专利名称：基于检测谷光甘肽s转移酶的一种或多种同功酶来评估器官状态的快速测定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种为了评估器官状态而检测和/或测定谷光甘肽S转移酶(GSTs)的快速测定法。
GSTs是一类蛋白质的多基因家族，主要由α、μ、θ和π类异物体(isoform)组成，主要通过与谷光甘肽结合来负责异体生物学(xenobiotics)的一定范围内的解毒。αGST是主要的肝型同功酶，并均匀地在肝中分布。相反，πGST却主要分布于胆管内的上皮细胞中。在肾中亦存在着一种类似的独特分布情形，即αGST分布在肾单位的近端小管处，πGST分布在肾单位的远端小管区域。因此可得出结论测定血浆中或尿中的GST水平都将有助于监测个体的肝或肾的状态。事实上，许多学者已经运用GST的测定值来评价个体的肝和肾的损伤情况，所述的个体或者进行了器官移植手术，或者由于接触了肝或肾毒素而使器官受到了损害(参见，例如，Trull，A.K.等人，“移植”(1994)58，1345-1351)。
目前，这种测定通常采用放射免疫测定法(RIA)来进行。然而，最近已可从市面上购得由Biotrin International Limited，Mount Merrion，County Dublin，Ireland出品的基于微滴定板的酶免疫测定试剂(EIAs)，该试剂可测定生物液体中的α和πGST水平。尽管起始时有些人抱有怀疑的态度，然而这些EIAs正被科研机构广泛地接受(c.f.Beckett，G.J.和Hayes，J.D.临床化学进展(1993)30，325页)。因此，当前RIA成了一种本领域内许多技术人员选择采用的检测方法。到目前为止，这两种技术均有一定的局限性，因为它们都要求有专门的设备和训练有素的有能力的人，来得到有意义的和精确的结果。这些测定法相对较慢，从开始到结束平均需要2小时或更长。所以，需要更加快速地测定GSTs的测定法。
由于时间分辨免疫测定法(TR-IFMA)的使用，说明GST同功酶检测法正趋于变得越来越复杂。Tiainen，P等人(临床化学(1996)42 2，334-335)对αGST的酶免疫测定法(EIA)和TR-IFMA测定法做了比较。EIA所采用的是Hepkit(Biotrin International公司的商标)。发现在内部测定的精确性方面，Hepkit要比TR-IFMA好些。而且，还言道TR-IFMA比Hepkit更费力一些，因为TR-IFMA需要较多的重复(4个)及更多的洗涤循环来完成测定步骤。因此，很明显，当前GST的检测与定量的研究已聚焦在较为错综复杂的检测系统的TR-IFMA的发展上面来。
那些进行了器官移植手术的人或那些由于接触了肝或肾毒素而使器官遭到损害的人必须受到仔细的监测。对于那些进行了器官移植的个体和那些用免疫抑制药物(特别是环孢菌素)进行了移植后长期治疗的个体尤其应该如此。一旦这些个体出院后，必须对他们不断地监测，目前这种监测还需患者经常返回到相应的医疗单位，以便进行必要的GST和其它测定。所以，这些患者能有一套自我监测装置则是最希望不过的了，这样患者可减少去医院的次数，更重要的是，还可向患者和医生发出需要治疗的早期信号，即当发现GST的水平高于正常值时。
因此，可对血浆、尿和其它生物学液体如胆汁进行GST的快速而简单检测的方法将具有明显的优点，因为它使医生无需求助于医院内的费时费钱的试验就能监测受影响个体的肝或肾的状态。
需要快速测定操作的另一领域是在移植前评价器官或进行活体外试验。目前，还没有人们普遍接受的对供体器官在移入受体前进行评估的方法。结果，如同通过供体器官的起初质量来判断一样，不可能确切地预测到移植手术的最终结果。任何在移植前有助于对供体器官做出评估的方法都会极大地有助于手术最后结果的评价，并可使医生采取移植后支持疗法对患者进行较早的治疗，以防止移植体由于质量差或宿主排斥而产生损失。
作为正常器官恢复步骤的一部分，一旦供体器官被取出到器官供体体外，要用特殊的试剂(如Wisconsin大学缓冲液)平衡或灌注所述的供体器官。这种试剂及其它的此类试剂所起的作用是，在器官植入受体之前于低温下(4-10℃)在体外维持器官的完整性，并且还用来在进行手术重新使供体器官与受体附着前，将贮存的器官平衡到体温(37℃)。供体器官的质量明显依赖于许多因素如供体的健康状况、在活体外贮存的时间和温度、处理步骤、以及所用防腐试剂的质量。因此，由上述任何因素所引起的活体外移植体的损害可通过评估器官的酶渗漏而得到监测。
快速测定操作法是已知的。例如，EP 0291 194B1描述并权利要求了一种分析试验装置及使用所述装置的分析方法，该装置适于在家庭、诊所或诊疗所内使用，而且该装置能给出分析性的结果，它出结果快并只需要最低程度的技能及对用户的连累程度最低。该装置被指出特别适于用作妊娠检验装置。没有专门提到GSTs。孕妇体内的标志激素如人绒毛膜促性腺激素(HCG)的水平趋于以较高的浓度存在，因而与上文所述的那些类型的患者的GSTs水平相比更容易检测到，但GSTs水平的升高对他们而言却是至关重要的，或者，事实上是表示生命受到潜在威胁的临床指标。
采用酶活性测定法来区分GSTs的异构体的困难在文献中有充分的报道(BeckettG.J.和Hayes，J.P.(1993)文献号同上文所述)。如上文所述，其它研究者已采用RIA(Howie，A.F.等人(Chinica ChimicaActa)(1989)1984，269-278)和TR-IFMA(Tiainen，P.和Karhi，K.K.Clin.Chem.(1994)40-2，184-189)来检测GST。所有的这些技术均是检测生物分子的极为敏感的技术。然而，各项技术均需要专门的仪器和技术人员。例如，TR-IFMA需要采用特殊的时间分辨(time-resolved)荧光计。
人们需要一项适于非专家所用的技术，或是一项在紧急情况下能快速且容易使用的技术。紧急情况的例子是移植后的肝损害或肾损害或是由于扑热息痛过量引起的潜在肝衰竭。
因此，本发明提供了快速评估测试对象的器官状态的方法，该方法基于多种生物液体内的谷光甘肽S-转移酶(GST)的一种或多种同功酶的检测，该方法包括使颗粒标记的对所述同功酶特异的抗-GST抗体与怀疑含有所述同功酶的生物液体样品接触，所述抗体灵敏得足以检测到皮摩尔量的所述同功酶，以及将颗粒标记的抗体一同功酶复合物捕获到固定的捕获抗体上，以便产生视觉可检测到的信号。
在此处的术语“快速”是指GST同功酶的检测或测定，从与颗粒标记的抗-GST接触时开始算，一般在30分钟的时间内完成。
本文的术语“器官状态”包括免疫学或毒理学危害后的器官损害。
对本领域的普通技术人员而言，本发明的主要优点显然在于它的简单性，该方法可被几乎没有或根本未受过科学训练的人采用，来监测他们自身的健康状况和/或在上文所述的紧急情形下快速地提供信息。
还将认识到的是进行测定操作或结果评价和解释无需错综复杂的设备或详细的试验程序。操作和结果评估的这种简单性明显不同于当前的GST检测步骤。
优选的所述的GST是肝或肾源的αGST、πGST或μGST。
最优选的所述的GST是肝或肾源的αGST或πGST。
任何快速测定GST的测定法的特别要求是抗体对GST具有必需的亲和性。
对于αGST，已经制备出能检测出浓度低至6.5ng/ml的αGST的多克隆抗体(如下文所述)，该抗体是本方法全部敏感性的主要原因。
根据本发明，抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，通常优选采用具有可检测出浓度低至5ng/ml的GST同功酶亲和性的抗体。
适于与固相结合的抗-GST抗体是多克隆抗体，特别优选的是多克隆IgG。然而，在某些情况如在测定πGST的情况下，固相抗体优选单克隆抗体。
所述的抗-GST抗体可适当地结合到已知类型的硝酸纤维素膜上，如那些可从德国的Schleicher和Schuell GmbH得到的硝酸纤维素膜。这种膜具有结合蛋白(包括免疫球蛋白)的天然能力。然而，应认识到的是，各种各样已知的固相支持物就其本身而论，都可用作捕获抗体的支持物。此处所说的支持物通常是指固相的。
适宜的硝酸纤维素膜具有的孔大小在5-10μm的范围内。
如下文所述，根据所采用的测定方式，选择性地对硝酸纤维素膜上的非特异性结合位点进行封闭。通过利用蛋白质如牛血清白蛋白或牛奶蛋白或用聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，用已知的方式进行处理，可适当地实现非特异性结合位点的封闭。
所述的固相支持物可具有各种各样的构造，并可包括上文所述的EP 0291 194B1所披露的那种装置，只要所用的抗-GST抗体具有必需的特异性就行。
本文所用的术语“抗-GST抗体的特异性”是指该抗体对相应GST的亲和性。该亲和性以可检测出的被分析物的浓度来表示，而不是以较为理论性的术语如给定浓度下的特异亲合性Ka来表示。
可将所述的固相支持物装在塑料的盒子中，并可在一端或两端装上芯(wick)，以便易于免疫测定的组分的色谱运动。
用在根据本发明方法中的适当的生物液体是胆汁、血浆、血清或尿，较为优选的是血浆、血清或尿。
可对所述的生物液体进行稀释或不加以稀释(用其本体)。
所述的生物液体也可是灌注液，因此根据本发明的方法可在移植前或离体试验中用来评价器官。
如上所述，还没有已被普遍接受的用来评价供体器官的方法存在。我们已经表明采用本发明的方法，快速地检测灌注液内的GST作为离体器官状态的标志是可能的。在这种情况下，检测的快速性是重要的，因为此时供体器官正在遭受单方向且经常的离体低氧，该低氧会最终导致不可逆转的损害，因而使该供体器官不能再用于移植。因此，可用来估测器官的任何试验对医生而言，都应极为便利。
将所述的生物液体与颗粒标记的抗-GST抗体接触，以便使待检测的GST同功酶在与被固相固定化的抗体接触之前，与所述的颗粒标记的抗-GST抗体结合。可用作标记物的颗粒包括胶体颗粒、乳胶颗粒和金属溶胶颗粒。适当的金属溶胶颗粒是平均直径为15-40nm的金颗粒。所述的金颗粒可自市售购得，例如，由Janssen Life Sciences Products公司投放市场。
根据本发明，还可将颗粒标记的抗-GST抗体置于将要与生物液体接触的任何装置的加样端附近。
颗粒标记的抗—GST抗体的使用意味着不包括(信号)放大步骤。所以，在用颗粒标记的抗—GST抗体检测GST同功酶的情形中，在上文所述的情况下，利用颗粒标记的抗体检测抗原，检测可简单地基于直接的抗体—抗原相互作用或伴有视觉好处的相互使用。
这就是更加令人惊奇之处，因为即使包括了提高检测敏感性的放大系统，从文献来看，关于用EIAs来检测GST，在科学领域明显地一直存在着一些怀疑。
当采用的抗体是颗粒标记的抗一GST IgG时，特别优选在固相支持物两端的任一端设有芯(如上文所述)，因为这有助于被标记IgG的色谱运动。例如，在硝酸纤维素膜的情况下，在膜的加样端及膜的顶端各设有一个芯，则有助于金标记的IgG在喷洒到膜上之前的色谱运动。而且，在固定到膜上的抗—GST IgG上包括纯化的GST，将对金标记的抗—GST IgG结合作用起到内部/操作对照的作用。
在此实施方案中，将金标记的抗—GST IgG重新悬浮在生物样品的液体中，并且存在的任何GST同功酶均被金标记的IgG结合了。由于上面的芯的吸引作用，该复合物然后沿着膜迁移或向上迁移。如果有足够的GST同功酶存在，那么GST/金标记的抗—GST IgG复合物则被固定到结合了抗—GST IgG的膜处。此种阳性信号结果表明有GST存在于样品中。过量的金标记的抗—GST IgG结合物将结合到膜上的步骤对照点(GST)上。
还将认识到的是，当利用颗粒标记的抗体来结合生物样品中的抗原时，所结合的GST的测定可在一步内完成，可将该步骤描述成“一壶”测验。
本发明还提供了用于完成上文所述定义的GST检测法的试剂盒，该盒包含对本文所述的GST同功酶特异的抗—GST抗体。
本文所述的测定方式主要在两方面不同于前面提到的EIA和RIA型免疫测定法。首先，检测抗原的顺序不同，到目前为止，在根据本发明的方法中，抗原首先与颗粒标记的抗体(PLA)结合，然后该抗原—PLA复合物再被固定化的捕获抗体捕获，以此产生阳性信号。因此，不需要任何中间步骤如洗膜以除去未结合的材料(如其它的尿、血、灌注液组分)或者加入任何放大试剂以便于检测所结合的抗原—PLA复合物。事实上，该复合物是“自我检测”。
此种情况与目前的GST免疫检测法(EIA/RIA)形成了明显的对照，在EIA/RIA中，抗原首先与固定化的捕获抗体接触，经过了多次的洗涤步骤来除去未结合的/干扰组分之后，将抗体结合物(抗体—酶或放射活性标记的抗体)加入到抗原—抗体复合物中，以检测所结合的抗体的存在。在使用抗体—酶结合物的情况下，必须加入另外的试剂—底物，通过有色产物的出现检测所结合的酶。
酶免疫和放射免疫测定法两者都需要昂贵且复杂的设备，以使科学家或试验室技术人员来阐释试验数据的重要性。当采用根据本发明的快速测定法来进行GST的免疫检测时，最终结果可简单地由色(带)的有无来显示，并可容易地非作专家阐明。
根据本发明的方法和已知测定系统之间的第二主要方面的区别已经在上面提及了，即此方面的中心在于本发明的测定法不需要将信号放大，从而有助于GST的免疫检测。事实上，根据本发明，快速检测GST所需的检测灵敏性是该测定法所固有的。除了颗粒标记的抗体和捕获抗体之外，不再需要另外的放大试剂。进行GST免疫检测的其它技术均采用了一些信号放大法，包括产生有色产物的酶学法(EIA)、采用Eu3+标记抗体的荧光增强法(TR-IFMA)和与原子核粒子放射有关的广泛的信号放大法(即，放射活性检测法)(RIA)。
图1是根据本发明采用金标记的抗—αGST IgG和结合有抗—αGST IgG的膜进行测定的快速测定法示意图，所述测定法如实施例2和3所述；以及图2是根据本发明采用金标记的抗—αGST IgG和结合有抗—αGST IgG的膜进行测定的快速测定法的示意图，所述测定法如实施例4所述。
参照下列实施例，将对本发明做进一步的描述。
实施例1
αGST的纯化和用纯化的αGST产生抗血清αGST的纯化验尸时获取人肝。将113.2g肝加入到400ml pH为7.2的均化缓冲液中，然后在Warning搅拌器(Warning是商标)中于4℃进行细胞破碎2分钟，来完成肝的均化，所述的均化缓冲液的组成如下10mM磷酸钠250mM庶糖lmM EDTA使所得的匀浆以l1,500g离心10分钟，此后移出上清液并以48,000g再次离心45分钟。用20mM Tris-HCl(pH 7.8)于4℃对最终所得的上清液(380ml)进行彻底透析。一旦透析完成，将透析液加到S-己基GSH琼脂糖(Sepharose)亲和柱上。αGST特异性地与该柱结合，并用0.3mM的S-己基GSH来洗脱。
然后如下进行质量对照的检查1.通过SDS-PAGE，发现如此纯化的αGST是纯的。
2.纯化的αGST与抗-αGST抗血清起反应，而不与抗-π或抗-μGST抗血清起反应。
3.等电聚焦显示出在pI(等电点)为8.5和7.8处的两条带。纯化的B1B1(αGST)为在pI 8.5处的一条带。因此，推测pI为7.8的那条带可能是含有αGST的二聚体的B2带。针对人αGST的抗血清的制备采用下列程序，用兔子(内部I.D.Syncor G和H)在如下所示的时间内进行针对人αGST的抗血清的制备第1天采集试验血样，自兔耳采集5ml血(免前血清)，然后将0.5ml的人αGST抗原(100μg)和等体积的Freund氏完全佐剂混合。均化所述的抗原和佐剂，以确保较好的乳化。然后将此混合物皮下注射到兔背的多个位点，所述的位点是预先刮过毛的。
第28天采集试验血样，自兔耳采集5ml血(免前血清)，然后将0.5ml的人αGST抗原(100μg)和等体积的Freund氏完全佐剂混合。均化该抗原和佐剂以确保较好的乳化。然后将该混合物皮下注射到兔背的多个位点内。
第42天自兔耳采集10ml的试验血样。
第56天如第28天所述，对兔子进行第二次免疫加强注射。
第70天自兔耳采集10ml的试验血样。当滴度足够高时，处死兔子并尽可能多地采集血液。
抗体纯化将10ml的抗血清(兔子的)加到10ml的蛋白质A琼脂糖柱上，该柱是事先用磷酸盐缓冲液(PBS)平衡过的。兔IgG(总的)结合到蛋白质A上，并用0.1M的甘氨酸(pH 3.0)洗脱。通过SDS-PAGE确定其纯度，并且通过微滴定板包被、圆点印迹和韦斯特(Western)印迹分析以及与辣根过氧化物酶(HRP)的直接结合来确定其官能度(抗-GST的活性)。
在微滴定板包被中，所用的抗-αGST的浓度为1μg/ml，溶在0.1M pH为9.6的碳酸钠缓冲液中。
在αGST检测范围为0-50ng/ml的酶免疫测定法中所用的抗-αGST IgG-HRP结合物的浓度为77ng/ml。该结果表明该抗体的敏感性高，因为对其它兔IgG-HRP结合物而言，进行此种酶免疫测定(例如，商标为Mukit由Biotrin International Limited公司，Mount Merriton，CountyDublin，Ireland投放市场的EIA和其它公司的EIA)一般所需的浓度大于700-7,000ng/ml。
实施例2基于颗粒的αGST的测定1.将抗-αGST IgG(溶于PBS中，0.5mg/ml)直线喷涂到硝酸纤维素膜条(3mm×8cm)上。在膜的制备过程中不包括封闭步骤。然而，包括这样的步骤会有助于带的稳定性并可减少非特异性结合。
2.用金颗粒(直径为15-40nm)标记抗-αGST抗体，所述金颗粒和抗体由订立了合同的生产商供给，并将标记过的抗-αGST抗体贮存于0.1％(W/V)的叠氮化钠中(以2mM pH 7.2的四硼酸钠为稀释剂)。测定步骤1.采用下列稀释剂1％(W/V)牛血清白蛋白1％(W/V)吐温-20溶在PBS中，pH 7.2将含αGST的样品与给定体积的金标记的抗-αGST IgG混合，并进行下文所述的试验。
2.将硝酸纤维素膜(预先用抗-αGST IgG包被过)(1-3mm宽)浸入上述的混合物中，并在原位停留3-5分钟。试验步骤对下述样品(样品编号为1-5)进行快速测定样品1 25μg/ml(25mg/l)的αGST。
样品2三个具有已知αGST浓度的稀释尿样在进行1/5稀释前分别为a)6.01，b)18.34和c)1.03ng/ml。
样品3稀释剂本身。
样品4πGST。
样品5 50ng/l(50μg/l)的αGST.结果样品1.25μg/ml的溶液获得了信号，这表明即使在高于正常尿αGST水平1000倍的含量时，也没观察到“勾状效应”(假阳性)。
样品2a-2c.在所有的3个尿样中(用稀释缓冲液按1/5进行了稀释)，均检测到有αGST的存在，而且三位不同的观察观察到信号的强度与起始的αGST浓度成比例。
样品3.在快速测定法中，对稀释剂本身的试验未观察到信号。
样品4.未观察到信号。
样品5.在测定中，该溶液给出了清晰可辨的信号。
实施例3基于颗粒的αGST测定1.将抗-αGST IgG(鼠源单克隆；1mg/ml的PBS溶液)固定到硝酸纤维素膜条(0.5×4cm)上。
2.通过在2％的(w/v)无脂牛奶溶液和2％(w/v)的聚乙烯吡咯烷酮溶液(pH 7.4，溶剂为Tris缓冲盐水，含有0.5％(w/v)的吐温20)中，将上述的纤维素膜条于室温温育30分钟，来封闭之。
3.用蒸馏水漂洗该纤维素膜条，并在室温下干燥1小时。
4.用金颗粒(直径为40nm)标记抗α-GST抗体，所述金颗粒和抗体由订立了合同的生产商提供，将标记过的抗体贮存于0.1％(w/v)的叠氮化钠中，所述的叠氮化钠溶液以pH 7.2的0.2mM的四硼酸钠为稀释剂。测定步骤1.用Tris缓冲盐水(pH 7.4，含0.5％(w/v)的吐温20)作稀释剂，将含αGST的样品与给定体积的金标记的抗-αGST IgG混合。
2.将预先用抗-αGST IgG包被过的硝酸纤维素膜条浸入上述的混合物中，并在原位停留5分钟以上。试验步骤对下列样品进行快速测定样品1250ng/ml的αGST。
样品2稀释剂本身结果样品1在测定中得到了清晰可辨的信号。
样品2在测定中，当仅对稀释剂进行试验时，没有得到信号。
实施例2和3的技术原理以及结果阐释金标记的抗-αGST IgG向膜的上方迁移。如果αGST存在于混合物中，金标记的IgG/αGST复合物则结合到固定在膜上的抗-αGST IgG上，形成粉红色的直线(沉淀线)。如果混合物中没有αGST，那么金标记的抗-αGST IgG色谱迁移到膜的顶端，并且观察不到直线(沉淀线)。
结合图1，再对此技术加以阐述。在图1中，硝酸纤维素膜条以10表示，图中显示该膜条正被浸入生物液体样品中，该样品被盛于含有金标记的抗-αGST IgG的容器11中。固定有抗-αGST IgG的一条带(1-3mm)以点状轮廓线示出，以12表示。样品在硝酸纤维素膜10上移动的方向用箭头表示。金标记的抗-αGST IgG结合αGST(如果存在的话)，并向膜的上方迁移，并在12处被所固定的IgG捕获。硝酸纤维素膜10与样品保持接触3-5分钟，然后将之移出，如纤维素膜条A和B所示。如果αGST存在(阳性结果)，如条A所示，就可观察到粉红色的线(沉淀素线)。如果没有αGST存在(阴性结果)，如条B所示，在12处就不会形成粉红色的线。图1中所画的纯属说明性的，而在商售的产品中，金标记的抗-αGST(作为移动相)可在硝酸纤维膜的加样端13附近提供。
该快速测定法的特别的优点是显然的，因为在整个操作过程中只包括一个步骤。然而，应认识到的是，根据本发明的快速测定法较传统的基于微量滴定板的免疫测定法有显著的进步。
实施例4基于颗粒的αGST测定1.将抗-αGST IgG(鼠的单克隆；1mg/ml的PBS溶液)固定到距硝酸纤维素膜条(0.5×4cm)的顶端大约1cm的地方。
2.通过在2％的(w/v)无脂牛奶溶液和2％(w/v)的聚乙烯吡咯烷酮溶液(pH 7.4，溶剂为Tris缓冲盐水，含有0.5％(w/v)的吐温20)中，将上述的纤维素膜条于室温温育30分钟，来封闭之。
3.用蒸馏水漂洗该纤维素膜条，并在室温下干燥1小时。
4.用金颗粒(直径为40nm)标记抗α-GST抗体，所述金颗粒和抗体由订立了合同的生产商提供，将标记过的抗体贮存于0.1％(w/v)的叠氮化钠中，所述的叠氮化钠溶液以pH 7.2的0.2mM的四硼酸钠为稀释剂。
5.将金标记的抗-αGST的抗体施加到硝酸纤维素膜条上距该条顶端约3cm的地方。在施加该金标记的抗体之前，在该膜条的此区域先上一底层30％(w/v)的庶糖(溶于蒸馏水中)。测定步骤1.将含αGST的样品施加到硝酸纤维素膜条上。试验步骤对下列样品进行快速测定样品1250ng/ml的αGST，采用Tris缓冲盐水(pH 7.4，含有0.5％(w/v)吐温20)作稀释剂。
样品225ng/ml的αGST，采Tris缓冲盐水(pH 7.4，含有0.5％(w/v)吐温20)作稀释剂。
样品3稀释剂本身。
样品4两个αGST的浓度已知的稀释灌注液样品，在进行1/20前，浓度分别为a)6716和b)29295ng/ml。
样品5三个αGST的浓度已知的稀释血清样品，在进行1/20的稀释前，其浓度为(a)26.62(b)119.34和c)251.86ng/ml。
样品6αGST的浓度已知的三个稀释胆汁样品，进行1/20的稀释前，其浓度为(a)7.26(b)31.93和(c)68.12ng/ml。
样品7已知在进行1/20的稀释前，αGST的浓度为88.07ng/ml的稀释尿样。结果样品1在测定中，得到了清晰可辨的检测信号。
样品2在测定中，得到了清晰可辨的检测信号。
样品3在测定中，当对稀释剂本身进行试验时，没有得到信号。
样品4在两个灌注液样品中均检测到了有αGST的存在。
样品5当对含有26.62ng/mlαGST(在1/20稀释前)的血清样品进行试验时，没有得到信号，这表明该测定法不能检测出相当于正常血清水平的αGST。在含119.34和251.81ng/mlαGST的样品(在1/20稀释前)中检测到了αGST的存在。
样品6当对含7.26和31.93ng/ml αGST(在1/20稀释前)的胆汁样品进行测试时，没有得到信号，这表明该测定法检测不到这些水平的αGST。
在含68.12ng/ml αGST(1/20稀释前)的样品中检测出有αGST的存在。
样品7在尿样中检测到有αGST的存在。
实施例4的技术原理及结果阐释在受试样品沿着硝酸纤维素膜条迁移的时候，它与该膜条上的金标记的抗-αGST抗体混合。如果样品里有αGST存在，该金标记的抗α-GST抗体就与αGST结合，形成抗体—抗原复合物，这种复合物沿着膜条迁移，并与固定在该膜条上的抗-αGST IgG结合，并产生粉红色的直线。如果样品内不含αGST，那么被标记的抗-αGST抗体就迁移到膜条的顶端，并且观察不到直线的出现。
参照图2，对该技术加以说明。硝酸纤维素膜条如20表示；在其端部21附近是带有金标记的抗-αGST抗体的带22。在该膜条20的上游是带状的带有固定化的抗-αGST IgG的区域23。将样品加到端部21处，样品沿着膜条向端部24方向迁移。在迁移过程中，样品在22处与金标记的抗-αGST抗体混合，而αGST(如果样品内含有的话)则与金标记的抗体结合，形成抗体—抗原复合物。该复合物与固定在23处的抗-αGST IgG结合，并产生粉红色的直线。如果样品内不含αGST，在23处则没有粉红色的直线形成。
实施例5基于颗粒的πGST测定1.将抗-πGST IgG(鼠的单克隆；0.6mg/ml的PBS溶液)点到硝酸纤维素膜条上(1μl/点＝0.6μg)。在该膜的制备过程中不包括封闭步骤，但是包括这样的步骤则有助于膜条的稳定性，并可减少非特异性的结合。
2.用金颗粒(直径为40nm)标记抗-πGST抗体(兔的多克隆抗体)，该金颗粒和抗体由订立了合同的生产商提供，然后将标记过的抗体贮存于0.1％(w/v)的叠氮化钠溶液中，该溶液以2mMpH 7.2的四硼酸钠为稀释剂。测定步骤1.将含πGST的样品(各10μl，1-500μg/ml)与给定体积(50μ1)的金标记的抗-πGST IgG和140μl的下列稀释剂混合1％(w/v)牛血清白蛋白1％(w/v)吐温20均溶于PBS中，pH 7.2，并进行下文所述的试验。
2.将预先用抗-πGST IgG(0.6μl/点)包被过的硝酸纤维素膜浸到上述混合物中，并在其中停留3-15分钟。试验步骤对下列样品进行快速测定样品1-4缓冲液内仅含πGST样品5仅含缓冲液；以及样品6-15如表1所列，为含πGST的尿、胆汁和血浆。
样品7和8(尿)以及样品12和13(血浆)中掺有纯化的πGST。然而胆汁样品含有疏忽的(inate)πGST。
表1样品编号起始浓度最终浓度 存在的量(ng/ml)(ng/ml) (ng5)1 500,00025,000 50002 50,000 2,500 5003 5,000 250 504 1,000 50 105 0 0 06(尿) 30 1.5 0.37(尿) 1000 50 108(尿) 5000 250 509(胆汁) 1507.5 1.510(胆汁)＞5000 ＞250 ＞5011(胆汁)3730186.5 37.212(血浆)100050 1013(血浆)5000250 5014(血浆)*1000250 5015(血浆)120 6 1.2*(50μl+样品+50μl金标记的抗-πGST IgG和100μl稀释剂)结果结果被列于表2。
表2样品编号结果样品1 阳性样品2 阳性样品3 阳性样品4 阳性样品5 阴性样品6 阴性样品7 阳性样品8 阳性样品9 阴性样品10 阳性样品11 阳性样品12 阳性样品13 阳性样品14 阳性样品15 阴性从上面的结果可看出，在尿、胆汁和血浆样品中可检测出πGST。看来该测定法的灵敏度在50ng/ml左右，但测定的最适条件可能会提高该敏感性水平。然而，在生物样品(如胆汁和组织灌注介质)中已经观察到了此种水平的πGST。
发现用此测定法检测πGST必需单克隆—多克隆抗体夹心(sandwich)。然而，如果鉴定出有足够敏感性的多克隆抗体，那么可能的是该IgG将在该测定法中发挥作用(如同上文所述的测定αGST的快速测定法)。或者，单克隆/单克隆型测定也会具有足够的敏感性。
实施例6基于颗粒的πGST测定1.将抗-πGST(鼠的单克隆；0.6mg/ml的PBS溶液)固定到硝酸纤维素膜条(0.5×4cm)上。
2.通过在2％的(w/v)无脂牛奶溶液和2％(w/v)的聚乙烯吡咯烷酮溶液(pH 7.4，溶剂为Tris缓冲盐水，含有0.5％(w/v)的吐温20)中，将上述的纤维素膜条于室温温育30分钟，来封闭之。
3.用蒸馏水漂洗该纤维素膜条，并在室温下干燥1小时。
4.用金颗粒(直径为40nm)标记抗π-GST抗体，所述金颗粒和抗体由订立了合同的生产商提供，将标记过的抗体贮存于0.1％(w/v)的叠氮化钠中，所述的叠氮化钠溶液以pH 7.2的0.2mM的四硼酸钠为稀释剂。测定步骤1.用Tris缓冲盐水(pH 7.4，含0.5％(w/v)吐温20)作稀释剂，将含πGST的样品与给定体积的金标记的抗-πGST IgG混合。
2.将预先用抗-πGST IgG包被过的硝酸纤维素膜条浸入上述混合物中，并在其中停留30分钟。试验步骤对下列样品进行快速测定样品1250ng/ml的πGST。
样品2稀释剂本身。结果样品1在测定中，获得了清晰可辨的检测信号。
样品2当仅对稀释剂进行测试时，在测定中没有得到信号。
实施例5和6的技术原理和结果阐释金标记的抗-πGST IgG向膜的上方迁移。如果混合物中有πGST存在，那么该金标记的IgG/πGST复合物则与固定在膜上的抗-πGST单克隆IgG结合，形成粉红色的直线(沉淀线)。如果混合物中没有πGST存在，那么金标记的抗-πGST IgG则迁移到膜的顶端，并且观察不到直线(沉淀物)。
还应认识到的是，当与传统的基于微滴定板(或膜)的测定法相比时，本测定法代表着向前迈了明显的一步，因为在整个过程中它只包括简单的一个步骤。
实施例7基于颗粒的πGST测定1.将抗-πGST IgG(鼠的单克隆；1mg/ml的PBS溶液)固定到距硝酸纤维素膜条(0.5×4cm)的顶端大约1cm的地方。
2.通过在2％的(w/v)无脂牛奶溶液和2％(w/v)的聚乙烯吡咯烷酮溶液(pH 7.4，溶剂为Tris缓冲盐水，含有0.5％(w/v)的吐温20)中，将上述的纤维素膜条于室温温育30分钟，来封闭之。
3.用蒸馏水漂洗该纤维素膜条，并在室温下干燥1小时。
4.用金颗粒(直径为40nm)标记抗π-GST抗体，所述金颗粒和抗体由订立了合同的生产商提供，将标记过的抗体贮存于0.1％(w/v)的叠氮化钠中，所述的叠氮化钠溶液以pH 7.2的0.2mM的四硼酸钠为稀释剂。
5.将金标记的抗-πGST抗体施加到硝酸纤维素膜条上距该条顶端约3cm的地方。在施加该金标记的抗体之前，在该膜条的此区域先上一底层30％(w/v)的庶糖(溶于蒸馏水中)。测定步骤1.将含πGST的样品施加到硝酸纤维素膜条上。试验步骤对下列样品进行快速测定样品1250ng/ml的πGST，采用Tris缓冲盐水(pH 7.4，含有
0.5％(w/v)吐温20)作稀释剂。
样品225ng/ml的πGST，采Tris缓冲盐水(pH 7.4，含有0.5％(w/v)吐温20)作稀释剂。
样品3稀释剂本身。
结果样品1和2在测定中，两个样品均可获得了清晰可辨的检测信号，而且该信号的强度与πGST的浓度成比例。
样品3在对稀释剂本身进行测试的测定中没有得到信号。
实施例7的技术原理和结果阐释在受试样品沿着硝酸纤维素膜条迁移的时候，它与该膜条上的金标记的抗-πGST抗体混合。如果样品里有πGST存在，该标记的抗-πGST抗体就与πGST结合，形成抗体—抗原复合物。这种复合物与固定在膜条上的抗-πGST IgG结合，产生粉红色的直线。如果样品内不含πGST，那么被标记的抗-πGST抗体则迁移到膜条的顶端，并且观察不到直线。因此，该技术相应于在实施4中所描述的技术，并如图2所示。
权利要求
1.一种基于检测各种生物液体内的谷光甘肽S转移酶(GST)的一种或多种功酶对测试对象的器官状态进行快速评估的方法，该方法包括使颗粒标记的对所述同功酶特异的抗-GST抗体与怀疑含有所述同功酶的生物液体样品接触，以及将颗粒标记的抗体一同功酶复合物捕获到固定化的捕获抗体上，产生视觉可检测出的信号，所述的抗体具有足以将至少皮摩尔量的所述同功酶检测出的敏感性。
2.权利要求1的方法，其中GST是αGST。
3.权利要求1的方法，其中GST是πGST。
4.按照权利要求1-3中的任一权利要求所述的方法，其中所述的抗-GST抗体是多克隆抗体。
5.按照权利要求4的方法，其中所述的抗-GST抗体是具有能检测出浓度低至6.5ng/ml α-GST亲和性的抗-α GST抗体。
6.根据以上任一项权利要求所述的方法，其中所述的捕获抗体结合在硝酸纤维素膜上。
7.根据权利要求6所述的方法，其中存在于硝酸纤维素膜上的非特异结合位点是被封闭的。
8.根据以上任一权利要求所述的方法，其中生物液体被稀释。
9.根据以上任一权利要求所述的方法，其中所述的生物液体选自胆汁、血浆、血清和尿。
10.按照权利要求1-8中的任一权利要求所述的方法，其中所述的生物液体是灌注液，而且该方法用来在移植前或在活体外评价器官。
11.按照以上任一权利要求所述的方法，其中所述的颗粒是平均直径在15-40nm范围内的金颗粒。
12.完成权利要求1-11的任一项权利要求所述方法的试剂盒，该盒包含颗粒标记的抗-GST抗体，该抗体特异于GST同功酶。
全文摘要
本发明公开了一种基于物测多种生物液体内的谷光甘肽S转移酶(GST)的同功酶,快速评估受试对象的器官状态(包括免疫学或毒理学危害后的器官损害)的方法,该方法包括:使颗粒标记的特异于所述的同功酶的抗－GST抗体与怀疑含有所述同功酶的生物液体样品接触,所述的抗体具有的敏感性足以将低至皮摩尔量的所述同功酶检测出来,以及将该颗粒标记的抗体—同功酶复合物捕获到固定化的捕获抗体上,以此产生视觉可见的检测信号。该方法自开始至与所固定的抗－GST抗体接触时算,允许在30分钟的时间内完成GST同功酶的检验和测定。该方法操作简单,因此,可在(例如)家里由患者自己用来监测其进行肝或肾移植后的特定GST同功酶的水平。
文档编号G01N33/558GK1180411SQ96193068
公开日1998年4月29日 申请日期1996年4月2日 优先权日1995年4月3日
发明者约翰·马丁·多伊尔, 科马克·杰勒德·基尔蒂 申请人:拜奥特恩知识产权有限公司