吸收波长范围(当该方法进行时它吸收此波长范围的光)覆盖了荧光探针的发射波长范围部分波长(由探针发射之光的波长范围)，步骤(3C)中在该范围内检测光量。
在步骤(3B)和(3C)中，降低本底化合物最好是在悬浮有细胞(或病毒)的溶液中。为使光吸收化合物就波长范围来说成为有效的本底降低剂，其在该范围中的平均摩尔消光系数较好是在范围为520nm至560nm之锥虫蓝的平均摩尔消光系数的至少2%;更好是在该范围内摩尔消光系数为范围在520至560nm锥虫蓝之平均摩尔消光系数的至少10%。
因为许多细胞荧光检测法是在可见光即约400nm至660nm范围内进行的，所以在该波长范围内有效的本底降低剂是特别有价值的。但有的细胞荧光检测并不需要在可见光范围内进行，因此在特定情况下也可使用在250到1000nm范围内有吸收的本底降低剂。实际上本发明的原理可应用于能使用细胞荧光检测器检测的任何波长。
本文所说的“光”是指通过流式细胞计数器或使用荧光显微镜之观测器或照相机检测的光。为此，在正常情况下，应是可见光，但对于特殊检测目的来说，细胞计数器或显微镜改为检测能量大于或低于可见光的光子，为此目的该光子也被看作是所说的术语“光”。
因为降低本底化合物的光吸收部分具有与荧光探针的荧光染料部分不同的结构，所以正常情况下应有所需特性，即如果它确实发射光(即它是一种荧光化合物)，则将具有不同于荧光部分的发射光谱(即对于被吸收的给定波长光的给定量而言，作为波长之函数，发射光的强度将有所不同)。
假定本发明实施方案特别有效是部分因为降低本底化合物如探针一样结合到至少某些相同的非特异性靶上，并且因为降低本底化合物和探针是处于十分靠近的位置，故降低本底化合物将吸收由探针发射的光。此外，降低本底化合物将吸收由细胞内非探针分子的自发荧光发射的光。在吸收由非特异结合的探针或自发荧光分子发射的光之后，本底化合物可在其自身发射光波长处发射光。由特异结合的探针分子发射的光被降低本底化合物吸收到较小程度;从而改善了该分析方法的总体敏感性。
最好在加入本底降低剂后的45分钟内检测荧光;但如果本底降低剂是在步骤(38)和(36)中使用的溶液中，则可等24小时再进行荧光检测。
在本发明的一特别优选的方案中，该方法还包括在上述步骤(3A)和(3B)之间加入一个洗涤步骤。可将细胞或病毒从悬浮它们的溶液中离心出来，然后再将其悬浮于洗涤溶液中，并再次将细胞或病毒离心出来以完成洗涤步骤。洗涤溶液通常是无探针溶液，其中可以悬浮有或没有降低本底化合物。
细胞应在含有降低本底化合物的无探针的溶液中保留足够长时间，以使之吸收降低本底化合物。为此目的，一般是保留5分钟，但这一时间可以有很宽的变动范围。
探针将包含荧光染料。它也可包含共价结合到染料上的单股核酸(DNA或RNA)部分。所说的部分(moiety)是分子的一部分。例如，由核酸贡献的探针部分即是核酸部分;由荧光染料贡献的部分是荧光染料部分。可通过接头进行共价连接，其中染料和核酸分子(或抗体)在不同位点连接到接头分子上。
已公开了许多染料及其他光吸收化合物的最大发射或吸收波长数据(如参见Merck Index或Aldrich Chemical Company，Milwaukee，Wisconsin的商品目录)。这些数据提示但没有确定什么化合物是适用的。扫描荧光仪给出完整的发射或吸收光谱。下面列出了适用于某些探针染料的某些降低本底化合物。就给定的探针染料来说，可以很容易地试验降低本底化合物的效力。
常常被用作荧光探针染料荧光素的最大吸收波长约为488nm，且最大发射波长为大约525nm。可用作良好的本底降低剂的光吸收化合物包括偶氮染料衍生物，其具有一个多聚芳烃结合物部分，并且在该部分上有一个或多个极性基团如硝基(-NO2)、磺基(-SO3)或氨基(-NH2)基团。因为它们倾向结合于如非特异结合之探针所结合的同一蛋白质和膜上，所以可能是好的本底降低剂。
许多探针染料中，适用于本发明的少数几个是荧光素，FITC、德克萨斯红，香豆素，若丹明，藻红素和Perci-P。
与探针染料荧光素(或异硫氰酸荧光素(FITC))一起使用的某些降低本底化合物是偶氮胭脂红B、酸性红114、伊凡斯氏蓝、宫殿坚牢黑Wan，锥虫蓝，萘酚蓝黑和硫代若丹明101(Sulforho-damine 101)。
与探针染料德克萨斯红合用的某些降低本底化合物是萘酚蓝黑和宫殿坚牢黑WAN。对于荧光素以外的探针染料，有用的降低本底化合物可不同于荧光素或FITC标记的探针合用的降低本底化合物。在用荧光检测器、荧光显微镜或流式细胞计数器检测的探针染料的发射波长范围中，优选降低本底化合物具有平均摩尔消光系数在520nm至560nm范围内之锥虫蓝的平均摩尔消光系数的至少2%(最好是10%)。
对于任何染料荧光探针来说，有许多化合物可用作本底降低剂。一般来说，所用本底降低的浓度可以在0.0002%和0.10%(w/v)之间。
游离基清除剂作为本底降低剂在3SR原位方法的另一个方面，特别是使用荧光报导物基团检测步骤(3)期间形成的杂交体时，游离基清除剂存在于用来完成(1)、(2)和(3)中一个或多个步骤的反应混合物内。在这种情况下，步骤(3)包括使杂交的探针暴露于具有杂交之探针的荧光吸收波长的光，并检测有杂交之探针的荧光发射波长的光。游离基清除剂最好存在于用来完成步骤(2)的反应混合物中。
在步骤(3)期间，最好选择适当的游离基清除剂以符合使由清除剂发射的光量不超过清除剂引起的自发荧光的降低量这一条件要求。可通过一次不加清除剂，一次加清除剂这样的两次检测过程(在两种情况下，在检测中可不用探针)来检测某清除剂对给定的荧光吸收和荧光发射波长并存条件是否适宜。
游离基清除剂包括下列四类化合物1)氢供体化合物较好是有硫羟基团特别是连接到芳香基团上之硫羟基团的化合物，如苯硫酚。
2)不是供氢体组带有能与其他游离基结合之游离基的化合物。例子包括N-羟基衍生物如染料Tempo、肼衍生物和偶氮衍生物，所说的偶氮衍生物中，通过双键结合到另一个氮上，并通过单键连接到碳原子上的氮携带游离基。这些化合物最好有这样一个结构，即可造成一种防止它们彼此相互反应的空间位阻，从而不必清除游离基。
3)对位羟基芳族化合物。维生素E(一种优选的清除剂)即是这一类中的化合物。
4)有不饱和碳原子(Koelch基团)的化合物。
其他人已鉴定了许多包括上述各类化合物的游离基清除剂。
可根据其在规定条件下作为游离基清除剂的能力来限定游离基基团清除剂。如果FRS代表作为游离基清除剂的待试化合物，则可利用下述三步骤检测法证实FRS是游离基清除剂1)在5ml二甲基甲酰胺中混入FRS和10mg三氯乙酰过氧化物，以使FRS对三氯乙酰过氧化物的摩尔比例为2∶1。
2)将反应混合物加热至80℃保持M分钟。
3)用高效液相层板法(HPLC)(如果Cl3C-FSR不是挥发性的或气相色谱法(如果Cl3C-FSR是挥发性的)分析反应混合物，并检测Cl3C-FSR的量。根据所测得的Cl3C-FRS的量限定清除活性。
选择适当时间M分钟，以便如果用该方法试验维生素E时，使转化成Cl3C-维生素E之维生素E的百分比例小于100。一般说来，预期M小于10分钟。
当在相同条件下试验两种化合物(如维生素E和另一种化合物)时，可经比较所形成的Cl3C-FRS的量来计算这两种化合物的相对清除活性。如果某化合物所形成的Cl3C-FRS的量是当在检测中加入维生素E时所形成之量的20%。则该化合物清除活性为维生素之清除活性的20%。
检测清除活性的方法是基于一系列反应，其中包括在80℃下处理引起1分子三氯乙酰过氧化物分解，而产生两分子游离基，Cl3C＊，再与游离基清除剂反应以产生Cl3C-FRS。
探针或化合物(如游离基清除剂)的荧光吸收波长是可被探针或化合物吸收的幅射波长(特别是紫外或可见光)，且如果被吸收，则可导致由该探针或化合物以长于荧光吸收波长的波长的发射光(特别是可见光)。上述较长波长是指“荧光发射波长”。荧光吸收波长最好是在大约420nm到460nm范围内。荧光发射波长最好是在大约450nm至690nm范围内。在实践中，使探针群体暴露于吸收波长范围，并在发射波长范围内监测发射光。
荧光探针或化合物是具有荧光吸收波长和荧光发射波长的物质。
在本发明的荧光检测法中，最好选用游离基清除活性至少为维生素E之该活性的1%的游离基清除剂(系每摩尔清除剂的清除活性，如果清除剂分子是其中各重复单元均有清除活性的聚合物，则重复单元的摩尔浓度可随之改变);更优选的是游离基清除活性至少为维生素E之该活性的20%的清除剂，且最好选用至少与维生素E有同样大清除活性的清除剂。
如果从实施例中看出的，一般该荧光检测法可基本上同时用于大量细胞。
在该方法的一个优选方案中，步骤(5)包括检测以大约520nm至560nm(特别是大约520nm)的波长发射的光，步骤(4)所检测的吸收波长最好是小于520nm。
荧光检测法的优选实施方案还包括在步骤(2)和(3)之间的洗涤步骤。可将细胞从悬浮它们的溶液中离心出来，然后重新悬浮于洗涤溶液中，其后再从中离心出来以完成洗涤步骤。洗涤溶液通常是无探针溶液。
游离基清除剂最好不是发射探针之荧光发射波长的光的荧光分子。具体地说，最好游离基清除剂既不吸收探针之荧光吸光波长的光，也不发射探针之荧光发射波长的光。
在该方法的特定实施方案中，步骤(3)中使用的溶液包含荧光探针，游离基清除剂和固定液。如在混合物中加入游离基清除剂，其浓度较好是0.1%至10%(v/v)。
多报导物标记的探针在本发明的优选实施方案中，探针包括一单股核酸部分和多个报导物部分，以使各报导物部分借助接头部分共价连接到中间原子上，该中间原子则连接到核酸部分的核酸间磷原子上。核苷间磷原子是位于核苷之间，而不是吸附在寡核苷酸的3′或5′端的一个核苷上，报导物部分较好是染料分子，且报导物部分最好是荧光染料部分。可用流式细胞计数器或在适于荧光检测的显微镜下检测荧光染料。
对于用来检测细胞核内靶分子(如核DNA)的探针上的染料来说，探针的长度较好是小于约40个核苷酸。如果探针有7个染料分子，各分子的分子量约为500至600之间，并且有7个分子量与乙酰氨基部分分子量(约为60)相近的接头部分和40个平均分子量约为345的核苷酸，则被标记之探针的分子量应约为20，000。为了进行特异性杂交，一般探针长度应至少有大约15个碱基。
对于用来检测细胞胞浆内核酸，特别是RNA的探针来说，较好选用长度不超过200个核苷酸(分子量不大于约100，000)的探针，但也可以使用例如1000个核苷酸长的较大寡核苷酸。
对于染料来说，最接近接头部分的染料环至少要由两个原子与磷分隔开(即“分隔长度”至少为两个原子)。一般说来，优选的分隔长度为3至30个原子，更好是3至10个原子。
为了尽可能地减少潜在的抗杂交和骤冷影响，将结合染料的磷原子与寡核苷酸骨架上的下一个磷原子分开的平均核苷酸较好至少为4个原子。各磷原子最好由6个原子将其与寡核苷酸上的下个磷原子分隔开。
介于接头部分和核苷间磷原子之间的原子例如可以是氧原子、硫原子或氮原子。如果中间介入原子是氧原子，即有一个核苷间磷酸三酯键;如果中间介入原子是硫原子，则有一个核苷间硫代磷酸三酯键;如果中间介入原子是氮原子，则有一个核苷间氨基磷酸三酯核苷间键(参见Agrawal and Jamecnik，Nucleic Acids Research，vol185419，(1990))，例如硫代磷酸三酯和氨基磷酸三酯键。三酯键包括见于天然核酸骨架上的二酯键加上位于磷原子和中介原子(介入磷原子和接头部分之间的原子)之间的第三个酯键。
如果中介原子是硫原子，则接头部分可以是乙酰氨基部分。在此情况下，如果染料是荧光素，则分隔染料分子环和核苷间磷原子的原子数目将是4(氮和乙酰氨基部分的两个碳原子加上中间介入的硫原子)。
如果中介原子是氮原子，则接头部分可以是氨己基部分。在此情况下，如果染料是荧光素，则分隔最接近接头之染料分子环和核苷间磷原子的原子数目将是8，即包括氮和6个接头部分的碳原子加上中间介入的氮原子。如果染料分子是异硫氰酸荧光素，则分隔最接近接头之染料分子环和磷原子的原子将还包括另外两个原子，即由异硫氰酸酯部分贡献的氮和碳原子。
应明确的是，探针的核酸链与靶的核酸链杂交而形成杂交分子是因为这两条链具有彼此互补的核苷顺序(例如核苷的碱基，腺嘌呤互补于另一核苷中的尿嘧啶或胸腺嘧啶，鸟嘌呤互补于胞嘧啶)，但并不一定是探针的整个核苷顺序互补于靶的整个核苷顺序。
可按需要选择荧光染料。常用的荧光染料(注意带有方便的接头部分)是5-(2-碘乙酰)氨基)乙基)氨基)萘-1-磺酸，5-磺乙酰氨基荧光素、6-碘乙酰氨基荧光素、四甲基若丹明-5-碘乙酰胺、四甲基若丹明-6-碘乙酰胺、一溴二亚胺、赤藓红-5-碘乙酰胺、7-二乙氨基-3-((4′-碘乙酰氨基)苯基)-4-甲基香豆素、4′-((碘乙酰氨基)甲基)荧光素、赤藓红-5-碘乙酰胺、生物素碘乙酰胺、N-(1-芘)碘乙酸酯、生物素碘乙酰胺、N-(1-芘)碘乙酸酯、N-((2-(碘乙酰氧基)乙基)-N-甲基)氨基-7-硝基苯-2-并噁-1，3-二唑。
碘乙酰胺的许多可替代物之一是马来酰亚胺。
为本发明之目的，优选的染料是7-二乙氨基-3-((4′-碘乙酰氨基)苯基)-4-甲基香豆素，特别是5-碘乙酰氨基荧光素、6-碘乙酰氨基荧光素、四甲基若丹明-5-碘乙酰胺、四甲基若丹明-6-碘乙酰胺和N-((2-(碘乙酰氧基)乙基)-N-甲基)氨基-7-硝基苯-2-并噁-1，3-二唑。
对于真核细胞的原位杂交来说，一溴二亚胺的效率较差，这可能是因为它不能有效地通过细胞膜。
重要的是，在杂交试验条件下，报导物部分能稳定地连接到核酸探针部分上，给出足够的信号，而且如果它是一种荧光染料，还具有适用的激发和发射波长。
在检测细胞内分析物RNA分子的3SR原位方法的再一个实施方案中，在步骤(2)期间芳族报导物基团是探针分子的一部分，并且在完成步骤(3)之前将细胞与报导物基团的结构类似物一起保温。优选是，在步骤(2)期间，该类似物存在于用来使探针分子与细胞内扩增分子杂交的同一溶液中另外步骤(3)是以一种将检测报导物基团但不检测类似物的方式完成的(如使用有将导致检测报导物基团但不检测类似物之激发和/或吸收波长的荧光探针)。
在本发明的一个次要方面，报导物基团是环状化合物。在本发明的另一个次要方面，环将基团包括有不饱和键。在本发明的一个较窄的次要方面，环状基团是芳族化合物(一个或多个苯环)。
较好的是，以摩尔量计类似物超过报导物基团的量，更好是类似物相当于报导物基团的至少10倍。
可以假定本发明的方法是基于类似物与报导物基团竞争非特异性结合位点。在使用金精或其衍生物与核酸探针结合时，另一个机制可能包括金精结合到蛋白质中本应结合报导物基团的活性位点上。
较好是选择适当的类似物，以使之保留大多数或所有报导物基团的结构特征。类似物可以具有探针所没有的其他结构特征。
类似物应能够穿透细胞或病毒。在类似物是金精衍生物(玫红酸衍生物)的情况下，较好是类似物在其芳族基团上带有-CO2、-NH2、-OH或-SO3基等极性功能基团;其例子是铬精花青R(chromoxane cyanine R)和铬天青S。优选类似物的亚基团是封闭赖氨酸上NH2基团的亚基团。使报导物基团吸收能量，然后发射某些吸收的能量，并检测所发射的能量，从而得以检测荧光报导物基团。
使化学发光报导物基团进入反应如酶促反应中，导致能量以光的形式发射出来，从而得以检测化学发光报导物基团。
其他报导物基团如生物素，因为它们能与例如直接或间接结合到酶(如能催化可检测之反应的碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)上的链霉抗生物素蛋白结合而得以被检测。
本发明可使用的荧光素基团包括荧光素(或FITC)、德克萨斯红、香豆素、若丹明、若丹明衍生物、藻红素和Perci-P。
本发明可使用的化学发光基团包括异鲁米诺(或4-氨基邻苯二甲酰;参见Aldrich Chemical Co.，1990-91目录，或参见Molecular Probes，Inc.，目录)。
在本发明的一个优选方案中，当报导物基团是荧光素时，步骤(4)包括检测波长在大约520nm和560nm之间(特别是约520nm)的发射光，步骤(3)的吸收波长最好是小于520nm。
荧光检测法的优选方案进一步包括步骤(2)和(3)之间的洗涤步骤。可将细胞从悬浮它们的溶液中离心出来，然后再悬浮在洗涤溶液中，并从洗涤溶液中离心出来从而完成洗涤步骤。洗涤溶液通常是无探针溶液。
在本方法的特定实施方案中，步骤(2)中使用的溶液包含探针(包括报导物基团)、报导物基团的类似物、以及固定剂。这样的探针溶液本身也构成本发明的一部分。
如果在步骤(2)所用的溶液中加入类似物，则其浓度较好为0.01至0.5%(特别是大约0.05至0.01%)(w/v)。
优选组合方式是荧光素或若丹明衍生物与金精、其衍生物或Napa-chrome Green合用。
探针核酸探针可以是DNA、RNA或包括DNA或RNA的寡核苷酸或多核苷酸。DNA或RNA可由碱基脲嘌呤，尿嘧啶，胸腺嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶或其任何天然或人造化学衍生物组成。探针能够通过一种或多种类型的化学键，通常是通过氢键形成结合到互补或镜象靶细胞基因顺序上。
在加入到杂交溶液中之前，可对核酸探针进行可检测性标记。另外，可以选择能结合到杂交产物上的可检测标记。可将用任何适用于本发明的检测基团来标记探针。这样的可检测基团可以是任何有可检测之物理或化学特性的材料。特别有用的酶促活性基团，如酶(参见Clin.Chem.，221243，1976)，酶底物(考见英国专利说明书1，548，741)，合酶(参见美国专利Nos.4，230，797和4，238，565)和酶抑制物(参见美国专利No.4，134，792)、荧光物质(参见Clin.Chem.，25353，1979)、发色团、发光物质如化学发光物质和生物发光物质(参见Clin.Chem.，25512，1979)、特别是可结合的配体、近端相互作用对以及放射性同位素如3H、35S、32P、125I和14C。
可借助缺口翻译、酶学或化学方法将生物素标记的核苷酸掺入到DNA或RNA中。使用抗生物素蛋白/链霉抗生物蛋白、荧光、酶或胶体金结合物杂交后检测生物素化的探针。也可以使用其他荧光化合物、可进行免疫检测的荧光衍生物或生物素类似物标记核酸。也可借助与蛋白质连接来标记核酸。也可使用与放射活性物质或荧光组蛋白HI、酶(碱性磷酸酶和过氧化物酶)或单链结合(ssB)蛋白质交联的核酸。为了增加检测胶体金或过氧化物酶产物的敏感性，可使用多种利用银溶液完成的增强或放大方法。
也可使用间接荧光免疫细胞化学方法(Rudkin and Stollar，Nature 265472，1977;Van Prooijen et al.，Exp.Cell Res.，141397，1982)。经给动物注射poly(rA)-poly(dT)而产生抗RNA-DNA杂交体的多克隆抗体。DNA探针与细胞原位杂交，并且用抗RNA-DNA杂交体的抗体进行保温而检测杂交体。
发光生物素TM(PhotobiotinTM)标记探针优于生物素标记。
细胞、组织和体液中的靶分析物RNA可定位于细胞或病毒生物实体中。可将细胞或病毒悬浮于溶液中而不固定在固相载体上。另一方面，也可将细胞或病毒固定在固相载体上。细胞或病毒可以是组织切片(组织学切片)的一部分。
在本方法的一个实施方案中，在杂交期间将靶细胞固定在固相表面上。在另一实施方案中，在整个操作过程中靶细胞均悬浮于液体内而不固定在固相表面上。本发明中特别适于使用常规流式细胞计数装置。
含有分析物核酸分子的细胞可以是真核细胞(如人细胞)，原核细胞(如细菌)，植物细胞或其他类型的细胞。它们可以是简单的真核细胞如酶母，或者是由复杂真核细胞生物如人体得到的细胞。
分析物RNA可以是在无被膜或有被膜(具有非包裹膜如脂蛋白膜)的病毒中。
分析物RNA可以是病毒RNA。对于某些病毒(如人免疫缺陷病毒)来说，在单一细胞内可同时存在互补的分析物RNA链。
病毒核酸靶可以是病毒的一部分，此时病毒可以在或不在细胞内。另外，病毒核酸靶也可能不是病毒的一部分，但可能是在细胞内。
可对存在于液态悬浮液中的生物实体、载玻片上或其他固相载体上的细胞内、组织培养细胞内及组织切片中之靶进行杂交分析。当生物实体是细胞时，其可来自实体组织(如神经、肌肉、心脏、皮肤、肺、肾、胰、脾、淋巴结、睾丸、子宫颈和脑)，或者是存在于各种衬膜管道、导管和腔(如胃肠道、尿道、输精管、子宫腔、子宫管、阴道、呼吸道、鼻腔、口腔、咽、喉、气管、支气管和肺)或体液(如尿、胃液、脊髓液、血液和淋巴液)或粪便中的细胞。
杂交固定剂和溶液已在PCT申请WO90/02173和WO90/02204中讨论了固定化细胞的固定剂和杂交方法。固定剂应能很好地保持细胞的形态学及杂交靶的可接近性和杂交能力(必要时还应保持抗原的可接近性和免疫反应性)。沉淀固定剂包括乙醇、乙酸、甲醇、丙酮和这些物质的组合。交联固定剂包括多聚甲醛、戊二醛和甲醛。必须在不致于形成俘获核酸的网络或对其造成共价修饰以致破坏其可杂交性的条件下使用交联固定剂。
固定剂可选自单独或联合使用的任何沉淀剂或交联剂，并可以是含水或不含水的。固定剂可选自一组包括甲醛溶液、醇、盐溶液、氯化汞、氯化钠、硫酸钠、重铬酸钾、磷酸钾、溴化铵、氯化钙、乙酸钠、氯化锂、乙酸铯、乙酸钙或镁、硝酸钾、重铬酸钾、铬酸钠、碘化钾、磺酸钠、硫代硫酸钠、苦味酸、乙酸、多聚甲醛、氢氧化钠、丙酮、氯仿、甘油、百里酚的物质。固定剂最好包含通过沉淀作用固定细胞成分并具有下列特征的试剂作用是可逆的，可保持细胞(或病毒)形态、保留所需细胞成分的抗原性、使核酸在细胞中保留适当的定位、不会以一种使核酸不能形成双或三股杂交体的方式修饰之，以及不以一种使核酸与所有已存在的靶顺序杂交受到抑制的方式影响细胞成分。
所使用的交联剂最好于10%(v/v)。用于检测分析物核酸分子之方法的步骤(2)中的杂交溶液一般可含有高离液序列变性剂、缓冲液、微孔形成剂、杂交体稳定剂。高离液序列变性剂(Robinson，D.W.and Grant，M.E.(1966)，J.Biol.Chem.，2414030;Hama-guchi，K.and Geiduscheck，E.P.(1962)，J.Am.Chem.Soc.，841329)包括甲酰胺、尿素、硫氰酸胍、三氯乙酸盐、四甲胺、高氯酸盐和碘化钠。可优选任何能使pH保持在至少7.0至8.0之间的缓冲液。微孔形成剂可以是去污剂如Brij 35、Brij 58、十二烷基硫酸钠、CHAPS或Triton X-100。似乎0.05% Brij 35或0.1% Triton X-100可以使探针通过胞浆膜但不能通过核膜。脱氧胆酸钠将使探针穿过核膜，因此为了限制与胞浆生物多聚物靶杂交，应避免使用核膜微孔形成剂。当靶生物多聚物定位于胞浆内时，这种选择性亚细胞定位可通过降低或阻止探针与互补核顺序杂交从而提高该方法的特异性和敏感性。杂交体稳定剂如一或二价阳离子盐包含于杂交溶液中，用于促进探针之互补顺序与其靶生物多聚物之间的氢键形成。所用的氯化钠浓度最好是0.15M至1M。为了防止核酸探针的非特异性结合，可在杂交溶液中加入与生物多聚物无关的核酸。
可利用的固相载体包括但不只限于玻璃、Scotch条(3M)、尼龙、Gene Screen Plus(Neu England Nuclear)和硝酸纤维素。最好使用显微镜载玻片。
为了构建用于完成本发明各种方法的药盒，可将用于本发明的各种化合物和试剂放入包装盒和/或瓶内，并装进单一容器中，并最好附带说明如何完成本发明方法的说明书。基本的药盒应含有用于3SR的方法的试剂，如必须的酶并最好还含有脱氧核糖核苷和核糖核苷，其中应包括用于杂交的试剂，如含甲酰胺的缓冲液。杂交试剂最好包括下列的一种或多种本发明的通透增强剂，游离基清除剂及报导物基团类似物。较优选的药盒应带有本底降低剂如荧光检测期间使用的伊凡斯氏蓝。药盒的另一实施方案则包括信号增强剂。特定的药盒应含有用于特定诊断目的如诊断易位或病毒RNA感染的探针和引物。
试剂可从多个不同来源购买试剂，包括Aldrich Chemical Co.，Mil-waukee，Wisconsin;Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri;Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon;Clontech，Palo Alto，California;Kodak，Rochester，NY和Spectrum Chemical Manu-facturing Corp.，Gardenea，California。
有关本文涉及的某些物质的其他信息可参见下示表1。
表1.化合物和染料的缩写和通用名称缩写或通用名称 化合物Tempo 2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧基{CAS#2564-83-2}EDTA 乙二胺四乙酸DMSO 二甲基亚砜DTT 二硫苏糖醇
PVP 聚乙烯吡咯烷酮PEG4000 聚乙二醇(分子量约4000)PBS 磷酸盐缓冲盐水CHAPS 3-((3-胆酰氨基丙基)-二甲基氨)-1-丙烷-磺酸盐{CAS#75621-03-3}发光生物素 N-(4-叠氮基-2-硝基苯基)-N'-(3-生物素基氨丙基)-N'-甲基-1,3-丙二胺{CAS#96087-37-5}Ficoll 非离子聚蔗糖(Pharmacia)Percoll 胶体PVP涂复的硅{CAS#65455-52-9}Triton X-100 辛苯氧基聚乙二醇(一种聚氧乙烯醚){CAS#9002·93-1;参见Aldrich Chem. Co.,1998-91目录}Brij35 聚氧乙烯23十二基醚{CAS#9002-92-0}Brij58 聚氧乙烯20十六基醚{CAS#9004-95-9}Hoechst 33258 2'-[4-羟苯基]-5-[4-甲基-1-哌嗪基]-2,5'-双-1H-苯甲酰氨吡咯三盐酸化物{CAS#23491-52-3}
染料缩写染料编号 染料实际名称 缩写12 萘酚蓝黑 萘酚B1,B1K、13 宫殿坚牢黑WAN 宫殿F-B WAN20 磺基若丹明101水合物 磺基若丹明101荧光素异硫氰酸盐 FITC溶液SSC具有下列组分0.15M NaCl、0.15M柠檬酸钠，pH7.0。配成2X SSC以便在用水以1∶1稀释后将得到SSC;配成10X SSC以便在用水以1∶10稀释后得到SSC。0.1X SSC是用水以1∶10稀释SSC得到的。
流式细胞计数中使用的固定溶液F含有下列成分4体积(vol)乙醇加5体积1X PBS溶液再加1体积冰醋酸。
1号洗涤溶液(＃1)具有下列组成0.4M异硫氰酸胍，0.1%Triton X-100，0.1X SSC，溶于去离子水中。2号洗涤溶液(＃2)具有下列组成0.1%Triton X-100，0.1% SSC，溶于去离子水中。
PBS是磷酸盐缓冲盐水，配方为0.136M NaCl，0.003M KCl，0.008M Na2HPO4·7H2O，0.001MKH2PO4。
用本发明方法检测之疾病和转位的例子表2举例列示了可使用本发明方法检测的多种类型的疾病，但它并不是用于限制可用本发明方法检测之疾病或转位的类型。
表2已知的转位的例子t(2;8)(p11;q24) Burkitt淋巴瘤(Fujino et al.,Jpn.J.
Cancer Res.,vol77;pp24-77(1986);
t(11;14)(q13;q32) 慢性淋巴细胞白血病(Y.Tsujimoto et al.,Nature vol 315;pp340-343(1985));
t(7;9)(q34;q34.3) 急性T细胞成淋巴细胞淋巴瘤(T.C.Reynoldset al.,Cell vol 50,pp107-117(1987));
t(14;14)(q11;q32) T细胞慢性淋巴细胞白血病(M.P.Davey et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol85;pp9287-9291(1988));
t(8;14)(q24;q32) Burkitt淋巴瘤(F.G.Haluska et al.,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,vol84,pp6835-6839(1987));
t(10;14)(q24;q11) T细胞急性成淋巴细胞白血病(M.Zutter etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol87pp3161:3165(1990));
t(9;14)(p13;q32) 弥散性大细胞淋巴瘤(H.Ohno et al.,Proc,Natl.Acad.Sci.USA,vol87,pp628-632(1990));
t(1;14)(p33;q11) 白血病细胞(8)(C.G.Begley et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol86;pp2031-2035(1989));
t(X;18)(p11.2;q11.2) 滑膜肉瘤
(X-Y转位) X连锁的隐性软骨发育不良穿孔(47,XY,+del(5)(q12,q34),t(15;21)(q21;q22) 急性成髓细胞白血病(AML)47,XY,+del(5)(q12,q34) 急性非淋巴细胞白血病(ANLL)t(8;14)(q24;q11) 急性成淋巴细胞白血病(T-All)t(8;14)(q24;q11) 白血病/淋巴瘤13(q11) 其它急性成淋巴细胞白血病(proximal del15q) Prader-Willi综合症t(1;15)(p36.2;p11.2) 普遍性肌肉张力减退(X;5)(p11.2;q35.2) 色素失调症(2q13) 横纹肌肉瘤t(16;21)(q11;p11) 三体性16pt(1;19) 前B细胞急性成淋巴细胞白血病t(15;17) 急性前髓细胞白血病(APL)t(1;7)(p11;p11) 急性髓样白血病或脊髓发育不良(8q24 14q32) Burkitt淋巴瘤Bcl-2t(11;14)(q13;q32) Bcl-1t(14;18)(q32;q21) Hodgkin淋巴瘤(NHL)t(8;14)(q24;q32) 滤泡组织型t(3;22)(q27;q11) Burkitt样淋巴瘤t(11;14)(q13;q32) 弥散性大细胞淋巴瘤t(9;22)(q34;q11) 慢性髓性单核细胞白血病W/(Ph)t(4;6)(p15;p12) 慢性髓性单核细胞白血病W/(Ph)
inv(3)(q21 q26) 顽固性贫血t(3;3)(q21;q26) RAEB-Tinv(3)(q21 q26) 有髓样化生的骨髓纤维变性(MMM)3p上的损伤 肾细胞肉瘤(RCC)(3;21)(q26;q22) 继发性白血病t(3;21)(q26.3;q22) 急性骨髓样白血病5q35 儿童的恶性组织细胞增多症t(5;6)(q35;p21)t(2;13)(q37;q14) 横纹肌肉瘤(RMS)(Y;11)(q11.2;q24) Jacobsen氏综合征t(X;18)(p11;q11) 两相和单相性滑膜肉瘤t(X;15;18)(p11;q15;q11) "t(X;7)(q11-12;q32) "14q32(28%)或14q11(14%) 成人T细胞白血病/淋巴瘤t(19;22)(q13.3;p11.2) 远侧19q染色体*11和22之间的转位 神经上皮瘤tder(1q9p) 骨髓增殖紊乱Xp22和Xq28上的破坏点 平衡的X常染色体11q23 成人急性骨髓白血病13q或三体性137q和1q的畸变三体性11qt(8;14)(q24;q32) Burkitt型白血病t(9;22)(q34;q11) Philadelphia阳性All(Phl+All)
X;6 q15-16 先天性急性成淋巴细胞白血病(ALL)(8;21) 顽固性贫血46,XY,der(5)t(5;11)(p15.2;p14)[11p15] Beckwith-Wiedemann氏综合症(BWS)11p15,fus(14p;21p),和fus(15p;21p) 骨的巨大细胞瘤(GCT)11q13 多发性I型内分泌肿瘤生成(MENI)t(7;22)(p22;q13) 与inv(16)(p13q22)急性非淋巴细胞白血症(M4)相关联46,XY/46,XY,t(7;19)(q22;p13.3) 急性骨髓单核细胞白血病(FAB M4)46,XY/46,XY,t(7;19)(q11;q13) 儿童ALL46,XY,t(3q;11q),t(7q;19p),t(15;17)(q26;q22) ANLL(FAB M3)'2实施例1原位转位3SR检测计数3×107个生长于含10%胎牛血清之培养基中的K562人慢性骨髓源性成白血病极期细胞系细胞，以250xg离心5分钟。室温下放置3分钟后吸去上清液并将细胞重新悬浮于磷酸盐缓冲盐水中。将细胞悬浮离心5分钟后吸去上清液，并将细胞重新悬浮在4%多聚甲醛中。室温下保温3分钟后使细胞通过分级醇脱水。
将细胞离心5分钟，吸去4%多聚甲醛，并将细胞重新悬浮在1mlDEPC处理的30%乙醇中(DEPC是焦碳酸二乙酯)。室温放置3分钟后加入0.8ml 100%乙醇将乙醇浓度调到60%。再过3分钟后，加入1.8ml 100%乙醇使乙醇浓度达到80%。最后，再放置3分钟并加入11.4ml 100%乙醇使乙醇浓度为95%。然后将细胞离心5分钟，吸去乙醇并将细胞重新悬浮在4.5ml 100%乙醇中。室温放置3分钟后，对细胞进行逐步再水化处理。
加入250μl DEPC处理的水使乙醇浓度达到95%;3分钟后加1.15ml DEPC处理的水达到80%乙醇浓度。3分钟后再加入1.9ml DEPC处理的水达到60%乙醇浓度。最后，加入7.5ml DEPC处理的水使乙醇浓度为30%。将细胞离心5分钟，吸去上清液并将细胞重新悬浮在1ml DEPC处理的2XSCC溶液中。将细胞转移到1.5ml微量离心管中并保温3分钟，然后用蛋白酶K消化并进行3SR反应。
在微量离心管中将细胞以1500rpm离心2分钟，吸去上清液并将细胞重新悬浮在溶于DEPC处理的2mM CaCl2、20mM Tris-HCl，pH7中的蛋白酶K(ml)(10μg/ml)。于42℃消化15分钟后，以1500rpm将细胞离心2分钟并重新悬浮在1ml DEPC处理的PBS中。将细胞悬浮液以1500rpm离心2分钟，吸去上清并再次悬浮在1ml DEPC处理的PBS中。以1500rpm离心2分钟，吸去上清，向细胞内加入100μl含bcr-和abl-3SR引物(各250ng/100μl)和酶及3SR反应缓冲液的3SR溶液。
3SR反应溶液含有Tris-HCl(40mM，pH8.1)、MgCl2(30mM)、KCl(20mM)、DTT(10mM)、亚精胺(4mM)、ATP(7mM)、CTP(7mM)、GTP(7mM)、UTP(7mM)、dATP(1mM)、dCTP(1mM)、dGTP(1mM)、TTP(1mM)。
5′bcr引物具有下列核苷酸顺序AATTTAATACGACTCACTATAGGGATCAGGTGCACAGCCGCAACGGC3′abl引物具有下列核苷酸顺序AATTTAATACGACTCACTATAGGGATCGGCTTCACTCAGACCCTGAGG3SR反应混合物中的酶是AMV反向转录酶(30单位/100μl)和T7 RNA聚合酶(100单位/100μl)，以及E.coliRNase H(3单位/100μl)。42℃反应2小时后，加入1.4mlDEPC处理的PBS，并将各0.5ml等分的反应溶液分别转移到3个微量离心管内。将细胞以1500rpm离心2分钟，吸除溶液并加入杂交探针。
定名为NR的阴性探针是由存在于细菌中的氮还原酶基因衍生来的，并已知不与真核细胞内的核酸杂交。
L6-26探针具有顺序CGCTGAAGGGCTTCTTCCTTATTGATK28-26探针具有顺序CGCTGAAGGGCTTTTGAACTCTGCTT合成寡核苷酸应用Biosystems 380B型DNA合成仪;其推荐使用A.B.I.试剂)，并在最后的步骤中将磷酸氨基己基接头连接到5′末端上。然后将5′-氨基己基寡核苷酸偶联到本文所述的荧光素染料(FITC)上，并以使用基线810层析工作位置的Waters HPCL纯化之。
为完成杂交步骤，向离心的细胞沉淀团块中加入50μl杂交混合物，该混合物由30%甲酰胺、5X SSC、0.16M磷酸钠缓冲液(pH7.4)、1μg/μl剪切的DNA、3%(v/v)Triton X-100、5%PEG4000，25mM DTT、4M异硫氰酸鈲、15X Ficoll/PVP及以2.5μg/ml浓度加入的探针(NR，28S，或合用K28-26和L6-26，即本文中所说的K28+L6探针)组成的。将细胞于95℃保温1分钟以使3SR产物变性并于42℃使探针退火30分钟。杂交反应后适当的洗涤对于消除因探针的非特异性结合所造成的本底是很必要的。在1ml由0.1X SSC.0.4异硫氰酸鈲和0.1% Triton X-100组成的洗涤溶液A中于42℃下保温细胞。在涡旋混合器上混合各管内容物，并在微量离心机中以1500rpm离心2分钟。除去上清，并在细胞沉淀物中加入1ml由0.1X SSC、0.2%Triton X-100组成的洗涤溶液B(42℃)。在涡旋混合器上混匀并以1500rpm离心2分钟。吸除洗涤溶液B后，将细胞悬浮在250μl溶于PBS的0.0025%依文斯篮(作为本底降低剂加入)中，在涡旋混合器上混合并在Coulter Profile流式细胞计数器上分析之。
用Coulter装置在Profile ⅡTM上分析细胞。该装置使用488nm氩激光，对于FL1有252nm带通过滤光片且对于复染剂则有635nm带通过滤光片。对于各被分析样品，首先分析含有阴性探针的样品并设定四分象限状态，以使小百分比例的细胞落入右上四分之一范围内。然后在与分析含阴性探针之样品完全相同的参数下分析含阳性探针的待分析样品。因为准确地设定了四分象限并且对两样品均作相同的处理，所以在右上四分之一记录的任何细胞数目(对照水平以上)都是作为阳性记录的。
在使用包括所有细胞并排除大部分细胞碎片的2号散射光栅的情况下，88%颗粒是在左下直方图的区域之中。用NR探针时log荧光1(FITC)的平均荧光波道是0.899，而用K28+L6探针时在36526个中100%的颗粒是8.7这就代表了大约10倍信噪比。这一比例要比没有进行3SR扩散时高得多。
此外，后来又使用LISTVIEW软件和调整到包括100%细胞颗粒的散射光栅重新对所列典型数据进行分析。选择游标以使93.5%比使用NR探针时所选择的水平低，且使99%比使用K28+L6探针时所选择的水平高。
实施例2证明本实施例在杂交条件下25碱基寡聚体杂交而6至12碱基寡聚体不杂交。
下述实验中使用H9细胞。用无核酸酶磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗培养的细胞，放入一定浓度的单细胞悬液中得到清楚分离的细胞。离心细胞得到细胞沉淀团块，并吸除上清液。将细胞重新悬浮在40%乙醇、50%PBS和10%冰醋酸中并于4℃下放置12-16小时。固定后，离心细胞以除去固定剂，然后在1X PBS洗细胞并悬浮于2X SSC中。细胞应立即被使用。
对于阳性对照探针，设计并利用真核细胞28S rRNA的保守片段;将其定名为28s-25-AL并用作进行上述实验的阳性探针。定名为NR25-AL的阴性探针衍生于见于细菌中的氮还原酶基因并已知不与真核细胞内的核酸杂交。下列表4中列出了所使用的这两种探针的DNA顺序。还用下列表4中示出的顺序制备衍生于25碱基寡聚体的12碱基、10碱基、8碱基和6碱基寡聚体。实施例中展示的所有顺序均具有作为各顺序之左侧末端的5′末端。
表4探针 顺序28S-25-AL ATCAGAGTAGTGGTATTTCACCGGC28S-21-AL ATCAGAGTAGTGGTATTTCAC28S-18-AL ATCAGAGTAGTGGTATTT28S-15-AL ATCAGAGTAGTGGTA28S-12-AL ATCAGAGTAGTG28S-10-AL ATCAGAGTAG28S-8-AL ATCAGAGT28S-6-AL ATCAGANR25-AL TACGCTCGATCCAGCTATCAGCCGTNR 12-AL TACGCTCGATCCNR 10-AL TACGCTCGATNR 8-AL TACGCTCGNR 6-AL ATCGCT(在本文所述的所有顺序中，5′末端都在左侧)，合成寡核脱氧核苷酸(Applied Biosystems DNA合成仪，380B型，A.B.I.试剂)，并在最后阶段将氨己基接头加到5′末端磷酸上。然后纯化5′-氨基己基寡脱氧核苷酸，将其偶联到来自Molecular Probes的若丹明衍生物上并使用基线810层析工作装置以Waters HPLC纯化之。
为了进行杂交过程，将由30%甲酰胺、5X SSC、0.16M磷酸钠缓冲液(pH7.4)、1μg/μl剪切的DNA、3%(v/v)Triton X-100(聚氧乙烯醚的醇衍生物，参见Aldrich ChemicalCo.1990-91目录)、5%PEG4000(聚乙二醇)、25mMDTT(二硫苏糖醇)、0.4M异硫氰酸鈲、15X Ficoll/PVP和以2.5μg/ml浓度加入的探针组成的50μl杂交混合物加到细胞沉淀饼上。杂交于42℃下进行30分钟。上文所说的500X Ficoll/PVP是5g Ficoll 400型(分子量为400，000的聚蔗糖)加5g PVP(聚乙烯吡咯烷酮)溶于水中至终体积为100ml;15X Ficoll/PVP是用水以15/500稀释比例稀释的500X Ficoll/PVP。
杂交反应后，适当的洗涤对消除因探针的非特异性结合造成的本底污染是十分必要的。杂交后将细胞放在已加有10ml预加热至42℃由0.1X SSC、0.4M异硫氰酸鈲和0.1%Triton组成之洗涤溶液的15ml锥形试管内。搅拌溶液直到细胞成为单细胞悬液，然后以250xg离心5分钟。除去上清液，向细胞团块中加入预加热到42℃由0.1X SSC和0.1% Triton组成的10ml洗涤溶液。搅拌溶液直到细胞成为单细胞悬液。然后以250xg离心5分钟。去掉上清液并将细胞团块再次悬浮在0.2ml由溶在1X PBS中的0.0025%伊凡斯氏蓝组成的溶液中。
用Coulter Instruments制造的Profile ⅡTM分析细胞。该装置使用488nm氩激光，针对FL1的525nm带通过滤光片，且针对复染剂的635nm带通过滤光片。各被检测样品中，首先分析含阴性探针的样品，并设定四分状态以使落入右上四分之一范围内的细胞少于0.01%。然后在分析带阴性探针样品的完全相同参数下分析含阳性探针的样品。因为已准确地设定了四分状态，并且对两样品均已作了完全相同的处理，所以在右上四分之一记录的细胞数目(0.01%以上)是作为阳性记录的。
将大约500，000个H9细胞等分到两个试管中并按上述方法固定。向其中一份等分样品中加入含有阳性探针(28S)的杂交溶液。并向另一份中加入含相当于上表4中所列阳性探针同样大小之阴性探针(NR)的杂交溶液。然后进行杂交，洗涤和流式细胞计数。
使用流式细胞计数法测得的下列结果是当使用28S-25-AL探针时，99%以上的细胞为阳性；当使用28S-21-AL探针时，0.01-99%的细胞为阳性当使用其他探针时，不到0.01%的细胞为阳性。此外，为检测平均LFL1，则得到如表5所示的结果。
表5信号(平均)长度 NR 28S Fold Diff.
6 .322 .370 1.18 6.4 .441 Neg10 .422 .3 .7012 .321 .231 .7215 .327 .373 1.118 .407 .339 .8321 .281 .616 2.225 .3 50.0 168实施例3通透增强剂和信号增强剂流式细胞计数使用Coulter Profile Ⅱ流式细胞仪进行流式细胞分析。用FIFC作探针染料时，LFL3的滤光片是635nm长通过滤光片且LFL1的滤光片是540bp滤光片，激发波长是488nm，根据需要设定PMT1和PMT3的校正参数。当荧光素是染料部分时典型的有用校正参数是PMT1设在1100，PMT3设在900，且颜色补偿(PMT1，PMT3)为15%。
杂交混合物“HC”是含有下列组成的溶液5X SSC、15X Ficoll/PVP、0.16M磷酸钠缓冲液(pH6)、1mg/ml剪切的鲑精子DNA、10% Triton X-100、0.4M异硫氰酸鈲、30%(v/v)甲酰胺、10mM乙二胺四乙酸(“EDTA”)、1.5%聚乙二醇(“PEG”)、25mM DTT(二硫苏糖醇)和5-10μg/ml(微克/毫升)探针。
杂交混合物“HC-DMSO”是含有下列组分的溶液5X SSC、15X Ficoll/PVP、0.16M磷酸钠缓冲液(pH6)、1mg/ml剪切的鲑精子DNA、10% Triton X-100、0.4M异硫氰酸鈲、30%(v/v)甲酰胺、10mM乙二胺四乙酸“EDTA”、1.5%聚乙二醇“PEG”、25mM DTT(二硫苏糖醇)10%(v/v)DMSO、以及5-10μg/ml探针。上文中，500X Ficoll/PVP是5g Ficoll 400型(分子量为400，000的聚蔗糖)加5g PVP用水稀释到总体积100ml;15X Ficol/PVP是500X Ficoll/PVP用水进行15/500稀释得到的。
为在流式细胞仪中进行流式细胞检测，将细胞悬浮在1X PBS溶液中。
28S RNA探针是对核糖体RNA特异的，并具有本文所述的28S-25-AL的核苷酸顺序。NR探针是对见于细菌(而不是真核细胞)中的氮还原酶基因特异的，其具有本文所述NR-25-AL的核苷酸顺序。
“载玻片原位制备和杂交程序”1)将细胞悬浮在固定液(3体积乙醇加1体积甲醇)中并使用Cytospin装置离心转移到载玻片上。
2)将含DNA探针的检测溶液(25μl)(只含杂交混和物HC或与一种或多种作为增强剂的被试化合物混合)加到细胞上并盖上盖玻片。
3)将载玻片于90℃下加热5分钟以使DNA变性，然后于46℃保温30分钟进行杂交。
4)用已在42℃下平衡的1号洗涤溶液洗细胞1次，并用在42℃下平衡的2号洗涤溶液洗细胞10次。
5)在细胞上放置衬底溶液(溶于1X PBS中的50%甘油(v/v)以及核染色剂Hoechst(＃33258；1μg/ml)并盖上盖玻片。
6)在使用若丹明衍生物滤光片(激发波长567nm，发射波长为584nm)有荧光检测能力的Olympus BH 10显微镜下观察杂交信号。
“液体原位细胞制备和杂交程序”(步骤1-6)1.在溶液F中固定细胞，然后将细胞重新悬浮在2X SSC中。
2.从溶液中离心分离出细胞并重新悬浮在检测溶液(只含杂交混合物HC或与作为增强剂的一种或多种被试化合物合并)中。
还加入其他附加化合物时，测定其对探针信号强度的影响。用流式细胞计数法分析数据。
液体原位细胞制备和杂交方案如下所述。所用的细胞是Hela细胞。所用探针是28S RNA探针和NR探针。各探针均有借助Aminolink交联接头分子(氨己基，购自Applied Biosystems，Inc.)连接到其5′末端上的FITC部分。
28S RNA探针是对核糖体RNA特异的靶特异性探针;用其测得的荧光代表来自靶结合之探针、非特异性结合之探针的荧光以及来自细胞分子之自发荧光的总和。NR探针是对植物核酸顺序特异的，并且在本实施例中，用其测得的荧光代表来自特异性结合之探针的荧光和自发荧光的总和。在本实施例中，杂交混合物由9体积HC-DMSO加上体积附加化合物组成。在对照样品中，以1体积水代替1体积水代替1体积附加化合物。结果，所有样品中DMSO的浓度都是9%(v/v)。
表6杂交混合物中的附加化合物 28SRNA探针 NR探针 28SRNA/NR之比水 6.070 0.137 4410%吡咯烷酮 10.19 0.133 7710%β-环糊精 9.593 0.135 7110%六甲基二硅氧烷 7.426 0.126 5910%棕榈酸异丙酯 8.057 0.140 5810%丙二醇 8.227 0.148 5610%十二醇 4.804 0.142 34
3.42℃下放置30分钟后，从试验溶液中离心分离出细胞，在预加热至42℃的洗涤液中洗细胞。
4.然后在预加热至42℃的2号洗涤液中洗细胞。
5.将细胞重新悬浮在含有作为复染剂之0.002%锥虫蓝的1X PBS溶液中。
6.使细胞通过流式细胞仪并制作“计数对LFL1”的直方图(“计数”是指细胞计数)。以该直方图作为确定平均LEL1的基础。
可使用实施例1的探针和细胞(RNA扩增和杂交后)，或任何对具有足够待检RNA的细胞有相似分辨能力的探针进行本实施例的下述四个次要方面(a)、(b)、(c)、(d)的分析(如果在未经扩增时细胞有足够RNA，那么也可以进行这些分析(如参见(b))。
(a)按下述方法证明加入碱(角鲨烷)和其他化合物的影响原位制备细胞载玻片然后杂交。杂交混合物由8体积HC-DMSO、1体积角鲨烷，和1体积角鲨烷及1体积其他化合物组成。其他化合物是下列化合物之一十二醇(醇)、β-环糊精(糖)、棕榈酸异丙酯(脂肪酸酯)、1，2-丙二醇(醇)、吡咯烷酮(内酰胺)、六甲基二硅氧烷(有机硅烷)或油醇(醇)。对照样品中，用1体积水代替1体积其他化合物。结果是所有样品中DMSO和角鲨烷的浓度分别是8%和10%(v/v)。就对照样品来说，观察到载玻片上信号强度为2。与对照载玻片相比，依据强度是否分别为对照样品载玻片的0.5、1.0、1.5和2倍而估测所有其他载玻片的分级值为1、2、3或4。
(b)在原位液体杂交试验中，除向检测溶液中加入DMSO外
10%油酸 3.643 0.142 2610%油醇 0.731 0.136 -10%异三十醇 0.611 0.123 -28S/NR的比例是用28S RNA探针和NR探针观察到的平均LFLI的比例。“28S RNA探针”和“NR探针”栏中所示结果分别是用28S RNA和NR探针观察到的平均LEL1。
这些结果是四次独立实验的平均值。表6中的结果显示与单用9%DMSO所测得之结果相比，将吡咯烷酮、β-环糊精、六甲基二硅氧烷、棕榈酸异丙酯和丙二醇与9%DMSO合用时增加了信号亮度。如果单用DMSO，就信号亮度来说，9%是最佳或接近最佳的DMSO浓度。
使用10%角鲨烷或10%油醇可使其从溶液中沉淀出来，并在两种情况下都产生双相混合物。结果两种情况下都明显地降低了信号强度。
(c)进行液体原位细胞制备并完成杂交步骤如下在检测合用DMSO和角鲨烷对荧光探针信号的影响的基础上，检测再与第三种化合物合用后进一步提高增强效果。
几乎在两种情况下杂交混合物都由9体积HC-DMSO，半体积角鲨烷和半体积附加化合物组成。附加化合物是下列化合物之一十二醇(醇)、β-环糊精(糖)、棕榈酸异丙酯(脂肪酸酯)、1，2-丙二醇(醇)、吡咯烷酮(内酰胺)、六甲基二硅氧烷(有机硅)或油醇(醇)。一种情况是用水代替附加化合物从而杂交混合物便由9体积HC-DMSO、0.5体积角鲨烷和0.5体积水组成。在对照样品中，混合物由9体积HC-DMSO和1体积水组成。结果在所有样品中都有9%DMSO(v/v)。当存在角鲨烷时，其比例为5%;如有附加化合物亦为5%。
测量使用分析物RNA分子特异性探针测得之信号的平均LFL1对使用NR探针测得之信号的平均LFL1的比例。
(d)当将作为信号增强剂的各种化合物包含在固定液中，而不是包含在将其悬浮于固定液中之前将其悬浮溶液内，借以证明这些化合物的有效性。在原位杂交步骤后，洗细胞然后加入改动的固定溶液并于显微镜下观察细胞的荧光信号。改动的固定溶液包含9体积固定溶液和1体积附加化合物，其中附加化合物是被检测是否具有作为信号增强剂之能力的化合物。附加化合物选自水(对照)，1，2-丙二醇、羟丙基环糊精，六甲基二硅氧烷、十二醇、吡咯烷酮、棕榈酸异丙酯、油醇、角鲨烷和角鲨烯(烯烃)。固定溶液由加在50%甘油中的0.1%1，4-二苯胺(抗衰剂)和核着色剂Hoechst(＃35258;1μg/ml)组成。
实施例4本底降低剂的实例本实施例的目的是确定某化合物是否具有本底降低剂功能，即它是否可降低由非特异性结合之探针分子和自发荧光分子发射的光量，而不同样降低由特异性结合之探针分子发射的光量。
表1.所用的染料缩写名称染料号 染料实际名称 缩写名称12 萘酚蓝黑 萘酚B1,B1K.
13 宫殿坚牢黑WAN 宫殿F-B WAN20 磺基若丹明101水合物 磺基若丹明101异硫氰酸荧光素 FITC
NR探针是与细菌氮还原酶基因的一部分结合的DNA25聚体;其核酸部分具有本文所述探针NR-25-AL的核苷酸顺序。28S RNA探针是与28S核糖体RNA结合的DNA25聚体，其核酸部分具有本文所述探针28S-25-AL的核苷酸顺序。合成探针并在最后阶段将一氨己基接头连接到5′末端磷酸上。然后将5′氨己基寡脱氧核苷酸偶联到FITC染料分子(得自Molecular Probes)上并用HPLC纯化之。
按实施例3中所述方法使用Coulter Profile Ⅱ流式细胞计数仪。
杂交混合物HC的组成同实施例3中所述，但其中改用3%TritonX-100(v/v)和5%PEG。
着色染料溶液含有下列组成在1X PBS中的0.002%(W/V)着色染料。一般说来，如果使用着色染料并将其用作本底降低剂，则其浓度为0.0002%和0.10%(w/v)之间。最好将细胞与降低本底化合物于20℃至46℃下保温2分钟至8小时。某些着色染料也是降低本底化合物。其中大多数也用作复染剂。
着色染料溶液具有与FAScan的流动缓冲液相同的组成。
H9细胞是得自人体的淋巴瘤细胞系(ATCC No.CRL 8543)。
为进行非特异性结合试验，使用“NR”探针。
为进行特异性结合试验，使用“28S”探针。
当使用NR探针时，发射光的量将是由两个光源发射之光的总量非特异结合的探针分子和自发荧光的分子。换句话说，该发射光的量即是本底光。
当使用28S探针时，发射光的量是三个光源发射的光的总和特异结合的探针、非特异结合的探针和自发荧光的分子。换句话说，该发射光的量是靶特异性光加上本底光。
因此，要找到一种能够降低本底光的化合物，就要找到有最大A/B比值的化合物，这里所说的A是当使用28S探针时所发射的光量，B是当使用NR探针时发射的光量。作为一个衡量标准，在不加入作为本底降低剂的化合物时测定A/B比例。
然而，有最大A/B比例是不够的，除此之外，还必须有足够高的探针特异性光量。探针特异光的量即是(A-B)。可以看出，当使用降低本底化合物时，探针特异性光的量仍是可达到相当的水平。
按下述方法进行实验。
1.在溶液F中固定未被感染的H9细胞，然后重新悬浮在2X SSC中。
2.将细胞从溶液中离心出来，并再次悬浮在杂交混合物HC中。就所使用的探针来说，HC混合物仅随样品的不同而异。所用三种类型的探针是NR探针、HIV 探针和28S RNA探针。各探针均带有连接到探针寡核苷酸上的荧光素。
3.42℃下杂交30分钟后，以250xg离心5分钟，将细胞从杂交混合物中分离出来，并在预加热到42℃的1号洗涤溶液各洗细胞。
4.然后在预加热到42℃的2号洗涤溶液中洗细胞。
5.将细胞重新悬浮在1X PBS溶液或含有待检测其作为本底降低剂之有效性之待试化合物(该化合物在本实施例中也被看作是着色染料)的PBS溶液中。
6.用流式细胞计数仪计数细胞，并得到一个轴表示着色染料荧光(LFL2和LFL3)而另一轴表示探针荧光(LFL1)的直方图。
步骤(6)中制得的是“合计数对LFL1”直方图(“合计数”是指细胞数)。以此直方图为基础，确定待试化合物是否可用作有效的本底降低剂。还制作其他直方图和FS/SS曲线图，但不用作确定本底降低作用的基础;本文中没有给出或概括这些图。
使用磺基若丹明101水合物(作为着色染料)和NR探针或28S探针制得一系列合计数对LFT1直方图的实例。其结果总结于表8和9中。
表8
图1中所示计数对LFL1直方图之结果的总结组 细胞计数 细胞Pct 平均LFL11 4917 100.0 0.15602 4587 93.3 0.1263 309 6.3 2.9664 4 0.1 41.66表9:计数对LFL1直方图之结果的总结组 细胞计数 细胞Pct 平均LFL11 5034 100.0 101.02 2 0 0.2183 31 0.6 6.5354 4999 99.3 103.0表8和9中，“Pct细胞数”栏给出占总细胞计数的百分比;“LFL”代表“Log荧光”。
下表中总结了对各被试着色颜料的检测结果。
表10.结果的总结各探针的平均值 28S/NR染料号 着色染料 NR HIV 28S 平均值比例12 萘酚B1.B1K. 1.159 1.301 73.43 63.6613 宫殿F-B WA. 0.726 1.030 63.76 87.8214 锥虫蓝 0.266 0.259 77.56 291.620 磺基若丹明101 0.156 0.143 101.0 647.4PBS 磷酸盐缓冲盐水 64.5 38.73 246.1 3.82“平均值比例，28S/NR”是NR探针之平均值对28S探针之平均值的比例。
从表10的右手栏(其中给出上述A/B比例的度量)可以看出，所有四种被试染料都增加了A/B比例。另外，探针特异性光的量(A-B)仍是显著的。因此表4中列出的所有染料均可用作本底降低剂。
实施例5游离基清除剂表11.化合物的缩写化合物 缩写维生素E(α-生育酚) Vit.E.
2,2-二苯基-1-苦基偕腙肼水合物 2,2,DIPH2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧基 Tempo异硫氰酸荧光素 FITC二乙胺四乙酸 EDTA二甲基亚砜 DMSO
二硫苏糖醇 DTT聚乙烯吡咯烷酮 PVP聚乙二醇(分子量约4000) PEG4000按本文所述方法使用Coulter Profile Ⅱ流式细胞计数仪，但应注意的是，进行LFL1检测时使用540bp(40)滤光片，即只允许波长520nm至560nm的光通过的滤光片。LFL3的滤光片是635nm波长能通过的滤光片，即允许所有635nm波长以上的光通过。
本实施例中使用下述溶液杂交混合物HC具有本文已述及的成分，并作了下列改动使用3%Triton X-100(v/v;Tviton X-100是聚氧乙烯醚的醇衍生物，参见Aldrich Chemical Co.的1990-91目录)和5%PEG 4000。
如果在混合物中加入游离基清除剂，其优选浓度为0.1%至10%(v/v)。
在使用加有核酸探针的杂交混合物时，优选杂交反应温度为30°至46℃;优选反应时间为5分钟至16小时。
ALEX细胞是人细胞系。
NR探针是本文已述及的荧光素标记的NR-25-AL探针。28S RNA探针是本文已述及的对人28S RNA核苷酸顺序特异的荧光素标记DNA寡聚体。两种探针均有连接到5′末端磷酸上的氨己基接头，然后该接头又偶联到FITC分子上。
按下述方法进行第一次实验1.在溶液F中固定细胞，然后将细胞再悬浮于2X SSC中。
2.从溶液中离心分离出细胞并将其重新悬浮在杂交混合物HC中。仅就所存在的游离基清除剂(如果确实加入的话)而言，该HC混合物将随样品的改变而改变。
3.42℃下杂交30分钟后，以250xg离心5分钟，从杂交混合物中分离出细胞并在预加热到42℃的1号洗涤溶液中洗细胞。
4.再在预加热到42℃的2号洗涤溶液中洗细胞。
5.将细胞重新悬浮在1X PBS溶液中。
6.在流式细胞计数仪上计数细胞，并得到一个轴代表自发荧光(LFL3)而另一个轴表示探针荧光(LFL1)的直方图。
步骤(6)中得到的是“合计数对LFL1”直方图(“合计数”是指细胞计数)。以此直方图作为确定待检化合物是否为有效的自发荧光降低剂的基础。还产生了其他的直方图和FS/SS曲线图，但不将它们作为确定自发荧光降低作用的基础;本文没有显示这些图。
表11.使用游离基清除剂的平均LFL1和LFL3加入的化合物 平均LFL1 平均LFL3无 7.92 0.22Vit.E 0.501 0.1192,2,DIPH 17.27 0.863Tempo 3.23 0.181苯硫酚 1.69 0.138表11中，“加入的化合物”是加入(如维生素E之类液体为5%(v/v)浓度;固体为5克/100ml)到试验混合物中的化合物。
因加入游离基清除剂引起之自发荧光降低作用的指标是使用前述混合物测得的平均LFL1强度和使用混合物加游离清除剂测得的LFL1强度间的差异。另一项指标是使用该混合物测得的平均LFL3强度和使用混合物加游离基清除剂测得的平均LFL3强度间的差异。结果显示，Tempo、苯硫酚和维生素E是游离基清除剂，结合本实施例所用荧光吸收一发射波长时也是有效的自发荧光降低剂。另一方面，结果显示2，2DIPH在这些条件下则不能用作自发荧光吸收剂。2，2，DIPH无效可能不是由于它不降低自发荧光，而是由于它是发射处于本实施例所监测之波长处的光的荧光化合物。用游离基清除剂Vit.K也观察到相似的情况。
在第二项实验中，实验程序基本上与第一项实验相同，但用未被感染的H9细胞代替ALEX细胞，并且加在HC混合物中的NR探针或28S RNA探针的浓度为10μg/ml。NR探针是对不存在于人细胞中的细菌氮还原酶基因特异的。该探针被用作阴性对照。
28S RNA探针是对人28S RNA序列特异的。
结果示于表13中。
表13探针 HC混合物中有无Vit.E LEL1NR 无 13.27NR 有 8.8628S 无 25128S 有 231结果显示，杂交混合物中存在维生素E可使不希望有的本底水平(NR造成的)降低约33%，而只导致用靶特异性探针(28S RNA)测得的信号水平降低8%。
可对本文所述实施例的方法进行下述一点或多点改变在100μl混合物中加入5μl 1M(即1摩尔浓度)DTT和5μl蛋白酶K(1mg/ml)溶液，并例如在42℃下杂交反应5分钟，然后于95℃下杂交5分钟，再于42℃下杂交2分钟。
权利要求
1.检测生物实体中分析物RNA分子的方法，该方法包括以下步骤1)在反向转录酶、DNA依赖性RNA聚合酶、RNaseH和各自都是DNA寡核苷酸的第一引物和第二引物存在下保温生物实体，从而产生具有互补或相同于所说的分析物RNA分子中核苷酸顺序之核苷酸顺序的扩增分子，2)在所说的生物实体中探针分子和所说的扩增分子之间形成杂交体，以及3)检测所说杂交体中的探针分子，其中第一引物包括互补于分析物RNA分子的第一核苷酸顺序的核苷酸顺序，其中第二引物包括等同于分析物RNA分子的第二核苷酸顺序的核苷酸顺序，其中所说的第一核苷酸顺序位在分析物RNA分子中所说的第二核苷酸顺序和分析物分子之3′末端之间的位置上，其中所说的两引物中至少一个包含所说聚合酶的启动子核苷酸顺序，而且其中探针包括有互补于所说扩增分子之一中核苷酸顺序之核苷酸顺序的寡核苷酸，所说的生物实体是细胞或病毒。
2.权利要求1的方法，其中生物实体是细胞。
3.权利要求2的方法，其中细胞是带有由在接合点处连接的第一染色体片段和第二染色体片段组成的异常染色体的细胞，所说的第一和第二片段在正常细胞中并不连接在一起，且其中的分析物RNA分子是跨越转位接合点的RNA分子。
4.权利要求2的方法，其中第一引物包含启动子核苷酸顺序且第二引物包含一启动子核苷酸顺序。
5.权利要求3的方法，其中引物或探针，或它们两者就细胞RNA分子或扩增RNA分子来说是跨越接合点的分子。
6.权利要求5的方法，其中跨越转位接合点的引物或探针长度在20和50个核苷酸之间。
7.权利要求6的方法，其中探针或引物与之互补的跨越接合点的片段的一半是在含该片段的转位接合点的一侧上，且其中所说片段的另一半是在该接合点的另一侧上。
8.权利要求6的方法，其中探针是跨越转位接合点的探针。
9.权利要求7的方法，其中探针是跨越转位接合点的探针。
10.权利要求3的方法，其中分析物RNA分子的转位接合点是在所说的分析物分子内，互补于部分或全部第一引物的核苷酸顺序和等同于部分或全部第二引物的核苷酸顺序之间。
11.权利要求2的方法，其中探针包含报导物基团，该报导物基团是荧光部分并且是基于由所说的部分发射的能量光而可以检测的。
12.权利要求11的方法，其中步骤(3)用在溶液中而不在载玻片上的细胞完成的。
13.权利要求2的方法，其中步骤(2)是在包含选自二甲基亚砜(DMSO)、醇、脂族烷烃、烯烃、环糊精、脂肪酸酯、酰胺或内酰胺以及有机硅烷这一组中的混合物的溶液中进行的。
14.权利要求13的方法，其中用于步骤(2)中的检测溶液包含核酸探针和DMSO(2-20%和一种或多种选自醇(2-20%)、脂族烷烃(2-20%)、烯烃(2-20%)、环糊精(2-20%)、式R1(COO)R2的脂肪酸酯(2-20%)以及式(SiR5R6R7)N(SiR8R9R10)、(SiR5R6R7)-(SiR8R9R10)、(SiR5R6R7)O(SiR8R9R10)或(SiR5R6O)(SiR7R8O)(SiR9R10O)这一组中的化合物，且其中DMSO和选自这一组中的化合物的合并的体积不超于检测溶液的30%(v/v)。
15.权利要求13的方法，其中用于步骤(2)中的检测溶液包含核酸探针和DMSO(2-20%)和一种或多种选自醇(2-20%)、脂族烷烃(2-20%)、烯烃(2-20%)、环糊精(2-20%)、式R1(COO)R2的脂肪酸酯(2-20%)、式R3(NH)(CO)R4的酰胺或内酰胺(2-15%)以及式(SiR5R6R7)N(SiR8R9R10)、(SiR5R6R7)-(SiR8R9R10)、(SiR5R6R7)O(SiR8R9R10)或(SiR5R6O)(SiR7R8O)(SiR9R10O)的有机硅烷(2-20%)这一组中的化合物，且其中DMSO和选自这一组中的化合物的合并的体积不超过检测溶液的30%(v/v)。
16.权利要求13的方法，除DMSO外其中还含有一种烯烃或一种烷烃以及至少一种选自该组中的其他化合物。/
17.权利要求2的方法，其中步骤(3)包括如下所述的3A、3B和3C这三个步骤，以及在步骤3B之前完成3A，且在步骤3C之前或与步骤3C同时完成3B(3A)从检测溶液中除去细胞，(3B)向悬浮细胞的溶液内加入信号增强化合物，(3C)检测作为信号的由与靶结合的探针分子直接或同接产生的光量子，信号增强剂选自醇、脂族烷烃、糖、脂肪酸酯、酰胺或内酰胺以及有机硅烷这一组化合物中。
18.权利要求3的方法，其中步骤3至少包括如下所述的3A、3B和3C这三个步骤，其中3A是在3B之前进行的，且步骤3B是在步骤3C之前或基本上与步骤3C同时完成的(3A)从完成步骤(2)的溶液中除去细胞，(3B)使细胞暴露于有荧光探针分子这吸收波长的光，以及(3C)测定以荧光探针的发射波长发射的光量;其中在开始步骤(1)之后和终止步骤(3C)之前的时间，降低本底化合物存在于其中悬浮有细胞的溶液中;降低本底化合物包含与荧光探针的荧光染料部分有不同结构的光吸收部分;降低本底化合物具有与荧光探针的发射波长范围(探针发射的光的波长范围)的该部分重叠的吸收波长范围(当该方法进行时它吸收该波长范围的光)，其中在步骤(3C)中检测荧光探针之该部分发射波长范围的光量。
19.权利要求18的方法，其中步骤(3B)和(3C)降低本底化合物是在其中悬浮有细胞的溶液中。
20.权利要求2的方法，其中荧光报导物基团用于检测步骤(3)期间形成的杂交体中的探针分子，且游离基清除剂存在于用来完成步骤(1)、(2)和(3)中一个或多个步骤的反应混合物中。
21.权利要求20的方法，其中游离基清除剂存在于用来完成步骤(2)的反应混合物中。
22.权利要求2的方法，其中游离基清除剂选自维生素E、苯硫酚和2，2，6，6-四甲基哌啶-N-氧基这一组中。
23.权利要求2的方法，其中在步骤(2)期间芳族报导物基团是探针分子的一部分，并且在完成步骤(3)之前将细胞与报导物基团的结构类似物一起保温。
24.权利要求23的方法，其中在步骤(2)期间类似物存在于用来使探针分子与细胞内扩增分子杂交的同一溶液中，此外步骤(3)是以一种将检测报导物基团但不检测类似物化合物的方法完成的。
25.权利要求2的方法，其中探针包括单股核酸部分和大多数报导物部分，这样各个报导物部分借助一个接头部分共价连接到中介原子上，后者则连接到核苷部分的核苷间磷原子上。
26.包含反向转录酶、RNA聚合酶和RNAse H以及用于完成3SR原位反应之工具的药盒。
27.权利要求1的方法，其中探针包括报导物基团，该报导物基团是荧光部分并且是可基于由所说的部分发射之能量光而得以检测的，且其中步骤(3)包括用溶液中的而不是在载玻片上的细胞进行荧光检测。
28.权利要求8的方法，其中探针包括是为荧光部分并且可基于由所说的部分发射的能量光得以检测的报导物基团，且其中步骤(3)包括用溶液中而不是在载玻片上的细胞进行荧光检测。
29.权利要求9的方法，其中探针包括是为荧光部分并且可基于由所说的部分发光的能量光得以检测的报导物基团，且其中步骤(3)包括用溶液中而不是在载玻片上的细胞进行荧光检测。
全文摘要
本文公开了使用3SR扩增技术检测原位RNA分子的方法，其中所说的分子例如是已经受染色体易位的细胞内的跨越易位连接点的分子。还公开了提高该方法效果的改进方面。
文档编号G01N33/53GK1088261SQ93116878
公开日1994年6月22日 申请日期1993年7月17日 优先权日1992年7月17日
发明者C·L·里丁, M·L·库比治, P·V·海多克, J·布雷泽, N·普拉沙, M·布里克, W·D·韦伯, S·-C·祝, M·阿斯加里, D·科尔文, R·祖尔苏克 申请人:阿普罗精内斯有限公司