唾液的分析方法

文档序号:6096093阅读:1002来源:国知局
专利名称:唾液的分析方法
技术领域
本发明涉及唾液的处理方法,特别是涉及诊断属于幽门螺杆菌(H.pylori)的抗原的存在的试验用的唾液处理方法。
唾液是源自口腔内各种腺的分泌物的复杂混合物,其中很多组分是各种酶、免疫球蛋白和粘蛋白、以及细胞碎片与细菌菌群宿主。特别是粘蛋白赋予唾液以粘弹性质,且作为具有保护性及抗菌性的润滑剂。这些糖蛋白的粘弹性质依赖于合成期间所得到的蛋白质及糖组分,但也受其与唾液的其它组分间相互作用程度的影响。例如,类脂也对唾液的粘弹性质起显著作用。
含免疫球蛋白的唾液可用于各种疾病的诊断,特别是检测对病原菌产生的抗原具有特异性的IgG,可预示感染或新近的接触。例如由幽门螺杆菌引起的感染。可采用下列方法诊断幽门螺杆菌感染显微镜检查、微生物培养或胃粘膜的活组织检查中脲酶的测定、脲口臭试验(ureabreath test)或由ELISAs检测的血清中特异性抗体的存在。幽门螺杆菌感染胃粘膜,并且可能引起IgA抗体的响应,这可从胃分泌的粘液中测定。但是已发现,粘液分泌物中主要的幽门螺杆菌-特异性抗体是IgG类而不是IgA。AU-A-9067676描述了用于测定对幽门螺杆菌抗原呈特异性的、粘液分泌物中的IgG的方法。由此提出了监测哺乳动物内微生物感染的方法。相应的学术论文有Witt等人,Frontiers inMucosal Immunology 1693-696(1991)。
幽门螺杆菌〔幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori)〕阳性病人的唾液中IgG抗体的存在,业已在美国胃肠病学协会(the AmericanGastroenterological Association)的年会会议论文中引起了一定的关注。在1989年的会议论文中Czinn等人报道了这类抗体的存在之后,于1991.5的会议论文中Larsen等人得出唾液中的IgG含量是抗生素疗法中对治疗响应的实用的、非侵害性的标志。在1992.4的会议论文中,Landes等人证实了以前的观察结果并发现检测针对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的唾液IgG,是检测幽门螺杆菌阳性病人的一种简单的、非侵害性试验法,尤其是对于那些不能用其它试验法的普遍的或儿科病人。
WO-A-9322682公开了一种方便而可靠的幽门螺杆菌体外试验的方法,该试验法利用一种抗原制剂与待测哺乳动物的粘液分泌物中的IgG抗体反应。
然而,将唾液用于这类诊断法也有其伴随的问题这些诊断方法通常凭借唾液试样与结合在膜或衬垫或其它类似材料上的抗原接触,因此唾液在这类器材上的流动性是该试验的关键因素。还有,预定的流过时间对于提供准确而有意义的结果也很重要。但是,由于唾液的复杂性、并且特别是由于微粒及粘蛋白的存在,致使各唾液试样受各种内、外因素变化的显著影响。
唾液中存在的微粒可以只是沉积于膜表面而粘附到膜上并减少流动时间。粘蛋白具有粘弹性质因而会导致凝胶状基质沉积于膜上,从而降低液体的流动性。唾液的流过时间应该是下列两种要求之间的平衡一种要求是IgG与抗原的准确结合,它意味着流过时间不能太快,另一种要求是该试验法应是实用的,即流过时间不能太慢。微粒及粘蛋白附着在粘附有抗原的任何膜或衬垫的表面会导致流过时间的大为减少。
与粘蛋白及微粒在膜表面的沉积相关的进一步的问题涉及信号的展开(signal development)。信号展开的一个优选的方法是应用IgG-胶体金缀合物,它会被沉积物截留,这样就会导致假阳性结果。更糟糕的情况是,缀合物不能自由通过,整个膜就可能粘附缀合物。
从理论上说来是可以除去粘蛋白,但所需的试剂及固相介质使该方法不能在商业上被接受。因此需要一种可供选择的、更为经济的方法来减少沉积作用从而改善流过时间。
目前可以用被称为Omnisal的体系处理唾液,在该体系中唾液被收集到棉垫片上,然后用一种缓冲溶液将其提取并用一个多孔塑料滤器将其过滤。但是,这样得到的液体仍然流动性差。
现在我们惊异地发现通过改变唾液试样的性质例如粘弹性质,则其流过的时间可得以改善,从而使试验法更准确、更灵敏。它无需除去例如唾液中存在的粘蛋白,而只是改变其性质。
于是,本发明提出改善唾液的流动特性的一种方法,该方法包括改变唾液试样的性质的步骤。特别地,本发明涉及改变唾液的粘弹性质。
在本发明的一个优选的实施方案中,唾液的性质是通过将唾液流经过滤介质而得以改变的,所述过滤介质能达到这种效果。优选的过滤介质包括活性炭、DEAE-SepHarose以及硅藻土如Celite,其中硅藻土是最优选的。该过滤介质除去了微粒。机械切变、除去高分子量凝聚物及类脂会破坏粘蛋白的聚合结构,导致流动特性的改善。
但存在的粘蛋白未被该方法除去,其聚合结构可能被改变了,因此流动特性得以改善。
在本发明的第二个实施方案中,通过加入去污剂和调节唾液试样的离子强度和/或pH可以控制唾液试样的性质。通过把唾液试样通过适当的缓冲溶液而达此目的。当然,如果唾液的性质按该方法来调节,它通常还包括一个单独的过滤步骤以除去微粒物质。
因此,在本发明的一个特别优选的实施方案中,不但唾液试样流经过滤介质后改变了唾液的性质,而且通过将其流经适当的缓冲溶液而使其pH和/或离子强度得以调节以及去污剂得以被加入。
本发明的方法尤其适用于唾液中特异性抗体的快速诊断试验。因此,本发明的进一步方面是提出一种测定唾液试样中的抗体的方法,该方法包括改变唾液的性质例如粘弹性质而改善其流动特性的步骤。如文中所述,可通过过滤和/或缓冲溶液操作来达到此目的。
该试验法优选地是用于测定幽门螺杆菌特异性抗体、通常是IgG。
这种诊断方法的实施通常是利用一个诊断盒,其中有一张粘附有抗原的膜或垫片。因此,本发明的更进一步方面是提出用于检测唾液试样中的抗体的一种诊断盒,它包括改变唾液试样的性质例如粘弹性质的工具,那些工具以过滤材料和/或缓冲溶液的形式被提供,在应用于试验区之前,上述工具之一或二者能改变唾液试样的流动性。
现在可参照下述实施例来阐述本发明,但无论如何也不能认为下述实施例限制本发明。
实施例参照的图有

图1显示有或没有Celite过滤步骤时唾液的流动时间;图2显示有或没有Celite过滤步骤时IgG金缀合物的流动时间。
实施例利用Omnisal(Saliva Diaghostic Systems,Lnc.,11719 NE 95thStreet,Vancouver,WA 98682,USA)唾液收集及处理体系收集一些人的唾液样本。只是要用下述缓冲液提取唾液20mM pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液,其中含有0.5%v/v吐温60、125mM NaCl、10mM叠氮化钠及0.1%w/w BSA。
用Omnisal滤器或用Celite将唾液滤入缓冲液而被提取。然后取1ml所得溶液置于Helisal快速试验卡上,该卡含用抗原作点状标记的膜。接着记录流过时间。在唾液流过后,加入1ml IgG-金缀合物并记录流过时间。测得结果如表所示。

讨论图1和2通过图示反映上述数据。从中可清楚地看出以下两点i)经处理步骤处理过的唾液试样本身及IgG-金缀合物的流过时间均缩短了;ii)此外,两种场合中试样间的流过时间的差异大为减小了。
经上述处理过的试样还显示因IgG-金的截留而出现的背景色的显著减少,因此一些假阳性结果的数量得以大为减少。
权利要求书按照条约第19条的修改1.一种改善唾液的流动特性的方法,它包括使唾液流过活性炭、DEAE-Sepharose或硅藻土过滤介质的步骤,从而改变唾液的性质。
2.权利要求1所要求的方法,其中唾液的粘弹性质被改变了。
3.权利要求2所要求的方法,其中的过滤介质是Celite。
4.改善唾液的流动特性的方法,它包括控制唾液的pH和/或离子强度及加入去污剂的步骤。
5.权利要求6所要求的方法,其中的唾液试样还进行权利要求1~3中任一项规定的过滤步骤。
6.一种检测唾液试样中的抗体的方法,它包括利用权利要求1~5中任一项规定的方法来改变唾液的性质以改善其流动特性。
7.权利要求6所要求的方法,其中的抗体是幽门螺杆菌特异性抗体。
8.权利要求7所要求的方法,其中的幽门螺杆菌特异性抗体是IgG。
9.用于检测唾液试样中的抗体的一种诊断盒,它包括活性炭、DEAE-Sepharose或硅藻土过滤介质以改变唾液的性质从而改善其流动特性。
10.权利要求9所要求的诊断盒,其中的过滤介质是Celite。
11.权利要求9或权利要求10所要求的诊断盒,其中的诊断盒进一步包括一种缓冲液和/或去污剂。
权利要求
1.一种改善唾液的流动特性的方法,该方法包括改变唾液的性质的步骤。
2.权利要求1中所要求的方法,其中唾液的粘弹性质被改变了。
3.权利要求1或权利要求2中所要求的方法,其中是通过使唾液流过过滤介质而改变唾液的性质。
4.权利要求3中所要求的方法,其中的过滤介质是活性炭、DEAE-Sepharose或硅藻土。
5.权利要求4中所要求的方法,其中的过滤介质是Celite。
6.一种改善唾液的流动特性的方法,该方法包括控制唾液的pH和/或离子强度及加入去污剂的步骤。
7.权利要求6中所要求的方法,其中的唾液试样还进行权利要求3~5中任一项规定的过滤步骤。
8.一种测定唾液试样中的抗体的方法,该方法包括改变唾液的性质以改善其流动特性的步骤。
9.权利要求8所要求的方法,该方法用权利要求2~7中任一项或多项的特征进行了改正。
10.权利要求9所要求的方法,其中的抗体是幽门螺杆菌特异性抗体。
11.权利要求10所要求的方法,其中的幽门螺杆菌特异性抗体是IgG。
12.用于检测唾液试样中的抗体的一种诊断盒,它包括改变唾液的性质以改善其流动特性的工具。
13.权利要求12所要求的诊断盒,其中的工具包括一种过滤介质。
14.权利要求13所要求的诊断盒,其中的过滤介质是硅藻土。
15.权利要求14所要求的诊断盒,其中的硅藻土是Celite。
16.权利要求12~15中任一项所要求的诊断盒,其中该诊断盒进一步包括一种缓冲液和/或去污剂。
全文摘要
一种改善唾液流动特性的方法,该方法包括改变唾液的性质的步骤。该方法最好还包括一个过滤步骤和/或改变唾液的pH/离子强度,以及加入去污剂。
文档编号G01N33/569GK1164278SQ95196260
公开日1997年11月5日 申请日期1995年11月14日 优先权日1995年11月14日
发明者K·琵克, C·J·史密斯 申请人:科特克斯有限公司
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