专利名称：检查或测量细胞相关性分子总量的方法和装置的制作方法
本申请是申请日为1992年10月30日的序号为968，793的部分继续。
存在大量的细胞相关性分子，包括细胞表面抗原，胞内细胞因子，微生物抗原，药物试剂及其代谢物，和核酸。其中许多细胞相关性抗原涉及对免疫功能较重要的各种细胞对细胞的相互作用和通信。还有一些其它的分子是免疫机能障碍和其它疾病症状的重要标记物。特定分子的检查在对正常及反常情况的分析中可能是有用的。
细胞因子细胞因子是一组较大的各种各样的生物活性蛋白质和多肽，一般具有相当低的分子量调节众多的细胞活性。例如，细胞因子调节B淋巴细胞的免疫球蛋白产量和各种细胞类型的生物合成活性。白细胞介素—2(IL—2)(最初发现为一种T细胞生长因子)和其它免疫学活性细胞因子与T细胞功能和各种造血细胞类型的生长及分化相联系。
细胞因子一般以非构成方式产生，通常需要可能通过一种细胞表面受体对生产细胞的活化或刺激。尽管许多较好特征化的细胞因子由免疫系统的细胞产生，细胞因子也由范围较宽的各种细胞类型产生。典型地，一种给定的细胞类型产生一定数量的不同细胞因子。细胞因子影响大范围的各种免疫和炎症反应。其作用以复杂的相互作用网络来进行，其中一种细胞因子的释放可能导致一系列的多种生理学反应，有些还归功于其它细胞因子的诱导。
使用体外培养系统对细胞因子的生产和作用进行了大量的研究。事实上，大多数细胞因子在血流中不可检测，即使在免疫应答期间也一样。因为在免疫应答中细胞因子的活性表现出所设计的在短范围和短时间间隔内作用，它们在非常低的浓度下一般显示活性。大多数细胞因子研究根据在各种生物学测定中对细胞因子生物学活性的测量进行。在免疫试验，如酶联免疫吸附试验(ELISA)中测量了血液中的细胞因子水平。然而，当对血清中来源于细胞的细胞因子进行检查时，这方面的研究受到一些局限，因为它们的浓度较低且在体内的半衰期极短。用单克隆抗体以ELISA对血清细胞因子的检测性受到一些因素的影响，如1)体内局部产生的细胞因子迅速被靶细胞受体吸收并可能不会到达血浆；2)细胞因子的半衰期短使取样时间变得很重要；和3)细胞因子蛋白质在样品贮存期间通常不稳定。一般来说，对存在于血清中的分子的免疫试验对于检测不能稳定贮存的蛋白质没有用处。由于所有上述原因，需要改进检查和测定血样中细胞因子的方法。
微生物抗原大多数成功增殖的微生物中一些在进入身体部位的上皮细胞内或在其表面繁殖，导致在上皮内传播感染，接着排出到外表面。例如，通常限定于上皮表面的病毒感染包括流感，副流感，鼻病毒，冠形病毒和乳头瘤。
在本领域需要一种简单的，直接的和敏感的方法，通过检查或测定在上皮细胞，组织或液体样品中与病毒相关的分子或抗原的总量来检测侵入上皮中的微生物的存在。
一些较重要的病毒穿过上皮表面后一般形成全身性感染。这些包括细胞内的微生物。对于传播到全身的专性细胞内微生物，它们必须先进入血液或淋巴。这意味着它们必须作为一种自由生物体进入上皮下的淋巴腔或血管中，或先进入可动细胞(如白细胞)并由它载入血液或淋巴。感染白细胞的生物体的例子包括麻疹和小痘病毒。这些生物在细胞内增殖而能避开细胞内的防御机制，如溶酶体降解。
如果能对含有该生物的体液或含该生物的宿主细胞以极微量的处理和加工样品进行简单直接和敏感的试验来检查和定量各种病原性微生物将有极大的益处。本发明试图提供这种试验方法。
核酸细胞中DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)的总量是某些细胞相关性分子存在的有用标志。而且，DNA或RNA的检测对于鉴定恶性或恶性前细胞的存在可能是有用的。正常细胞仅含有单拷贝的细胞DNA而恶性细胞常是多倍体。通常用DNA结合染料以流式细胞光度术分析总细胞DNA来测定多倍体。本发明允许缺乏流式细胞光度计的实验室以直接试验检查多倍体或测量细胞内的DNA或RNA总量，因此，提供了一种在细胞样品中检查各种成分，和甚至肿瘤细胞的方法。
细胞表面抗原大量分子，包括蛋白质、糖蛋白、糖脂，寡聚糖苷，和类似的物质在细胞膜表面表达。在细胞表面，或在细胞内分室里还能检测到的是由细胞内寄生物(如病毒)产生的分子。细胞表面分子也存在于细胞质中。常规流式细胞光度术试验检测或计数在其表面表达一种给定分子的细胞，这由观察或测量抗体与细胞上的该分子抗原决定基的结合来实现。熟知的具临床意义的细胞表面分子包括T细胞受体分子。许多这类分子以它们与特定单克隆抗体的反应来定义。特别地，表达CD4和CD8分子的T细胞之鉴别和计数已具有重大的临床实用性。事实上，追踪CD4＋细胞的循环水平是评介获得性免疫缺陷综合症(AIDS)进展的关键前兆指示剂。
T细胞的两组主要的分子称为CD4和CD8。以其调节功能，分别为辅助剂/诱导剂和抑制剂/细胞毒素来区别。CD4分子是一种大约为55千道尔顿的糖蛋白单体，存在于细胞外，横跨膜和细胞质区域。CD4分子能发挥传导细胞内信号和调节T细胞活化的功能，T细胞的活化导致B细胞信号的产生和经细胞因子的释放诱导CDT细胞产生细胞毒性。另外，CD4可以作为附着分子帮助MHCII级分子或存在于细胞中的抗原与T细胞受体锚着。因此，CD4分子用作辅助T淋巴细胞的表型标记。
一般来说，以细胞表面标记物对人类B和T淋巴细胞群的鉴定可得到正常及病理学状态下的免疫状态情况。例如，在大于90％的血液B淋巴细胞中发现细胞表面抗原CD19，CD20和CD21，而CD2和CD3几乎在全部正常外周血T淋巴细胞中表达。用于细胞介导免疫的T淋巴细胞依赖于其表型，对MHC的受体特异性和细胞功能可进一步分化成两类细胞群。一般来说，CD4＋CD8－辅助T淋巴细胞包含大约65％的外周T细胞并在与MHCII级分子相联系的抗原活化下能分泌细胞因子。另一类细胞群，即CD4－CD8＋细胞毒性淋巴细胞(大约35％的外周T细胞)在由MHC I级提供的抗原活化后能溶融靶细胞。
经过对这些各种细胞表面标记物使用单克隆抗体试剂并结合流式细胞光度术方法可监测外周血淋巴细胞群中与各种自身免疫和免疫缺陷疾病，白血病和淋巴瘤，以及移植排异相联系的成分变化。在AIDS病例中，已发现CD4分子是人免疫缺陷病毒(HIV)的细胞表面受体并显示出可监测CD4 T淋巴细胞的减少，它是AIDS发展的特征。
测定淋巴细胞群的早期方法，如以噬斑和细胞介导功能的分析具有高度技术依赖性并且不具有细胞谱系特异性。利用单克性抗体对细胞表面标记物的有效性，以流式细胞光度术对细胞表面CD4的测量扩展了以免疫监测对淋巴细胞群鉴定的研究。然而，这一方法需要使用复杂的程序，昂贵的仪器和很高的劳动强度。TRAXTMCD4是一种酶免疫试验，用它可以全血溶胞产物中鉴定总CD4蛋白质。使用这种基于酶免疫试验(EIA)和是到的结果与以流式细胞光度术测定的CD4T淋巴细胞计数值相比具有大于88％的相关性。
干燥血迹(DBS)样品收集介质被证实为对流行病学的研究是一种有用的方法。按常规收集新生儿脚后跟穿刺血样并显示出对PKU和甲状腺机能减退，镰状细胞性贫血和其它血红蛋白病，以及HIV的检测是有用的。在发展中国家，成人手指穿刺DBSS提供了一种给公众取样并向试验实验室运输稳定样品的方法。然而，这一技术至今来未被运用到对包含在细胞内或在细胞表面的细胞相关性分子的鉴定技术中。直到现在，干燥的血液收集方法尚未用于对血液中CD4淋巴细胞的鉴定中。
本发明提供了测定细胞相关性抗原的方法。在一个实施例中，测定了一个全血样品中选择的细胞相关性抗原(例如，CD4)的总量，在一个具体实施方案中，血样点样到滤纸上，滤纸干燥后放入含有选择的稀释剂和裂解试剂的小瓶中，在选择的温度下培养一段选择的时间。然后从小瓶中回收选择大小的样品并在标准试验(例如免疫测定试验)中测定。根据本发明的方法可测定细胞相关性抗原，如CD4，CD8，CD3，CD19，CD25(IL—2R)，CD2，CD56，CD54(ICA M—1)，细胞内病毒、细胞因子和核酸。与血浆部分中的可溶性抗原相反，发现细胞相关性抗原存在于细胞内或在细胞表面。还提供了用于本发明试验中的装置。
本发明的进一步的实施例提供了对样品中给定细胞相关性分子阳性细胞之近似数目的测定。根据本发明的之一方面，测定细胞相关性分子的方法可用于计数表达特定细胞相关性分子的细胞。本发明人发现细胞相关性分子总量可以收集在纸上或与细胞数相关的其它合适的收集装置上的样品中回收。根据本方法，可从样品得到的细胞相关性分子总量与根据常规细胞数测定方法中得到的测量值表现出线性相关。本发明的方法优于背景技术的方法。
根据本方法，分析了样品中选择的细胞相关性分子(例如CD4)的总量。一种样品，优选血液样品，更优选的是一种全血样品，被收集到合适的收集材料上(优选一种滤纸)。滤纸干燥后回收细胞相关性分子。在优选的方法中，经将纸或其它合适的收集材料放入含有选择的回收试剂(例如，稀释剂和裂解试剂)之小瓶中并在选择的温度下培养一段选择的时间来回收细胞相关性分子。然后从小瓶中回收选择大小的样品并在标准试验(例如免疫测定试验)中进行测定。以免疫测定对细胞相关性样品的检测提供了在样品中存在的细胞相关性分子总量的信息。根据本发明，细胞相关性样品的量与细胞数相联系。
图1显示了在CD4，TRAXTM试验中干燥的血液极端品与溶胞产物的相关性。CD4干燥的血液样品值以单位每ml(V/ml)来表示。一单位定义为用1％NP—40溶融的103个Jurkat细胞中发现的CD4总量。
图2显示了在CD4 TRAXTM试验中干燥的血液样品与流式细胞光度计测量的相关性。CD4干燥的血液样品值以单位每ml(V/ml)来表示。一单位定义为用1％NP—40溶融的103个Jurkat细胞中发现的CD4总量。V/ml向相当的CD4值的转换是根据在V/ml和以流式细胞光度术测定的CD4细胞值之间建立的线型关系来实现的。具有较宽范围的CD4水平的病人临床研究数据用于产生转换等式。TRAXTM试验试剂盒的标准值校正为CD4T淋巴细胞数，样品结果直接从标准曲线上读出并报道为细胞数/μl。
本发明指导对样品中细胞相关性分子(下文称作“靶分子”)总量的检查或测量并将该检查或测量用于检测，诊断。阶段确定，严重性鉴定，和疾病及紊乱的治疗，以及对表达靶分子的细胞计数中。本发明的方法和装置允许检查或测量以前用与结合配偶体(如抗体)结合不易检测的靶分子。
根据本发明的方法可检查或测定可得到结合配偶体的任何靶分子。靶分子可以是内源性的(由宿主细胞基因组编码或由宿主细胞产生的分子)。内源性靶分子的例子包括细胞因子，细胞附着分子，表型标记物，活化标记物，和核酸。
靶分子也可以是外源性分子(由非宿主细胞的基因组编码的或由外源试剂产生的分子)。根据本发明可测量的典型外源性靶分子是与微生物病原体相联系的分子如病毒抗原。
本发明试图提供的靶分子之非限制性例子有蛋白质，肽，糖蛋白，糖多肽，糖脂，多聚糖苷，寡聚糖苷，核酸，药物学试剂及其代谢物，和类似物，或其片段。根据本发明优选的靶分子是微生物相关性分子。细胞因子，附着分子，药物学试剂或其代谢物，和类似物。在具体实施方案中，本发明提供了检查或测量细胞内靶分子总量的方法。在另一实施方案中，靶分子是细胞表面分子。本文所用的“细胞相关性分子”意思是附着于细胞表面或存在于细胞内的分子。
依赖于样品和靶分子的性质，靶分子总量的测定可用直接计数表达靶分子的细胞来代替，并在监测对病人的治疗学效果，对病人疾病的检查，诊断或状态确定，和预测治疗结果或疾病预测和在评价和监测病人的免疫状态中可能是有用的。
用于本发明试验的结合配偶体包括(但不局限于)靶分子的受体和抗体。尤其是不为抗体的结合配偶体包括靶分子的细胞表面受体。
在优选的实施方案中，靶分子是抗原，并且靶分子的检查或测定用靶分子与至少一种抗体的免疫特异性结合方法来实现。带有可在免疫试验中检测或定量的抗原决定簇或抗原决定基的所有抗原都在本发明的范围内。
可得到用于本发明方法之样品的优选实验对象是脊椎动物，包括但不局限于，哺乳动物，鱼类、两栖类、爬行类、鸟类，有袋动物且最优选的是人类。因此，本发明的方法可运用于人类临床和兽医用途。
本文所用的“样品”涉及在获得样品的内环境中的细胞收集物，即生物学液体，涉及细胞的膜和/或细胞内胞质成分。可被测量总分子的样品来自于生物学液体，例如全血，血浆，血清，血细胞，唾液，尿，滑液，胸膜渗出物，肿瘤和组织渗透物，羊水，脊髓液或脑颅液。在另一实施方案中，生物学液体可以是细胞培养液。样品可包含组织，包括组织液。在优选情况下，当样品是组织样品时，处理组织使结缔组织基质破裂，例如用胰蛋白酶消化或匀浆作用来实现。在另一实施方案中，样品包含来自上述来源的细胞。
在优选的实施方案中，样品包含血液样品，更优选的是全血样品。全血意思是未分部分离的血液，可经针刺收集。
所用的样品量依赖于靶分子类型的功能及其在制品中的丰度，并能由本领域的普通技术人员不经过度的实验而测定。
本发明提供的方法。正如下面所作的更详细的描述，克服了许多背景技术的局限，特别是关于细胞相关性分子的测量和检查，以前需要进行细胞分离，接着用显微镜或流式细胞光度术进行直接或间接免疫荧光分析。
背景技术：
程序的局限包括需要新鲜的样品，相当大的样品量，浓缩的细胞群体而不是全组织或血液，大量的制样时间和昂贵的仪器如流式细胞光度计。本文提供的方法克服了这些局限。令人惊奇的是，本文所述的方法和装置适于分析新鲜样品中的各种成分，即，全血，并且样品体积相当小。即大约20-100μl。因此，样品收集涉及简单的技术如手指穿刺。而且样品较稳定，便于以邮寄或其它方式适输到分析中心处，因而避免了对新鲜血液样品和静脉切开放血术的需要。
在本发明的方法步骤中，选择的液体生物学样品的量被收集到合适的收集材料上。在一个实施方案中样品点样到纸收集装置上。适合于本发明内容的收集材料包括，但不局限于滤纸。适于本文目的的滤纸是本领域一般已知的和可以商品买到的。各种等级一般可得到并涉及纸的孔隙度，以及其吸收力，密度和其制造材料。
本文所用的“点样”意思是样品与(例如)滤纸收集材料接触并将全部或部分样品转移到装置上。至于滤纸，当样品被吸入到滤纸的纤维成分中时以吸入来实现这种吸附。
本领域的技术人员可优化这些参数，达到在滤纸的限定区域内样品分散总体上的均匀性，以便当控出一块圆片时，从样品到样品基质上样品浓度相当均匀。在某些优选的实施例中，例如在全血样品中当白细胞标记物是靶分子时，优选的滤纸含100％棉花纤维。在这一方案中，每滤纸点平均吸收血清大约1.4到大约1.7μl，特别优选的是大约1.5到大约1.6μl。血清吸收是常规的吸收力测量，因此可用这一技术鉴定和优化吸收力。一般优选的吸收时间为大约1分钟内，更优选5—30秒。密度可用吸入时间和流动均匀性来测量。孔隙度涉及吸收和密度。因为纸的孔大小和孔分布影响前述参数。在一些实施例中，合成纤维织物，(编织的和非编织的)如聚酯，或GorteXTM可在总体测量效果中提供优势。
适于本目的的样品量相当小，这就是说优选的量范围从大约150微升到大约10微升，特别优选大约80微升到大约40微升。转移后的样品可优先在室温条件下干燥，一般变动范围可从大约18℃到大约29℃，更典型的是大约20℃到大约26℃，或者如果不需要样品的长期稳定性时，在大约30℃到37℃处理一段更短的时间。干燥步骤一般从大约1至4小时。此后，样品可贮存起来直到用于进一步的分析，或按本文所述可立即进行进一步的处理。干燥样品可被送到中心试验机构进行这种进一步的处理，或可在取样点进行该步骤。
从点样区域取出适当量的干燥样品，与选择的稀释剂及裂解试剂接触一段时间以溶解所述样品。一般来说， 英寸直径的圆片携带大约12μl样品，对某些试验状态来说，这可能是合适的样品大小。而其它试验需要的量可能更大或更小。考虑到通过常规优选，本领域的技术人员可以测定其需要。例如，更小的圆片可用于对相当低浓度的分析，即小于大约10-11，而多个圆片(直径大约5.5mm)可用于更高浓度，即大于大约10-11。“溶解”意思是溶融生物学样品的固态部分(即完整细胞)，使靶分子释放到稀释剂和溶融试剂中。在优选的实施方案中，这一步骤的时间是在室温下至少大约2小时。合适的稀释剂包括生理上合适的缓冲液，如磷酸缓冲盐水，盐水，Dulbecco培养基，及其类似物。特别优选的缓冲液包含磷酸缓冲盐水，优选加入至少一种蛋白质，如来源于牛的血清蛋白质。合适的溶胞试剂包含至少一种非离子去污剂。其中可提及的非离子去污剂有Triton系列，如Triton X—100，X—114，X—305，X—405；Brij系列，如Brij 35，56，58；Tween系列，如Tween 20，Tween 80。Nonidet P—40(NP40)，和两性离子去污剂，如CHAPS和CHPSO及其类似物。用于本文所优选的是Triton和NP40以相当高的浓度组合。与样品相联系的优选浓度范围分别为大约6—10％和大约4—7％，当白细胞标记物是靶分子时特别优选的分别是大约9％和6％(考虑到液体样品的稀释因素，所有测量的浓度基础不是终浓度)。根据本文的方法，溶解的样品可进一步加工或贮存至所需的进一步处理，贮存时，优选在至少大约-20℃冷藏，更优选大约-20℃到至少大约-70℃，特别优选至少大约-70℃。
收集选择量的所说可溶样品并与至少一种靶分子特异性的结合配偶体接触以便进行检测或计数。这一步骤可用普遍接受的免疫试验检测试剂盒和用于这一目的的类似物来进行。作为例子，对于检测CD4受体的分析，可从T细胞诊断，Inc.，Cambridge，MA(见国际专利申请号WO92108981，1992年5月29日公开，由Rittershans，C.提交)得到TRAXTMCD4测定试剂盒，接该试剂盒提供的测定方案用于本目的。也可用其它常规测定技术或甚至是用于其它细胞表面受体的类似物的以商品形式可获得的测定试副来实现。
在优选的实施方案中，毛细血管或静脉血样被收集到滤纸上并干燥。从干燥的血迹中取下适当的面积，例如，从干燥的血中挖出一块5.5mm(0.25英寸)的圆片，用缓冲的去污剂溶液室温下从纸片上洗脱至少2小时得到分析样品。
然后在标准TRAXTMCD4微滴定板ELISA试验中分析50微升(50μl)洗脱物以测定血样中的CD4细胞数。同批内和间隔试验的试验CVS都不超过8％。试验灵敏度是大约86—130个细胞/μl，特别是每μl 86个细胞，且与流式细胞光度术的相关性大约为90％。当在4℃下与干燥剂一起贮存时样品可稳定几个月。去污剂处理后溶解的样品也可冷冻贮存，例如在-20℃，优选在-70℃。这样带来的优势是在一次试验中允许同时份析取自不同时间的多份样品，因此减少了间隔试验的变异性。本发明的方法表明其适用的极广，流式细胞光度术的范围却受到局限。
本发明的滤纸收集装置可以适于“野外”收回生物学样品的分开包装形式提供。还将提供的是一种容器，便于当纸点样后滞留样品，它可帮助容纳可能有传染性的样品。另外，对实施本发明有用的剩余试剂可以与滤纸收集装置联合或单独以试剂盒的形式按常规提供。本发明试剂盒的部分必须成分是浓缩的非离子去污剂溶液和以免疫学检测抗原存在的方法。
试剂盒可包含本领域已知的任何免疫学检测方法，即多层试验形式，竞争免疫测定形式，及类似方法。优选的免疫学检测方法是先俘获细胞相关性分子特异性的抗体，再检测细胞相关性分子特异性抗体。提供的第一抗体可在固态支持物上，如玻璃或塑料珠，膜，塑料棒，微孔，玻璃或塑料试管，或本领域已知的用于免疫测定的其它固态技术物。作为选择，提供的第一抗体可用于滞后制动。第一抗体和第二抗体可用能重建的冻干制品或以浓缩溶液的形式提供。第二抗体可用标记方法检测。在优选的实施方案中，标记方法是一种酶。
提供的去污剂溶液在容器中，该容器有足够的容积容纳期望以试剂盒进行的一定量试验所必需的溶液量。优选的去污剂溶液含有两种或多种非离子去污剂。在一个优选的实施例中，去污剂溶液包含溶于蒸馏水的9％Triton X—100和6％的N—40。这一特定的去污剂浓度对CD4和CD8的测定都是最佳的。
优选的试剂盒包含一种以溶液或可恢复的冻干品形式的细胞相关性分子标准品。更优选的试剂盒包含一种含有已知数目的目标分子阳性细胞的标准品。因此，未知样品中细胞相关性分子活性的测定可直接与已知样品进行比较，由此计数未知样品中对该分子呈阳性的细胞数。
根据本发明，样品中对白细胞标记物呈阳性的细胞数可用下面方法测定(1)根据本发明的方法测定样品中细胞相关性分子总量，和(2)从细胞相关性分子总量计算对细胞相关性分子呈阳性的细胞总数。在一个实施方案中，可用细胞相关性分子总数对细胞相关性分子阳性细胞总数的标准曲线得到一个公式，细胞相关性分子总量列入公式中。
当第二抗体经附着到抗体标记物上可检测时，试剂盒还可包含一种与标记物发生反应的试剂。例如，当标记物是一种酶时，试剂盒能提供酶底物。试剂盒还能提供一种稀释缓冲液为达到终浓度，它可用于对高浓度的稀释或对干燥样品的重建。
在另一实施方案中，试剂盒提供对超过1种分子的免疫学检测方法。在优选的实施方案中，试剂盒包含对CD4和CD8抗原的免疫学检测方法。
本发明用下面非限制性的实施例来作进一步的说明。
实施例1试验方案皮肤穿刺或手指刺扎后，全血点样到Schleicher andSchuell，Inc.(Keene，NH)903级滤纸上。环形标记内充满了大约60μl血液。纸片在室温下干燥大约2小时并立即使用或与干燥剂一起在大约4℃下贮存于密封的容器中。
从干燥的血迹上挖下0.25英寸的圆片并放入12×75mm的玻璃管中，加入100μl洗脱缓冲液。洗脱缓冲液是6∶1的TRAXTMCD4样品稀释剂(T细胞诊断公司；Cam-bridge，MA)溶液和TRAXTMCD4溶胞试剂(T细胞诊断；Inc；Cambridge，MA)，例如1.0ml样品稀释剂(含有牛血清蛋白质或thimerosal的缓冲溶液)加入0.2ml溶胞试剂(6％Nonidet P—40(NP—40)和9％Triton X—100溶于1XPBSK)。然后盖上玻璃管并放在一摇动器上以200rpm室温下处理至少2小时。结束后，用吸管尖端小心挤压圆片并混匀溶液，然后从玻璃管中取出50μl。按照TRAXTMCD4试验试剂盒说明(T细胞诊断公司；Cambridge，MA)的方案将50μl样品加入到标准TRAXTMCD4试验中。
实施例2 TRAXTMCD4试验TRAXTMCD4试验是用于定量测定总CD4蛋白质和用于人血CD4淋巴细胞计数的多层EIA。使用本试验得到的结果被证实与用流式细胞光度术结合血液学资料测定的绝对CD4T淋巴细胞数相对应。对全血样品的简单预处理使CD4蛋白质从淋巴细胞中释放出来，然后样品可用EIA进行分析和/或贮存于-20℃到-70℃以备以后的试验。试验在微滴定孔中进行。该孔预先用人CD4蛋白质的单克隆抗体覆盖。在加入标准品，对照或样品后，与辣根过氧化物酶结合的第二抗CD4单克隆抗体吸入到孔中。存在于标准品，对照或样品中的可溶CD4蛋白质与覆盖在板上的抗体结合，而结合的抗体与CD4分子上的第二抗原决定基结合完成多层试验，培养一段时间后，彻底洗涤各孔去掉未反应的成分并加入酶特异性色素溶液。再培养一段短时间后，终止反应并在490mm下测定吸光率。终点的颜色结果与存在的CD4蛋白质总量直接成比例并与原始样品中CD4 T淋巴细胞数相对应。用标准品制备标准曲线，对照和样品值从标准曲线中测定并以细胞/μl来表示。
实施例3 CD4 TRAXTM纸圆片试验—抑制和回收5份新鲜全血样品被收集到EDTA中每样品的一半体积中CD4被耗尽。测量时，用它稀释剩余的一半样品，以便造成已知量的CD4增加。以4种不同的浓度进行增加。根据实施例1所述的程序将它们与高值样品(纯净样)和耗尽部分的样品一起点样到S&S 903滤纸上。所进行的稀释覆盖了标准曲线的范围。按照上面实施例所述的程序进行试验。根据回收的量除以增加的量(从纯净样和耗尽值测定)计算回收率。结果如表1所示。在标准曲线范围内加入已知量的CD4到5个不同的新鲜全血吸附样品中后回收率平均为98％。
表1
实施例4 CD4 TRAXTM纸圆片试验—直线性11份新鲜全血样品被收集到EDTA中并根据实施例1所述的程序点样到S&S 903滤纸上。每份样品保留一部分用于流程测定和用于溶胞产物制备。对点样物进行的稀释覆盖了标准曲线的范围。根据实施例1和2所述的程序进行试验。根据纯净样值计算回收率。结果如表2所示。在标准曲线范围内对11份新鲜全血点样样品平行稀释后的回收率平均为112％。
表2
实施例5 CD4 TRAXTM纸圆片试验—同批内试验的精确性在一个试验中，以一式三份测定10份样品，(即，每份样品测3个点样点)。结果如表3所示，一式3份(点样点)的上述10份样品的平均相关值(CV)是4.1％。
表3
实施例6 CD4 TRAXTM纸圆片试验—间隔试验的变异性测定4份样品以研究间隔试验的变异性，结果如表4所示。
表4
>按下面测定平均CV为5.9样品n 平均值SD CV99719106.2 7.47.09982076.3 5.57.21000 1996.1 3.84.01001 1877.6 4.15.3实施例7 CD4 TRAXTM纸圆片试验—干燥血液样品与溶胞产物的相关性测定了干燥血液样品与溶胞产物的相关性。结果如表5和图1所示。
表5
实施例8 CD4 TRAXTM纸圆片试验—干燥的血液吸附点与流式细胞光度术的相关性测定了干燥的血液样品结果与用流式细胞光度术所得结果之间的相关性。结果如表6和图2所示。
表6
所发现的相关性为0.93，如图2所示。
权利要求
1.一种检查或测定来自实验对象的样品中细胞相关性分子总量的方法，包括如下步骤(a)将来自实验对象的选择量的液体生物学样品点样到滤纸收集装置上；(b)将滤纸收集装置与选择的稀释剂和溶胞试剂在选定的温度下接触给定的时间以产生可溶的样品；(c)回收选定量的所说的可溶样品；(d)在允许发生特异性结合的条件下将所说的可溶样品与至少一种细胞相关性分子特异性的结合配偶体接触；和(e)检查或测定样品成份与所说的至少一种结合配偶体发生的特异性结合的量，其中，检查或特异性结合的量显示了样品中细胞相关性分子的存在或含量。
2.权利要求1的方法，其中所说的细胞相关性分子选自由CD4，CD8，CD3，CD19，CD25，CD2，CD56和CD54所组成的组。
3.权利要求2的方法，其中所说的细胞相关性分子是CD4。
4.权利要求1的方法，其中所说的细胞相关性分子包含细胞因子。
5.权利要求1的方法，其中所说的细胞相关性分子是一种细胞内病毒抗原。
6.权利要求1的方法，其中所说的细胞相关性分子包含核酸。
7.权利要求1的方法，其中所说的细胞相关性分子包含一种药物学试剂或其代谢物。
8.权利要求1的方法，其中所说的选定的稀释剂包含一种缓冲液和溶胞试剂。
9.权利要求1的方法，其中所说的选定的缓冲溶胞试剂包含一种非离子去污剂。
10.权利要求9的方法，其中所说的非离子去污包含Triton X—100和Nonidet P—40。
11.权利要求1的方法，其中滤纸收集装置与稀释剂和溶胞试剂在大约室温下至少接触2小时。
12.权利要求1的方法，其中所说的选定的可溶样品量50μl。
13.权利要求1的方法，其中将血液点样到收集装置上包含将血样收集到滤纸上并使它干燥以产生干燥的血斑。
14.权利要求13的方法，其中取出0.25英寸直径的干燥血斑部分。
15.权利要求13的方法，其中在(b)步骤中将所说的0.25英寸直径部分接着与稀释剂和溶胞试剂接触。
16.权利要求1的方法，其中所说的滤纸收集装置包含在其上有圆形标记的903级滤纸。
17.权利要求16的方法，其中所说的圆形标记内可容纳大约60μl血液。渗透物，脊髓液，滑液和血液组成的组。
19.一种计数样品中细胞相关性分子阳性的细胞之近似数量的方法，包含(a)根据权利要求1—3和11—17的方法测定细胞相关性分子总量和(b)从(a)步中测定的细胞相关性分子总量计算细胞相关性分子阳性细胞的近似数目。
20.权利要求17的方法，包含下面步骤(a)将来自实验对象的选定量的液体生物学样品点样到滤纸收集装置上；(b)将滤纸收集装置与选定的稀释剂和溶胞试剂在选定的温度下接触一段选定的时间以产生可溶样品；(c)回收选择量的所说可溶样品；(d)在允许发生特异性结合的条件下将所说的可溶样品与至少一种细胞相关性分子特异性的结合配偶体接触；(e)检查或测定样品成份与所说的至少一种结合配偶体发生特异性结合的量，其中检查或特异性结合的总量显示了样品中细胞相关性分子的存在或含量；和(f)根据样品中细胞相关性分子总量计算近似细胞数。
21.权利要求20的方法，其中的生物学样品包含全血。
22.权利要求21的方法，其中的细胞相关性分子是CD4。
23.一种用于计数细胞相关性分子阳性细胞近似数的试剂盒，包含(a)纸收集装置；(b)去污剂；和(c)免疫学检测方法。
全文摘要
本发明涉及检查或测量生物学液体样品中细胞相关性分子总量的方法和装置。可被检查或测量的细胞相关性分子包括(但不局限于)细胞表面抗原，细胞内的细胞因子，微生物抗原药物学试剂或其代谢物，和核酸。在优选的实施例中，全血样品被收集到滤纸上并干燥。从干燥的血迹上挖出一块圆片，用缓冲的，相当高浓度的去污剂溶液从纸片上洗脱出感兴趣的物质进行分析。然后在标准试验(如免疫试验)中测定洗脱物。
文档编号G01N33/543GK1122614SQ94192039
公开日1996年5月15日 申请日期1994年5月11日 优先权日1993年5月14日
发明者乔治·H·帕森, 约翰·A·玛格丽特, 鲁格·E·阿瑟 申请人:T细胞诊断公司