专利名称：标记分析固相材料表面活化方法
技术领域：
本发明属于生物标样(血、尿及其他)标记分析材料的制备方法。固相法是当今标记分析的发展方向，标志着标记分析的水平。与液相法比，固相法特别是夹心固相法，更灵敏，更准确，操作更简单，更适合自动化。固相法的基础是固相表面的活化技术。人们创造了许多活化方法。其中JeanCause的方法，是近年被推祟的。它是利用苯乙烯-顺丁二酸酐共聚体包被塑料。具体方法是将顺丁烯二酸酐溶于苯乙烯中，加入过氧化苯甲酰作催化剂，在85℃水浴条件下聚合。马上放到冰水中冷却。多聚体溶解在丁酮中，用乙腈改变溶解性。每支聚苯乙烯管加1ml活化液，即刻吸出。管子经24小时自然干燥即为活化管。JeanCause采用二氧六环-乙酸处理管子随后加甲醇-乙酸酐，马上水洗达到活化管子的目的。Butter J.E.利用浓硝酸处理聚苯乙烯管变聚苯乙烯管表面为硝化聚苯乙烯，在强碱性条件下，用硫代硫酸钠还原成氨基聚苯乙烯。在酸性条件下，经亚硝酸进一步还原成偶氮聚苯乙烯，可以连结抗体。氨基聚苯乙烯与蛋白质结合的方法很多，可以首先与溴乙烯溴，二氟二硝基苯，碘化乙酰酐，氯化苯偏二酸酐、戊二醛、碳化二亚胺等结合，形成可以与蛋白的氨基相结合的集团。Parsons J Barrett、George等均提出了用戊二醛活化固相表面或聚合蛋白达到抗体蛋白结合到固相表面的目的。Bondet F在免疫学方法杂志上介绍了紫外光处理聚苯乙烯管，以企增加抗体的结合，用于酶联分析。综上所述，活化固相表面的方法很多但都离不开强酸、强碱、易燃、易爆、剧毒物质，生产工艺复杂，成本高，有废水、废物产生，而且结合容量小。
本发明的目的就是为克服上述现有技术的不足，发明一种不用强酸、强碱和易燃、易爆、剧毒物质，而且工艺简单，成本低廉，不产生废物，废水的标记分析固相材料活化法。
本发明是在大量试验的基础上，发现了在弱碱性条件下，用丙烯醛的饱和水溶液，可以在固相表面聚合形成一个带有活性醛基的包层。本发明就是在此发现的基础上提出了新的固相材料表面活化法，本发明的技术方案如下(1). 被活化表面的材质本方法可以活化聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、尼龙等固相材料表面。其材质可以做成管、球、珠、柱、片状物体，其表面部可以用本发明活化(2)活化试剂①PH8.6的无氨离子及氨化合物的缓冲液；②丙烯醛；③活化液的配制加0.5克丙烯酰胺到100ml PH8.6 0.04M巴比妥缓冲液中，再加0.5ml丙烯醛混合，出现凝聚可滤除。
(3)固相表面活化方法可用自动或手工，加一毫升活化液到聚苯乙烯管内。不要触及管壁，不要倾斜，在室温下静置1-4小时，用泵吸去活化液，自然干燥，即为活化管。这种活化液可以活化聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、尼龙等多种材质，可以活化管、球、珠、环、片等形体表面。
(4).活化表面的用途经表面活化的管子、球、珠、环、片、柱等固体表面，有一层能够结合抗原、抗体或其他含有氨基的物质。这种结合了抗原抗体的固相材料可用于放射性标记分析、酶标记分析、荧光标记分析、DNA分析测定。下面具体介绍本发明的操作条件一.活化条件的优选与确定1.丙烯醛浓度对活化效果的影响以不同浓度的活化剂活化试管，以最适包被条件包被抗体，比较各种浓度的活化剂活化试管结合的放射性。
活化剂浓度(％) 0.1 0.25 0.5 1 2结合放射性Kcpm 16 15.5 15.5 16.5 16.5上述结果说明，活化剂浓度相差20倍对活化效果无影响。
2.活化酸度对活化效果的影响活化酸度(PH) 6.4 7.4 8.6 9.2 9.8 10.3结合放射性(Kcpm) 3.6 3.9 9.3 8.9 8.6 9.0上述结果说明，最佳活化酸度为PH8.63.稳定剂0.5％丙烯酰胺对包被抗体稳定性的影响加有稳定剂的活化管，在最适宜条件下包被并加表面处理，干燥后，开放常温保存一定时间，加相应标记抗原，过夜，弃液体，水洗后测放射性。
包被管存放时间(月) 0 1 2 3加稳定剂 (Kcpm)43.5 38.3 3734.2不加稳定剂(Kcpm)43.5 3.1 1.0-从上表可以看出不加稳定剂保存一个月活性损失90％以上，加了稳定剂保存三个月活性无变化，若塑封低温避光保存，活性保存更好。
4.活化时间对活化效果的影响活化时间(小时)2 4 624活化效果(Kcpm) 55 58 58.8 58活化时间在2-24小时之间对活化效果无影响5.活化剂存放时间对活化效果的影响存放时间即刻一天二天一周(Kcpm) 10.111.212.412.2活化剂存放一周对活化效果无影响6.活化温度对活化效果的影响20℃ 活化14.6Kcpm37℃ 活化13.7Kcpm活化温度在20℃及37℃活化效果无影响7.活化管的稳定性活化管开放保存一段时间，包被抗体后，测结合的放射性(Kcpm)，每次都以新活化管对照，数据经规一处理列表如下存放时间(月) 0 123结合的放射性(Kcpm)2.69 2.65 2.57 2.49总结以上，在PH8.6的条件下，活化剂浓差20倍，活化剂保存一周，活化温度在20-37℃之间，活化时间在2-24小时之间，活化效果一致，说明活化条件宽松。
二.包被条件的选择1.包被酸度对包被效果的影响包被液酸度3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8包被抗体活性 5.8 7.1 8.1 9.5 10.3 10.3 8.7(Kcpm)包被液以PH4.5为好2.包被温度、时间对包被效果的影响包被时间(小时)0.5 1234 682437℃(Kcpm)2.3 4.0 4.5 4.8 4.2 4.0 3.8 3.945℃(Kcpm)2.5 4.0 4.7 4.9 4.3 3.4 4.0 3.6包被时间以2-3小时为好，37℃与45℃对包被效果无影响。
3.包被抗体浓度对包被效果的影响蛋白含量0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0(抗人IgGμg/ML)结合标记放射性 0.2 3.0 6.7 7.2 9.2 9.8(Kcpm)包被抗体重，随包被液抗体含量增加而增加，无倒钩现象。
三.包被抗体的表面处理抗体在干燥过程中失活很严重，对这个问题进行了研究。
1.利用不同浓度的甘油处理包被管与不处理的包被管干燥后，在相同条件下与标记抗原结合甘油浓度(％) 01.25 2.5 5结合放射性(Kcpm) 8.86 15.416.016.01.25-5％甘油可以有效避免抗体失活1％的明胶与1.25％-5％甘油处理效果相同。
2.竞争法需要标记抗原与被测物都加入后，同时启动反应，用1％的明胶解决了这个问题。明胶可以在包被管的表面形成一个薄层，在样品和标记加入后，不经混旋，室温静置相当一段时间无反应，可以有一个从容的操作时间，保证竞争反应同时启动。放置时间(分) 20 40 60 120静置室温 (Kcpm)0.2 0.2 0.3 0.3混旋后37℃(Kcpm)3.5 4.4 4.6 10.6四.包被管性能试验1.包被管变异任取十支包被管利用加心法测定变异，求平均值与标准差。
58874 56565 56936 56989 5527556518 55673 54774 55321 53980M 55790.5SD 983.0GV 1.76％2.包被抗体量Barrel根据理论计算，若抗体蛋白均以长轴结合在固相上，每平方厘米表面最多可结合1.5μg蛋白，若均以短轴结合则最多0.075μg，本发明的活化、包被技术每平方厘米可结合0.2μg。接近理论值，因为抗体在固相表面结合并非全是短轴或全是长轴，分子间还有间距。
3.结合的牢固性结合标记抗原经常规三次洗涤后，再经3000转混旋洗涤一分钟，放射性无明显降低(在放射性测量的统计涨落范围内)。
4.包被管透明度无变化，可用于酶标及时间分辨荧光分析。
一.活化包被实例1.活化试剂配制溶0.5克丙烯酰胺于100ml0.04M PH8.6巴比妥缓冲液，加0.5ml丙烯醛，振荡将大片聚合物滤除即可应用。冰箱保存一周活化效果无影响，随着时间延长可能出现混浊无碍使用2.活化操作根据需要，准确加入0.5或1ml活化液于聚苯乙烯管内，其他材质试管也可以。加样头直插管底切勿触及管壁，加样量要准确一致，不可摇动，37℃3小时吸出活化试剂，自然或减压干燥后，即为活化试管，室温保存至少叁个月。
3.包被方法根据被测物的含量，抗体效价，总蛋白含量及分析方法——加心法以投入抗体多为好，竞争法则需要通过实验确定一个最佳值。包被液PH4.5枸橼酸盐或醋酸盐缓冲液均可。提纯的IgG可以提高有效抗体的结合量。向活化聚苯乙烯管内，准确加入1ml稀释抗体，37℃3小时，吸去包被液。
4.包被聚苯乙烯管的表面处理根据不同需要有以下两种方法。
①.用于夹心法的包被管的处理，加1ml0.2％牛白蛋白混匀37℃3小时抽出，再加2％甘油1ml混匀抽出，自然干燥，塑封、避光、4℃保存三个月以上。
②.适用于竞争法也可用作夹心法包被管的处理向包被聚苯烯管内加入1％明胶1ml混匀，吸干，自然或减压干燥，塑封、避光、4℃保存至少可以应用三个月。
应用实例一.固相竞争法测尿中IgG。
1.试剂①125碘标记人IgG本院标记，用0.2％牛白蛋白的0.1MPH7.4PB稀释成每毫升30000cpm。
②标准人IgG，用0.2％牛白蛋白稀释成每毫升1、2、4、8、16、32μg。
③包被抗入IgG抗体聚苯乙烯管，本院按照上述方法制备。
2.方法①向包被聚苯乙烯管内分别加入0.1ml标准或检样向非特异管加PH7.4PB②向上述各加入1ml稀释标记试剂③37℃过液后吸除标记试剂④γ计数测量各管放射性
⑤计算机做数据处理和运算3.结果①零管计数 非特异计数＞100②变异 3.3％-3.7％③与常规法相关良好，相关系数0.96④批内质量变异系数≤0.12⑤批间质量变异系数≤0.08二.夹心法以CEA测定为例1.试剂①标记CEA单克隆抗体20bq/10μg/ml②标准CEA 0 2.5 5 10 20 40 ng/ml③抗CEA多克隆抗体包被聚苯乙管2.方法①向抗CEA多克隆抗体包被管内入0.1ml样品或标准②再加0.1ml标记抗CEA眷单克隆抗体③37℃过夜④水冼两次γ计数器测量⑤计算3.结果①.零管计数/非特异管行数＞100②.变异3.3％-3.7％③.与常规法相关良好，相关系数0.95④.批内质量变异系数≤0.06⑤.批间质量变异系数≤0.10三.应用本发明活化包被的聚苯乙烯、聚丙烯管、珠曾用于加心法、竞争法法测定AIB、IgGβ2-MG AFP CEA Fer TSH等均取得满意结果。
本发明的优点
1.本发明不需要大量强酸、强碱、易燃、易爆、剧毒物。
2.不产生废物。
3.操作工艺简单、便于机械化。
4.成本低廉。
5.活性表面可以长时保存而不失活。
6.本发明适用于多种材质如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、尼龙等表面活化。本发明适用于多种形体固相表面如管、球、环、片、等表面活化。
7.结合容量大，每平方厘米可结合有效抗体0.2微克以上接近理论值。
8.可以直接包被抗原抗体，不必象氨基聚苯乙烯管那样，需要通过“桥”联接。
权利要求
1.一种标记分析固相材料表面的活化方法，适用于活化聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、尼龙等材质的固相表面，用于放射性标记分析、酶标记分析、荧光标记分析等，其特征在于用丙烯醛溶液直接活化固相表面，形成活性醛基。
2.根据权利要求1所述的标记分析固相材料表面的活化方法，利用丙烯酰胺作稳定剂，浓度在0.1-3％。
3.按照权利要求1和2所述的标记分析固相材料表面的活化方法，其特征在于固相材料表面最佳活化条件为PH8.6，丙烯醛最佳浓度在0.1-2％，温度在20-50℃，时间在1-4小时，稳定剂丙烯酰胺浓度0.5％。
4.根据权利要求1所述的标记分析固相材料表面的活化方法，其特征在于，在制备的活性表面上，包被抗体、抗原等生物活性物质的条件为PH4.5为好，包被管用甘油或明胶处理，保护抗原或抗体活性。
全文摘要
本发明是一种固相标记分析中使用的固相材料表面活化方法，适用于多种材质如聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、尼龙等制成的试管、球、珠、环、片等表面活化。其原理是在弱碱性条件下用丙烯醛在固相材料表面聚合，形成一个活性醛基的薄层。活化后的固相表面每平方厘米可结合有效抗体蛋白0.2μg以上，变异4％以下，活化条件宽松，可以满足夹心法，竞争法标记分析的需要。
文档编号G01N33/48GK1149721SQ9511709
公开日1997年5月14日 申请日期1995年10月27日 优先权日1995年10月27日
发明者张兴祥 申请人:首钢总公司, 张兴祥, 王俐敏