端粒酶逆转录酶的制作方法

专利名称：端粒酶逆转录酶的制作方法
技术领域：
本发明提供新的端粒酶基因和蛋白质，并涉及端粒酶的催化蛋白质成分，称为端粒酶逆转录酶(“TRT”)的克隆和表征。
特别是，本发明涉及从Euplotes aediculatus分离的端粒酶，这一端粒酶的123和43千道尔顿的两个多肽亚单位，以及E.aediculatus端粒酶的裂殖酵母、其它酵母、四膜虫、其它真菌、小鼠和其它哺乳动物同系物的多肽、核酸和序列。
背景技术：
端粒酶，物理结构定位于真核生物体的末端的蛋白质DNA结构是染色体稳定所需要的，并且参与核内的染色体构成(参见例如，Zakian，科学2701601(1995)；Blackburn和Gall，分子生物学杂志，12033(1978)；Oka等人，基因10301(1980)；和Klobutcher，等人，国家科学院年报，783015(1981))。我们确信端粒在如酵母，可能大多数其它真核细胞的这样生物体中是关键，因为它们允许细胞区分完整和断裂染色体，保护染色体不受降解，并且可作为新的复制机制的底物。端粒通常以复合物，细胞周期，和发育调节的方式，由“端粒酶”，特异于端粒的DNA聚合酶复制。但是，用于端粒维持的独立于端粒酶的方式已经公开。在最近几年，更多的涉及已经集中到端粒，因为失去端粒已经与染色体变化如癌症和老化中出现的事件相关。
端粒DNA
在大多数生物体中，已经报道了端粒DNA由非常简单的序列的串联排列组成，这些序列在许多情况中是短而准确的。通常，端粒由在从5’到3’朝染色体末端排列的链中富G残基的简单重复序列组成。例如，在四膜虫中的端粒DNA是由序列T2G4组成的，而在Oxytricha中，该序列是T4G4，在人中，该序列是T2AG3(参见例如，Zakian，科学2701601(1995)；和Lingner等人，基因发展，81984(1994))。但是，在一些生物体中已经报道了异源端粒序列(例如，在酵母中的序列TG1-3)。另外，在一些生物体中，重复端粒序列更长，如乳克鲁维氏酵母的25个碱基对序列。而且，一些生物体的端粒结构是完全不同的。例如，果蝇的端粒结构是由可转座元件组成的(参见，Biessman等人，细胞61663(1990)；和F.m Sheen和Levis，美国科学院年报，9112510(1994))。
许多生物体的端粒DNA序列已经确定(参见例如，Zakian，科学2701601(1995))。但是，已经注意到，由于已知了更多的端粒序列，甚至鉴定一个疏松的共有序列叙述它们逐渐变得困难了(Zakian，出处同上)。而且，已知端粒DNA的平均数量在生物体之间是变化的。例如，小鼠的每个端粒可能具有多至150kb(千碱基)的端粒DNA，而Oxytricha大核DNA分子的端粒只有20碱基对的长度(Kipling和Cooke，自然347400(1990)；Starling等人，核酸研究，186881(1990)；和Klobutcher等人，美国科学院年报，783015(1981))。另外，在大多数生物体中，端粒DNA的数量是波动的。例如，在野生型菌株中的单个酵母端粒的端粒DNA数量可能的范围是约200碱基对到400碱基对之间，而DNA的量随机增加和降低(Shampay和Blackburn，美国科学院年报，85534(1988))。异质性和端粒长度中的自发变化可以反映端粒束的降解和加长中涉及的过程之间的复杂的平衡。另外，遗传的，营养的和其它因子可以引起端粒长度的增加或减少(Lustig和Petes，美国科学院年报，831398(1986)；和Sandell等人，细胞9112061(1994))。所有端粒DNA实质上的内在异质性表明端粒不是通过常规的复制过程维持的。
除了端粒本身，也已经研究了邻接端粒的区域。例如，在大多数生物体中，紧接在简单重复内部的亚端粒区由中等重复序列，命名为端粒相关(“TA”)DNA。这些区域具有与果蝇的转座子端粒的一些相似性。在酵母中，已经叙述了两类TA元素，命名为“X”和“Y”(Chan和Tye，细胞33563(1983))。这些元素在大多数或所有端粒中可以是单独的或结合存在的。
端粒结构蛋白与端粒DNA相互作用的各种结构蛋白已经叙述，它们明显地区别于端粒酶的蛋白质成分。这样的结构蛋白包括酵母染色体(Wright等人，基因发展，6197(1992))和纤毛虫大核DNA分子(Gottschling和Cech，细胞38501(1984)；和Blackburn和Chiou，国家科学院年报，782263(1981))的“端粒”。端粒是非核小体的，但分立的染色质结构，包括端粒重复的整个末端排列。在酵母中，邻接端粒的DNA包装进入核小体。但是，据报道这些核小体与在酵母基因组的大多数其它区域有区别，正如它们具有的特征是转录失活染色质(Wright等人，基因发展，6197(1992)；和Braunstein等人，基因发展，7592(1993))。在哺乳动物中，大多数简单重复端粒DNA包装进入紧密隔开的核小体(Makarov等人，细胞73775(1993)；和Tommerup等人，分子细胞生物学，145777(1994))。但是，在端粒状结构中存在定位于人染色体远末端的端粒重复。
端粒复制线性真核染色体的末端的完全复制存在DNA复制的常规方法的特殊问题。例如，常规DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而是它们需要RNA引物，这些RNA引物在复制过程中后期除去。在端粒的情况中，如果亲本端粒末端平齐化，从后随链末端除去RNA引物必定留下5’末端缺口，导致丢失序列(Watson，天然新生物学，239197(1972)；Olovnikov，理论生物学杂志，41181(1973))。但是，叙述的端粒具有3’突出(Klobutcher等人，国家科学，583015(1981)；Henderson和Blackburn，分子细胞生物学，9345(1989)；和Wellinger等人，细胞7251(1993))。对于这些分子，可能除去后随链5’末端RNA引物能够再生3’突出而没有丢失分子这一侧的序列。但是，将出现在引导链末端的序列信息的丢失，因为缺乏在3’突出的合成中作为模板的互补链(Zahler和Prescott，核酸研究，166953(1988)；Lingner等人，科学2691533(1995))。
但是，染色体的完全复制必定存在。当常规DNA聚合酶不能准确再生染色体DNA末端，存在特别的因子保证它们的完全复制。在这一过程中端粒酶是关键成分。端粒酶是核蛋白(RNP)颗粒和聚合酶，该酶利用它的内部RNA成分的一部分作为模板用于端粒重复DNA合成(美国专利号，5,583,016；Yu等人，自然344126(1900)；Singer和Gottschling，科学266404(1994)；Autexier和Greider，基因发展，8563(1994)；Gilley等人，基因发展，92214(1995)；McEachern和Blackburn，自然367403(1995)；Blackburn，生物化学年评，61113(1992)；Greider，生物化学年评，65337(1996))。这一酶的活性依赖于它的RNA和蛋白质成分，从而顺利解决利用RNA(即，与DNA相反)作为端粒DNA合成的模板的末端复制存在的问题。端粒酶扩展了端粒DNA的G链。包括端粒酶持续合成能力，在单个端粒中的作用频率，和端粒DNA降解的速度的因子的联合对端粒的大小有作用(即，是否加长，缩短，或维持一定大小)。在体外，端粒酶可能是特别持续的，四膜虫端粒酶在酶分解之前在G链引物上平均添加了约500个碱基(Greider，分子细胞生物学，114572(1991))。
重要的是，通过发育和细胞周期因子可以调节端粒复制。已经假定，端粒复制各方面可以在细胞周期中作为信号。例如，某些DNA结构或DNA蛋白质形成信息可以作为关卡点表明染色体复制已经完成(参见，例如Wellinger等人，分子细胞生物学，134057(1993))。另外，已经观察到在人中，在大多数体细胞组织中端粒酶的活性是不可检测的，虽然在许多肿瘤中可以检测到(美国专利号，5,583,016，出处同上)。所以，确信端粒长度的作用是分裂钟，在体内和/或体外限制了细胞的复制潜力。在本领域中仍然需要的是研究端粒的作用和在正常以及不正常细胞(即癌细胞)中它们的复制的其它方法。对端粒酶和它的功能的理解是开发更好的方法以便利用端粒酶作为癌症治疗或抗老化过程的靶所需要的本发明概要本发明第一次提供了TRT酶和端粒酶复合物的克隆，鉴定，合成，纯化和重组表达，所述复合物首先包括重要的人端粒酶逆转录酶蛋白质(hTRT)，以及提供补充这一明显成果的新方法和试剂。
本发明提供了用于端粒酶的纯化和使用的组合物和方法。特别是，本发明涉及从Euplotes aediculatus以及其它生物体(例如，裂殖酵母，其它酵母，四膜虫，其它真菌，小鼠和其它哺乳动物)获得的端粒酶和共纯化多肽。本发明同时提供用于在其它生物体种类和属中检测和鉴定端粒酶同系物的方法。
本发明涉及端粒酶的催化蛋白成分称为端粒酶逆转录酶(“TRT”)的克隆和鉴定。在一个方面，本发明提供来自纤毛虫，真菌和脊椎动物，特别是哺乳动物的TRT基因和蛋白质。在一个重要的方面中，本发明涉及人端粒酶(“hTRT”)的催化蛋白成分的克隆和鉴定。
在一个方面，本发明提供用于鉴定和克隆新TRT的试剂和方法，其中利用了产生或起源于TRT聚核苷酸的核酸探针和引物用于克隆TRT基因和cDNA；和，提供了特异性地识别TRT，包括基序和其它TRT表位的抗体，这样的抗体可用于TRT基因的表达克隆，TRT多肽属的鉴定和纯化，和本文公开的其它应用。
到现在为止，如在SDS-PAGE上测量，本发明提供约123千道尔顿(SEQ ID NO2)和43千道尔顿(SEQ ID NO4-6)的E.aediculatus的端粒酶TRT亚单位蛋白质。特别是，本发明提供了基本纯化的E.aediculatus123千道尔顿和43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位。
本发明的一个方面的特征是分离和基本纯化的编码端粒酶亚单位(即，E.aediculatus123千道尔顿和43千道尔顿蛋白质亚单位)的聚核苷酸在特定的方面，聚核苷酸是SEQ ID NO1的E.aediculatus的核苷酸序列(编码123千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的E.aediculatus端粒酶基因的DNA序列)，或其突变体。在可选择的实施方案中，本发明提供编码长度至少10个氨基酸残基的E.aediculatus端粒酶123千道尔顿亚单位的分离的(即，基本纯化)聚核苷酸的片段。本发明进一步涉及长度至少是6个核苷酸，至少25个核苷酸，至少30个核苷酸，至少100个核苷酸，至少250个核苷酸，和至少500个核苷酸的这一聚核苷酸序列(即，SEQID NO1)的片段。另外，本发明的特征是在严格条件下与SEQ ID NO1或其片段杂交的聚核苷酸序列。本发明进一步涉及包括SEQ ID NO1的核酸的补体，或其变异体的聚核苷酸序列。本发明也提供了具有SEQ ID NO3的序列(编码E.aediculatus的43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的基因的DNA序列)的聚核苷酸。特别是，本发明提供了包括至少SEQ ID NO3的核酸序列的一部分的聚核苷酸序列，或其突变体。在一个实施方案中，本发明提供编码长度至少10个氨基酸残基的E.aediculatus端粒酶43千道尔顿亚单位的分离的(即，基本纯化)聚核苷酸的片段。本发明也提供了编码SEQ ID NOS4-6的E.aediculatus的多肽(所有三个E.aediculatus的43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的开放读框的氨基酸序列)的分离的聚核苷酸序列或其变异体。本发明进一步涉及长度至少是5个核苷酸，至少20个核苷酸，至少100个核苷酸，至少250个核苷酸，和至少500个核苷酸的这一聚核苷酸序列(即，SEQID NO3)的片段。另外，本发明的特征在于严条件下与SEQ ID NO3或其片段杂交的聚核苷酸序列。本发明进一步涉及包括SEQ ID NO3的核酸的补体，或其变异体的聚核苷酸序列。
本发明进一步提供了包括SEQ ID NO2的氨基酸序列(123千道尔顿E.aediculatus端粒酶TRT亚单位)的至少一部分的基本上纯化的E.aediculatus的多肽，或其变异体。在一个实施方案中，该多肽序列的一部分包括SEQ ID NO2的大于10个氨基酸的长度的片段。但是，本发明也涉及各种长度的多肽序列，所述多肽的序列包括在SEQ ID NO2内，其范围从5-500个氨基酸。本发明也提供了编码SEQ ID NO2的分离的聚核苷酸序列，或其变异体。
本发明提供了选自于SEQ ID NO4-6组的氨基酸序列(43千道尔顿E.aediculatus端粒酶亚单位开放读框)的至少一部分的基本上纯化的E.aediculatus的多肽，或其变异体。在一个实施方案中，多肽的部分包括SEQ ID NO4的片段，具有的长度大于10个氨基酸。在可选择的实施方案中，多肽的一部分包括SEQ ID NO5的片段，具有的长度大于10个氨基酸。仍然在另一个可选择的实施方案中，多肽的部分包括SEQ ID NO6的片段，具有的长度大于10个氨基酸。本发明同时涉及各种长度的多肽序列，这些多肽序列包括在SEQ ID NO4，5和/或6(SEQID NO4-6显示的Euplotes aediculatus 43千道尔顿多肽开放读码框架)内，范围为5到500个氨基酸。
本发明同时提供了至少由一个纯化重组E.aediculatus43千道尔顿端粒酶蛋白质，至少一个纯化重组E.aediculatus 43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位，和纯化的重组RNA组成的端粒酶复合物。在优选的实施方案，端粒酶复合物包括一个纯化的重组123千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位，一个纯化的重组43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位，和纯化的重组端粒酶RNA。在一个优选的实施方案中，端粒酶复合物包括从Euplotesaediculatus获得的123千道尔顿和/或端粒酶蛋白质亚单位。涉及SEQ IDNO1可以编码E.aediculatus端粒酶复合物的123千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位。同时涉及的是端粒酶复合物的123千道尔顿E.aediculatus端粒酶蛋白质亚单位由如SEQ ID NO2所示的氨基酸组成。同时涉及的是从E.aediculatus纯化可以获得端粒酶复合物的43千道尔顿的端粒酶蛋白质亚单位。进一步涉及的是SEQ ID NO3编码端粒酶复合物的43千道尔顿端粒酶亚单位。同时涉及的是端粒酶复合物的43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位是由选自包括SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，和SEQIDNO6的组的序列中的氨基酸组成。受到涉及的是端粒酶复合物纯化的RNA由如Linger等人公开的那些序列编码的RNA组成(Linger等人，基因发展，81985(1994))。在优选的实施方案中，端粒酶复合物能够复制端粒DNA。
本发明同时提供在除了E.aediculatus的真核生物体中鉴定TRT和端粒酶蛋白质亚单位的属的方法。这些方法由多个步骤组成。第一个步骤是合成至少编码至少已知TRT编码序列的一部分，如氨基酸序列SEQID NOS2，4，5或6的编码序列的一部分(相同或互补的)一个探针或引物低聚核苷酸。可选择地，合成探针或引物低聚核苷酸，与至少编码氨基酸序列SEQ ID NO2，4，5或6的E.aediculatus的编码序列的一部分互补。第二个步骤包括将至少一个探针或引物低聚核苷酸与来自基因组的核酸，或可选择地，其它生物体的基因组的表达部分(即，非E.aediculatus生物体)，在适于形成核酸杂合体形成的条件下接触。然后，扩增或没有扩增鉴定杂合体，例如利用探针标记或利用DNA聚合酶(例如，Taq或本领域已知的任何其它适当聚合酶)进行扩增。最后，利用本领域已知的方法确定杂合体的序列，和分析衍生氨基酸序列的序列与SEQ ID NOS2，4，5或6的相似性。
本发明同时提供在真核生物体中鉴定编码端粒酶蛋白质亚单位的核酸序列属的任何成员的合法，包括步骤提供确信含有编码真核端粒酶蛋白质亚单位的核酸的样品，将样品与编码至少已知TRT的区域如Euplotes aediculatus端粒酶蛋白质亚单位和聚合酶，的核酸序列相同或互补的至少一个低聚核苷酸引物接触；在一定条件下培养，以便通过引物扩展扩增编码真核端粒酶蛋白质亚单位的核酸；确定真核端粒酶蛋白质亚单位的序列；和比较真核端粒酶蛋白质亚单位的序列和Euplotesaediculatus端粒酶蛋白质亚单位。在一个优选的实施方案中，Euplotesaediculatus端粒酶亚单位包括至少SEQ ID NO1的一部分。在可选择的优选实施方案中，Euplotes aediculatus端粒酶亚单位至少包括SEQ IDNO3的一部分。
因此，本发明同时提供在除了E.aediculatus的真核生物体鉴定端粒酶蛋白质亚单位的方法。本发明允许将SEQ ID NO2，4，5，或6的E.aediculatus氨基酸序列和起源于其它生物体的基因序列或通过蛋白质的直接氨基酸序列分析获得的氨基酸序列进行比较。然后，可以选择显示与SEQ IDNOS2，4，5或6具有最大程度的同一性(即，同源性)的氨基酸序列进一步测试。特别重要的序列是那些与Euplotes序列的逆转录酶(RT)或特征性的其它基序具有同一性的序列。一旦鉴定，通过遗传或生物化学方法包括下面的实施例中阐述的方法可以测试含有显示最大程度的同一性的序列的蛋白质在端粒酶活性中的作用。
本发明同时提供纯化本发明的TRT属的方法，包括步骤；提供样品；将样品与亲和低聚核苷酸在一定条件下接触，其中亲和低聚核苷酸与端粒酶结合以便形成端粒酶-低聚核苷酸复合物；和将低聚核苷酸端粒酶复合物与替换低聚核苷酸在一定条件下接触，以便从模板中释放端粒酶。在优选的实施方案中，该方法进一步包括洗脱端粒酶的步骤。在另一个优选的实施方案中，亲和低聚核苷酸包括反义部分和生物素残基。在一个实施方案中，涉及在接触步骤的过程中，在亲和低聚核苷酸上的生物素残基与抗生物素蛋白小珠结合，反义部分与端粒酶结合。同时涉及的是，在接触步骤过程中，替换低聚核苷酸与亲和低聚核苷酸结合。
本发明进一步提供基本纯化的多肽，该多肽包括含有SEQ ID NOS58(Oxytricha)，61(人端粒酶基序)，63(粟酒裂殖酵母)，64(啤酒酵母)，65(Euplotes aediculatus)，67(人端粒酶基序)，和68(裂殖酵母)的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明同时提供纯化的，分离的聚核苷酸序列，该序列编码含有氨基酸序列SEQ ID NOS58，61，63，64，65，67和68的多肽。本发明涉及该低聚核苷酸可以编码(或与其相同或互补)序列的任何部分，该合一序列序列编码各种长度的SEQ ID NOS58，61，63，64，65，67和68的部分或片段。在一个实施方案中，多肽的该部分包括长度大于5，10或更多氨基酸的片段。但是，本发明也涉及编码各种长度的序列的多肽的聚核苷酸，这些序列包括在SEQ IDNOS58，61，63，64，65，67和68内，范围是在5到500个氨基酸之间(如果适当，是基于SEQ ID NOS58，61，63，64，65，67和68的长度的)。
本发明同时提供与SEQ ID NOS55(啤酒酵母)，62(人端粒酶基序)，66(啤酒酵母)，和69(裂殖酵母)，或其变异体相同，互补或包含的核酸序列。本发明进一步提供分离的聚核苷酸序列的片段，这些序列至少是6个核苷酸，至少是10，至少是20，至少是25个核苷酸，至少是30个核苷酸，至少是50个核苷酸，至少是100个核苷酸，至少是250个核苷酸，和至少是500个核苷酸的长度(如果合适的话，对应于SEQ IDNOS55，62，66，和69，或其变异体的序列的长度，和准备的应用)。
在特别优选的实施方案中，聚核苷酸特异性地与TRT端粒酶的序列的属的个别种类杂交，其中端粒酶序列选自包括哺乳动物(即，人，小鼠)，Euplotes aediculatus，Oxytricha，裂殖酵母，和酵母端粒酶序列的组。在其它优选的实施方案中，本发明提供含有选自包括SEQ ID NOS55，62，66，和69或其变异体的组的核酸序列的补体的聚核苷酸序列。仍然在其它优选实施方案中，本发明提供了在严谨条件下与至少来自包括SEQ IDNO55，62，66和69的组的一个核酸序列杂交的聚核酸序列。在另一个实施方案中，该多核苷酸序列包括长度约为10-30个核苷酸的纯化的合成的核苷酸序列。
在可选择的优选实施方案中，本发明提供了对应于hTRT，人端粒酶，包括SEQ ID NOS113和117(人)的聚核苷酸序列，和它们的互补序列。本发明进一步涉及这些聚核苷酸序列(即，SEQ ID NOS113和117)的片段，这些片段至少是5个核苷酸，至少是20个核苷酸，至少是100个核苷酸，至少是250个核苷酸，和至少是500个核苷酸的长度。本发明进一步涉及这些聚核苷酸序列(即，SEQ ID NOS113和117)的补体的片段，它们至少是5个核苷酸，至少是20个核苷酸，至少是100个核苷酸，至少是250个核苷酸，和至少是500个核苷酸的长度。另外，本发明的特征是在严谨条件下与SEQ ID NOS113和117，和/或片段杂交的聚核苷酸序列和/或其互补序列。本发明进一步涉及含有SEQ IDNOS113和117，或其变异体的核酸的补体的聚核苷酸序列。在另一个实施方案中，聚核苷酸序列含有对应于SEQ ID NOS113和/或117的片段的纯化，合成核苷酸序列，具有的长度约为10到30个核苷酸。本发明进一步提供质粒pGRN121(ATCC登记号#209016)，和λ克隆25-1.1(ATCC登记号#209024)和GM5(ATCC登记号#98505)。
本发明进一步提供基本上纯化的hTRT多肽，这些多肽含有氨基酸序列SEQ ID NOS114-116，和118(人)。在另一个实施方案中，本发明同时提供了编码氨基酸序列SEQ ID NOS114-116，和118的多肽的纯化，分离聚核苷酸序列。本发明涉及各种长度的SEQ ID NOS114-116，和118的部分或片段。在一个实施方案中，多肽的部分含有长度大于10个氨基酸的片段。但是，本发明同时涉及各种长度的多肽序列，这些序列包括在SEQ ID NOS114-116，和118内，范围为5到1100个氨基酸(如果适当，是基于SEQ ID NOS114-116，和118的长度的)。
本发明同时提供了在生物样品中检测编码至少TRT的一部分的核苷酸序列的存在的方法，包括步骤，提供怀疑含有对应于TRT，例如SEQ ID NOS1(Euplotes)，3(Euplotes)，53(四膜虫)，62(人)，66(啤酒酵母)，69(裂殖酵母)，117(人)中阐述的核苷酸序列；SEQ ID NO1，3，53，62，66，69，117或其片段的核苷酸的生物学样品；将生物样品与核苷酸在一定条件下合并，以致在核酸和核苷酸之间形成杂交复合物；检测杂交复合物。
在本方法的一个实施方案中，对应于TRT，例如在SEQ ID NOS1，3，53，62，66，69，117中阐述的核苷酸序列的核酸是核糖核酸，而在可选择的实施方案中，该核苷酸序列是脱氧核糖核酸。仍然是本方法的另一个实施方案，检测的杂交复合物与生物样品中TRT，例如SEQID NOS1，3，53，62，66，69，117中阐述的聚核苷酸的表达相关。仍然是本方法的另一个实施方案，与生物样品中的TRT例如，SEQ IDNOS1，3，53，62，66，69，117中阐述的聚核苷酸比较，杂交复合物的检测包括允许带有变化的核酸的检测。
本发明同时提供含有与TRT聚核苷酸，例如在SEQ ID NO1，3，55，62，66，67，69和117中阐述的，至少的一部分互补的核酸序列。在可选择的优选的实施方案中，本发明同时提供含有SEQ ID NO1，3，55，62，66，67，69和117的反义分子，和药物可接受赋形剂和/或其它化合物(例如，佐剂)的药物组合物。
仍然在另一个实施方案中，本发明提供包含在重组表达载体上TRT聚核苷酸序列。在一个实施方案中，含有的TRT聚核苷酸序列的表达载体包含在寄主细胞内。
本发明同时提供生产TRT多肽的方法，TRT多肽含有如SEQ IDNOS2(Euplotes)，4-6(Euplotes)，52(四膜虫)，58(Oxytricha)，61(人)，63(裂殖酵母)，64(啤酒酵母)，65(Euplotes)，67(人)，68(裂殖酵母)，或118(人)，显示的氨基酸序列。该方法含有步骤在适于表达TRT多肽的条件下培养寄主细胞；和从寄主细胞培养物中回收或纯化多肽。
本发明同时提供纯化抗体，这些抗体与多肽特异结合，该多肽至少含有TRT种类的氨基酸序列的一部分，包括例如，SEQ ID NOS2，4-6，52，58，61，63，64，65，67，68，和/或118中所示。在一个实施方案中，本发明提供至少含有一个抗体和药物可接受赋形剂的药物组合物。
本发明进一步提供在生物样品中检测TRT的方法，包括步骤提供怀疑表达人端粒酶蛋白质的生物样品；和至少一个与至少TRT的氨基酸序列的一部分，例如，SEQ ID NOS2，4-6，52，55，61，63，64，65，67，68和/或118中所示特异结合的抗体；在一定条件下合并生物样品和抗体以致形成抗体蛋白质复合物；和检测该复合物，其中复合物的存在与生物样品中蛋白质的表达相关。
本发明进一步提供基本纯化的TRT种类的肽，包括例如，这些肽含有选自包括SEQ ID NOS71，73，75，77，79，82(所有四膜虫)，83(啤酒酵母)，84(Euplotes)，85(四膜虫)，86，和101(人)的组的所有或部分氨基酸序列。在可选择的实施方案中，本发明提供纯化，分离的编码对应于这些序列的多肽的聚核苷酸序列。在优选的实施方案中，聚核苷酸特异地与TRT序列杂交，其中TRT序列选自包括哺乳动物(例如，人，小鼠)，Euplotes aediculatus，Oxytricha，裂殖酵母，酵母，四膜虫组的序列。仍然在另一个实施方案中，聚核苷酸序列包括含有选自于SEQ IDNOS70，72，74，76，78，80，81(所有四膜虫)，100(hTRT)，113(hTRT)，117(hTRT)和它们的变异体的组的核苷酸序列的补体。在另一个实施方案中，在严格条件下与选自包括SEQ ID NOS66(啤酒酵母)，69(裂殖酵母)，80(四膜虫)，和81(四膜虫)的组的核酸序列杂交的聚核苷酸。仍然在另一个实施方案中，聚核苷酸序列选自包括SEQ ID NOS70，72，74，76，78(所有四膜虫)；87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99(所有hTRT)；102，103，104，105，106(所有粟酒裂殖酵母)；107(Adapt SfiII)，108(Adapt SfiII)，109(粟酒裂殖酵母)，110(粟酒裂殖酵母)，111(四膜虫)，113(hTRT)，和117(hTRT)的组。在可选择的实施方案中，该核苷酸序列包括具有长度约为10到50个核苷酸的纯化的，合成核苷酸序列。
本发明同时提供检测生物样品中编码至少TRT的一部分的核苷酸序列的存在的方法，包括步骤提供怀疑含有对应于TRT的核苷酸序列，例如SEQ ID NO100，和/或SEQ ID NO113，和/或SEQ ID NO117中所示；SEQ ID NO100，和/或SEQ ID NO；113，和/或SEQ ID NO117，或它们的片段的核酸的生物样品；将生物样品与核苷酸在一定条件下合并，以便在核酸和核苷酸之间形成杂交复合物；和检测杂交复合物。
在本方法的一个实施方案中，对应于SEQ ID NO；100，和/或SEQID NO；113，和/或SEQ ID NO117的核苷酸序列的TRT核酸是核糖核酸，而在可选择的实施方案中，该核苷酸序列是脱氧核糖核酸。仍然在本方法的另一个实施方案中，检测的杂交复合物与生物样品中聚核苷酸SEQ ID NO100，和/或SEQ ID NO113，和/或SEQ ID NO117的表达相关。仍然在本方法的另一个实施方案中，检测杂交复合物包括在一定条件下温育，这些条件允许检测与SEQ ID NO；100和/或SEQ IDNO113，和/或SEQID NO117的聚核苷酸相比，生物样品中核酸的变化。
本发明同时提供含有核酸序列的反义分子，例如，至少TRT聚核苷酸的一部分互的序列，例如在SEQ IDNO82(四膜虫)，100，113，和117(所有hTRT)中所示。在可选择的优选实施方案中，本发明同时提供包括SEQ ID NOS82，100，113，117的反义分子，和药物可接受赋形剂和/或其它化合物(例如，佐剂)的药物组合物。
仍然在另一个实施方案中，本发明提供包含在重组表达载体中的TRT聚核苷酸序列。在一个实施方案中，含有聚核苷酸序列的表达载体包含在寄主细胞内。
本发明同时提供生产TRT多肽的方法，这些多肽例如包括SEQ IDNOS82，83，84，85，86，101，114，115，116和/或118的氨基酸序列，该方法包括步骤在各种适于表达多肽的条件下培养寄主细胞；和从寄主细胞培养物中回收或纯化多肽。
本发明同时提供与TRT多肽特异结合的抗体，该TRT多肽至少包括例如SEQ ID NOS2，2-4，71，73，75，77，79，82，83，84，85，86，101，114，115，116和/或118的TRT氨基酸序列的一部分。在一个实施方案中，本发明提供含有至少一个抗体和药物可接受赋形剂的药物组合物。
本发明进一步提供检测生物样品中的TRT的方法，包括步骤提供怀疑表达TRT蛋白质的生物样品；和至少一个与至少TRT氨基酸序列的一部分特异结合的抗体，所述TRT的氨基酸序列例如SEQ IDNOS71，73，75，77，79，82，83，84，85，86，87，101，114，115，116，和/或118，在一定条件下合并生物样品和抗体，以便形成抗体蛋白质复合物；检测生物样品中的复合物，其中复合物的存在与端粒酶的表达相关。
本发明提供由至少一个TRT，用作端粒重复DNA合成的模板的端粒酶相关核酸成分，和可选择地其它端粒酶复合物相关蛋白，如共纯化蛋白和调节酶活性的其它蛋白组成。在一个实施方案中，端粒酶复合物是由人起源的成分，包括人端粒酶(含有hTRT，SEQ ID NO117的cDNA编码的)，人端粒酶RNA(hTR)成分和端粒酶相关蛋白质组成。在一个实施方案中，复合物含有cDNA SEQ ID NO117编码的，具有SEQ IDNO；118的序列的约127千道尔顿的hTRT蛋白质。
本发明同时提供许多不同的方法，用于表达和分离端粒酶和端粒酶相关化合物，它们可以在一个或更多的方面用作试剂和方法。
本发明的方法和试剂提供TRT基因和序列，该序列可以用于敲出细胞中的同源基因。本发明的新试剂和方法因此提供了TRT敲出细胞和动物和产生这样的细胞和转基因哺乳动物的方法。
本发明的一个方面是使用聚核苷酸，该聚核苷酸至少是10个核苷酸到约10kb或更长长度，含有至少10个核苷酸的邻接序列，该序列与在测试或筛选TRT基因序列或TRT mRNA，或制备重组寄主细胞中的天然存在的TRT基因或TRT mRNA中的邻接序列相同或准确互补。
本发明的其它方面是在治疗增加脊椎动物细胞的增殖能力的症状的药剂，可选择地用于抑制老化的影响的药剂的制造中使用增强TRT的表达的试剂。
仍然是本发明的另一方面是在治疗人细胞内与端粒酶活性水平提高相关的症状的药剂的制造中使用端粒酶活性抑制剂。
在本发明的其它方面中同时提供了本发明的蛋白质，变异体和片段，和编码聚核苷酸或片段用作药物。
本发明另外包括在本文定义的各种情况中，在药剂的制造中，例如在用于抑制老化或癌症的药剂的制造中使用蛋白质，变异体或片段，或使用聚核苷酸或片段。
在本发明的一些实施方案中，TRT聚核苷酸与AA281296(SEQ IDNO121)的389个核苷酸聚核苷酸和/或克隆712562，与含有不同插入片段的质粒，插入片段的序列如图58，SEQ ID NO122所示。
本发明进一步包括在本文定义的各种情况中，在药剂的制造中，例如在抑制老化或癌症的影响的药剂的制造中使用蛋白质，变异体或片段，或使用聚核苷酸或片段，本发明的其它方面是选自下面的聚核苷酸(a)具有如SEQ ID NOS2，4-6，52，58，61，63，64，65，67，68或117中阐述的序列的DNA；(b)至少10个核苷酸的聚核苷酸，该聚核苷酸与前面的DNA杂交，并且编码hTRT蛋白质或变异体，或与这样的变异体的编码序列杂交；和(c)作为(a)和(b)中定义的DNA序列的遗传密码的简并的结果并且编码hTRT多肽或变异体的DNA序列。
附图的说明

图1图解说明了显示结合和替换洗脱步骤的端粒酶的亲和纯化。
图2是在Euplotes端粒酶的纯化过程中获得的端粒酶制剂的Northern印迹的照片。
图3显示了Euplotes端粒酶纯化方案中的端粒酶活性。
图4是Euplotes端粒酶的SDS-PAGE凝胶的照片，显示了存在约123千道尔顿的多肽和约43千道尔顿的双联体。
图5是显示Euplotes端粒酶的沉降系数的图片。
图6是含有Euplotes端粒酶的加了36％甲醛的聚丙烯酰胺/脲凝胶的照片。
图7显示了端粒酶RNA模板与小组A中的SEQ ID NOS43和44，与小组B中的SEQ ID NOS45和46的推测的序列对比。
图8是图6中显示的凝胶的25-30泳道在更亮的曝光水平的照片。
图9显示编码123千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的Euplotes端粒酶基因的DNA序列(SEQ ID NO1)。
图10显示了Euplotes 123千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图11显示了编码Euplotes 43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的基因的DNA序列(SEQ ID NO3)。
图12显示了Euplotes 43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的所有三个开放读码框架的DNA序列以及氨基酸序列(SEQ ID NOS4-6)。
图13显示了E.aediculatus的123千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位(SEQ ID NO2的位置2到1008)和T.thermophila(SEQ ID NO52)的80千道尔顿的多肽之间的序列比较。
图14显示了E.aediculatus的123千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位(SEQ ID NO2的位置132到1028)和T.thermophila的95千道尔顿多肽(SEQ ID NO54)之间的序列比较。
图15显示了E.aediculatus的43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的“La-区”的部分(SEQ ID NO9)和T.thermophila的95千道尔顿多肽部分(SEQ ID NO10)之间的最匹配序列对比。
图16显示了E.aediculatusd 43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的“La-区”的部分(SEQID NO11)和T.thermophila的80千道尔顿多肽部分(SEQ ID NO12)之间的最匹配序列对比。
图17显示了E.aediculatus的123千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的聚合酶区(SEQ ID NO13和18)和各种逆转录酶(RT)的聚合酶区(SEQID NOS14-17，和19-22)的序列对比和基序。
图18显示了各种La蛋白质(SEQ ID NOS24-27)和43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的区(SEQID NO23)的序列对比。
图19显示了编码T.thermophila80千道尔顿多肽的核苷酸序列(SEQID NO51)。
图20显示了T.thermophila80千道尔顿多肽的氨基酸序列(SEQ IDNO52)。
图21显示了编码T.thermophila95千道尔顿多肽的核苷酸序列(SEQID NO53)。
图22显示了T.thermophila95千道尔顿多肽的氨基酸序列(SEQIDNO54)。
图23显示了L8543.21(“Est2p”)(啤酒酵母)的氨基酸序列(SEQIDNO55)。
图24显示了具有EuplotesTRT序列(SEQID NO59)的OxytrichaPCR产物(SEQ ID NO58)编码的氨基酸序列的序列对比。
图25显示了具有tezl粟酒裂殖酵母(S.pombe)序列(SEQIDNO63)，啤酒酵母Est2p(SEQ ID NO64)，和EuplotesP123(SEQ ID NO65)氨基酸序列的部分的hTRT氨基酸基序(SEQ ID NO61)的序列对比。
图26显示了啤酒酵母Est2的DNA序列(SEQ ID NO66)。
图27显示了由图28的核酸序列(SEQ ID NO62)编码的氨基酸序列(SEQ ID NO67)。
图28显示了编码图27的SEQ ID NO67的氨基酸序列的DNA序列(SEQ ID NO62)，如图25(SEQ ID NO61)所示。
图29显示了裂殖酵母tezl的氨基酸序列(SEQ ID NO68)。
图30显示了裂殖酵母tezl(“Sp-Trtlp”)的DNA序列(SEQ IDNO69)。
图31显示了啤酒酵母EST2p(SEQ ID NO83)，Euplotes(SEQ IDNO84)，和四膜虫(SEQ ID NO85)氨基酸序列，以及共有序列序列对比。
图32显示了用于生产抗TRT抗体的肽的序列。
图33是粟酒裂殖酵母tezl+测序实验的图解概括。
图34显示了用于鉴定E.aediculatus p123序列的粟酒裂殖酵母同系物的两个简并PCR引物。
图35显示了利用图34中显示的简并引物的PCR中产生的四个主要谱带。
图36显示了E.aediculatus pl123，啤酒酵母，和Oxytricha(SEQ IDNO58)TRT蛋白质序列与由M2PCR产物编码的氨基酸序列的序列对比。
图37是显示用于获得粟酒裂殖酵母TRT序列的3’RT PCR方案的图解。
图38显示了粟酒裂殖酵母端粒酶蛋白质序列的文库和筛选文库的结果。
图39显示了利用含有粟酒裂殖酵母端粒酶序列的HindIII消化的阳性基因组克隆获得的结果。
图40图解显示了获得粟酒裂殖酵母TRT序列的5’RT PCR方案。
图41显示了来自端粒酶催化亚单位的RT区的序列对比。
图42显示了三个端粒酶序列的序列对比。
图43显示了用于裂解粟酒裂殖酵母中的端粒酶基因的裂解方案。
图44显示了证明来自粟酒裂殖酵母tezl的裂解的实验结果。
图45显示了在粟酒裂殖酵母中由于tezl裂解，端粒的逐渐缩短。
图46显示了标明了编码区的tezl的DNA(SEQ ID NO69)和氨基酸序列(SEQ ID NO68)。
图47显示了来自克隆712562(SEQ ID NO122)的EcoRI-NotI插入片段的约63千道尔顿的端粒酶蛋白质或其片段的开放读码框架(ORF)的DNA序列(SEQ ID NO100)和编码的氨基酸序列(SEQ ID NO101)，所述克隆包括Genbank#AA281296EST(SEQ ID NO121)。
图48显示了各种来源的逆转录酶基序的序列对比。
图49提供了质粒pGRN121的限制性和功能图谱(ATCC登记号#209016)。
图50提供hTRT的初步核酸测序分析的结果(SEQ ID NO113)。
图51提供了hTRT的初步核酸(SEQ ID NO113)和推测的ORF序列(SEQ ID NO114-116)。
图52提供了质粒pGRN121的重新精炼的限制性和功能图谱。
图53提供了hTRT的核酸(SEQ ID NO117)和推测的ORF序列(SEQID NO118)。
图54提供了λ克隆25-1.1的限制性图谱(ATCC登记号#209024)。
图55显示了TRT同感序列，即基序(“TRTcon”)与来自TRT属的几个种类，包括粟酒裂殖酵母Trtl(“Sp-Trtlp”)；人TRT(“hTRT”)；Euplotes p23(“EA-p123”)；和啤酒酵母Est2p(“Sc-Est2p”)的TRT序列的多个序列对比。图55同时显示了逆转录酶共有序列即RT基序(“RTcon”)和来自其它含有RT基序的蛋白质的同感序列的多个序列对比，这些蛋白质包括“Sc-al”，来自啤酒酵母线粒体的细胞色素氧化酶基团II内含子1编码蛋白质；“Bm-R1”，来自Bombyx mori R1非LTR可逆转座的元素的逆转录酶；和来自HIV-1的逆转录酶。
图56显示了hTRT与小鼠端粒酶逆转录酶蛋白质的序列对比。
图57显示了hTRT；粟酒裂殖酵母Trtl(“spTRT”)；Euplotesp123(“eaTRT”)；和啤酒酵母EST2pTRT序列(“sc-Est2”)的比较和序列对比。该图同时显示了TRT共有序列，即保守TRT基序序列(“TRTcon“)与这些序列的比较，在图57A比较的基序命名为“端粒酶特异基序”，在图57B“命名为端粒酶RT基序(指)”，和在图57C命名为“端粒酶RT基序(掌，引物柄)”。
图58显示了hTRT的初步核酸和氨基酸序列分析(分别命名为SEQID NO119和120)。
图59显示了克隆#712562的TRTcDNA的完全测序(SEQ IDNO122)，和推测的翻译产物(SEQ ID NO123)。
图60显示了mTRT cDNA的核酸序列。
本发明的详细说明本发明提供了用于研究端粒酶活性，包括潜在的核酸酶活性的纯化端粒酶制剂和端粒酶蛋白质亚单位。特别是，本发明涉及从Euplotesaediculatus获得的端粒酶和共纯化多肽。选择这一生物体，hypotrichousciliate用于本发明，因为它含有一般大数目的染色体末端(Prescott，微生物综述，58233(1994))，因为，在它的多倍体大核中存在非常大数目的基因大小的DNA分子。四膜虫，通常用于前面的端粒酶和端粒的研究中的holotrichous ciliate是与来自哺乳动物的植物一样与Euplotes有进化上远缘关系(Greenwood等人，分子进化杂志，3163(1991))。
在123千道尔顿E.aediculatus端粒酶亚单位和L8543.12序列(SEQID NO55)(即啤酒酵母的Est2；参见Lendvay等人，遗传学1441399-1412(1996))，裂殖酵母和人基序之间的同源性如含有大，碱性的蛋白质并且含有这样的逆转录酶基序的全长人端粒酶分子的预测的提供了强大基础。所以，本发明的组合物和方法可用于鉴定来自各种各样的种类的其它端粒酶。本发明叙述了123千道尔顿逆转录酶基序在鉴定与Euplotes远缘相关(例如，Oxytricha)，以及与Euolotes不相关的生物体(例如，酵母，裂殖酵母，小鼠，人等等)中的相似基序的方法中的用途。
本发明同时提供了其它方法用于研究端粒酶的不同形式的结构和功能。受到涉及的是本发明的端粒酶蛋白质将用于诊断应用，进化研究(例如，系统发育)，以及组合物的开发，和癌症治疗或抗老化治疗方案的方法。虽然本发明的端粒酶蛋白质亚单位本身具有用途，但是进一步涉及本发明的多肽可以与端粒酶的RNA成分的结合应用(即，完整的端粒酶)。
同时受到涉及的是本发明的方法和组合物将导致发现其它独特的端粒酶结构和/或功能。另外，本发明提供了纯化功能端粒酶以及端粒酶蛋白的新方法。在实施例3中叙述的方法基础上的这一亲和性是功能活化端粒酶的纯化中的重要方面，正如是本发明提供的两个TRT抗体。这一方法的主要优点是有能力使用温和洗脱条件，在该过程中，与柱基质非特异结合的蛋白质没有洗脱。
端粒酶是含有RNA成分和催化蛋白质成分的核糖核蛋白复合物(RNP)。本发明涉及克隆和鉴定端粒酶的催化蛋白质成分，称为“TRT”(端粒酶逆转录酶)。TRT这样命名是因为这一蛋白质的作用是依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)，利用了端粒酶RNA成分(“TR”)指导了端粒DNA重复序列的合成。另外，TRT在进化上与其它逆转录酶成分是相关的。
在一个方面，本发明提供了来自纤毛虫，真菌，和脊椎动物，特别是哺乳动物如人的TRT基因和蛋白质，人端粒酶逆转录酶，称为“hTRT”。TRT是非常需要和有价值的，因为人(和其它哺乳动物细胞)中的端粒酶活性与细胞增殖能力，细胞不灭，和肿瘤性转化表现型的发展相关。例如，在与死的细胞(如大多数人体细胞)相关的不灭人细胞(如恶性肿瘤细胞和不灭细胞系)中人TRT基因产物的端粒酶活性和水平升高。
在一个方面，本发明涉及E.aediculatus端粒酶的蛋白质亚单位的核酸和氨基酸序列，以及来自其它生物体包括人的端粒酶的核酸和氨基酸序列。另外，本发明涉及功能性端粒酶的纯化。如下所述，本发明同时包括各种形式的端粒酶，包括从各种生物体获得的重组端粒酶和端粒酶蛋白质亚单位。
在从Euplotes aediculatus纤毛虫纯化端粒酶后开始鉴定TRT。利用RNA亲和层析和其它方法充分纯化E.aediculatus端粒酶产生蛋白质“p123”。惊人地是，p123与前面确信构成端粒酶全酶的蛋白质亚单位的蛋白质(即，Tethahymena thermophila的p80和p95)不相关。对p123DNA和蛋白质序列(Genbank登记号U95964；图9和10)(SEQ IDNO1和SEQ ID NO2)的分析发现逆转录酶(RT)基序与p123作为端粒酶催化亚单位的作用一致(参见，例如，图17，25，55，57)。另外，p123与啤酒酵母(酵母)蛋白质Est2p(Genbank登记号S5396)相关，已知Est2p在啤酒酵母中的端粒的维持中起作用，但没有认识为它编码端粒酶催化亚单位蛋白质(参见，例如Lendvay等人，1996，遗传学，1441399)。
在一个方面，本发明提供用于鉴定和克隆新TRT的试剂和方法，其中利用从本文公开的TRT聚核苷酸产生或起源的核酸探针和引物(例如，用于克隆TRT基因和cDNA)；特异识别基序或基序序列或其它TRT表位的抗体(例如，用于表达克隆TRT基因或纯化TRT蛋白质)；利用的方法是筛选计算机数据库或其它手段。例如，如实施例16中所述，利用从Euplotes p123RT基序B’和C设计的简并序列引物进行粟酒裂殖酵母DNA的PCR(聚合酶链式反应)的扩增。在四个产生的主要产物中，一个编码与Euplotes p123和啤酒酵母Est2p同源的肽序列。利用这一PCR产物作为探针，通过筛选粟酒裂殖酵母cDNA和基因组文库和通过采用逆转录和PCR扩增粟酒裂殖酵母RNA(RT-PCR)获得粟酒裂殖酵母TRT同系物的完全序列。发现粟酒裂殖酵母基因(“tezl”或“SP-Trtlp”或“trtl”，基因库登记号AF015783；图69，图46)的完整序列显示p123和Est2p的同源性在逆转录酶基序中特别高(参见图56，58)。
利用起源于端粒酶RT基序的简并引物的扩增也可用于在Oxytrichatrifallax和Tetrahymena thermophila中获得TRT基因序列，如实施例13和15中所述。
本发明的Euplotes p123，粟酒裂殖酵母trtl，和啤酒酵母Est2p序列可用于人表达序列标记(ESTs)的计算机化数据库的研究，其中利用的程序是BLAST(Altschul等人，1990，分子生物学杂志，215403)。在含有Est2p序列的这一数据库的检索没有表明匹配，但对p123和trtl序列的研究鉴定了人EST(基因库登记号，AA281296)(SEQ ID NO121)如实施例17所述，它编码同源蛋白质。含有EST的cDNA克隆(本文下面称为“克隆712562”，参见图47，SEQ ID NO122)的完整序列表明存在7个RT基序。但是，这一克隆不能编码邻接人TRT，因为基序B’，C，D和E包含在不同的ORF中而不是多个NH2末端的基序中。另外，基序A和B’之间的距离实际上比三个前面鉴定的TRT更短。
如实施例17所述，从起源于人293细胞系的cDNA文库分离编码功能性hTRT(SEQ ID NO1)的cDNA克隆，pGRN121(ATCC登记号#209016)。克隆712562与pGRN121的比较显示克隆712562在基序A和B之间具有182个碱基对缺失。存在于pGRN121中的另外182个碱基对在单个开放读码框架中放置了所有的TRT基序，在基序A和B’区域之间的间隔加大到与其它已知TRT一致的距离。SEQID NO117编码具有SEQ ID NO118的序列的催化活化端粒酶蛋白质。SEQ ID NO118的多肽具有1132个残基，和计算的约127千道尔顿(kD)的分子量。
在从端粒酶阳性细胞逆转录RNA后，检测具有克隆712562的特征性182个碱基对缺失的TRT cDNA(例如，睾丸和293个细胞)。缺乏这一182个碱基对序列的hTRT RNAs通常称为“182突变体”，和代表一个，两个，或几个种类。虽然在pGRN121 cDNA(SEQ ID NO117)中发现缺乏182个碱基对的序列的hTRT变异体不可能编码全长活性端粒酶催化酶，他们可能在端粒酶调节中起作用和/或具有部分端粒酶活性，如端粒结合或hTR结合活性。
Euplotes的123千道尔顿和43千道尔顿端粒酶亚单位蛋白质序列图1-6中显示了Euplotes123和43千道尔顿蛋白质亚单位的核酸和推测的氨基酸序列。根据本发明，编码E.aediculatus端粒酶或它的亚单位的任何核酸序列可以用于产生表达Euplotes端粒酶或它的亚单位的重组分子。
本领域技术人员将会认识到，作为遗传密码的简并性的结果，可以产生许多端粒酶亚单位蛋白质序列，一些含有与任何已知的和天然存在的基因的核苷酸序列最小的同源性。本发明涉及每个核苷酸序列和其可能的变化，这种变化可以通过在可能的密码子选择的基础上的合并，考虑使用密码子“UGA”作为E.aediculatus中的编码半胱氨酸而产生。除了“UGA”密码子，根据标准三联体遗传密码，当用于编码天然存在的E.aediculatus端粒酶的核苷酸序列时产生这些联合，所有这些变化将考虑作为特异性公开。例如，43千道尔顿核苷酸序列的三个开放读码框架中的每一个编码的氨基酸序列特定地包括其中(SEQ ID NO4-6)。受到涉及的是本发明中包括端粒酶亚单位蛋白质的任何变异体形式，只要该蛋白质在测试中发挥功能，如在实施例或本文的其它地方叙述的。
虽然编码E.aediculatus端粒酶蛋白质亚单位的核苷酸序列和他们的变异体在适当选择的严谨条件下，优选地能够与天然存在序列的核苷酸序列杂交，这可以有利地产生编码E.aediculatus端粒酶蛋白质亚单位或他们的衍生物的核苷酸序列，这些衍生物具有基本不同的密码子用途，包括人和其它系统使用的“标准”密码子用途。根据寄主利用的特别密码子的频率，可以选择密码子增强肽存在于特定的原核或真核表达寄主的表达的速度。基本上改变编码端粒酶亚单位的核苷酸序列和它们的衍生物而没有改变编码氨基酸序列的其它原因包括产生了比天然存在的序列产生的转录物具有更需要的特性的RNA转录物，这些特性如更大或更短的半衰期。
现在，通过合成化学产生编码端粒酶蛋白质亚单位和它们的完整衍生物的DNA序列或其一部分是可能的，然后，可以将合成基因利用本领域已知的试剂插入许多可得的DNA载体和细胞系统的任何一种。另外，合成化学可以用于在编码E.aediculatus蛋白质亚单位或其任何部分的序列，以及编码酵母或人端粒酶蛋白质，亚单位，或其任何部分的序列中导入突变。
同时包括在本发明的范围内的是聚核苷酸序列，它们能够与端粒酶属的任何成员的核苷酸序列在各种严格条件下杂交，这些序列包括图9的序列(编码123千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的基因的DNA序列)，图11的序列(编码43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的基因的序列)，图12的序列(43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的开放读码框架)，和图26的序列(啤酒酵母Est2的DNA序列)。所以，在一个实施方案中，本发明的新组合物包括编码核酸的TRT和抗TRT抗体，也可以用于鉴定和纯化TRT的属，包括来自任何其它生物体的TRT同工型和端粒酶或端粒酶成分。
本发明的一个实施方案中包括Euplotes 43千道尔顿端粒酶的同工型和同系物，包括人p43同系物，这些同样可以通过本发明提供的独特试剂和本文叙述的方法鉴定和分离。
在其它的实施方案中，TRT和端粒酶复合物成分可用于鉴定端粒酶相关成分。
用于鉴定和分离TRT属的成员的杂交条件的基础是核酸结合复合物或探针的熔化温度(Tm)，如Berger和Kimmel(Berger和Kinnel，分子克隆技术指导，酶学方法，152卷，学术出版社，圣地雅戈，CA(1987))中谈到的，该文献引入本文作为参考，杂交条件也可以利用定义的“严格条件”。
根据本发明可以使用的编码端粒酶蛋白质亚单位的改变的核酸序列包括产生编码同样或功能等当的端粒酶亚单位的聚核苷酸的不同核苷酸的缺失，插入或替代。该蛋白质也可以表现氨基酸残基的缺失，插入或替代，这些修饰产生沉默的变化并产生功能等当的端粒酶亚单位，或缺乏一个或多个TRT部分活性的亚单位或具有与其融合的另一个肽。故意的氨基酸替代可以在残基的极性，电荷，可溶性，疏水性，亲水性，和/或两亲性特性中的相似性的基础上产生，只要保留端粒酶亚单位的生物学活性。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；带有同样的亲水值的无电荷极性头基团的氨基酸包括亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，甘氨酸，丙氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。
DNA测序的方法是本领域已知的，并且利用了酶如DNA聚合酶I的Klenow片段，测序酶R(US生物化学公司，Cleveland OH)，Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer，Norwalk CT)，热稳定T7聚合酶(Amersham，芝加哥IL)，或重组聚合酶和校正外切核酸酶的联合，如Gibco BRL销售的ELONGASE扩增系统(Gaithersburg MD)。优选地，利用机器自动控制过程，如Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton，Reno NV)，Peltier热循环仪(PTC200；MJ研究，WatertownMA)和ABI377DNA序列仪(Perkin Elmer)。
同时包括在本发明的范围内的是编码人或其它哺乳动物或其它真核细胞端粒酶蛋白质和亚单位的等位基因。如本文所用，术语“等位基因”或“等位序列”是编码人端粒酶蛋白质或亚单位的核酸序列的可替代形式。突变产生等位基因(即在核酸序列中的变化)，通常产生改变的mRNA或多肽，它们的结构和/或功能可以改变或不改变。任何给定基因可以没有，有一个或许多等位形式。产生等位基因的常见突变变化通常指氨基酸的天然缺失，叠加，或替代。这些类型的变化的每一个可以单独，或与其它联合，在给定的序列内一次或多次出现。
端粒酶逆转录酶属和鉴定基序本发明提供具有端粒酶催化亚单位蛋白质的序列(即，端粒酶逆转录酶)的分离和/或重组基因和蛋白质，这些蛋白质通常是大的，碱性蛋白质，具有逆转录酶(RT)，和端粒酶特异氨基酸基序。因为这些基序在各种生物体中是保守的，本发明提供了来自许多生物体的TRT基因的属，可以利用引物，核酸探针，和本发明的抗体即，如特异于基序序列的一个或多个的那些进行鉴定，分离或合成。
本发明提供端粒酶亚单位蛋白质的属的端粒酶种类。端粒酶逆转录酶蛋白质亚单位本身是逆转录酶蛋白质的属的成员。本文叙述的TRT种类解释了在结构基序的形式中TRT属的成员中的共同结构特征。这些基序可以产生一般的端粒酶功能。TRT种类的序列分析表明这些种类含有与其它逆转录酶(RT)蛋白质相同的氨基酸区域，如图17，18，25，48，55和57中说明。这一区域约在hTRT mRNA(cDNA，SEQ ID NO1)的中间三个中；这一区域与来自其它生物体的逆转录酶比较是hTRT的结构最保守的区域。对应于这样的基序区域的本发明的新试剂可以用于本发明的方法以便产生抗体和核酸探针，和鉴定来自其它生物体的另外的同工型和端粒酶种类。本发明提供对应于这些基序区域，包括RT区的低聚核苷酸，包括已知端粒酶产生的限制酶片段和扩增产物。对应于基序的低聚核苷酸也可以体外合成。下面叙述了用于扩增TRT的RT基序的PCR引物对。这些低聚核苷酸也可以用作PCR扩增引物或杂交探针以便鉴定和分离来自其它生物体的另外的人同工型和端粒酶种类。这些低聚核苷酸也可以用作引物以便扩增另外的TRT种类，利用的技术如下所述的RACE。
在TRT中发现7个RT基序，它们与其它逆转录酶中发现的那些相似，具有特异于TRT属的特定的标记。例如，图55和图57C中显示的，在TRT RT基序内，在其它RT中高度保守的残基中存在许多氨基酸替代(用箭头标记)。例如，在基序C中，与其它RT中的(F/Y)xDDh比较，与活化位点金属离子协同的两个天冬氨酸残基(DD)(参见，Kohlstaedt等人，1992，科学2561783；Jacobo-Molina等人，1993，美国科学院年报，906320；Patel等人，1995，生物化学345351)存在于hxDD(F/Y)中，，更优选地是端粒酶RT中的(L/V)xDD(F/V)(其中h是疏水氨基酸，“x”是任何氨基酸；参见Xiong等人，1990，EMBO J。93353；Eickbush，见病毒的进化生物学(S.Morse，Ed，Raven出版，纽约，p121，1994)。
端粒酶亚单位的另一个系统变化特征存在于基序E，其中WxGxSx是共有序列，或在端粒酶蛋白质中是保守的，而hL Gxxh是其它RT的特征(参见图55和57C；Xiong(1990)，出处同上；Erckbush(1994)出处同上)。这一基序E称为“引物柄”，已经报道了这一区域中的突变影响RNA引导，而不是影响DNA引导(Powell等人，1997，生物化学杂志，27213262)。图55和57C给出了几个端粒酶RT引物柄区域，包括hTRT的序列对比(基序E)。因为端粒酶需要DNA引物(例如，染色体3’末端)，不能预期TRT应该与引物柄区域中的其它RT不同。
另外，基序A和B’之间的距离在TRT中比其它RT中常见的更长，这可能代表了在相似于右手的结构的“手指”区内的插入片段(参见图57B；参见Kohlstaedt等人，出处同上；Jacobo-Molina等人，出处同上；和Patel等人，出处同上)。
另外，如上注意到，T基序是TRT蛋白质的其它标记。例如在图55和图57A中所示的T基序含有可以利用通式Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8-9-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp叙述的序列，其中X是任何氨基酸，下标是相邻残基的数目，R1是亮氨酸或异亮氨酸，R2是谷氨酰胺或精氨酸，R3是苯丙氨酸或酪氨酸，R4是赖氨酸或组氨酸。也可以利用下面通式描述T基序Trp-R1-X4-h-h-X-h-h-R2-p-phe-phe-Tyr-X-Thr-Glu-X-p-X3-p-X2-3-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp其中X是任何氨基酸，下标是指相邻残基的数目，R1是亮氨酸或异亮氨酸，R2是容氨酰胺或精氨，酸R3是苯丙氨酸或酷氨酸，R4是赖氨酸或组氨酸，h是选自Ala，Leu，Ile，Val，Pro，Phe，Trp，和Met的疏水氨基酸，p是选自Gly，Ser，Thr，Tyr，Cys，Asn和Gln的极性氨基酸。
在一个实施方案中，本发明提供分离的天然存在和重组TRT蛋白质，这些蛋白质含有图55和57说明的一个或多个基序，例如，基序T W-X12-FFY-X-TE-X10-11-R-X3-W-X7-I基序T’E-X2-V-X基序1 X3-R-X2-PK-X3基序2 X-R-X-I-X基序A X4-F-X3-D-X4-YD-X2基序B’Y-X4-G-X2-QG-X3-S-X8基序C X6-DD-X-L-X3当TRT蛋白质含有一个以上TRT基序，顺序(NH2-＞COOH)如图55中所示。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的天然存在的TRT蛋白质，这些蛋白质含有下面的超级基序(NH2)-X300-600-W-X12-FFY-X-TE-X10-11-R-X3-W-X7-I-X5-20-E-X2-V-X-X5-20-X3-R-X2-PK-X4-10-R-X-I-X-X60-80-X4-F-X3-D-X4-YD-X2-X80-130-Y-X4-G-X2-QG-X3-S-X8-X5-35-X6-DD-X-L-X3-X10-20-X12-K显然，对于一个技术人员，提供了试剂，本文公开的这些试剂的TRT序列，和本文提供的方法和指导(含有上面叙述的特异方法)，通过一个普通技术人员可以获得，分离和产生重组形式的TRT基因和蛋白质。例如，提供了引物(例如，简并扩增引物)，该引物与TRT的特征性编码RT和T基序的基因序列杂交。根据靶生物体的密码子用途可以制备与编码T基序，其它TRT基序(如上讨论)的FFYXTE区的序列，或基序或共有序列的联合杂交的一个或多个引物或简并引物，并且该引物可以用于从靶生物体制备的基因组DNA或cDNA扩增TRT基因序列。简并引物的用途是本领域已知的，并可使用与核酸序列系列杂交的引物系列，该序列潜在地编码靶基序的氨基酸，考虑了密码子的优先和靶生物体的用途，和利用适于允许在退火步骤中的碱基错配的扩增条件(例如，PCR)。通常使用两个引物，但是，单个引物(或，在这种情况中，单个简并引物系列)扩增系统是已知的，并且可以用于获得TRT基因。
表1提供了本发明的说明性引物，可以用于扩增新TRT核酸，特别是来自脊椎动物(例如，哺乳动物)的那些。“N”是所有四个核苷酸的等摩尔混合物，在圆括号中的序列是特定的核苷酸的等摩尔混合物。
表1用于TRT核酸的扩增的说明性简并引物基序 方向5′-序列-3′a FFYVTE正向TT(CT)TT(CT)TA(CT)GTNACNGAb FFYVTE反向TCNGTNAC(GA)TA(GA)AA(GA)AAc RFIPKP正向(CA)GNTT(CT)AT(ACT)CCNAA(AG)CCd RFIPKP反向GG(TC)TTNGG(TGA)AT(GA)AANCe AYDTI 正向GCNTA(CT)GA(CT)ACNATf AYDTI 反向TANGT(GA)TC(GA)TANGCg GIPOG 正向GGNAT(ACT)CCNCA(AG)GGh GIPOGS反向(GC)(AT)NCC(TC)TGNGG(TGA)ATNCCi LVDDFL正向(CT)TNGTNGA(CT)GA(CT)TT(CT)(CT)Tj DDFLLVT 反向GTNACNA(GA)NA(GA)(GA)AA(GA)TC(GA)TC允许的引物结合 (y＝是，n＝不)反向正向 b d f h ja-n y y y yc-n n y y ye-n n n y yg-n n n n yi-n n n n n
在一个实施方案中，将扩增的TRT核酸用作与从靶生物体产生的文库(例如，cDNA文库)菌落杂交的杂交探针，以致具有完整TRT蛋白质编码序列的核酸，或其基本部分得到鉴定，分离或克隆。以这一方式，本发明提供了鉴定，分离和克隆所有TRT属的种类的方法和试剂。作为说明性例子，根据本文叙述的方法，将如那些刚刚叙述的试剂和方法用于获得基因序列的TRT属的许多种类，包括人，小鼠，Euplotesaediculatus123千道尔顿和43千道尔顿种类，啤酒酵母，粟酒裂殖酵母，Oxytricha trifallax和Tetrahymena thermophila。将认识到的是在前面未鉴定的TRT种类基因的克隆之后，该序列可以通过常规方法确定，并合成编码肽和测试TRT活性如端粒酶催化活性(如本文所示和/或通过本领域已知的端粒酶测试)。
对技术人员同样明显的是所有TRT基因和多肽是在要求保护的属的范围内，因为他们可以利用本发明提供的独特的试剂克隆并且利用任何形式的克隆方法可以鉴定，分离和克隆。本发明的含有TRT基序的核酸和多肽的用途可以用于广泛种类的方法。例如，利用可以使用根据已知TRT的序列的探针与来自靶生物体的DNA或其它核酸文库的杂交，如下面的实施例中的叙述。令人满意的是简并PCR引物或他们的扩增产物本身可以标记和用作杂交探针。在另一个实施方案中，利用了表达克隆的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供的肽和蛋白质可以通过合成或通过重组的手段产生，从而产生抗体，这些抗体依次可以与来自任何种类的TRT如人TRT，包括例如hTRT同工型和人p43同系物特异反应。例如，与肽特异结合的一个或多个抗体跨越TRT基序或其它TRT表位如FFYXTE基序(其中X是任何20个标准氨基酸)，这些抗体可以用于分离含有TRT蛋白质和编码它的mRNA的核糖体复合物。
为了产生本发明的这样的抗体，肽免疫原通常在6和30个氨基酸的长度之间，更通常是在约10到20个氨基酸长度。该抗体也可以用于探测起源于需要的生物体的cDNA的表达文库，以便鉴定编码TRT序列的克隆。在另一个实施方案中，含有已知TRT的保守序列的DNA的DNA数据库的计算机检索也可以用于鉴定编码TRT序列的克隆。
人端粒酶基序本发明同时提供人端粒酶基序的核酸和氨基酸序列信息。这些序列第一次在BLAST研究中得到鉴定，其中利用了Euplotes123千道尔顿肽，和来自粟酒裂殖酵母的同源序列，称为“tezl”(SEQ ID NO69)。
图25表示了在这一比较检索中鉴定的Euplotes(“p123”)(SEQ IDNO65)；裂殖酵母(“tezl”)(SEQ ID NO63)；酵母Est2p(SEQID NO64)(即Est2核酸序列(SEQ ID NO55)编码的啤酒酵母蛋白质，在本文中也称为“L8543.12”)；和人同系物(SEQ ID NO61)的序列对比。这一对比的部分中的人氨基酸序列是SEQ ID NOS61和67(图25和27)(对应的cDNA编码序列是在SEQ ID NO62中提供的，图28)。图25中表示的telz部分是SEQ ID NO63，显示的酵母Est2的部分是SEQ ID NO64，和显示的Euplotes p123部分是SEQ ID NO65。
如图25所示，在这些蛋白质之间存在高度保守的区域。例如。在这一图中所示，在“基序0”，“基序1”，“基序2”，和“基序3”中存在相同的区域。用星号(*)表示相同的氨基酸，而相似的氨基酸残基用园环(M)表示。这表明在端粒酶基序内存在的区域在各种真核细胞，范围从酵母到纤毛虫，到人之间是保守的。受到涉及的是其它生物体将同样含有这样的序列的保守区。
图27显示了编码人端粒酶基序的cDNA克隆的氨基酸序列(SEQIDNO67，参见图25，SEQ ID NO61)。图28显示编码图27的氨基酸序列的DNA序列(SEQ ID NO62)，其中包括人端粒酶肽基序。在SEQ IDNO61，图25中提供了与其它TRT种类排列在一起的人氨基酸序列。图29显示了粟酒裂殖酵母tezl的氨基酸序列(SEQ ID NO68)，而图30显示了tezl的DNA序列(SEQ ID NO69)。在图30中，在下面情况显示了内含子和其它非编码区域，在上面情况显示了外显子(即，编码区)。
本发明提供了可以与编码TRT蛋白质或cDNA核酸序列(即，SEQID NO117)或编码TRT的蛋白质序列(即，SEQ ID NO118)的核酸特异杂交的低聚核苷酸引物和探针，这样的试剂可以用于鉴定和扩增端粒酶蛋白编码序列的属的许多种类。利用本发明的PCR引物也可以扩增内含子和基因组(非转录)序列以便鉴定新TRT种类。为了说明，下面叙述PCR引物和扩增方法。
在属的不同成员之间保守的TRT序列，即同感TRT序列，如TRT和RT基序的扩增可以用于产生本发明的低聚核苷酸试剂以便用作杂交探针以便鉴定和分离来自其它生物体的其它同工型和TRT种类。这些低聚核苷酸也可以用作引物以扩增其它TRT种类或序列，其中利用的技术是如下所述的RACE。
低聚核苷酸可以用于鉴定和检测其它端粒酶种类，其中利用了各种杂交技术和条件。本领域的技术人员将认识的是，不管利用了扩增或杂交方法，如果需要定量的结果，必须小心使用维持或控制扩增的或其它靶核酸的相对频率的方法。适当的扩增方法包括，但不限于聚合酶链式反应，PCR(PCR方法，方法和应用的指导，Innis，学术出版社，纽约(1990)和PCR策略(1995)，Innis编辑，学术出版社，纽约(Innis))，连接酶链式反应(LCR)(Wu(1989)基因组4560；Landegren(1988)科学2411077；Barringer(1990)基因89117)；转录扩增(Kwoh美国科学院年报，861173(1989))；自身持续序列复制(Guatelli(1990)美国科学院年报871874)；Qβ复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导技术(例如，NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)；参见Berger(1987)酶学方法，152307-316Sambrook，和Ausubel，以及Mullis(1987)酶学方法，152307-316，Sambrook，和Ausubel，以及Mullis(1987)美国专利号，4,683,195和4,683,202；Arnheim(1990)C和EN36-47；Lomell临床化学杂志351826(989)；Van Brunt，生物技术，8291-294(1990)；Wu(1989)基因4560；Sooknanan(1995)生物技术13563-564。体外扩增核酸的克隆方法如Wallace，美国专利号5,426,039所述。
本发明提供来自上面每个方法的产物的扩增和操作或缺失以便制备编码TRT蛋白质的DNA。在PCR技术中，合成和利用了与DNA区域的两个边界互补的低聚核苷酸引物(参见，Innis)。在各种方案中，可以使用PCR以便扩增，鉴定，分离和操作编码人端粒酶的核酸。在这些方案中，叙述了选择适当引物和探针的标准方法。本发明提供了鉴定和扩增编码人端粒酶蛋白质的DNA的引物和探针并且可以生产含有所有或部分本文列出的核酸序列。
PCR扩增的序列也可以标记和用作可检测的低聚核苷酸探针，但利用任何本领域已知的任何合成或其它技术，如上所述可以产生这样的核酸探针。本发明的标记的扩增的DNA或其它低聚核苷酸或核酸可以用作探针以便进一步鉴定和分离来自各种cDNA或基因组文库的TRT蛋白质种类或同I型。
本发明提供以RACE基础的方法，用于从任何生物体分离TRT核酸(RACE是用于DNA扩增的另一个以PCR基础的途径)。简要地说，该技术涉及利用PCR扩增DNA序列，其中利用了5’引物和定义的3’引物(5’RACE)或任意3’引物和定义的5’引物(3’RACE)。然后，将扩增序列亚克隆进入载体，其中可以利用标准技术测序和操作。RACE方法是本领域技术人员已知的，进行PACE的试剂盒是市场购买的(例如，Gibco BRL#18374-058(5’RACE)或 # 18373-019(3’RACE)(Gaithersburg，MD))，参见Lankiewicz(1997)核酸研究252037-2038；Frohman(1988)美国科学院年报，858998。
对于5’RACE，靠近已知序列的5’末端的方向延伸到5’末端选择引物，特异于基因的引物，。在引物延伸反应中利用引物，该反应利用了逆转录酶和mRNA。在非强制性地移除RNA后，特异性引导cDNA是1)“末尾”具有脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)和二脱氧末端转移酶，然后，与含有5’末端的末尾互补的引物，该5’末端提供了独特的PCR位点，和第一个特异于基因的引物用于PCR扩增cDNA；或2)利用RNA连接酶将提供独特PCR位点的低聚核苷酸，连接到cDNA末端；然后，与加入的位点互补的引物和第一个特异于基因的引物用于PCR扩增cDNA。通常利用与第一个引物相互嵌套的特异于基因的引物随后进行扩增。然后通常利用凝胶电泳纯化扩增产物，，然后测序和检测以便观察是否它们含有其它需要的cDNA序列。
对于3’RACE，将低聚dT引物与mRNA的聚A末尾退火，然后通过逆转录酶延伸。通常，低聚dT引物具有提供独特PCR位点的5’末端。然后，非强制性地移除RNA，或分解RNA，利用引物将cDNA扩增成为靠近已知序列的3’末端(定向朝着3’末端)的低聚dT末尾和特异于基因的引物。随后进行扩增并且纯化扩增的产物，如对于5’RACE所述。
另一个获得本发明的核酸的有用方法如大的基因组克隆是筛选BAC或P1基因组文库。BAC，细菌人工染色体是可以含有120+Kb插入片段的载体。BAC的基础是大肠杆菌F因子质粒系统，并且简单地以微克的量操作和纯化。因为，每个细胞中BAC质粒保持1到2个拷贝，利用可以在本方法中使用的YAC观察到的重排问题不存在了。BAC载体可以包括荧光素酶和绿荧光蛋白质(GFP)的标记基因(Baker(1997)核酸研究251950-1956)。P1是感染大肠杆菌的噬菌体，可以含有75-100kb的DNA插入片段(MeJia(1997)基因组研究7179-186；Ioannou(1994)Nat Genet684-89)，与多数同样的方法作为λ文库筛选。
利用本领域已知的部分核苷酸序列和各种方法扩展编码端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位，或它们的功能等当物的聚核苷酸序列，以便检测上游序列如启动子和调节元素。例如，Gobinda(1993)PCR应用方法2318-22，叙述了作为直接方法的“限制位点”聚合酶链式反应(PCR)，该方法利用了通用引物恢复与已知座位邻接的未知序列。首先，在存在接头序列的引物和特异于已知区的引物时扩增基因组DNA。将扩增的序列进行第二轮PCR，其中利用了同样的接头引物和另一个的第一个的内部特异引物。利用适当的RNA聚合酶转录每轮PCR的产物并通过逆转录酶测序。
利用已知区域基础上的趋异引物可以将逆PCR用于扩增或延伸序列(Triglia等人，核酸研究168186(1988))。利用OLIGO4.06引物分析软件(国家生物科学公司，Plymouth MN(1992))，或另一个适当程序设计引物长度为22-30核苷酸，具有GC含量为50％或更多，并且与靶序列在68E-72EC的温度下与靶序列退火。该方法利用了几个限制酶以便在基因的已知区产生适当片段。然后，将该片段通过分子内连接环化，并用作PCR模板。
捕获PCR(Lagerstrom等人，PCR应用方法1111-19(1991))，可以利用在人和酵母人工染色体DNA中与已知序列邻接的DNA片段的PCR扩增的方法。捕获PCR也需要多个的限制酶消化和连接以便将工程双链序列在PCR之前置于DNA分子的未知部分。
可以用于恢复未知序列的另一个方法是步行PCR(Parker等人，核酸研究193055-60(1991))，用于靶基因步行的方法。可选择地，PCR，嵌引物，PromoterFinderTM(Clontech，Palo Alto CA)和PromoterFinder文库可以用于在基因组DNA中跑步。这一过程避免了筛选文库的需要，并且可用于发现内含子/外显子接合。
筛选全长cDNA的优选文库是已经过大小选择，含有较大的cDNA的那些。同时，随机引导的文库是优选的，因为它们含有更多序列，这些序列含有基因的5’和上游区。随机引导的文库可能特别有用，如果低聚d(T)文库不产生全长cDNA。基因组文库可用于延伸进入5’非翻译调节区。
毛细管电泳可以用于分析大小或在测序或PCR产物中证实核苷酸序列。快速测序的系统可以从Perkin Elmer，贝克曼仪器(FullertonCA)，和其它公司获得。毛细管测序可以利用用于电泳分离的可流动聚合物，四种不同的荧光染料(每种核苷酸一种)，这些染料是激光活化的，通过电荷偶联的装置相机检测发射波长。利用适当的软件将输出信号/光强度转化成电信号(例如来自Perkin Elmer的GenotyperTM和SequenceNavigatorTM)，从样品的加载到计算机分析和电子数据展示的整个过程是计算机控制的。毛细管电泳是特别适于DNA的小片段的测序，这些片段可以在特定的样品中以有限量存在。在30分钟再生测序M13噬菌体DNA的高达350bp已有报道(Ruiz-Martinez等人，化学年评652815-8(1993))。
核苷酸序列的表达根据本发明，编码端粒酶，端粒酶蛋白质亚单位，或它们的功能等当物的聚核苷酸序列可以用于重组DNA分子，该重组分子通过适当的寄主细胞指导端粒酶或端粒酶亚单位的表达。
本发明的核苷酸序列可以工程化，目的是因为各种原因改变一个或两个端粒酶亚单位，包括但不限于修饰基因产物的克隆，加工和/或表达和/或活性的改变。例如，利用本领域已知的技术可以导入突变(这些技术如位点特异诱变以便插入新的限制性位点，改变糖基化方式，改变优先密码子，产生拼接变异体，改变活性，等等)。
表达系统为了表达生物活性端粒酶蛋白质亚单位，将编码亚单位或功能等当物的核苷酸序列插入适当的表达载体(即，含有必要元素的载体用于插入编码序列的转录和翻译)。为了表达生物活性端粒酶，将编码端粒酶蛋白质亚单位的核苷酸序列插入适当的表达载体，将编码端粒酶RNA亚单位的核苷酸序列插入同一或另一个载体用于RNA表达。然后在相同细胞中表达该蛋白质或RNA亚单位或分别单独地表达，然后，混合以便获得再构成的端粒酶。
本领域的技术人员已知的方法可以用于构建含有端粒酶蛋白质亚单位序列和适当的转录或翻译控制的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术，和体内重组或遗传重组。在Sambrook等人中叙述了这样的技术(Sambrook等人，分子克隆，实验室手册，冷泉港出版社，Plainview纽约(1989))，和Ausubel等人(Ausubel等人，分子生物学中目前的方案，John Wiley和Sois，纽约NY(1989))。这些同样的方法可以用于转换UGA密码子成为寄主表达系统识别的UGU或UGC密码子，这些UGA密码子编码Euplotes中的半胱氨酸。
各种表达载体/寄主系统可以用于包含和表达编码端粒酶亚单位的序列。这些包括但不限于微生物如利用重组噬菌体，质粒或柯斯质粒DNA表达载体转化的细菌；利用酵母表达载体转化的酵母；利用病毒表达载体感染的昆虫细胞系统(例如，杆状病毒)；利用病毒表达载体(例如，花椰菜病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)转染或利用细菌病毒载体转化(例如，Ti或pBR322质粒)的植物细胞系统或动物细胞系统。
这些系统的“控制元素”或“调节序列”在长度和特异性上是变化的，并且是载体，增强子，启动子，和3’未翻译区的非翻译区，这些区域与寄主细胞蛋白质作用以便进行转录和翻译。根据载体系统和利用的寄主，可以利用任何数目的适当转录和翻译元素，包括组成型和可诱导启动子。例如，当在细菌系统中克隆，可以使用如Bluescript噬菌体质粒(Stragene.La Jolla CA)或pSportl(Gibco BRL)和ptrp-lac杂合体的杂合lacZ启动子和诸如此类的可诱导启动子。在昆虫细胞中可以使用杆状病毒多面体启动子。起源于植物细胞基因组(例如，热休克，RUBISCO；和储藏蛋白质基因)或植物病毒(例如，病毒启动子或引导序列)的启动子或增强子可以克隆进入载体。在哺乳动物细胞系统中，来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子是最适当的。如果必须产生花叶编码端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位的序列的多重拷贝的细胞系，基于SV40或EBV的载体可以与适当的可选择标记一起使用。
在细菌系统中，根据打算的端粒酶蛋白质或亚单位的使用可以选择许多病毒载体。例如，当大量的端粒酶蛋白质，亚单位，或肽是抗体诱导所需要的，指导容易纯化的融合蛋白高水平表达的载体是符合需要的。这样的载体包括但不限于，多重功能大肠杆菌克隆和表达载体如Bluescript(Stratagene)，其中编码端粒酶或蛋白质亚单位的序列可以连接到载体的编码氨基末端的Met和随后的7个β半乳糖苷酶的残基序列框架内，以致产生了杂合蛋白(例如，pin载体；Van Heeke和Schuster，生物化学杂志，2645503-5509(1989))和诸如此类的载体。pGEX载体(Promega，Madison WI)也可以用于表达外源多肽如含有谷胱苷肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。总的来说，这样的融合蛋白是可溶的，并且可以容易地通过吸收到谷胱苷肽-琼脂糖小珠，接着在存在游离谷胱苷肽时洗脱从溶解的细胞进行纯化。在这样的系统中生产的蛋白质可以设计成含有肝素，凝血酶，或因子Xa蛋白酶切割位点，以致需要的克隆多肽可以从GST成分中根据意愿释放。
在酵母，啤酒酵母中，可以使用许多载体，它们含有组成型或可诱导的启动子，例如α因子，乙醇氧化酶，和PGH。综述可以参见Ausubel等人(出处同上)和Grant等人，酶学方法，153516-544(1987)。
在使用植物表达载体的情况中，编码端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位的序列的表达可以由任何数目的启动子驱动。例如，可以单独或与来自TMV的Ω引导序列(Takamatsu等人，EMBO J，6307-311(1987))联合使用病毒启动子如CaMV的35S和19S启动子(Brisson等人，自然310511-514(1984))。可选择地，可以使用植物启动子如RUBISCO的小亚单位(Coruzzi等人，EMBO J.，31671-1680(1984)；Broglie等人，科学224838-843(1984))或热休克启动子(Winter和Sinibaldi Results Probl.细胞分化，1785-105(1991))。这些构建体可以通过直接的DNA转化或致病原介导的转染导入植物细胞(这些技术的综述参见Hobbs或Murry，McGraw Hill科学和技术年册，McGraw Hill纽约，NY，pp191-196(1992)；Weissbach和Weissbach，植物分子生物学方法，学术出版社，纽约，NY，pp421-463(1988))。
可以用于表达端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位的可选择表达系统是昆虫系统。在一个这样的系统中，将Autographa californica核多角体病毒(AcNPV)在Sodoptera frugiperda细胞或在Trichoplusia幼虫中用作载体表达外源基因。可以将编码需要的端粒酶亚单位的序列克隆进入病毒的非必要区，如多角体基因，并置于多角体启动子的控制下。编码端粒酶蛋白质或端粒酶蛋白质亚单位的序列的成功的插入将使多角体基因失活，并产生缺乏包衣蛋白的重组病毒。然后，重组病毒可以用于感染S.frugiperda细胞或Trichoplusia幼虫，其中端粒酶亚单位序列得到表达(Smith等人，病毒学杂志，46584(1983)；Engelhard等人，美国科学院年报，913224-7(1994))。
在哺乳动物寄主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在将腺病毒用作表达载体的情况中，编码端粒酶蛋白质或端粒酶蛋白质亚单位的序列可以连接到腺病毒转录/翻译复合物，该复合物是由晚期启动子和三联引导序列组成的。病毒基因组插入在非必要E1或E3区将产生能够在感染寄主细胞中表达的存活病毒(Logan和Shenk，美国科学院年报，813655-59(1984))。另外，转录增强子，如劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子可以用于增强哺乳动物寄主细胞中的表达。
编码端粒酶蛋白质亚单位的序列的有效翻译也需要特异的起始信号。这些信号包括ATG起始密码和连接序列。在寄主细胞表达编码端粒酶蛋白质亚单位的序列的情况中，可以将它的起始密码和上游序列插入最合适的表达载体中，并且可能不需要其它翻译控制信号。但是，在只有编码序列，或其一部分插入，或细胞的调节环境将抑制转录的情况中，可以提供包括ATG起始密码的外源转录控制信号。起始密码应该处于正确的读码框架中以便保证整个插入片段的转录。外源转录元素和起始密码可以是各种起源的，天然和合成的。表达的效力可以通过适于使用的细胞系统的增强子的参与而增强(Scharf，等人，细胞分化问题的结论，20125(1994)；和Bittner等人，酶学方法，153516(1987))。
另外，从调节插入序列的表达或以需要的方式加工表达蛋白的能力可以选择寄主细胞菌株。多肽的这样的修饰包括但不限于，乙酰化，羧化，糖基化，磷酸化，脂化，和酰基化。切割蛋白质的“前原”形式的翻译后加工也可能对于准确的插入，折叠和/或功能是重要的。不同的寄主细胞如CHO(ATCC CCL61和CRL9618)，HeLa(ATCC CCL2)，MDCK(ATCC CCL34和CRL6253)，HEK293(ATCC CRL 1573)，WI-38(ATCC CCL 75)(ATCC美国典型培养物收藏中心，Rockwille，MD)具有这样的翻译后活性的特异细胞机器和特征性机制，并且可以选择不同的寄主细胞以便保证准确的修饰和导入的，重组蛋白质的加工。
对于重组蛋白质的长期的，高产量的生产，稳定的表达是优选的。例如，利用表达载体可以转化稳定表达的端粒酶或端粒酶亚单位蛋白质的细胞系，所述表达载体含有复制的源点或内源表达元素和可选择标记基因。在导入载体后，可以允许细胞在丰富培养基中生长1-2或更多天，然后，转移到选择培养基中。选择性标记的目的是给予对选择的抗性，它的存在允许细胞的生长和回收，这些细胞成功地表达了导入序列。稳定转化细胞的抗性簇可以利用适于细胞类型的组织培养技术增殖。
可以使用任何数目的选择系统回收转化的细胞系。这些选择系统包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，细胞11223-32(1977))和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，细胞22817(1980))基因，这些基因可以分别用于tk-或aprt-细胞。同时，抗代谢，抗生素或除草剂抗性可以用作选择的基础；例如dhfr给予氨甲喋呤抗性(Wigler等人，美国科学院年报，773567(1980))；npt，给予氨基糖苷新霉素和G-418抗性(Colbere-Garapin等人，分子生物学杂志，1501(1981))，和als或pat，分别授予对绿黄隆和膦丝菌素酰基转移酶的抗性(Murry，在McGrawHill科学和技术的年册，McGraw Hill，纽约，NY，pp191-196，(1992))。另外，已经叙述了可选择基因，例如，trpB，该基因允许细胞利用吲哚替代色氨酸，或hisD，该基因允许细胞利用histinol替代组氨酸(Hartman和Mulligan，美国科学院年报，858047(1988))。最近，可见标记物的利用已经获得含有这样的标记如花色素甘，β葡萄糖苷酶和它的底物，GUS，和荧光素酶和它的底物，荧光素的群体，这些标记不仅广泛用于鉴定转化体，而且用于对归功于特异的载体系统的短暂或稳定蛋白质表达的量进行定量(Rhodes等人，分子生物学方法，55121(1995))。
核酸杂交技术本文公开的杂交技术可以用于鉴定，分离和鉴定编码本发明的TRT蛋白质的基因和基因产物(即mRNA)，包括来自不同种类的TRT和各种种类中的TRT的等位基因变化。利用核酸杂交技术的特异的DNA和RNA检测和测量的各种方法是本领域技术人员已知的。参见，核酸杂交，实验方法，Hames，B.D和Higgins，S.J.IRL出版社，1985；Gall(1989)美国科学院年报63378；和Sambrook。根据应用，DNA杂交形式的选择经常是可任意选择的。例如，评估样品中编码端粒酶蛋白质的DNA的存在或缺乏的方法包括Southern转移。简要地说，核酸样品，如消化的DNA或mRNA，在琼脂糖平板胶或缓冲液中的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并且转移到膜上。利用核酸探针进行杂交。对于本发明的TRT核酸，核酸探针可以含有在TRT核酸属之间保守的核酸序列。优选地，核酸探针是10到20到30或更多碱基或更长的长度(参见，Sambrook，在核酸杂交中利用的选择核酸探针序列的方法)。编码TRT蛋白质的DNA或RNA的存在或缺乏的定量和定性测量可以根据本方法进行。
同样，正如许多例子中的一个，Northern转移可以用于编码端粒酶的蛋白质的mRNA的检测。例如，利用酸胍-酚-氯仿提取方法可以从给定的细胞样品中分离mRNA。然后，电泳mRNA以便分离mRNA种类，并且将mRNA从凝胶转移到硝酸纤维膜上。正如Southern转移，探针，如标记探针或PCR扩增产物可以用于鉴定端编码粒酶蛋白质核酸的存在或缺乏。本发明的hTRT mRNA经常在细胞中表达，表达的水平是低的以致通过Northern影印检测，甚至利用最敏感的测试检测非常困难。这甚至在高水平表达hTRTmRNA的细胞如不灭的和癌症细胞中也是事实。由于端粒酶mRNA的表达水平通常非常低，下面叙述了最适Northern影印方法。
在这样的细胞中可以看到的低水平的TRT蛋白质反映了低水平的端粒酶mRNA，甚至在TRT阳性细胞中，即表达端粒酶活性的细胞，如癌细胞。通过本发明的检测方法可以检测这样的蛋白质，包括免疫影印(Western影印)。利用敏感的Western影印系统可以检测人癌细胞系293中的TRT蛋白质，其中利用了本发明的抗端粒酶多克隆抗血清，虽然Western影印上的TRT信号是微弱的，部分地表明hTRT甚至在不灭细胞中低或非常低的量存在。
夹心测试在商业上可用于杂交测试以便检测或分离蛋白质或核酸。这样的测试利用了，共价地固定在固体支持物的“捕获”核酸或蛋白质通常在溶液中和标记的“信号”核酸。临床或其它样品提供了靶核酸或蛋白质。“捕获”核酸或蛋白质和“信号”核酸或蛋白质与靶核酸或蛋白质杂交或结合形成“夹心”杂交复合物。为了有效，信号核酸或蛋白质不能与捕获核酸或蛋白质真正杂交或结合。
通常，低聚核苷酸探针是标记的信号核酸，它们可用于检测杂交。可以标记互补的探针核酸或信号核酸以用于任何一种或几种方法，这些方法通常用于检测杂交聚核苷酸的存在。检测的方法可以利用放射自显影或荧光自显影的标记物，例如3H，125I，35S，14C，或32P标记的探针或诸如此类(参见标记的定义，如上所述)。其它标记物包括与标记的抗体，荧光团，化学荧光试剂，酶，和抗体结合的配体，这些配体可以作为标记的配体的特异结合对成员。
杂交复合物的检测可能需要产生信号的复合物与靶和探针聚核苷酸或核酸的二倍体结合。通常，这样的结合通过配体和抗配体相互作用发生，如发生在配体共轭探针和与信号共轭的抗配体即抗体-抗原或互补核酸结合之间发生。例如，标记是半抗原或抗原，抗原通过利用抗体检测样品。在这些系统中，通过将荧光或酶分子附着于抗体，或在一些情况中，通过放射性标记的附着产生信号。杂交测试的敏感度可以通过利用靶核酸或信号扩增系统增强，这一系统将靶核酸或待检测的信号加倍。适于扩增用作分子探针的序列或适于产生用于随后的克隆核酸片段的体外扩增技术如上所述是已知的。这些系统可以用于直接鉴定等位基因的变化，或突变序列，这些序列中PCR或LCR引物或其它试剂设计成只有当特异的序列存在时才延伸或连接。可选择地，通常可以利用例如更多遗传PCR引物和后来探测或测序的扩增的靶区扩增特异的序列以便鉴定等位基因或突变的指示特异序列。
将会认识到的是核酸杂交测试也可以在排列基础方式中进行。不同“探针”或“靶”核酸(或其它化合物)的多重排列与靶核酸杂交。在这种方式中，大量的不同杂交反应可以基本“平行”地进行。这提供了快速，基本同时的大数目的反应剂的评估。在排列基础的方式中进行的杂交反应的方法是本领域的技术人员已知的，例如，Jackson(1996)自然生物技术，141685；Chee，科学274610(1995)。
确定编码蛋白质的基因的表达水平的可选择方法是原位杂交。原位杂交测试是已知的并且通常在Angerer(1987)酶学方法152649中叙述了。在原位杂交测试中，将细胞固定在固体支持物上，通常是玻璃片，或通过荧光活化细胞分拣器(FACS)分析。如果DNA是待探测的，通常利用热或碱使细胞变性。然后将细胞与杂交溶液接触，温度适中，允许标记探针与编码蛋白质的核酸序列特异性地退火。该探针通常是，即利用放射性同位素或荧光报道分子标记的。同时参见美国专利号5,583,016和USSN08/770,564和08/770,565,两个专利是1996年12月20日递交的；同时参见Soder(1997)癌基因141013-1021，其中叙述了例如hTR的原位杂交。原位杂交技术中的另一个已知技术是所谓的FISH荧光原位杂交，如Macechko(1997)组织化学细胞化学杂志，45359-363；和Raap(1995)人分子遗传学4(4)，529-534中所述。
含有聚核苷酸序列的转化体的鉴定虽然存在/缺乏标记基因表达表明也存在需要的基因，需要基因的存在和表达是可以证明的。例如，如果编码端粒酶蛋白质亚单位的序列插入在标记基因序列内，含有编码端粒酶蛋白质亚单位的序列的重组细胞可以通过标记基因功能的缺乏得到鉴定。可选择地，可以将标记基因与编码端粒酶蛋白质亚单位的序列一起串联置于单个启动子的控制下。应答诱导或选择的标记基因的表达通常同样表明串联序列的表达。
可选择地，含有端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位的编码序列和表达端粒酶或蛋白质亚单位的寄主细胞通过利用本发明的方法和试剂，本领域技术人员已知的各种标准方法得到鉴定。这些方法包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白质生物测试或免疫测试技术，其中包括膜，溶液，或基于嵌片的技术以便检测和/或定量检测核酸或蛋白质。
利用编码亚单位的序列的探针，部分或片段的DNA-DNA或DNA-RNA杂交或扩增可以检测编码端粒酶蛋白质亚单位的聚核苷酸序列的存在。基于核酸扩增的测试包括使用基于核酸序列的聚核苷酸或低聚物以便检测含有编码端粒酶亚单位的DNA或RNA的转化体。如本文所用，“低聚核苷酸”或“低聚物”指约10个核苷酸或更多和多达100个的核苷酸的核苷酸序列，优选地在15到30个核苷酸之间，更优选地在20-25个核苷酸之间，它们可以用作探针或扩增引物。
利用特异于蛋白质的多克隆或单克隆抗体的检测和测量蛋白质表达的各种标准方法是本领域已知的。例子包括酶联免疫吸附测试(ELISA)，放射性免疫测试(RIA)和荧光活化细胞分拣(FACS)。这些和其它测试在其它地方中有叙述，如在Hampton等人，血清学方法，实验室手册，APS出版社St Paul MN(1990))和Maddox等人，实验方法杂志，1581211(1983))。
各种标记物和共轭技术是本领域技术人员已知的，可以用于各种核酸和氨基酸测试。用于产生标记杂交的手段或检测相关序列PCR探针包括低聚标记，缺口翻译，末端标记或PCR扩增，其中利用了标记核苷酸或引物。可选择地，端粒酶蛋白质亚单位序列，或它的许多部分可以克隆到载体用于生产mRNA探针。这样的载体是本领域已知的，是商业可得的，并且通过加入了适当的RNA聚合酶如T7，T3或SP6和标记核苷酸可以用于体外合成RNA探针。
许多公司如Pharmacia Biotech(PiscatawayNJ)，Promega(MadisonWI)，和美国生物化学公司(Cleveland OH)供应这些方法的商业试剂盒和方案。适当的报道分子或标记物包括那些放射性核素，酶，荧光，化学发光素，或产色试剂以及底物，协同因子，抑制剂，磁颗粒和诸如此类。涉及这些标记物的使用的专利包括美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241，它们引入本文作为参考。同时，如在引入本文作为参考的美国专利号4,816,567所示可以产生重组免疫球蛋白。
端粒酶和端粒酶亚单位蛋白的纯化除了下面的实施例3中纯化TRT种类的说明性方法，受到涉及的是根据本发明的方法使用纯化(回收)来自天然来源的TRT或重组产生的端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位的其它方法。下面叙述了用于本发明的方法中的纯化端粒酶和组合物的方法的例子。
可溶性分级分离如果蛋白质混合物是复合物，起始的盐分级分离可以将需要的重组蛋白质与许多不需要的寄主细胞蛋白质(或起源于细胞培养基的蛋白质)分离开。优选的盐是硫酸铵。通过有效减少蛋白质混合物中的水的量硫酸铵沉淀了蛋白质。然后，基于它们的可溶性蛋白质沉淀。蛋白质越疏水，它更容易在低硫酸铵浓度时沉淀。常见的方案是在蛋白质溶液中加入饱和硫酸铵，以致得到的硫酸铵浓度是20-30％。这将沉淀最疏水的蛋白质。丢弃沉淀(除非需要的蛋白质是疏水)在上清液中加入硫酸铵到已知能够沉淀需要的蛋白质的浓度。然后，在缓冲液中溶解沉淀，如果需要除去过量的盐，使用的方法是透析或渗滤。依赖蛋白质的可溶性的其它方法如冷乙醇沉淀是本领域技术人员已知的，并且可以用于分级分离复合物蛋白质混合物。
大小差别过滤如果需要的蛋白质的大小是已知的，或者可以从cDNA序列估计，正如TRT蛋白质的属和本文的说明性种类的情况，较大和较小大小的蛋白质可以采用超滤通过不同孔大小的膜(例如，Amicon或Millipore膜)除去。正如第一步，通过膜超滤蛋白质混合物，该膜的孔的大小具有的截止低分子量低于需要的蛋白质的分子量。然后，对截止分子量大于需要的蛋白质的分子量的膜超滤前面超滤滞留物。重组蛋白质将通过膜进入过滤物。然后，将过滤物色谱层析。
柱层析基于大小，静表面电荷，疏水性和配体的亲和性可以分离蛋白质。另外，抗蛋白质的抗体可以与柱基质和免疫纯化的蛋白质共轭。所有这些常用的方法是本领域已知的，参见，Scopes，R.K.，蛋白质纯化原理和实践，第二版，Springer Verlag，(1987)。色谱层析技术可以在任何规模和利用来自许多不同的制造商(例如，Pharmacia Biotech)的仪器进行。蛋白质浓度可以利用任何技术确定，例如，在Bradford(1976)生物化学年评，72248-257。
TRT的纯化通过如上所述本发明提供的任何方法可以纯化端粒酶。在本发明的一个实施方案中，端粒酶可以纯化到超过细胞质粗细胞制剂的60,000倍的纯度。人TRT可以从“293”细胞，人胚胎肾来源的细胞的粗提取物进行纯化，这些细胞已经用腺病毒5型DNA的片段转化(Graham(1977)病毒遗传杂志，3659-77；Stillman(1985)分子和细胞生物学52051-2060)。293细胞是从美国典型培养物收藏中心，登记号ATCC CRL1573获得的。
包括在纯化方法中的步骤是取决于需要的纯化的水平的。从含有有机生物分子，例如，端粒酶阳性细胞的粗提取物的不纯的组合物中纯化端粒酶或TRT蛋白质到至少60,000倍于粗提取物(约4％的相对纯度)的方法可以例如包括(1)将端粒酶或TRT蛋白质与第一个结合带有负电荷的分子的基质，例如POROS50HQ接触，从其它与基质不结合的有机生物分子中分离端粒酶或TRT蛋白质和回收端粒酶；(2)将端粒酶或TRT蛋白质与结合带有正电荷的分子的基质，例如POROS肝素20HE-1接触，和将其它不结合基质的有机生物分子与端粒酶或TRT蛋白质分开，回收端粒酶；(3)将端粒酶或TRT蛋白质与结合带有负电荷的分子的第二个基质如SOURCE15Q接触，从其它不结合基质的有机生物分子中分离端粒酶或TRT蛋白质，回收端粒酶；(4)将端粒酶或TRT蛋白质与具有端粒酶或TRT蛋白质或RNA亚单位特异亲和性的亲和试剂例如与hTR或抗TRT或抗端粒酶抗体或其它蛋白质互补的低聚核苷酸接触，从其它不结合亲和试剂的有机生物分子中分离端粒酶或TRT蛋白质和收集端粒酶或TRT蛋白质；和(5)根据分子大小，形状，或浮力密度从其它有机生物分子中分离端粒酶或TRT蛋白质，例如根据在TosoHaas TSK-gel*G5000PWXL大小柱上的大小分离分子和收集端粒酶或TRT蛋白质。本发明包括更少或其它步骤的方案。
纯化方案也可以包括步骤将端粒酶或TRT蛋白质与中间产物选择性基质接触，从不结合中间产物选择性基质的其它有机生物分子分离端粒酶和收集端粒酶，优选地在亲和步骤之前。通过改变，纯化方案的步骤，改变纯化方案的顺序，或减少纯化方案的步骤可以分离端粒酶到不同的纯度水平。但是，任何优选的方案通常包括将端粒酶与亲和试剂如本发明的抗体接触端粒酶与至少一种结合携带负电荷或正电荷的分子的基质接触通常是包括在该方案的一个或几个优选的步骤。。
氨基酸序列确定通过本领域已知的技术例如Edman降解可以确定本发明的端粒酶，TRT蛋白质和端粒酶相关蛋白质的说明性氨基酸序列。除了内部序列(参见，Hwang(1996)J.Chromatogr.B.Biomed，Appl.686165-175)通过本领域已知的技术可以进行M末端测序。对于C末端序列测定，如Thiede(1997)当前生物化学杂志244750-754所述，可以利用用于肽的降解的化学方法和基质-辅助-激光吸收离子化基质光谱(MALDI-MS)分析。
分子量/等电点确定通过许多本领域技术人员已知的方法可以确定蛋白质的分子量。一些确定的方法包括SDS凝胶电泳，天然凝胶电泳，分子排除层析，区带离心，质谱学，和基于测序计算。不同技术的结果之间的差异可能是由于技术内在的因子。例如，天然凝胶电泳，分子排除色谱层析和区带离心是取决于蛋白质的大小。富半胱氨酸的蛋白质可以形成许多分子内和分子间二硫键。SDS凝胶电泳取决于是SDS与蛋白质中存在的氨基酸结合。一些氨基酸结合SDS比其它的更紧密，所以，基于它们的氨基酸组成蛋白质将迁移到不同位置。质谱学和从序列计算分子量部分依赖蛋白质中存在的特定氨基酸的频列和特定氨基酸的分子量。如果，蛋白质是糖基化的，质谱学分析的结果将反映糖基化，但是计算分子量可能不能反映糖基化。
hTRT(SEQ ID NO118)的计算分子量估计是约127千道尔顿。但是，本发明的范围内的其它人或非人TRT蛋白质，hTRT，hTRT同工型和其它TRT种类不局限于这一分子量范围。
通过天然凝胶(或盘状)电泳，等电点聚焦或在优选的方法中通过计算给出蛋白质的氨基酸含量可以确定蛋白质的等电点。已经计算出hTRT(SEQ ID NO118)的等电点(pI)约为11.3。但是，在本发明范围内的TRT种类或同工型不必定局限于这一范围的等电点。
cDNA克隆pGRN121是从实施例17中所述的人293细胞系的文库分离并且编码功能hTRT(cDNA是SEQ ID NO118)。SEQ ID NO117编码具有SEQ ID NO118的序列的催化活化端粒酶蛋白质。SEQ IDNO118的多肽具有1132个残基和约127千道尔顿(KD)的计算分子量。将克隆#712562(SEQID NO122)与pGRN121比较显示克隆#712562在基序A和B’之间具有182个碱基对缺失。存在于pGRN121中的其它182个碱基在单个开放读码框架中放置了所有TRT基序，增加了基序A和基序B’区之间的间隔到与其它已知TRT一致的距离。
从重组来源可以生产和纯化TRT。例如，在各种适于从细胞培养物表达和回收编码的蛋白质的条件下可以培养用编码端粒酶或端粒酶亚单位蛋白质的核苷酸序列转化的寄主细胞。重组细胞产生的蛋白质可以基于使用的序列和/或载体分泌出来或包含在细胞内。正如本领域技术人员能够理解的，含有编码端粒酶或亚单位蛋白质的序列的表达载体可以设计成含有信号序列，它可以指导通过原核细胞或真核细胞膜分泌端粒酶或端粒酶亚单位蛋白质。其它重组构建体可以将编码端粒酶或亚单位蛋白质的序列与编码多肽区的核苷酸序列连接起来。
端粒酶或端粒酶亚单位蛋白质也可以作为重组蛋白质表达，该重组蛋白质含有加入的一种或多种其它多肽区以便简化蛋白质纯化或其它目的或打算的应用。这样的简化纯化区包括，但不限于金属螯合肽如痕量聚组氨酸和组氨酸-色氨酸调节子，它们允许在固定的金属上纯化，还包括蛋白质A区，允许在固定的免疫球蛋白上纯化，和在FLAGS扩展/亲和纯化系统(Immunex公司，SeattleWA)中使用的区域。包含的可切割接头序列如在纯化区和端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位之间的因子Xa或肠激酶(Invitrogen，圣迭戈CA)可用于简化纯化过程。一个这样的表达载体提供融合蛋白质的表达，该蛋白质含有编码端粒酶和端粒酶亚单位的序列和编码6个组氨酸残基接着硫氧还蛋白或肠激酶切割位点的核酸序列。组氨酸残基简化了纯化过程而肠激酶裂解位点提供了从融合蛋白质纯化端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位的方法。涉及含有融合蛋白质的载体的文献在本领域可以得到(参见，例如Kroll等人，DNA细胞生物学，12441-53(1993))。
TRT序列的化学合成在本发明可选择的实施方案中，除了重组生产，可以利用本领域已知的化学方法，合成编码端粒酶亚单位的整个或部分序列(参见，例如，Caruthers等人，核酸研究Symp.Ser.，215-223(1980)；和Horn等人，核酸研究Symp.Ser.，225-232(1980))。可选择地，蛋白质本身可以利用化学方法产生，以便合成整个或部分端粒酶亚单位氨基酸序列。例如，利用各种固相技术(Roberge，等人，科学269202(1995)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149(1963))可以进行肽合成，并且例如根据制造商提供的说明利用ABI431A肽合成仪(Perkin Elmer)可以获得自动合成。可以化学地分开合成端粒酶蛋白质亚单位的各种片段并利用化学方法联合以便产生全长或更大分子。
通过如上所述的制备性高效液相色谱层析可以基本纯化新合成的肽(例如，Creighton，蛋白质，结构和分子原理，WH Freeman和Co，纽约，NY(1983))。通过氨基酸分析或测序可以证明合成肽的组成(例如，Edman降解过程；Creighton，出处同上)。另外，在直接合成过程中可以改变端粒酶亚单位蛋白质或其任何部分的氨基酸序列，和/或利用化学方法与来自其它蛋白质或其任何部分的序列联合，以便产生变异多肽。
通过各种溶液或固相方法核酸也可以合成地产生包括低聚核苷酸探针和引物，TRT编码序列，反义，核酶和诸如此类，。通过亚磷酸三酯，磷酸三酯，和H-磷酸酯化学的核酸的固相合成的方法的详细说明是广泛可得的。例如，利用自动合成仪的Beaucage和Carruthers的固相亚磷酰胺三酯方法在下面文献中有叙述Itakura，美国专利号4,401,796；Carruthers，美国专利号，4,458,066和4,500,707；Carruthers(1982)遗传工程41-17；参见Needham-VanDevanter(1984)核酸研究126159-6178；Beigelman(1995)核酸综述，233989-3994；Jones，第2章，Atkinson，第3章，和Sproat，第4章，低聚核苷酸合成实践途径，Gait(ed)，IRL出版社，华盛顿D.C.(1984)；Froehler(1986)四面体通信27469-472；Froehler，核酸研究145399-5407(1986)；Sinha，四面体通信，245843-5846(1983)；和Sinha，核酸研究124539-4557(1984)。纯化低聚核苷酸的方法包括天然聚丙烯酰胺凝胶电泳，阴离子交换HPLC，如Pearson(1983)色谱层析杂志255137-149中所述。利用化学降解方法例如，参见Maxam(1980)酶学方法，65499-560Xiao(1996)反义核酸药物研制6247-258，或固相化学降解方法，Rosenthal(1987)核酸Symp Ser 18249-252可以验证合成的低聚核苷酸的序列。
与端粒酶和端粒酶亚单位蛋白质相关的方法本文公开的核苷酸和肽序列部分是基于在本发明的开发和实施和产生的过程中观察到的E.aediculatus端粒酶123千道尔顿蛋白质亚单位，酵母蛋白质L8543.12(Est2)，裂殖酵母，和人基序之间的同源性。具体地说，酵母和123千道尔顿蛋白质在它们的C末端区含有逆转录酶基序，它们在逆转录酶基序以外的区域拥有相似性，它们同样是碱性的(123千道尔顿蛋白质具有的pI为10.1，酵母的为10.0)，它们都是大的(123千道尔顿和103千道尔顿)。另外，考虑到逆转录酶基序，确信它们的亚单位是含有它们各自的端粒酶的催化核心的。确实，在本发明中显示的123千道尔顿的E.aediculatus端粒酶蛋白质亚单位的逆转录酶基序可用于鉴定其它生物体中的相似序列。
由于E.aediculatus和啤酒酵母在系统发育上是远缘的，受到涉及的是这一同源性提供了强大的基础用于预测人和其它端粒酶将含有大，碱性的蛋白质并且含有这样的逆转录酶基序。确实，在编码TRT蛋白质的人同系物的克隆内已经鉴定了基序。另外受到涉及的是这一蛋白质是人端粒酶催化活性所必需的。这样发现证明对于通过PCR和其它方法扩增人端粒酶基因是有价值的。本发明的方法和试剂已经应用于在人和其它动物中筛选端粒酶序列以及通过遗传，生物化学，或核酸杂交方法鉴定候选端粒酶蛋白质或基因。同时受到涉及的是本发明的端粒酶蛋白质可发现可用于“加尾”或体外延伸染色体或其它DNA的3’末端。
受到涉及的是端粒酶和/或端粒酶亚单位蛋白质在细胞系中的表达将发现在肿瘤和老化因子的诊断剂的研制中的用途。核苷酸序列可以用于杂交或PCR技术以便诊断在疾病早期诱导mRNA序列的表达。同样，蛋白质可以用于产生用于ELISA测试的抗体或衍生物或其它诊断方式。这样的诊断测试允许区分不同类别的人肿瘤或其它细胞增殖疾病，从而简化适当的治疗方法的选择。
受到涉及的是在本发明的端粒酶蛋白质中的逆转录酶基序的发现将用于开发已知的测试方法，并仍然有待叙述逆转录酶抑制剂包括核苷，和非核苷的抗端粒酶活性。
受到涉及的是本文公开的氨基酸序列基序将导致用于人和/或其它动物中使用的药物(例如，端粒酶抑制剂)的开发，这将在细胞增殖为特征的癌症或其它紊乱中终止细胞分裂。同时受到涉及的是端粒酶蛋白质将发现在靶击和指导RNA或限定RNA的药物到特异的亚细胞部分如核或亚核细胞器，或到端粒上的方法中的用途。
在本发明的诊断方法的一个实施方案中，将端粒酶mRNA表达的正常或标准值确定为基准。这可以通过许多测试如利用起源于本文提供的端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位序列的核酸探针(DNA或RNA形式)，利用本领域已知的技术(例如，Southern影印，Northern影印，点或条影印)定量取自动物受试者，动物或人的组织中的端粒酶mRNA的量。从正常样品中获得的标准值可以与从来自受疾病(例如肿瘤或与老化相关的紊乱)潜在影响的的受试者获得的值相比。在标准和受试者值之间的差异可以确定存在疾病状态。另外，差异可以表明在疾病状态中的特定的临床结果(例如，转移的或非转移的)。
编码端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位的核苷酸序列当置于表达载体中时可用于产生各种量的治疗用途的蛋白质。端粒酶基因的反义核苷酸序列在设计用于基因治疗的载体中有潜在用途，基因治疗涉及包括转移的瘤形成。另外，端粒酶表达的抑制可以用于检测老化过程中的紊乱的发展或化学治疗过程中发生的问题。可选择地，编码核苷酸序列的端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位可以用于指导原位端粒酶或亚单位的表达，这种表达是增强端粒酶活性量需要的。
端粒酶亚单位蛋白质抗体本发明同时提供了通过各种方法检测或定量端粒酶和/或TRT或其它端粒酶亚单位蛋白质，如Euplotes p43(43千道尔顿)蛋白质和它的人同系物的方法和试剂。例如，通过掺入本发明的功能活性测试，通过利用本发明提供的各种抗端粒酶抗体的免疫测试，和通过基于核酸的方法可以检测和定量端粒酶，其中的例子下面详细叙述了。
在一个实施方案中，本发明提供了特异地结合hTRT或通常结合TRT的抗体，所以可以用于鉴定和分离本发明提供的TRT属的任何成员，或鉴定端粒酶或hTRT的单个种类。可以鉴定该属的任何成员的抗体可以通过用作抗原的含有该属的所有成员或其它特异于TRT的表位共有的结构特征的抗原肽产生。上面同样叙述了端粒酶的这些共同结构特征。通常，本发明的抗体可以用于鉴定，纯化，或抑制端粒酶和TRT蛋白质的任何或所有活性。抗体可以各种方式作为端粒酶活性的拮抗剂，作用方式例如通过防止端粒酶复合物或核苷酸与它的DNA底结合，防止端粒酶成分形成活化复合物，通过维持功能(端粒酶复合物)四级结构，或通过结合到一个酶活性位点或其它位点，这些位点对活性具有别构效应(端粒酶的不同部分活性在本申请书以外已经详细叙述了)。下面将叙述生产本发明的抗体的一般方法。
另外应该受到涉及的是发现抗端粒酶亚单位蛋白质的抗体，包括抗TRT基序的那些，在与端粒酶的表达(包括过度表达和缺乏表达)相关的症状和疾病的诊断和治疗中的用途。
这样的抗体包括，但不限于多克隆，单克隆，嵌合，单链，Fab片段和由Fab表达文库产生的片段。
由于在123千道尔顿的Euplotes端粒酶的亚单位中的逆转录酶基序的系统发育的保存，受到涉及的是抗这一亚单位的抗体将用于鉴定其它生物体包括人的同源亚单位例如，hTRT和Euplotes43千道尔顿(p43)TRT多肽的人同系物，另外应该受到涉及的是发现抗本发明提供的基序的抗体在应用的治疗和/或诊断区域的用途。
用于抗体诱导的端粒酶亚单位蛋白质不需要保留生物活性；但是，蛋白质片段或低聚肽必须是免疫原性的，优选地，抗原的。用于诱导特异抗体的肽可能具有包括至少5个氨基酸，优选地至少10个氨基酸组成的氨基酸序列。优选地，它们应该模仿天然蛋白质的氨基酸序列部分，并且可能含有小的，天然存在的分子的整个氨基酸序列。端粒酶亚单位蛋白质氨基酸的短序列可以与另一个蛋白质如钥孔戚血蓝蛋白和产生的抗嵌合分子的抗体的那些融合。用于抗体诱导的完全的端粒酶可以通过蛋白质和RNA成分在细胞中的共表达产生或通过从分开表达或合成的成分体外再构成产生。
产生多克隆和单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的，并且在科学和专利文献中叙述了，这些文献参见例如，Coligan，免疫学当前方法，Wiley/Greene，NY(1991)；Stites(eds)基础和临床免疫学(第7版)，Lange医学出版社，Los Altos，CA，和其中引用的参考文献(Stites)；Goding，单克隆抗体原理和实践(第二版)，学术出版社，纽约，NY(1986)；Kohler(1975)自然256495；Harlow和Lane，出处同上。这样的技术包括从重组抗体的文库选择抗体，这些文库由噬菌体或类似细胞提供。参见，Huse(1989)科学2461275和Ward(1989)自然341544。重组抗体可以通过在哺乳动物细胞中短暂或稳定表达载体得到表达，如在Norderhaug(1997)免疫方法杂志20477-87。
为了产生大量抗体用于例如，免疫亲和纯化或诊断，本发明提供的许多免疫原可以使用。从天然来源纯化的端粒酶或更优选地来自从本发明提供的转化细胞分离的重组蛋白质的端粒酶可以用作免疫原用于产生单克隆或多克隆抗体。天然存在的端粒酶或来自任何生物体的TRT蛋白质或重组端粒酶或TRT蛋白质可以纯化或非纯化形式使用。利用TRT氨基酸序列的任何部分可以产生合成肽用作免疫原。该肽可以单独或与另一个作为免疫原的组合物共轭使用。
另外，端粒结构可以用作免疫原产生特异于端粒酶的抗体。例如，在一些条件下，端粒可以形成更高秩序的超级结构，称为，G-四分孢子(Sen(1992)生物化学3165-70；Fang(1993)生物化学3211646-11657)，它可以用作免疫原。其它潜在地可以是免疫原的新三级结构包括端粒酶产物的稳定的发夹和G-四倍体(Salazar(1996)生物化学3516110-16115)。这些新结构可以作为形成抗体的免疫原，这些抗体例如可以检测端粒酶产物的形成，抑制端粒酶活性或鉴定样品中的端粒酶。这些新结构也可以是核苷酸的杂交靶，这些核苷酸可以用于测量端粒产物的形成，抑制活性，和诸如此类。
多克隆和单克隆抗体的产生方法是本领域技术人员已知的。简要地说，将免疫原与如上所述的佐剂混合，并且免疫接种动物。通过取测试的血液和确定与免疫原的反应性的效价检测对免疫原制剂的动物免疫应答。当获得抗免疫原的适当的高效价抗体时，从动物收集血液，并制备抗血清。另外，进一步可以将用于富集与蛋白质反应的抗体的抗血清的分级分离(Harlow和Lane，出处同上)。本发明的各种说明性肽，蛋白质和融合蛋白质已经用于产生这样的多克隆抗体。
利用用于通过用连续的细胞系培养物生产抗体分子的任何技术可以制备抗端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位的单克隆抗体。这些包括但不限于最初由Koehler和Milstein叙述的杂交瘤技术(Koehler和Milstein，自然，256495-497(1975)，人B-细胞杂交瘤技术(Koser等人，今日免疫学472(1983)；Cote等人，美国科学院年报，802026-2023(1983))和EBV杂交瘤技术(Cole等人，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R Liss Inc，纽约NY，pp77-96(1985))。用于免疫亲或纯化和免疫测试的大量单克隆抗体可以通过本领域技术人员熟悉的各种技术获得。简要地说，通常通过与骨髓瘤细胞融合使来自利用需要的端粒酶蛋白质免疫接种的动物的脾细胞永生。永生的可选择的方法包括利用埃-巴＝氏病毒，癌基因，或逆病毒，或本领域已知的其它方法转化。从单个永生细胞产生的菌落筛选产生和端粒酶和TRT蛋白质具有需要的特异性亲和性的抗体的菌落。这样的细胞产生的单克隆抗体的产量可以通过各种技术增高，这些技术包括注射到脊椎动物寄主的腹膜腔内。可选择地，通过从适当的人B细胞，即根据Huse(1989)科学，出处同上，中划出的常用方案免疫接种的细胞筛选DNA文库，可以分离编码单克隆抗体或其结合片段的DNA序列。
对于抗体的产生，各种寄主包括，山羊，兔，大鼠，小鼠，等等可以通过注射端粒酶蛋白质，蛋白质亚单位，或任何部分，片段或低聚肽进行免疫接种，这些免疫物质保留了免疫原特性。根据寄主的种类，可以使用各种佐剂增强免疫应答。这样的佐剂是商业可得的，包括但不限于弗氏，矿质凝胶如氢氧化铝，和表面活性物质如溶血卵磷脂，多聚醇，聚阴离子，肽，油乳剂，钥孔戚血蓝蛋白，二硝基酚，BCG(芽孢杆菌Calmette-Guerin)和小棒杆菌是潜在的有用的佐剂。
可以利用TRT或其片段，如含有SEQ ID NO；118的多肽或肽，或利用其同工型或免疫片段，单独或利用标准佐剂如弗氏佐剂，和标准免疫接种方案免疫接种动物(例如，小鼠或兔的近交品系)。可选择地，起源于本文公开的序列和与载体蛋白质共轭的合成肽可以用作免疫原。收集多克隆血清和在免疫测试中滴定抗端粒酶效价，免疫测试如利用固体支持物上的固定的端粒酶的固相免疫测试。选择效价为104或更高的多克隆抗血清并利用例如竞争性结合免疫测试，测试它们与来自其它生物体的同源蛋白质和/或非端粒酶蛋白质的交叉反应性。特异的多克隆和单克隆抗体和抗血清通常与至少约1微摩尔浓度，优选地至少约O.1微摩尔逍度或更多，和最优选的0.01微摩尔浓度或更多的KD结合。
抗体也可以通过在淋巴细胞群体中诱导体内生产或通过筛选重组免疫球蛋白文库或高度特异结合试剂的组也可以产生抗体(Orlandi等人，美国科学院年报，863833(1989)；Winter和Milstein，自然349293(1991))。
也可以生产含有端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位的特异结合位点的抗体片段。例如，这样的片段包括但不限于F(ab’)2片段，这些片段可以通过用胰蛋白酶消化抗体分子产生，和Fab片段，这些片段可以通过还原F(ab)2片段的二硫键产生。可选择地，可以构建Fab表达文库以便允许快速和容易地鉴定含有需要的特异性的单克隆Fab片段(Huse等人，科学2561275(1989))。
利用具有确定的特异性的多克隆或单克隆抗体的竞争性结合或免疫发射测试的各种方案是本领域已知的。这样的免疫测试通常包括在端粒酶或端粒酶蛋白质和它的特异性抗体之间形成复合物，和测量形成的复合物。在一些情形中利用与特异性端粒酶蛋白质亚单位上的两个非干扰表位反应的单克隆抗体的两位点，基于单克隆的免疫测试是优选的，但也可以使用竞争性结合测试(参见，例如Maddox等人，医学实验杂志，1581211(1983))。
选自包括图32显示的序列的组的肽可以用于产生特异性抗人和其它端粒酶蛋白质的多克隆和单克隆抗体。该肽可用于抑制端粒酶复合物与蛋白质-RNA，蛋白质-蛋白质相互作用，和端粒中的蛋白质-DNA相互作用。然后，将产生的抗这些肽的抗体用于各种方案中，包括但不限于能够抑制端粒酶活性的抗癌治疗，用于治疗的天然端粒酶的纯化，用于纯化和克隆人端粒酶和与人端粒酶相关的其它蛋白质的其它成分，和诊断试剂。
通过本发明的各种免疫测试方法可以测量端粒酶或TRT蛋白质的浓度。通常，在Stites，出处同上中叙述了免疫测试。本发明的免疫测试可以在任何几种构型中进行，背景信息参见酶免疫测试，E.T.Maggio，ed.，CRC出版社，Boca Raton，Florida(1980)；Tijssen，和Harlow和Lane，出处同上。
免疫结合测试免疫结合测试(例如，美国专利，4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168)是本领域已知的。综述，参见细胞生物学方法，37卷，细胞生物学抗体，Asai，ed.学术出版社，纽约，(1993)；和Stites，出处同上。免疫结合测试(或免疫测试)通常利用了捕获试剂以便特异地结合到和通常固定到分析物。捕获试剂是与分析物特异地结合的成分。在本发明的一个实施方案中，捕获试剂是与端粒酶或TRT特异性结合的抗体，这样的抗体(抗端粒酶或抗TRT)可以通过本发明的方法生产。
免疫测试也通常利用标记的试剂特异地结合到和标记由捕获试剂和分析物形成的结合复合物，如上所述。标记试剂本身可以是例如，一个含有抗体/分析物复合物的成分标记试剂可以是标记的端粒酶或标记的抗端粒酶抗体。可选择地，标记试剂可以是第三个成分，如另一个抗体，它与抗体端粒酶复合物特异性结合。标记试剂可以是例如，第二个含有标记物的抗端粒酶抗体。第二个抗体可能缺乏标记物，但，依次，它可以与特异于第二个抗体起源的种类的抗体的第三个标记的抗体结合。可以利用可检测的成分，如生物素，修饰第二个，而该可检测成分与第三个标记分子特异结合，如酶标记的链霉抗生物素。其它能够特异性结合免疫球蛋白恒定区的蛋白质如蛋白质A或蛋白质G也可以用作标记试剂。这些蛋白质是链球菌的细胞壁的常见组成成分，并显示了与来自各种种类的免疫球蛋白恒定区发生强烈的非免疫原反应通常(参见，Akerstrom(1985)免疫学杂志，1352589-2542；Chaubert(1997)ModPathol10585-591(1997)。
在整个测试过程中，在每次试剂的合并后可能需要温育和/或洗涤步骤。温育步骤可以从约5秒变化到几小时，优选地，从约5分钟到约24小时。但是，温育时间取决于测试方式，分析物，溶液体积，浓度和诸如此类。通常，在环境温度下进行测试，虽然可在一个温度范围内如10EC到40EC进行。
(1)非竞争性测试方式检测端粒酶和TRT蛋白质的免疫测试可以是例如竞争性或非竞争性的。非竞争性的免疫测试是直接测量捕获的分析物(如端粒酶，TRT或hTRT)的量的测试。在一个优选的“夹心”测试中，例如捕获试剂(抗端粒酶抗体)可以直接与固体底物结合，在固体底物中它们被固定。然后，这些固定的抗体捕获存在于测试样品中的蛋白质。然后，这样固定的端粒酶或TRT蛋白质与标记试剂如含有标记的第二个抗端粒酶抗体结合。可选择地，第二个抗端粒酶或抗TRT抗体可能缺乏标记物，但依次，它可以与特异于第二个抗体起源的种类的抗体的第三个标记的抗体结合。第二个可以利用可检测的成分如生物素修饰，第三个标记分子可以特异地结合该可检测成分，如酶标记的链霉抗生物素。
(2)竞争性测试方式在竞争性测试中，通过测量由存在于样品中的分析物从捕获试剂(抗端粒酶或抗TRT抗体)替代(或竞争离开)加入的(外源的)分析物(端粒酶或TRT)的量间接测量样品中存在的分析物(端粒酶)的量。在一个竞争性测试中，在样品中加入已知量的通常为标记的端粒酶或TRT。将样品然后与捕获试剂接触，在这种情况中，捕获试剂是特异地结合端粒酶或TRT的抗体。结合抗体的标记的端粒酶或TRT的量与样品中的端粒酶或TRT的浓度成反比。
在另一个实施方案中，抗体固定于固体底物上。结合抗体的端粒酶或TRT的量可以通过测量端粒酶/抗体或TRT/抗体复合物中存在的端粒酶或TRT的量，或可选择地通过测量仍然未复合的端粒酶或TRT的量进行确定。端粒酶或TRT的量可以通过提供标记端粒酶或TRT分子进行检测。
半抗原抑制测试是另一个竞争性测试。在这一测试中，已知的分析物，本发明的端粒酶或TRT固定在固体底物上。将已知量的抗端粒酶或抗TRT抗体加入样品中，然后，将样品与固定的端粒酶或TRT接触。在这种情况中，结合到固定的端粒酶或TRT的抗端粒酶或抗TRT抗体的量与存在于样品中的端粒酶或TRT的量成反比。再次，通过检测溶液中保留的抗体的固定部分或抗体的部分可以检测固定的抗体的量。检测可以如上所述直接进行，其中抗体被标记或间接通过随后加入特异性结合抗体的标记成分进行。
在竞争性结合方式中的免疫测试可以用于交叉反应测定，以允许技术人员确定是否蛋白质或酶复合物是本发明的TRT或端粒酶。例如，TRT可以固定在固体支持物上。在测试中加入蛋白质，这些蛋白质与抗血清竞争结合到固定抗原。蛋白质与抗血清竞争结合到固定TRT的能力可与用于包衣固体支持物的同样的TRT的结合相比。
(3)其它测试方式本发明同时提供Western印迹(免疫印迹)分析的方法，以便检测和/或定量检测样品中端粒酶的存在。该技术通常包括在分子量基础上通过凝胶电泳分离样品蛋白质，将分离的蛋白质转移到适当的固体支持物(如硝酸纤维滤纸，尼龙滤纸，或衍生的尼龙滤纸)，并将样品与特异结合端粒酶的抗体温育。该抗一端粒酶蛋白质抗体特异性地结合到固体支持物上的端粒酶。这些抗体可以直接标记，或可选择地可以随后利用标记的抗体(例如，标记的羊抗小鼠抗体)检测，这些抗体特异地结合抗端粒酶蛋白质。
抗体也可以用于探测表达文库，参见Young(1982)美国科学院年报801194。通常，cDNA表达文库可以从商业销售的试剂盒或利用容易得到的成分制备。噬菌体(Hurst(1997)分子生物学方法6915-159)，细菌(Davis(1997)美国科学院年报942128-2132)，昆虫(Granziero(1997)免疫方法杂志203131-139)，酵母和动物细胞文库(Xenopus oocytes)可以使用。人们选择来自一个来源的mRNA，该来源非强制性地富集靶mRNA，或其中蛋白质是丰富的，并且产生cDNA，然后，将cDNA连接到载体，该载体转化到文库寄主细胞用于免疫筛选。筛选包括结合和鉴定与细胞上特异蛋白质结合或在固体支持物上如硝酸纤维素或尼龙膜上固定的抗体。选择阳性克隆用于纯化到均一，并且然后制备在需要的寄主细胞中表达的分离cDNA。同时参见细胞生物学方法，第37卷，细胞生物学抗体，Assai(ed)1993。
本发明的方法同时与其它测试方式包括脂质体免疫测试(LIA)相容(Rongen(1997)免疫方法杂志204105-133)，其中设计脂质体结合特异性分子(例如，抗体)并且使用释放胶囊试剂或标记物。可以利用标准技术检测释放的化学物质(参见，例如，Monroe(1986)Amer，Clin.Prod.Rev.534)。
利用端粒酶特异性抗体诊断测试特定的端粒酶和端粒酶蛋白质亚单位抗体可用于以端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位表达为特征的症状或疾病的诊断，或用于检测待利用端粒酶，它的片段，拮抗剂或抑制剂(包括，能够减少端粒酶的表达的反义转录物)治疗的病人的测试中。端粒酶的诊断测试包括利用抗体和标记物检测人体液或细胞或组织的提取物中的端粒酶的方法。本发明的多肽和抗体可有或没有修饰使用。通常，多肽和抗体将通过共价或非共价地将它们与报道分子连接进行标记。许多种类的报道分子是已知的，它们中的几个如上所述。具体地，本发明可用于诊断人疾病，虽也涉及本发明将分析用于畜牧业。
利用特异于各自蛋白质的多克隆或单克隆抗体测量端粒酶蛋白质的各种方法是本领域已知的。例子包括酶联免疫吸附测试(ELISA)，放射性免疫测试(RIA)和荧光活化细胞分拣(FACS)。利用与端粒酶蛋白质或亚单位上的两个非干扰表位反应的单克隆抗体的两位点，以单克隆为基础的免疫测试是优选的，但可以使用竞争性结合测试。这些测试在其它地方，在Maddox(Maddox等人，实验方医学杂志，1581211(1983))中叙述了。
为了提供诊断的基础，通常建立对人端粒酶表达的正常或标准值。这可以通过在各自适于复合物形成的条件下将从正常受试者，动物或人取的体液或细胞提取物与抗端粒酶或端粒酶亚单位的抗体合并，这是本领域已知的。通过比较各自含有已知量的端粒酶蛋白的人工膜与来自活体解剖组织的对照种疾病样品可以定量标准复合物形成的量。然后，从正常样品中获得的标准值与从来自受到疾病(例如转移)潜在影响的受试者的样品获得值比较。标准与受试者值之间的偏差确定了疾病状态的存在。
药物筛选本发明涉及通过任何手段筛选能够修饰端粒的DNA复制能力，或端粒酶或TRT的部分活性的组合物。在各种实施方案中，本发明包括筛选结合TRT蛋白质的活化位点或干扰它的RNA成分的逆转录的拮抗物；筛选抑制核酸和/或端粒酶相关组合物与TRT的结合如TR与TRT的结合，或TRT与端粒酶相关蛋白质的结合或TRT与端粒酶或核苷酸的结合的组合物；筛选促进分解或促进酶复合物，如特异于TR或TRT的抗体的结合的组合物；筛选实现酶的持续合成能力的试剂；和，筛选结合到TRT的核酸和其它组合物，如与TR相同或互补的核酸。本发明进一步涉及筛选增强或降低TRT基因的转录和/或TRT基因产物的翻译的组合物。
筛选拮抗物活性提供降低端粒酶复制能力的组合物，从而消灭不灭细胞如癌细胞。端粒酶活性已经被鉴定为重要的癌标记，它的水平可以检测，诊断和预测疾病的结果或严重性，如美国专利号5,489,508；5,648,125；和5,639,613所述。通过分析端粒酶活性和hTRT基因表达，本发明提供了有用的试剂用于诊断和预测癌症。
筛选拮抗剂活性或转录或翻译激活剂提供了增强端粒酶的端粒复制能力或部分活性的组合物。这样的拮抗剂组合物提供了使正常非转化细胞包括可以表达有用的蛋白质的细胞不灭的方法。这样的拮抗剂同时可以提供控制细胞衰老的方法。
端粒酶或端粒酶亚单位蛋白质或它们的催化或免疫原片段或其低聚核苷酸可以用于在任何种类的药物筛选技术中筛选治疗化合物。这样的测试中使用的片段可以在溶液中是游离的，固定于固体支持物，细胞表面产生的，或定位于细胞内。在端粒酶或亚单位蛋白质和带测试的试剂之间形成的结合复合物可以得到测量。
在“氨基酸序列抗原性的确定”中(Geysen，WO申请84/03564，1984年9月13日，引入本文作为参考)详细叙述了可以用于高生产率筛选与端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位具有适当结合亲和性的化合物的药物筛选的另一个技术。简要地说，在固体底物，如塑料别针或其它一些表面上合成大量的不同小肽测试化合物。肽测试化合物与端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位的片段反应，并洗涤。然后，通过用于本领域已知的其它应用开发的标准方法，检测结合的端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位。基本纯化的端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位也可以直接包被到平板上用于前面提到的药物筛选技术。可选择地，非中和抗体可以用于捕获肽和将肽固定在固体支持物上。
本发明同时涉及利用竞争性药物筛选测试，其中能够结合端粒酶或亚单位蛋白质的中和抗体特异地与测试化合物竞争结合端粒酶或亚单位蛋白质。以这一方法，抗体可以用于检测任何肽的存在，该肽与抗体一起共享结合含有端粒酶或亚单位蛋白质的一个或多个抗原决定簇的能力。
编码端粒酶亚单位蛋白质的聚核苷酸和它们的应用编码端粒酶亚单位蛋白质的聚核苷酸序列或其任何部分可以用于诊断和/或治疗目的。为了诊断目的，编码本发明的端粒酶亚单位蛋白质的序列可以用于检测和定量端粒酶或亚单位蛋白质的基因表达。诊断测试可用于区别端粒酶的缺乏，存在和过量，和检测治疗事件中端粒酶水平的调节。包括在本发明的范围内的是低聚核苷酸序列，反义RNA，和DNA分子，和合成和其非天然存在的类似物，包括例如，含有非离子构架的核苷酸，如肽核酸(PNA)。
本发明的另一个方面是提供能够检测聚核苷酸序列包括基因组序列的杂交，或PCR探针或引物，这些序列编码端粒酶亚单位蛋白质或紧密相关的分子。探针的特异性，是否它是从高度特异的区(例如，5’调节区中10个独特的核苷酸)，或较小特异性的区(例如，特异地在3’区)产生的，杂交或扩增的严谨性(最大，高，中等或低)将确定是否该探针鉴定只是天然存在的端粒酶，端粒酶亚单位蛋白质或特定的端粒酶或TRT种类的相关序列或TRT聚核苷酸的所有或一些成员。
探针也可以用于检测相关序列和应该优选地含有来自这些端粒酶亚单位蛋白质编码序列的任何一个的至少50％的核苷酸(相同或互补)。本发明的杂交探针可以起源于本发明提供的核苷酸序列(例如，SEQ IDNO1，3，62，66，69或117)，或起源于基因组序列包括启动子，增强子元素和天然存在的编码端粒酶亚单位蛋白质的序列的内含子。杂交探针可以通过用各种报道基团，包括商业可得的放射性核素如32P或35S，或酶标记如碱性磷酸酶进行标记，这些标记物通过抗生物素蛋白/生物素偶联系统和诸如此类与探针偶联。
生产DNA的特异杂交探针的克隆到其它方法包括将编码端粒酶亚单位蛋白质的核酸序列或衍生物克隆到载体以以生产mRNA探针。这样的载体是本领域已知的，并且是商业可得的，借助于加入作为T7或SP6 RNA聚合酶的适当RNA聚合酶和适当的放射性标记的核苷酸的手段，可以用于体外合成RNA探针。
诊断应用编码端粒酶的聚核苷酸序列可以用于诊断端粒酶的不正常表达相关的症状或疾病。例如，编码人端粒酶的聚核苷酸序列可以用于来自活体解剖的体液或组织的杂交或PCR测试，以便检测端粒酶表达。这样的定性或定量方法的形式包括Southern或Northern分析，点影印或其它基于膜的技术；PCR技术；蘸条，针，嵌片和ELISA技术。所有这些技术是本领域已知的，并且是许多商业销售的诊断试剂盒的基础。
本文公开的编码端粒酶的核苷酸序列提供了用于测试的基础，这些测试检测了与疾病(包括转移)相关的活化或诱导；另外，缺乏端粒酶的表达可以利用编码本文公开的端粒酶的核苷酸序列检测。核苷酸序列采用本领域已知的技术进行标记，并且在各种适于形成杂交复合物的条件下被加入到来自病人的体液或组织样品。在温育期后，利用非强制性地含有染料(或其它需要显影剂的标记)的相容体液洗涤样品，如果核苷酸已经利用酶标记。在相容体液洗掉后，定量测定染料并且与标准比较。如果活体解剖或提取样品中的染料的量明显地高于相当的对照样品，那么核苷酸序列已经与样品中的核苷酸序列杂交，样品中存在编码端粒酶的核苷酸序列的水平升高表明存在相关的疾病。可选择地，在组织中人端粒酶序列的表达的丢失表明存在不正常或疾病状态，这些组织正常表达端粒酶序列。
这样的测试也可以用于评估动物研究，临床测试，或检测个别病人的治疗中特定的治疗方案的效力。为了提供诊断疾病的基础，必须确定人端粒酶表达的正常或标准的方式。这可以通过将从正常受试者，动物或人获取的体液或细胞提取物和人端粒酶或其部分在各种适于杂交或扩增的条件下进行合并。标准杂交可以通过将从正常受试者获得的值和在同样的实验中进行的人端粒酶的稀释系列比较进行定量，其中使用了已知量的基本纯化的人端粒酶。从正常样品中获得的标准值可以与从来自受到端粒酶相关的疾病影响的病人的样品获得的值比较。在标准和受试者值之间的差异确定了疾病的存在。
一旦确定了疾病，以治疗试剂给药，并且产生治疗方案。这样的测试可以有规律地重复，以便评估是否方案中的值朝着或恢复到正常或标准方式方向发展。连续的治疗方案可以用于显示在几天或几个月的时期的治疗效力。
可以如美国专利号4,683,195，4,683,202和4,965,188(引入本文作为参考)所述使用PCR，提供了基于编码端粒酶亚单位蛋白质序列的低聚核苷酸的其它用途。这样的低聚物通常是化学地合成的，但它们可以酶促产生或从重组来源产生。双链核酸含有两个分离的核苷酸序列的链，一个具有有意义定向(5’-3’)，一个具有反义定向(3’-5’)，该双链核酸也可以在各种最适条件下用于鉴定特异基因或状态。低聚物，嵌套的低聚物组，或甚至是低聚物的简并库可以在较不严格的条件下用于检测和/或定量紧密相关的DNA或RNA序列。
另外，可以用于定量特定的分子的表达的方法包括放射性标记(Melby等人，免疫方法杂志，159235-44(1993))或生物素化(Duplaa等人，生物化学年评，229-36(1993))核苷酸，共同扩增对照核酸，实验结果插入的标准曲线。以ELISA方式进行测试可以加速多个样品的定量，其中需要的低聚物存在于各种稀释液中，分光光度或比色应答给出了快速的定量方法。这一类型的确定的诊断可以允许健康的专业人员开始积极的治疗和防止症状进一步恶化。同样地，进一步的测试可以用于检测治疗过程中病人的进展。另外，本文公开的核苷酸序列可以用于仍然没有开发的分子生物学技术领域，条件中新技术依赖于核苷酸序列的特性，这些核苷酸序列目前已知如三联体遗传密码，特异的碱基对反应，和诸如此类。
治疗应用基于与其它端粒酶序列的同源性，本文公开的编码端粒酶蛋白质亚单位的聚核苷酸可以用于治疗转移，特定地，端粒酶表达的抑制可以是治疗性的。
起源于反录病毒，腺病毒，疱疹，或牛痘病毒或起源于各种细菌质粒的表达载体可以用于递送核苷酸序列(有意义或反义)到靶器官，组织，或细胞群体。本领域技术人员已知的方法可以用于构建重组载体，这些载体将表达编码端粒酶亚单位的反义序列。参见，例如，Sambrook等人(出处同上)和Ausubel等人(出处同上)中叙述的技术。
含有全长cDNA序列和/或它的调节元素的聚核苷酸能让研究者使用编码端粒酶亚单位的序列，包括作为以有意义(Youssoufian和Lodish，细胞分子生物学，1398-104(1993))或反义(Eguchi等人，生物化学年评，60631-652(1991))调节基因功能的研究工具的各种基序。这样的技术是本领域技术人员已知的，并且有意义或反义低聚物或更大的片段可以从编码或对照区的各种位置中设计。
利用表达载体转染细胞或组织可以将编码端粒酶亚单位的基因关闭，这些载体表达高水平的需要的端粒酶片段。这样的构建体可以用不可转译意义或反义序列淹没细胞。甚至在缺乏整合进入DNA时，这样的载体可以连续地转录RNA分子直到所有拷贝受到外源核酸酶的消化。短暂的表达可以持续一个月或具有非复制载体时几个月长，如果适当的复制元素是载体系统部分的话，甚至更长。
如上面提到，通过将反义分子，DNA，RNA，PNA，或诸如此类按排到编码人端粒酶的序列的控制区(即，启动子，增强子，和内含子)中可以获得基因表达的修饰。起源于转录起始位点的低聚核苷酸(例如，在引导序列的-10和+10之间区域)对于一些应用是优选的。反义分子也可以设计成通过防止转录物结合到核糖体而阻止mRNA的翻译。同样，利用“三联体-螺旋”碱基配对方法可以获得抑制。三联体螺旋配对危害了充分打开双链螺旋便以结合聚合酶，转录因子，或调节分子的能力(利用三联体DNA的最新治疗进展的评述，参见Gee等人，在Huber和Carr，分子和免疫途径，Futura出版社公司，Mt Kisco NY(1994))。
抑制低聚核苷酸本发明提供的一个特别有用的抑制剂系列包括在防止或抑制功能TRT蛋白质的情况时，能够结合编码TRT蛋白质的mRNA或TRT基因的低聚核苷酸。本发明的其它低聚核苷酸与端粒酶的RNA成分如hTR相互作用，或能够防止端粒酶或TRT与它的DNA靶的结合，或一个端粒酶成分与另一个或与底物的结合。这样的低聚核苷酸也可以结合端粒酶或TRT蛋白质并且如上所述抑制部分活性(如它的加工活性，它的逆转录酶活性，它的溶核活性，和诸如此类)。结合可以通过序列与另一个核酸特异地杂交，或通过一般的结合如在aptamer中。
另一个有用的抑制剂类别包括导致hTRTmRNA或hTR的失活或裂解的低聚核苷酸。这就是，低聚核苷酸化学地修饰或具有导致这样的裂解的酶活性，如核酶。如上所述，可以从许多不同的这样的低聚核苷酸库中筛选那些具有需要活性的。
抑制剂的另一个有用的类别包括结合多肽的低聚核苷酸。结合到特异的多肽靶的双链或单链DNA或单链RNA分子称为“aptamers”。
特异的低聚核苷酸-多肽的结合可以通过静电作用介导。例如，aptamer特异地结合阴离子结合凝血酶上的外位点，凝血酶与多阴离子肝素生理结合(Bock(1992)自然，355564-566)。因为TRT蛋白质结合hTR和它的DNA底物，并且因为本发明提供了纯化形式的大量hTRT和其它TRT蛋白质，本领域的技术人员可以容易地利用本发明的方法筛选结合TRT的aptamers。
端粒酶介导的DNA复制的拮抗物也可以基于通过互补序列识别或裂解如通过核酶抑制TR，如hTR(Norton(1996)自然生物技术14615-619)。这样的试剂可以用于与本发明的那些结合以便增强需要的效果。
可以通过用能够结合TRTmRNA的反义低聚核苷酸靶击TRTmRNA而抑制端粒酶活性。在一些情况中，用作反义低聚核苷酸的天然存在的核酸可能需要相当长(18到40个核苷酸)并且高浓度存在。许多种类的合成，非天然存在核苷酸和核酸类似物是已知的，它们可以论述这一潜在的问题。例如，如上面讨论，可以使用含有非离子构架，如N-(2-氨乙基)甘氨酸单位的PNA。也可以使用具有硫代磷酸键的反义低聚核苷酸，如WO97/03211；WO96/39154；Mata(1997)抗毒应用药学144189-197；反义治疗学，Sudhir Agrawal(Humana出版社，Totowa，新泽西，1996)。本发明提供的具有合成DNA骨架类似物的反义低聚核苷酸也可以包括二硫代磷酸，甲基磷酸，氨基磷酸，烷基磷酸酯，氨基磺酸，3-硫代乙酰，亚甲基(methylimino)，3’-N氨基甲酸酯，和吗啉氨基甲酸酯核酸，如上所述。
如上所述，联合的化学方法可以用于产生巨大数目的低聚核苷酸，这些核苷酸可以快速筛选任何靶，如本发明的TRT蛋白质的具有适当结合亲和性和特异性的特异低聚核苷酸(一般背景信息，参见Gold(1995)生物化学杂志，27013581-13584)。
抑制性核酶核酶是能够催化RNA特异的切割的酶促RNA分子。核酶的作用机制包括核酶分子与互补的靶RNA的序列特异杂交，接着内切溶核切割。在本发明的范围内的是工程化锤头基序核酶分子，这些分子可以特异地和有效地催化编码人端粒酶的序列的内切溶核切割。
在任何潜在的RNA靶内的特异核酶切割位点首先是通过扫描包括下面序列，GUA，GUU和GUC的核酶切割位点的靶分子得到鉴定。一旦被鉴定，可以评估对应于含有切割位点的靶基因的区的15-20个核糖核苷酸之间的短RNA序列的使低聚核苷酸不能起作用的二级结构特征。通过利用核糖核酸酶保护测试对与互补低聚核苷酸杂交的可行性进行测试可以评估候选靶的恰当性。
核酶的作用是通过借助核酶的经过靶RNA结合部分而结合靶RNA进行的，核糖酶固定在切割靶RNA的RNA的酶催化部分的附近，所以，借助于互补碱基配对核酶识别和结合靶RNA，，并且一旦与准确的位点结合，酶促催化切割和失活靶RNA。以这样的方式切割靶RNA将破坏它指导编码蛋白质的合成的能力，如果切割发生在编码序列。在核酶结合和切割它的RNA靶后，通常核酶从RNA中释放，从而可以重复结合和切割新靶。
在一些情况中，核酶的酶催化特性可能比其它技术如反义技术(其中核酸分子简单结合核酸靶以阻止它的转录，翻译，或与其它分子结合)有利，因为实现治疗必须的核酶的有效浓度可以比反义低聚核苷酸的低。这一潜在的优点反映了核酶的酶作用能力。所以，单个酶分子能够切割靶RNA的许多分子。另外，核酶通常是高度特异的抑制剂，具有的抑制特异性不仅依赖于结合的碱基配对机制，而且依赖于分子抑制它结合的RNA的表达的机制。就是说抑制是由RNA靶的切割引起的，所以，将特异性定义为切割靶的RNA的速度与切割非靶RNA的速度的比例。这一切割的机制是依赖于包括在碱基配对中的那些因子。所以，核酶的作用的特异性可能比结合同样的RNA位点的反义低聚核苷酸的更大。
酶促核酶RNA分子与靶如编码TRT的mRNA互补。酶催化核糖酶RNA分子能够切割RNA，并且从而失活靶RNA分子。互补性的作用是允许酶促核酶RNA分子与发生切割的靶RNA之间的足够的杂交。100％的互补性是优选的，但也可以利用低至50-75％的互补性。本发明提供了靶击TRT基因的编码区的任何部分的核酶，该酶以抑制mRNA的翻译，从而减弱端粒酶的活性的方式切割TRT基因mRNA。另外，本发明提供了靶击TRT基因的新生RNA转录物以降低端粒酶活性的核酸。
酶催化核酶RNA分子可以在锤头基序中形成，但也可以在发夹，δ肝炎病毒，I组内含子或RNaseP-类RNA(结合RNA指导序列)的基序中形成。这样的锤头基序的例子如Rossi(1992)艾滋病研究和人逆病毒8183中叙述了；Hampel(1989)生物化学284929，和Hampel(1990)核酸研究18299叙述了发夹基序；Perrotta(1992)生物化学3116中叙述了δ肝炎病毒；Guerrier-Takada(1983)细胞35849中叙述了RNaseP基序；和Cech美国专利号4,987,071叙述了I组内含子。这些特异基序的引证的目的不是限制；本领域的技术人员将认识到本发明的酶催化RNA分子具有特异的底物结合位点，这些位点与一个或多个靶基因RNA区互补，并且具有底物结合位点内或周围的核苷酸序列，这些序列给予分该子RNA切割活性。
本发明的反义分子和核酶可以通过本领域已知的任何合成RNA的方法进行制备。这些包括化学合成低聚核苷酸的技术如固相氨基磷酸化学合成。可选择地，RNA分子可以通过体外和体内转录编码人端粒酶和/或端粒酶蛋白质亚单位的DNA序列进行生产。这样的DNA序列可以掺入含有适当的RNA聚合酶启动子如T7或SP6的许多种类的载体。可选择地，组成型或可诱导地合成反义RNA的反义cDNA构建体可以导入细胞系，细胞，或组织。
可以修饰RNA分子以便增强细胞内的稳定性和半衰期。可能的修饰包括但不限于，在分子的5’和/或3’末端加入侧接序列，或在分子的构架中利用硫代磷酸或2’O-甲基而不是磷酸二酯键。这一概念是PNA的生产中固有的，并且，所有这些分子中包括非传统碱基，如肌甘，queosine和wybutosine以及乙酰基-甲基，硫代和相似的修饰形式的腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和尿嘧啶，这些是内源性内切核酸酶容易识别的。
在细胞或组织中导入载体的方法包括上面讨论的那些方法，并且它们同样适于体内，体外和体内治疗。对于体内治疗，载体可以导入细胞如从病人取的躯干细胞，并且无性繁殖以便自身移植回到同一病人，正如美国专利号5,399,493和5,437,994中的不同的文献中表示的，该公开物引入本文作为参考。转染和脂质体的递送是本领域十分熟悉的，可应用于本发明。
其它基因组中的相关的聚核苷酸序列检测和图谱分析编码E.aediculatus，啤酒酵母，粟酒裂殖酵母，和人端粒酶亚单位蛋白质的核酸序列和其变异体序列也可以用于产生用于对人和其它生物体中的天然存在的同源基因组序列图谱分析的杂交探针。该序列可以利用已知技术分析图谱并且定位到特定的染色体或染色体的区域。这些包括与染色体铺展，流动分拣的染色体制剂，或人工染色体构建体如酵母人工染色体，细菌人工染色体，细菌P1构建体，或单个染色体cDNA文库原位杂交，如Price(Price，血液综述，7127和Trask(Trask，遗传趋势7149)的综述。
染色体铺展的荧光原位杂交(FISH)的技术已经有文献叙述(Verma等人，人染色体基本技术手册，Pergamon出版社，纽约NY)。染色体制剂的荧光原位杂交和其它物理染色体图谱定位技术可能与其它遗传图谱数据相关。遗传图谱数据的例子可以在1994科学的基因组问题(2651981f)中找到。在物理的染色体图谱上的编码端粒酶亚单位蛋白质的序列的定位和特异性的疾病(或特异性疾病的诱因)之间的相关性可以帮助限定与疾病相关的DNA区域。本发明的核苷酸序列可以用于检测正常，载体，或受影响的个体之间的基因序列的差别。
在延伸遗传图谱中染色体制剂的原位杂交和物理图谱定位技术如利用确立的染色体标记的键分析是非常重要的(参见，例如，Hudson等人，科学2701945)。通常，基因在另一个哺乳动物种类如小鼠的染色体上的位置(Whitehead研究所/MIT基因组研究中心，小鼠的遗传图谱，Database Release 10，1995年4月28日)经常显示相关的标记，即使特定的人染色体的数目或臂是未知的。通过物理图谱定位可以将新序列指派到染色体臂或其部分上。这给利用位置克隆或其它基因发现技术寻找疾病基因的研究者提供了有价值的信息。
使端粒酶和TRT的表达最佳化在细菌和其它表达系统中，已知密码子的使用在高水平基因表达中存在的潜在障碍。根据在mRNA中的频率和存在，“稀少”密码子可能对从其翻译的蛋白质水平具有不利的影响。如果遇到该问题，可以通过修饰相关的密码子或通过共表达同源的tRNA基因或通过其它方法减轻。利用蛋白酶缺陷寄主品系可以增加细菌表达系统的产量，参见Makrides(1996)微生物学综述60512-538。
人们可以通过载体设计修饰如利用外源转录调节元素使端粒酶和TRT的表达水平最佳化。例如，如下面讨论，骨髓增殖肉瘤病毒(MPSV)LTR启动子在一些哺乳动物细胞系中一致地驱动了更高的表达水平。
通常，本领域的技术人员认为具有某些特异性序列的核酸在一个细胞中可能弱表达，在其它细胞中表达很好。作为预防措施，应该避免含有外来序列，即非编码序列如来自具有编码序列cDNA的3’非翻译序列。
所以，一个最佳化方案包括从编码序列插入片段中除去所有外来序列。这一方案在一些情况中可以在细菌，昆虫，酵母，哺乳动物和其它细胞表达系统中使蛋白质的表达增强5到10倍。
通过更高载体拷贝数或通过在染色体中复制基因进行基因扩增可以增强哺乳动物和其它细胞中重组蛋白质的产量。在哺乳动物细胞中的异源基因表达的一个体外扩增方法是基于利用长，线性DNA分子稳定转染细胞，这些DNA分子具有几个拷贝的完整表达单位，编码需要的基因，且与编码可选择标记的一个末端单位连接。正如另一个实施例，需要的基因的基因扩增可以通过将它连接到二氢叶酸还原酶(Dhfr)基因和将氨甲喋呤给予转染细胞获得；这一方法可以将重组蛋白质生产提高许多倍(参见，Monaco(1996)基因180145-150)。
端粒酶和TRT的产生，表达和筛选在一个实施方案中，本发明提供鉴定动物和植物中的端粒酶活性的调节物的筛选测试。筛选测试可以利用由端粒酶活性的全部或部分再构成或现存的活性的扩大衍生的端粒酶或TRT。本发明提供的测试或筛选可以用于测试端粒酶合成端粒DNA的能力或测试TRT和通常各种TRT的任何一个或所有或“部分活性”，如上所述。该测试可以掺入细胞的体外修饰，这些细胞已经通过操作处理表达了含有或没有它的RNA成分的端粒酶(或相关的蛋白质)，并且这些可以再植入动物，用于体内测试。所以，本发明提供体内测试和用于本文的转基因动物。这些体内测试系统可能使用“敲出”细胞，其中内源端粒酶复合物的一个或几个单位已经缺失或抑制，也可以使用其中再构成或活化外源或内源端粒酶活性的细胞。
本发明同时涉及通过在动物如转基因动物中再构成端粒酶活性或抗端粒酶活性筛选端粒酶调节物的方法。本发明提供体内测试系统，这些系统包括“敲出”模型，其中内源端粒酶如TRT，端粒酶RNA成分和/或端粒酶相关的蛋白质的一个或几个单位已经被缺失或抑制。内源端粒酶活性可以全部或部分保留。这样的基因的“敲出”包括细胞系，组织，或整个动物正如转基因动物的敲出。
在一个实施方案中，再构成外源端粒酶活性的全部或部分。本发明的转基因动物也提供表达本发明的大量的全部或部分活性端粒酶组合物的方法。转基因动物也提供不灭的其它正常细胞，它们然后被可以用于表达需要的组合物。
在本发明的一个实施方案中，重组端粒酶在正常，二倍体的可灭细胞中表达，以便使它们永生，或简化细胞的长期培养或复制。其它端粒酶复合物成分，如核酸端粒酶序列模板分子(hTR，例如)或其它相关的蛋白质这些成分对于表达是有利的，或作为活性调节物，它们也可以被共表达。本发明提供了获得的具有正常表现型和核型二倍体不灭细胞的方法。本发明的这一方面是非常可行的，并且有商业用途；例如，FDA和公众将估价从正常细胞中产生的重组蛋白质以便使从这样的细胞产生的产品的病毒或其它污染减到最小。本发明允许人们生产人B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的不灭的杂合体以便获得人杂交瘤生产人单克隆抗体。利用本发明的方法，将TRT蛋白质和端粒酶活性转染进入人B淋巴细胞允许人们生产不灭细胞以生产抗体。另一个实施方案提供在细胞中导入重组端粒酶和/或端粒酶相关RNA和本发明的其它化合物以便产生商业需要的蛋白质。例如，提供本发明的方法，产生激素如生长激素的不灭的核型仍然正常的人垂体细胞，以便商业用途。在这一的实施方案的修改方案中，从身体中除去正常人细胞，利用本发明的方法和试剂使之不灭，利用需要的基因转染，以便在适当的水平表达该基因，导入回到个体中，以致转染的基因表达影响个体健康的分子。
本发明的另一个实施方案包括同样的方法，但细胞是“通用供体细胞”，它已经被修饰缺失组织相容性抗原或以一些方式中修饰防止或降低免疫排斥的可能性。从这些细胞的再导入个体中产生的复杂性可能是细胞可能失去生长控制，和变成无控制的细胞生长，变成癌，肿瘤或其它恶性状态。本发明通过提供调节地表达TRT或其它端粒酶成分的方法和/或通过提供敲出端粒酶(或活性需要的端粒酶复合物成分)的方法解决了这一复杂性。而且，甚至用于移植或其它目的的“可灭”细胞可以通过本发明的方法灭亡。没有活化的端粒酶，细胞不可逆地死亡，所以降低了在移植或其它再导入寄主生物体后的癌或恶性转化的可能性。这将不影响细胞的功能，因为端粒酶在体细胞中不能正常活化。
调节地提供TRT和其它端粒酶成分的方法，即在寄主细胞，组织，或动物中可控制地表达包括使用反义构建体，该构建体当在适当的细胞或组织中发信号表达反义核苷酸时，抑制端粒酶活性并终止细胞不再分裂。细胞内的重组抗体结合成分的表达也可以用于这一目的。可诱导的和/或特异性于组织的顺式和/或反式-作用转录和翻译调节元素可以用于控制TRT和其它端粒酶成分的表达。顺式作用的转录调节元素的例子包括端粒酶基因的启动子和增强子。顺式作用转录调节元素的例子包括稳定mRNA或保护转录物免受降解的元件。顺式和反式作用调节因子的鉴定和分离提供了鉴定调节端粒酶的转录和翻译的因子的其它方法和试剂。
本发明也提供了用于在这样的动物以及正常细胞中表达本发明的端粒酶和TRT组合物的转基因动物和方法，这些正常细胞可以用于表达需要的组合物，并且可以用于相关的方法。本发明也提供表达或与酶RNA成分或其它端粒酶相关蛋白质共表达内源或外源TRT的转基因动物。本发明提供了用作例如生物反应器的转基因动物和重组细胞(Khillan(1997)分子生物学方法，63327-342)以便产生大量的端粒酶，TRT和本发明的其它蛋白质。为了产生活的测试系统以便筛选TRT的调节物，可以利用非人的动物模型。在这一非人动物中，可以首先使内源端粒酶变弱，或在导入重组TRT，TR和/或其它端粒酶相关成分之前“敲出”。
本发明的端粒酶表达核酸可以通过各种常规技术导入动物或植物寄主生物体(Jacenko(1997)分子生物学方法62399-424)。例如，在转基因和基因靶击途径中的最新进展允许通过基因叠加，基因缺失，或基因修饰复杂地操作小鼠基因组，使这一动物对于本发明的方法是方便的(Frarz(1997)分子方法杂志75115-129；Peterson(1997)遗传能量(NY)19235-255)。许多转基因构建的克隆载体是本领域已知的，如Yang(1997)生物技术221032-1034。对于在动物基因组中简单导入DNA，有两个良好地建立的方法，前核DNA注射和利用反录病毒转导(Wei(1997)药物抗毒性年评37119-141)。用于在动物和植物中导入DNA的微注射技术是本领域已知的，并在科学和专利文献中有叙述。利用聚乙二醇沉淀在细胞中导入DNA构建体在Paszkowski(1984)EMBOJ.32717中有叙述。电穿孔技术在Fromm(1985)美国科学院年报825824中有叙述。弹道转化技术是在Klein(1987)自然32770中叙述的。
本发明同时提供了转基因植物和表达本发明的端粒酶和TRT组合物和筛选测试的方法以便鉴定这样的植物中的端粒酶活性的调节物。在植物中，可以将DNA构建体直接利用技术如植物细胞的原生质体的电穿孔和微注射导入植物细胞的基因组DNA，或者可以将DNA构建体直接利用弹道方法如DNA颗粒轰击导入植物组织。如上所述，如含有本发明的端粒酶序列的烟草花叶病毒的植物病毒载体可以用于接种植物(Rouwendal(1997)植物分子生物学33989-999)。
药物组合物本发明也涉及含有单独的端粒酶和/或端粒酶亚单位核苷酸，蛋白质，抗体，拮抗剂，激动物，或抑制剂或与至少一种其它试剂如稳定化合物联合的药物组合物，这些药物组合物可以在任何无菌，生物相容的药物载体包括，但不限于盐，缓冲盐，葡聚糖，和水中给药。任何这些分子可以对病人单独或与其它试剂，药物或激素结合为药物组合物给药，其中这些分子与适当赋形剂，助剂，和/或药物可接受载体混合。在本发明的一个实施方案中，药物可接受载体是药物惰性的。
以药物组合物给药口服或肠胃外完成药物组合物的给药。肠胃外递送的方法包括局部的，动脉内的(例如，直接到肿瘤的)，肌肉内的，皮下，髓内的，鞘内的，心室内的，静脉内，腹膜内，或鼻内给药。除了活性成分，这些药物组合物可能含有适当的药物可接受载体，包括赋形剂和其它化合物，这可以简化活性化合物加工成制剂的过程，使该制剂可以用于药学。配制和给药的其它技术细节可以在最新版本的“Remington药学科学”中找到(Maack出版公司，EastonPA)。
利用本领域已知的药物可接受载体可以配制用于口服的给药药物组合物成适于口服给药的剂量。这样的载体能够使药物组合物配制成片剂，丸剂，糖衣药丸，胶囊，液体，凝胶，糖浆，浆，悬浮液，等等，这些适于病人消化。
用于口服的药物制剂可以通过将活性化合物与固体赋形剂结合，非强制性地，在加入适当的其它化合物后，研磨得到的混合物，加工混合物颗粒，如果需要获得片剂或糖衣药丸核心。适当的赋形剂是碳水化合物或蛋白质填充物，包括但不限于蔗糖，包括半乳糖，蔗糖，甘露醇，或山梨醇；来自玉米，小麦，水稻，土豆，或其它植物的淀粉；纤维素如甲基纤维素；或羟基丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素；和树胶包括阿拉伯树胶和西黄耆胶；以及蛋白质如明胶和胶原。如果需要，可以加入分解或溶解性的试剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，海藻酸，或其盐，如海藻酸钠。
糖衣药丸与适当的包衣，如浓缩的蔗糖溶液一起提供，也可以含有阿拉伯树胶，滑石粉，聚乙烯吡咯烷酮，carbopol凝胶，聚乙二醇，和/或二氧化钛，漆溶液，和适当的有机溶剂或溶剂混合物。在片剂或糖衣药丸包衣中加入染料或色素可以用于鉴定产物或鉴定活性化合物的量(即，剂量)。
可以口服的药物制剂包括与明胶组成的推入配合胶囊，以及由明胶，和例如甘油或山梨醇的包衣组成的柔软封闭的胶囊。推入配合胶囊可以含有与填充物或结合物如乳糖或淀粉，润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁，和非强制性地稳定剂混合的活性成分。在柔软的胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮于含有或不含有稳定剂的适当的液体，如脂肪油，液体石蜡，或液体聚乙二醇，。
对于肠胃外给药的药物制剂包括活性化合物的水溶液。对于注射，本发明的药物组合物可以在水溶液，优选地是生理相容缓冲液如Hank溶液，Ringer溶液，或生理缓冲盐中配制。水状注射悬浮液可以含有增强悬浮液粘度的物质如羧甲基纤维素钠，山梨醇，或葡聚糖。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。适当的亲脂溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。非强制性地，悬浮液也可以含有适当的稳定剂或能增强化合物的可溶性从而制备高浓度的溶液的试剂。
对于局部或鼻内给药，适于渗透特定屏障的渗透剂用于制剂中。这样的渗透剂通常是本领域已知的。
制造和储藏本发明的药物组合物可以根据本领域已知的标准制造过程制造(例如，通过常规混合，溶解，胶囊化，制造糖衣，调成糊，乳剂化，包成胶囊，埋入，或冻干方法)。
药物组合物可以以盐形式提供，并且可以与许多酸一起配制，这些酸包括但不限于盐酸，硫酸，乙酸，乳酸，酒石酸，苹果酸，琥珀酸等等。盐趋向于在水溶液或其它阳离子溶剂中更可溶，这些阳离子溶剂是相应的游离碱形式。在其它情况中，优选的制剂可以是冻干的粉末，它包含1-50毫摩尔浓度组氨酸，0.1-2％蔗糖，2％-7％甘露醇，pH范围4.5到5.5之间，在使用之前与缓冲液合并。
在已经制备了含有在可接受载体中配制的本发明的化合物的药物组合物后，可以将它们置于适当的容器中，并将它标记用作为治疗的指示症状。这样的标记通常将包括给药的量，频率，和方法。
治疗的有效剂量适于本发明使用的药物组合物包括含有有效量的活性成分的组合物以便达到预期的目的。确定有效剂量是本领域的技术人员的能力范围内的。
对于任何化合物，在细胞培养测试或在适当的动物模型中可以开始评估治疗有效剂量。动物模型也可以用于达到需要的浓度范围和给药途径。然后，这样的信息可以用于确定人中有用的给药剂量和途径。
治疗有效剂量指减轻症状或状态的蛋白质或它的抗体，拮抗剂，或抑制剂的量。这样的化合物的治疗效力和毒性可以通过细胞培养或实验动物中的标准药学方法确定(例如，ED50，50％的群体治疗有效的剂量；和LD50，50％的群体致死的剂量)。在治疗和毒性效果之间的剂量比例是治疗指标，它可以表达为LD50/ED50。显示大的治疗指标的药物组合物是优选的。从细胞培养测试和动物研究获得的数据是用于配制人用途的剂量范围的。这样的化合物的剂量优选地位于有小或没有毒性的ED50的循环系统浓度范围内。在该范围内，该剂量在根据使用的剂量形式，病人的敏感度，和给药途径变化。
由个别治疗人员根据待治疗的病人选择准确的剂量。调节剂量和给药以便提供足够水平的活性成分或维持需要的效果。可以考虑的其它因子包括疾病状态的严重性(例如，肿瘤大小和位置)；病人的年龄，体重和性别；饮食；给药的时间和频率；药物联合；反应的敏感度；和对治疗的耐受性/应答。长效的药物组合物可以每3到4天，每星期，或每2星期，根据特定的配方的半衰期和清除速度给药。至于特定的递送剂量和方法的指导在文献中提供了(参见，美国专利号4,657,760；5,206,344；和5,225,212，引入本文作为参考)。本领域技术人员将使用与蛋白质或它们的抑制剂不同的核苷酸配方。同样，递送聚核苷酸或多肽将是特异于特定细胞，症状，位置和诸如此类的。
同样涉及的是例如人端粒酶可以用作治疗分子以抗击疾病(例如，癌症)和/或其它与老化相关的问题。另外涉及的是能够降低人端粒酶或端粒酶蛋白质亚单位的表达的反义分子可以用作治疗分子以治疗与人端粒酶的异常表达相关的肿瘤。仍然另外涉及的是抗人端粒酶和能够中和人端粒酶生物活性的抗体可以用作治疗分子以治疗与人端粒酶和/或端粒酶蛋白质亚单位的异常表达相关的肿瘤。
定义为了简化对本发明的理解，下面定义了许多术语。
如本文所用，“亲和纯化”指，通过使用“亲和性低聚核苷酸”(即，反义低聚核苷酸)结合颗粒，接着通过“替换低聚核苷酸”从低聚核酸中洗脱颗粒来纯化核糖核蛋白颗粒。在本发明中，错配低聚核苷酸与亲和低聚核苷酸具有更大程度的互补性，因此产生比颗粒和亲和低聚核苷酸更具热动力学稳定的双链体。例如，端粒酶可以结合亲和低聚核苷酸，然后通过使用结合亲和低聚核苷酸的替换低聚核苷酸进行洗脱。在本质上，替换低聚核苷酸替代来自亲和低聚核苷酸的端粒酶，允许洗脱端粒酶。在足够温和的条件下，该方法导致得到丰富的功能性核糖核蛋白颗粒。所以，该方法可用于从化合物的混合物中纯化端粒酶。
如本文所用，“聚核苷酸中的变化”包括在编码端粒酶的聚核苷酸的序列中的任何改变，包括缺失，插入，和点突变。这些可以利用杂交测试检测。包括在这一定义中的是编码端粒酶的基因组DNA序列的变化的检测(例如，通过能够与SEQ ID NOS1或3的任何序列杂交的限制酶片段的图谱的改变[例如，RFLP分析]，选择的任何序列的片段不能与基因组DNA样品杂交[例如，利用特异性于等位基因的低聚核苷酸探针]，不适当或预期不到的杂交，如与不是正常染色体的端粒酶或端粒酶基因的位置的位点杂交，例如，利用FISH与中期染色体铺展杂交，等等])。
如本文所用，术语“氨基酸序列”指肽或蛋白质序列。
“扩增”的定义是产生核酸序列的其它拷贝，通常利用聚合酶链式反应(PCR)或本领域已知的其它技术进行(例如，Dieffenbach和Dveksler，PCR引物，实验室手册，冷泉港出版社，Plainview NY)。如本文所用，术语“聚合酶链式反应”(“PCR”)指K.B.Mullis的方法(美国专利号，4,683,195和4,683,202，引入本文作为参考)，其中叙述了没有克隆或扩增而增加基因组DNA混合物中靶序列的区段的浓度的方法。这一扩增靶序列的方法由在含有需要的靶序列的DNA混合物中导入大大过量的两个低聚核苷酸引物，接着在存在DNA聚合酶时准确的热循环顺序组成。两个引物是与双链靶序列的相关链互补的。为了实现扩增，使混合物变性，然后，将引物与靶分子内的互补序列退火。在退火之后，利用聚合酶延伸引物以便形成互补链的新配对。变性，引物退火和聚合酶延伸的步骤可以重复许多次(即，变性，退火和延伸构成一个“循环”，可以有许多“循环”)以便获得高浓度的需要的靶序列的扩增区段。需要的靶序列的扩增区段的长度是通过引物相互之间的相对位置确定的，所以，该长度是可控制参数。根据该过程的重复部分，该方法称为“聚合酶链式反应”(下面称为“PCR”)。因为靶序列的需要的扩增区段变成混合物中的主导序列(根据浓度)，将它们称为“PCR扩增”。
如本文所用，术语“扩增产物“和“PCR产物“指在完成变性、退火和延伸的两个或更多PCR步骤的循环后的化合物的混合物。这些术语包括的情况中有一个或多个靶序列的一个或多个区段已经扩增。利用PCR，可以扩增基因组DNA中的特异性的靶序列的单个拷贝达到通过几个不同方法可检测的水平(方法如，利用标记探针杂交，掺入生物素化引物，接着抗生物素蛋白酶共轭物检测；将32P-标记的脱氧核苷酸三磷酸，如dCTP或dATP，掺入扩增的区段)。除了基因组DNA，任何低聚核苷酸序列可以利用适当的引物分子系列扩增。特定地说，PCR方法本身产生的扩增部分本身是随后的PCR扩增的，有效的模板。扩增的靶系列可以用于获得DNA区段(例如基因)用于插入到重组载体。
术语“抗体”指基本由免疫球蛋白基因或与免疫球蛋白基因或其片段或合成或重组类似物编码的多肽，它特异性结合和识别分析物和抗原。识别的免疫球蛋白基因包括kappa，λ，α，γ，δ，ε和μ恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链划分为kappa或λ。重链划分为γ，μ，α，δ，或ε，这些依次定义免疫球蛋白的类别为IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。举证的免疫球蛋白(抗体)结构单位包括四聚体。每个四聚体由多肽链的两个相同对组成，每对具有一个“轻”(约25千道尔顿)和一个“重”链(约50-70千道尔顿)。每个链的N末端定义为约100到110或更多氨基酸的可变区，它们主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻和重链。抗体存在，例如作为完整的免疫球蛋白，或作为各种肽酶消化产生的许多很好鉴定的片段，参见基础免疫学，第三版，W.E.Paul，Raven出版社，NY(1993)。当根据完整抗体的消化定义各种抗体片段后，一个技术人员将认识到的那些片段是可以从头开始化学地，或通过利用重组DNA技术可以合成，例如在噬菌体，病毒，或细胞表面显示的重组单链Fv或其抗体或片段。术语免疫反应条件指抗体可以结合抗原如本发明的TRT的环境。如下所述，这可以是免疫结合测试。短语“与抗体特异性结合”当指蛋白质或肽时，指在存在蛋白质和其它生物试剂的异源群体时确定蛋白质的存在的结合反应。所以，在命名的免疫测试条件下，特异性抗体结合特定的蛋白质并且不以明显的量结合样品中存在的其它蛋白质。在这样的条件下与抗体的特异性结合可能需要由于其与特定蛋白质的特异性而选择的抗体。例如，可以选择特异性于本发明的端粒酶TRT蛋白质或特异性于由TRT序列的蛋白质的部分的抗体，它与本发明的所有TRT种类或只是本发明的一个TRT种类特异性地免疫反应，而与其它非端粒酶蛋白质不反应。如下所述，各种免疫测试方式可以用于选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测试通常用于选择与蛋白质特异性免疫反应的单克隆抗体。参见，Harlow和Lane(1988)抗体，实验室手册，冷泉港实验室出版社，纽约(Harlow和Lane)，可以用于确定特异性免疫反应性的免疫测试方式和条件的叙述。特异性的或选择性反应是产生至少两倍(2×)于背景信号或“杂音”的信号的反应。
如本文所用，术语“抗原决定簇”指与特定抗体保持接触的抗原部分(即，表位)。当蛋白质或部分蛋白质用于免疫接种寄主动物，蛋白质的许多区域可以诱导抗体的产生，这些抗体特异性地与蛋白质上的给定区或三维结构结合；这些区域或结构是指抗原决定簇。抗原决定簇可以与完整的抗原(即用于引发免疫应答的免疫原)竞争结合抗体。
如本文所用，术语“反义”用于指与特异性的RNA序列(即，mRNA)互补的RNA序列或其它低聚核苷酸或核酸包括那些含有或由全部合成或非天然存在的核苷酸或键组成的。反义RNA可以通过任何方法产生包括通过拼接需要的基因到允许合成编码链的病毒启动子进行合成。一旦导入细胞，这一转录链结合细胞产生的天然mRNA形成双链体。然后，这些双链体阻止mRNA的进一步转录或它的翻译。以这一方式，可以产生突变体或变化的表现型。术语“反义链”用于表示与“有意义”链互补的核酸链。名称(-)(即，“负”)有时用于表示反义链，名称(+)有时用于表示有意义(即，“正”)链。
术语“生物活性”指端粒酶(或其它)分子或具有天然存在的端粒酶(或其它)分子或肽的结构，调节或生物化学功能的肽。同样，“免疫活性”的定义是天然，重组，或合成的端粒酶蛋白质或其任何多肽或低聚肽，在适当的动物或细胞中诱导特异性的免疫应答和结合特异性抗体的能力。
如本文所用，术语“能够复制端粒DNA”指功能端粒酶发挥复制定位于端粒中的DNA的功能的能力。涉及的是该术语包括端粒，以及通常发现定位于染色体的端粒区的序列和结构的复制。例如，“端粒DNA”包括但不限于大多数生物体的端粒中发现的重复序列的串联排列。
如本文所用，术语“纤毛虫”指属于纤毛虫门的任何原生动物。
如本文所用，术语“互补”或“互补性”用于表示通过碱基配对原则相关的聚核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列“5’-A-G-T-3’”与序列“3’-T-C-A-5’”互补。互补可以是“部分的”，其中双链核酸的一些核苷酸碱基根据碱基配对原则配对。或者，可以是在核酸之间“完全”或“全部”互补。在核酸链之间的互补的程度对核酸链之间的杂交的效力和强度具有明显的影响。这在扩增反应以及依赖于核酸之间的结合的检测方法特别重要。
术语“保守替代”指蛋白质，如本发明的TRT的氨基酸组成变化成“保守变异体”，以致该变化基本不改变蛋白质的(保守变异体的)活性，该术语也指核酸的核苷酸序列中相应的变化。这保守地包括特定的氨基酸序列的修饰变异体，即那些不是蛋白质活性的关键的氨基酸替代或利用具有同样特性(例如，酸性，碱性，正或负电荷，极性，或非极性等等)的其它氨基酸替代，以致甚至关键氨基酸的替代基本不改变活性。提供功能相似的氨基酸的保守替代的表是本领域已知的。下面的六个基团每个含有相互保守替代的氨基酸1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)(参见，Creighton(1984)蛋白质，W.H.Freeman和Company)。本领域一个技术人员将认识到上面鉴定的替代不是唯一可能的保守替代。例如，一些情况下，可以认为所有带电氨基酸为相互可保守替代不管它们是正或负。另外，在编码序列中改变，叠加，或缺失单个氨基酸或小百分数氨基酸的个别替代，缺失或叠加也可以认为“保守修饰的变异”。术语“保守替代”也指在核酸序列中的变化成为“保守变异体”，以致替代基本不改变核酸涉及的活性(保守变异体)，例如，因为没有改变未改变的核酸编码的蛋白质的活性。本发明的核酸序列清楚地包括其保守(修饰的)变异体(例如，简并密码子替代)和互补序列，以及清楚地标明的序列。特定地，简并密码子替代可以通过产生其中一个或多个选择(或所有)密码子的第三个位置利用混合碱基和/或脱氧肌苷残基替代的序列获得(Batzer(1991)核酸研究，195081；Ohtsuka(1985)生物化学杂志，2602605-2608；Rossolini(1994)分子细胞探针891-98)。
如本文所用，术语“与聚核苷酸的表达相关”指通过杂交测试检测与端粒酶序列互补的核糖核酸(RNA)的存在表明了编码真核细胞端粒酶，包括样品中的人端粒酶的mRNA的存在。这样的相关性可以包括从编码蛋白质的基因表达端粒酶mRNA。
“缺失”的定义是在核苷酸或氨基酸序列中的变化，其中分别缺失了一个或多个核苷酸或氨基酸残基。
如本文所用，术语“衍生物”指分子的化学结构和这样的结构的修饰，例如，编码端粒酶结构的核酸，如E.aediculatus端粒酶的123千道尔顿或43千道尔顿蛋白质亚单位，或其它端粒酶蛋白质或肽。这样的修饰的描述为甲烷基，酰基，或氨基替代氢。核酸衍生物包括保留基本天然存在端粒酶或它的亚单位的生物特征的多肽的核酸。
如本文所用，术语“真核生物”指与“原核生物”区别的生物体。该术语的目的是包括具有显示真核生物常规特征的细胞的所有生物体，这些特征如存在具有核膜为边界的真核，核中具有染色体，存在结合膜的细胞器，和其它真核生物体中通常观察到的特征。所以，该术语包括但不限于如真菌，原生动物，和动物(人)这样的生物体。
如本文所用，术语“Euplotes端粒酶多肽”指至少含有Euplotes端粒酶结构的一部分的多肽。该术语包括Euplotes端粒酶的123千道尔顿和43千道尔顿多肽或蛋白质亚单位。该术语同样打算包括这些蛋白质亚单位的变异体。另外打算包括SEQ ID NO1和3编码的多肽。因为分子量测量可能根据使用的技术变化，所以不打算将本发明准确地限制于SEQ IDNO1和3编码的多肽的123千道尔顿或43千道尔顿的分子量，如特定的方法如SDS-PAGE确定。
术语“表达载体”或“载体”指为了在任何细胞，包括原核细胞，酵母，真菌，植物，昆虫或哺乳动物细胞中组成型地，可诱导地体外或体内表达本发明的核酸序列的重组表达系统。将表达的核酸序列插入(拼接)到载体。该术语包括线性或环形核酸表达系统，如保持游离型或整合进入寄主细胞基因组的那些。表达系统可以具有自我复制或没有，即在细胞中只有启动短暂表达的能力。该术语包括重组表达“盒”，只含有重组核酸转录需要的最小元件。
术语“同源性”，“序列等同性”和“序列相似性”指互补性或序列等同的程度。可以是部分同源或完全同源(即等同性)。部分互补序列是至少部分抑制完全互补序列杂交到靶核酸，并且可以指将该功能术语用作与完全互补序列“基本同源”。完全互补序列与靶序列的杂交的抑制可以利用杂交测试在低严格性条件下检测(Southern或Northern印迹，杂交溶液和诸如此类)。基本同源的序列或探针将在严格性条件下竞争和抑制与靶完全同源的结合(即，杂交)。这不是说低严格性条件允许非特异性结合；在低严格性条件要求两个序列相互结合是特异性(即，选择)相互作用。非特异性结合的缺乏可以通过利用缺乏部分程度的互补性(例如，少于约30％等同性)的第二个靶进行测试；在完全缺乏非特异性结合时，该探针将不与第二个非互补靶杂交。术语“序列等同性”，“序列相似性”和“同源性”指当两个序列，如本发明的hTRT蛋白质的核酸和氨基酸序列，以最适排列时，如利用程序BLAST，GAP，FASTA或BESTFIT，具有至少40％到50％的序列等同性，优选地至少60％或更大的序列等同性。“氨基酸序列等同性百分数”指两个TRT核酸或多肽的序列的比较，这两个序列以最适排列时，具有约同样的核苷酸或氨基酸的指定的百分数。例如，“60％序列等同性”和“60％同源性”指两个核酸或多肽的序列的比较，当最适排列时，具有60％的等同性。另一个适于确定序列等同性的算法是BLAST算法，这在Altschul(1990)分子生物学杂志215403-410；Shpaer(1996)基因组38179-191中叙述了。进行BLAST分析的软件在生物技术信息国家中心(http//www.ncpi.nlm.nih.gov/)公众可得。这一算法包括通过在查问序列中鉴定长度W的短语首先鉴定高得分的序列对(HSP)，当与数据库序列中同样长度的短语排列时，该序列匹配或满足一些正值限得分T被称作为相邻词的得分限值(Altschul等人，出处同上)。这些最初邻近短语标的的作用是开始研究发现含有它们的更长的HSP的种子。短语标的在沿着每个序列的两个方向延伸直到累积排列得分可以增强。当积累排列得分从它的最大获得值下降量X，在每个方向中的短语标的的延伸停止；因为一个或多个负得分残基排列的累积，积累得分到达零或零下；或达到序列的末端。BLAST算法参数W，T和X确定了排列的敏感度和速度。利用BLAST程序作为defaults，11的短语长度，50的BLOSUM62得分基质(参见，Henikoff(1992)美国科学院年报8910915-10919)排列(B)，10的例外(E)，M＝5，N＝4，和两条链的比较。术语BLAST指BLAST算法，在两个序列之间进行相似性的统计分析；参见，例如，Karlin(1993)美国科学院年报905873-5787。BLAST算法提供的相似性测量是最小总数的可能性(P(N))，提供了可能性的指示，通过这种可能性将随机发生两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配。例如，可以认为核酸与TRT核酸相似如果在测试的核酸与TRT核酸的比较中最小总数的可能性小于约0.5，0.2.0.1.0.01或0.001。
如本文所用，术语“杂交”包括“通过碱基配对核酸链与互补链结合的任何过程”(Coombs，生物技术词典，Stockton出版社，纽约NY)。如本文所用，术语“杂交复合物”指在两个核酸序列之间借助互补G和C碱基和互补A和T碱基之间的氢键的形成形成复合物；这些氢键可以进一步通过碱基堆积相互作用稳定。两个互补的核酸在反平行的构型中排列氢键。在溶液(例如，C0t或R0t分析)或在存在于溶液中的一个核酸和固定于固体支持物(例如在Southern和Northern影印，点影印中使用的尼龙膜或硝酸纤维素滤纸，原位杂交包括FISH(荧光原位杂交)中使用的玻璃片)上的另一个核酸之间形成杂交复合物。
术语“特异性杂交”指与特定的靶DNA或RNA序列杂交，成双螺旋，或结合的核酸。靶序列可以存在于总细胞DNA或RNA的制剂中。适当的退火条件是依赖于例如核酸的，如探针长度，碱基组成，和错配数目和它们在探针上的位置和相应的靶，并且假如适当的试剂是可得的，可以容易地凭经验确定退火条件。核酸探针设计和退火条件的讨论，参见例如，Sambrook，分子克隆，实验室手册(第二版)1-3卷，冷泉港实验室(1989)(Sambrook)和当前分子生物学方法，Ausubel，Greene出版社和Wiley-Interscience纽约(1987)(Ausubel)。术语“严格杂交”，“严格杂交条件”，“严格条件”，或“特异性杂交条件”指在该条件下，低聚核苷酸(当使用时，例如，作为探针或引物)将与它的靶序列，如生物样品中的核酸的TRT重组序列但不是非端粒酶序列杂交。严格条件是依赖序列的。所以，在一系列严格条件下，低聚核苷酸探针将与本发明的唯一TRT属种类杂交。在另一系列的严格条件下，低聚核苷酸探针将与本发明的TRT属的所有种类但不是非端粒酶核酸杂交。更长序列在较高温度特异性地杂交。选择严格条件比在确定的离子强度和pH的特异性序列的热熔点(Tm)低约5EC。Tm是当50％的与靶序列互补的探针在平衡时与靶序列杂交的温度(在确定的离子强度，pH，和核酸浓度下)(如果靶序列过量存在，在Tm时，平衡时占据了50％的探针)。通常，严格条件将是盐浓度小于约1.0M钠离子，即约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，pH 7.0到8.3，和温度对于短探针是30EC(例如，10到50个核苷酸)和对于长探针至少60EC(例如，大于50个核苷酸)。严格条件也可以加入去稳定剂如甲酰胺获得。通常，在低严格洗涤条件后高度严格洗涤条件能够除去背景探针信号。中等严格洗涤双链体例如大于100个核苷酸的条件的例子是1×SSC，在45EC15分钟(参见Sambrook)。洗涤双链体，例如超过100个核苷酸的低严格条件是4-6×SSC，在40EC，15分钟。在特定的杂交测试中观察到的2倍(或以上)的不相关的探针的信号与噪音比例表明检测到“特异性杂交”。在严格条件下，不相互杂交的核酸仍然可能基本相同，如果它们编码的多肽基本相同的话。这可以当产生编码保守替代的核酸时发生。严格杂交和严格杂交洗涤条件在不同的环境参数下是不同的，如Southern和Northern杂交。在Tijssen(1993)在生物化学和核酸探针的分子生物学杂交中的实验室技术，I部分，2章，杂交的原理和核酸探针测试的方案的总结，Elsevier，NY中可以发现核酸杂交的广泛指导。
“插入”或“叠加”是核苷酸或氨基酸序列中的变化，这些已经导致了与天然存在序列比较分别加入了一个或多个核苷酸或氨基酸残基。
如本文所用，“分离”，当用于分子或组合物，如TRT或端粒酶相关的核酸时，指从至少一个其它化合物，如蛋白质，其它核酸(例如，RNA)，或其它污染中分离分子或组合物，这些污染物是与该分子或组合物体内或天然存在状态结合的。所以，当TRT从任何其它天然结合的成分，例如细胞膜，如在细胞提取物中分离时认为TRT是分离的。但是，分离的组合物也可以是基本纯的。
术语“标记”指可检测的组合物，如通过光谱的，光化学的，生物化学的，免疫化学的，物理的或化学的手段。例如，有用的标记包括32p，35S，3H，14C，125I，131I，荧光染料(例如，FITC，若丹明，磷酸镧)，电子密度试剂，酶，例如通常在ELISA中使用的(例如，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，荧光素酶，碱性磷酸酶)，生物素，dioxigenin，或半抗原和蛋白质，由此可以获得抗血清或单克隆抗体。标记可以直接插入核酸，肽，或其它待检测的靶化合物，或者它可以附着于杂交或结合到靶的探针或抗体。可以通过掺入第二个报道分子识别的(例如，亮氨酸拉链配对序列，第二个抗体结合位点，转录激活多肽，金属结合区，表位标记)预定的多肽表位可检测肽。在一些实施方案中，标记附着于各种长度的隔离臂，从而减少潜在的立体障碍，或影响其它有用或需要的特性。参见例如，Mansfield(1995)分子细胞探针，9145-156。
如本文所用，术语“大核”指在纤毛虫中观察到的更大的两类核。这一结构有时也指“营养”核。大核含有各个基因的许多拷贝，并且是转录活化的。
如本文所用，术语“微核”是指在纤毛虫中观察到的两种类型的核的较小者。该结构有时被称作为“再生性”核，如参与减数分裂和自体授精。微核是二倍体的并且是转录失活的。
如本文所用，“核酸序列”或“低聚核苷酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，核苷酸或聚核苷酸，和其片段或部分，和天然或合成起源的DNA或RNA，它们可以是单或双链，或含有有义和反义链。该术语包括核酸即含有天然核苷酸的已知类似物的寡核苷酸，它们的与参考核酸具有同样的或提高的结合或其它特性，如为了需要的目的。该术语也包括以相似于天然存在的核苷酸的方式或以为了的目的提高的速度代谢的核酸。该术语也包括含有合成的骨架的核酸状结构。本发明提供的DNA骨架类似物包括磷酸二酯，硫代磷酸，二硫代磷酸，甲基磷酸，氨基磷酸酯，烷基磷酸三酯，氨基磺酸盐，3’-硫代乙酰，亚甲基(methylimino)，3’-N-氨基甲酸酯，吗啉氨基甲酸酯，和其它核酸；参见低聚核苷酸和类似物，实验方法，F.Eckstein，IRL出版社，牛津大学出版社(1991)；反义方案，纽约学术科学年报，600卷，Baserga和Denhardt(NYAS1992)；Milligan(1993)化学方法杂志，361923-1937；反义研究和应用(1993，CRC出版社)，在全部和特定地在15章，Sanghvi，名称为“核酸中的杂环碱基修饰和它们在反义低聚核苷酸中的应用”。如本文所用，“肽核酸”或“PNA”指低聚物分子，其中核苷通过肽，而不是磷酸二酯，键连接。这些小分子也称为抗基因试剂，通过结合它们的核酸互补链终止转录物的延长(Nielsen等人，抗癌药物Des853-63)。PNA含有非离子骨架，如N-(2-氨乙基)甘氨酸单位，如1996年4月9日递交的USSN08/630/019，和US CIP USSN08/838,545和PCT申请PCT/US/97/05931，两者是1997年4月9日递交的。硫代磷酸酯键如WO97/03211；WO96/39154；Mata(1997)抗毒药物应用144189-197中所述。该术语中包括的其它合成骨架包括甲基磷酸键或改变甲基磷酸和磷酸二酯键(Strauss-Soukup(1997)生物化学368692-8698)，苄基磷酸键，这些与未修饰的低聚核苷酸和甲基磷酸酯相比，对核酸酶更加稳定，显示了更高的亲脂性(Samstag(1996)反义核酸药物研制v6153-156)。术语核酸可与基因，cDNA，mRNA，低聚核苷酸引物，探针和扩增产物相互变换用。术语“外源核酸”指已经分离，合成，克隆，连接，以在自然界中没有发现的方式从另一个核酸的连接中切出，和/或导入和/或在细胞或细胞环境表达，而不是在不同于所述的核酸或蛋白质在自然界中存在的细胞或细胞环境的水平或形式表达的核酸。该术语包括两个从不同的生物体或细胞类型而不是它表达的细胞类型原始获得的核酸，和从与表达它的细胞系同样的细胞系中获得的核酸。
如本文所用，术语“聚合酶”指任何适于在需要的核酸的扩增中使用的聚合酶。该术语打算包括如从栖热水生菌获得的Taq DNA聚合酶的DNA聚合酶，虽然其它聚合酶，热稳定和不耐热的也包括在这一定义中。
如本文所用，术语“多倍体”指含有两套以上的染色体的细胞或生物体。
如本文所用，术语“部分”，当用于蛋白质时(如在“给定的蛋白质的部分”中)指蛋白质的片段。该片段的大小范围可以是四个氨基酸到全部氨基酸序列减一个氨基酸。所以，“至少含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的一部分”包括全长的123千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位和其片段。
如本文所用，术语“探针”指可以特异性地结合另一个的分子。例如，探针可以是低聚核苷酸(即，核苷酸序列)，不管作为纯化的限制消化物天然存在或合成产生，能够与另一个低聚核苷酸或需要的聚核苷酸杂交。探针可用于检测，鉴定，和分离特定的基因序列或特定的基因产物，不管是核酸或蛋白质。这涉及任何用于本发明的探针可以利用“报道分子”标记，可以在任何检测系统中检测，包括但不限于酶(例如，ELISA，以及基于酶的组织化学测试)，荧光，放射性活化，和荧光系统。同时涉及的是利用报道分子可以标记需要的低聚核苷酸，抗体，或其它蛋白质或核酸(即，待检测的)。同时涉及的是可以标记需要的探针和低聚核苷酸。本发明不打算局限于任何特定的标记系统或标记。
如本文所用，术语“限制内切核酸酶”和“限制酶”指细菌或其它酶，该酶在特异性的核苷酸序列或附近裂解双链或单链DNA。
术语“重组”，当用于细胞或核酸，蛋白质，或载体时，指材料，或对应于该材料的天然或天生形式的材料已经通过导入新成分或改变现存的成分修饰，或与其相同但从合成材料产生或起源的材料。例如，重组细胞可以表达在细胞的天然(非重组)形式中没有发现的基因，或通常在不同水平表达，或不表达的天然基因。术语“重组手段”指将如编码蛋白质的cDNA的重组核酸插入表达载体，将该载体导入细胞并且该细胞表达该蛋白质的技术。“重组手段”也包括将具有来自不同来源的编码或启动子序列的核酸连接到一个载体用于组成性或可诱导地表达蛋白质融合体，包括如本发明的TRT蛋白质的蛋白质。
如本文所用，术语“重组DNA分子”指由分子生物学技术和重组手段连接起来的DNA的区段组成的DNA分子。
如本文所用，术语“核糖核蛋白”指含有RNA和蛋白质的复合物大分子。
如本文所用，术语“样品”以最广意义应用。怀疑含有编码端粒酶亚单位的核酸的生物样品可以包括细胞，从细胞分离的染色体(例如，中期染色体铺展)，基因组DNA(在溶液中，或结合到固体支持物，如用于Southern影印分析)，RNA(在溶液中，或结合到固体支持物如Northern影印分析)，cDNA(在溶液中，或结合固体支持物)和诸如此类。怀疑含有蛋白质的样品可以包括细胞，组织的一部分，和含有一个或多个蛋白质的提取物和诸如此类。
术语“特异性的结合”或“特异性地结合”，当用于抗体和蛋白质或肽的相互作用中，指该相互作用依赖于蛋白质上特定结构(即，抗原决定簇或表位)的存在；用另一句话说，抗体识别和结合特异性的蛋白质结构而不是通常的蛋白质。例如，如果抗体特异性于表位“A”，含有表位A的蛋白质(或无，未标记A)在包括标记“A”和抗体的反应中的存在将减少结合到抗体的标记A的量。
“严格性”，用于指核酸杂交或结合通常发生的约Tm-5EC(低于探针的Tm5EC)到约低于Tm20EC到25EC的范围内。正如本领域技术人员能够理解的，严格杂交可以用于鉴定或检测相同的聚核苷酸序列或鉴定或检测相似或相关的聚核苷酸序列。本领域已知许多等当条件可以使用，包括低或高严格条件；考虑了因子如探针的长度和特性(DNA，RNA，碱基组成)和靶特性(DNA，RNA，碱基组成，存在于溶液中，或固定的，等等)和盐和其它成分(例如，存在或缺乏甲酰胺，硫酸葡聚糖，聚乙醇)浓度，杂交溶液可以改变为产生与上面列出的条件不同但相当的低或高严格杂交的条件。
“替代”产生于来源由不同的核苷酸或氨基酸分别替代一个或多个核苷酸或氨基酸。
如本文所用，术语“Tm”用于指“熔化温度”。熔化温度是双链核酸分子的群体一半分解为单链的温度。计算核酸的Tm的等式是本领域已知的。正如标准参考文献表明的，当核酸是1M NaCl的水溶液，Tm值的简单估价可以通过等式Tm＝81.5+0.41(％G+C)计算(参见，例如Anderson和Young，定量滤纸杂交，核酸杂交(1985)。其它参考文献包括更复杂的计算，将结构以及序列特征考虑进入Tm的计算中。
如本文所用，术语“靶”指待检测或特异性地操作的分子。例如，在PCR中，靶指与用于聚合酶链式反应的引物结合的核酸区。所以，“靶”从其它核酸序列中分拣出。“区段”的定义是在靶序列中的核酸区。
如本文所用，术语“端粒酶”和“端粒酶复合物”指功能性端粒酶。该术语打算包括端粒酶中发现的蛋白质和核酸的复合物。例如，该术语包括E.aediculatus的123千道尔顿和43千道尔顿的端粒酶蛋白质亚单位和端粒酶RNA。术语“TRT”和“端粒酶逆转录酶”指特异性于端粒的RNA依赖DNA聚合酶蛋白质，如E.aediculatus的123千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位。术语“TRT”和“端粒酶逆转录酶”指没有RNA成分的端粒酶全酶，除非特别表明。术语“端粒酶”和“端粒酶”指含有内部RNA成分的TRT，即用作DNA合成模板的RNA成分(“TR”)。端粒酶可以利用它的内部RNA成分的一部分作为模板以便指定端粒DNA重复序列加入到染色体的末端。本发明的TRT蛋白质是含有通常结构的特征，即如下详细讨论的基序的种类的蛋白质属，。本发明的TRT包括，当端粒与RNA成分(TR)如hTR结合能够催化端粒的合成的种类，能够具有一个或多个或所有部分的端粒酶活性的种类和如TRT同工型的种类，这些同工型被认为是本发明的属的成员，因为它们含有该属的需要的共同结构特征或与该属的另一个成员的足够的序列等同性。hTR已经被克隆和鉴定，各种有用的引物，探针和表达载体已经叙述，以及靶击hTR的诊断和治疗方法，这些方法可用于诊断和治疗癌症和其它端粒酶相关的疾病，参见PCT公开号96/01835，和96/40868和美国专利号5,583,016；同时参见USSN08/478,352,08/472,802和08/482,115，全部于1995年6月7日递交；08/521,634，于1995年8月31日递交；08/714,482，于1996年9月16日递交；和08/770,564，和08/770,565，于1996年12月20日递交。同时参见Feng(1995)科学2691236。另外，小鼠端粒酶RNA成分(mTR)已经被克隆和鉴定，参见USSN08/782,787，于1997年2月10日递交；08/670,516，于1996年6月27日递交；和08/485,778，于1995年6月7日递交。hTR敲出小鼠已经被构建，参见USSN08/623,166，于1996年3月28日递交。
术语“端粒酶活性”和“端粒酶逆转录酶活性”可以指端粒酶逆转录酶或端粒酶的“全部”或任何“部分活性”。端粒酶逆转录酶活性包括利用核酸模板，如端粒酶RNA合成DNA如端粒或端粒DNA的能力。端粒酶逆转录酶“部分活性”可以包括但不限于如TRT下面的能力的功能结合底物DNA；结合端粒酶RNA成分(TR)，即，hTR；催化核苷酸加到DNA底物；结合脱氧核苷酸底物；显示“溶核活性”(参见，Collins(1993)基因发展71364-1376)；结合端粒酶或端粒相关蛋白质或染色体结构；显示端粒酶的“持续合成”或“非持续合成”活性(参见Morin(1989)细胞59521-529)；显示端粒酶的“逆转录酶状活性”(参见Lingner(1997)科学276(5321)561-567)；结合作为其酶持续合成DNA聚合活性的一部分的核苷酸。体内结合染色体；体外或在再构成系统中结合低聚核苷酸引物(Harrington(1995)生化杂志2708893-8901)；和结合组蛋白，核基质蛋白质，细胞分裂/细胞周期控制蛋白和诸如此类。
关于氨基酸序列的“变异体”表示与另一个通常相关的氨基酸序列差异一个或多个氨基酸的氨基酸序列。变异体可以具有“保守”变化，其中替代的氨基酸具有同样的结构或化学特性(例如，用异亮氨酸替代亮氨酸)。更罕见地，变异体可能具有“非保守”变化，例如，用色氨酸替代甘氨酸。同样小的变异可以包括氨基酸缺失或插入(即，叠加)或两者。利用本领域已知的计算机程序，例如DNAStar软件可以发现确定哪个和多少氨基酸残基可以被替代，插入，或缺失而没有失去生物或免疫活性的指导。所以，涉及的是这一定义将包括端粒酶和/或端粒酶蛋白质亚单位的变异体。另一个例子，Euplotes的43千道尔顿多肽基因的三个开放读码框架(0RF)编码的多肽可被认为是相互的变异体，以及编码该多肽的43千道尔顿Euplotes基因的人同系物的变异体。可以在功能测试中如端粒酶测试，测试这样的变异体以便检测样品中功能端粒酶的存在。
实施例提供下面的实施例用于证明和和进一步解释本发明的一些优选的实施方案和方面并不构成限制范围。
在下面的实验公开物中，利用了下面的缩写eq(等当物)；M(摩尔浓度)；μM(微摩尔浓度)；N(正常)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；g(克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(纳克)；1或L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；EC(摄氏度)；RPN(核糖核蛋白)；MeRN(2’-O-甲基核糖核苷酸)；dNTP(脱氧核糖核苷酸)；dH2O(蒸馏水)；DDT(二硫苏糖醇)；PMF(苯甲基氟磺酰)；TE(10毫摩尔浓度TrisHCl，1毫摩尔亮度EDTA，约pH7.2)；KGlu(谷氨酸钾)；SSC(柠檬酸缓冲盐和钠)；SDS(十二烷基硫酸钠)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；Novex(Novex，圣迭戈，CA)；BioRad(Bio-Rad实验室，Hercules，CA)；Pharmacia(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)；Boehringer-Mannheim(Boehringer-Mannheim公司。Concord，CA)；Amersham(Amersham公司，芝加哥，IL)；Stratagene(Stratagene克隆系统，La Jolla，CA)；NEB(新英格兰生物实验室，Beverly，MA)；Pierce(Pierce化学公司，Rockford，IL)；Beckman(Beckman仪器，Fullerton，CA)；Lab工业(Lab工业公司，Berkeley，CA)；Eppendorf(Eppendorf科学，麦迪生，WI)；和分子动力学(分子动力学，Sunnyvale，CA)。
实施例1Euplotes aediculatus生长在这一实施例中，从David Priscott博士，MCDB，克罗里达大学获得E.aediculatus的培养物。Prescott博士最初从池塘水中分离这一培养物，虽然这一生物体也可以从ATCC(ATCC #30859)获得。如上所述在无菌条件下，在15升含有Chlorogonium作为食物来源的玻璃容器中生长培养物。从培养物中当密度达到104个细胞/毫升时收获生物体。
实施例2制备核提取物在这一实施例中，如本领域所述制备E.aediculatus的核提取物(Lingner(1994)基因发展，81984)，提取方法有一些小的修改，如下所述。简要地说，如实施例1所述生长的细胞通过15微米的Nytex滤纸浓缩并在冰上冷却。将细胞沉淀再悬浮于110毫升的最后体积的TMS/PMSF/精胺磷酸缓冲液。通过加入0.075克磷酸精胺(USB)和0.75毫升PMSF(来自100毫摩尔浓度乙醇中制备的储备液)到150毫升TMS制备储备液TMS/PMSF/精胺磷酸缓冲液。TMS含有10毫摩尔浓度Tris-乙酸，10毫摩尔浓度MgCl2，85,5752克蔗糖/升，和0.33297克CaCl2/升，pH7.5。
在TMS/PMSF/精胺磷酸缓冲液中再悬浮后，加入8.8毫升10％NP-40和94.1克蔗糖，将混合物置于含有附着于突出的电动机的不锈钢搅拌棒的硅烷化玻璃烧杯中。搅拌混合物直到细胞完全溶解(约20分钟)。然后，在7500rpm(8950×g)，在4EC利用BeckmanJS-13离心机离心混合物10分钟。除去上清液，在TMS/PMSF/精胺磷酸缓冲液中再悬浮核沉淀，利用BeckmanJS-13离心机再次在7500rpm(8950×g)，4EC，离心5分钟。
除去上清液，在含有50毫摩尔Tris-乙酸，10毫摩尔MgCl2，10％NP-40，0.4摩尔浓度KGlu，0.5毫摩尔浓度PMSF，pH7.5的缓冲液，再悬浮核沉淀，每10克收集细胞加入0.5毫升缓冲液体积。然后，在玻璃匀浆器中，用约50冲程，dounced再悬浮的核。然后以14000rpm，在4EC的Eppendorf离心管中离心25分钟。收集含有核提取物的上清液，在液氮中冷冻，储藏在-80EC直到使用。
实施例3端粒酶的纯化在这一实施例中，如实施例2中所述制备的核提取物用于纯化E.aediculatus端粒酶。在这一纯化方案中，首先通过在亲和-凝胶-肝素柱上层析富集端粒酶，然后，利用反义低聚核苷酸进行亲和纯化而充分地纯化。由于在端粒酶RNP颗粒中端粒酶RNA的模板区易于进入杂交的，合成与这一模板区互补的反义低聚核苷酸(即，“亲和低聚核苷酸”)，作为端粒酶的亲和诱饵。在低聚核苷酸的5’末端包括了生物素残基以便固定在抗生物素蛋白柱上。
在端粒酶与低聚核苷酸结合后，充分地洗涤，利用取代低聚核苷酸洗脱端粒酶。亲和低聚核苷酸包括碱基与端粒酶特异性序列的5’端粒酶RNA不互补的DNA。因为取代低聚核苷酸与亲和低聚核苷酸在整个长度互补，它能够形成的双链体比结合亲和低聚核苷酸的端粒酶更加热动力学更加稳定。所以，加入取代低聚核苷酸导致从柱中洗脱端粒酶。
将从45升培养物制备的核提取物冷冻直到收集总共34毫升核提取物。这对应于630升培养物(即，约4×109个细胞)。利用缓冲液核提取物稀释到410毫升，以便提供最后浓度为20毫摩尔浓度Tris-乙酸，1毫摩尔浓度MgCl2，0.1毫摩尔浓度EDTA，33毫摩尔浓度KGlu，10％(vol/vol)甘油，1毫摩尔浓度二硫苏糖醇(DTT)，和0.5毫摩尔浓度苯甲基氟磺酰(PMSF)，pH7.5。
将稀释的核提取物上样到亲和-凝胶-肝素凝胶柱(Bio-Rad)上，该柱有230毫升的床体积和5厘米的直径，并已在同样的缓冲液中平衡，和利用2升的33到450毫摩尔浓度KGlu的梯度洗脱。在4EC跑柱，流速为1柱体积/小时。每50毫升收集一组分，如实施例4所述测试端粒酶活性。从柱中在约170毫摩尔浓度KGlu洗脱端粒酶。合并含有端粒酶的组分(约440毫升)并且调节到20毫摩尔浓度Tris-乙酸，10毫摩尔浓度MgCl2，1毫摩尔浓度EDTA，300毫摩尔浓度KGlu，10％甘油，1毫摩尔浓度DTT，和1％Nonidet P-40。将这一缓冲液命名为“WB”。
在这一制剂中，每升合并液中加入各1.5纳摩尔的两种竞争DNA低聚核苷酸(5’-TAGACCTGTTAGTGTACATTTGAATTGAAGC-3’(SEQ ID NO28))和(5’-TAGACCTGTTAGGTTGGATTTGTGGCATCA-3’(SEQ ID NO29))，50微克酵母RNA(西格玛)，和0.3纳摩尔生物素标记的特异性于端粒酶低聚核苷酸(5’-生物素-TAGACCTGTTA-(MeRNG)2-(MeRNU)4-(MeRNG)4-(MeRNU)4-MeRNG-3’)(SEQ ID NO60)。端粒酶特异性低聚核苷酸的2-O-甲基核糖核苷酸与端粒酶RNA模板区互补；脱氧核糖核苷酸不互补。加入竞争剂，非特异性DNA低聚核苷酸增强了纯化的效力，因为核酸结合蛋白质和混合物中结合亲和低聚核苷酸或除去混合物中的端粒酶中的其它成分的作用将降到最小。
然后，将这一物质加入到Uetralink固定中性抗生物素蛋白加(Pierce)柱物质中，每毫升合并液加入60微升悬浮液体积。柱物质用WB制剂预封闭2次，每次封闭15分钟，WB的制剂含有0.01％Nonidet P-40，0.5毫克BSA 0.5毫克/毫升溶菌酶，0.05毫克/毫升糖原，和0.1毫克/毫升酵母RNA。在4EC利用旋转轮完全封闭柱物质进行封闭。在第一次封闭步骤后，和第二次封闭步骤前，在200×g离心柱物质2分钟沉淀基质。
在30EC温育合并的柱混合物8分钟，然后，在4EC再温育2小时，在旋转的轮上(约10rpm，Labindustries)允许结合。然后，在200×g离心合并的柱混合物2分钟，除去含有未结合物质的上清液。然后洗涤合并的柱混合物。这一洗涤过程包括利用WB在4EC漂洗合并柱混合物，利用WB在4EC洗涤混合物15分钟，利用WB漂洗，利用含有0.6摩尔KGlu，没有Nonidet P-40的WB在30EC洗涤5分钟，利用WB在25EC洗涤5分钟，最后利用WB再次漂洗。在最后洗涤或保留的柱体积仍然是小的，产生的缓冲液与柱物质的比例约为1∶1。
每毫升柱物质加入1纳摩尔取代脱氧低聚核苷酸(5’-CA4C4A4C2TA2CAG2TCTA-3’)(SEQ ID NO30)，在25EC温育30分钟从柱物质中洗脱端粒酶。在微型离心机(Eppendorf)中，以14,000rpm离心柱物质2分钟，收集洗脱物。每次利用新鲜替代低聚核苷酸将洗脱步骤重复二次以上。如上所述，因为取代低聚核苷酸与亲和低聚核苷酸互补，它与亲和低聚核苷酸形成比与端粒酶形成更加热稳定的复合物。所以，在亲和结合的端粒酶中加入取代低聚核苷酸导致在天然条件下有效地洗脱端粒酶。在这一时期端粒酶的显示大约50％纯度，如通过蛋白质凝胶上分析判断的。图1显示了端粒酶的亲和纯化和利用取代低聚核苷酸的洗脱(分别是组A和B)。在这一图中，亲和低聚核苷酸的2’-O-甲基糖表示为粗黑线。在这一图中的黑和阴影椭圆用于表示本发明的蛋白质亚单位。
利用Bradford的方法(Bradford(1976)生物化学年报，72248)利用BSA作为标准确定亲和-凝胶-肝素柱层析之后获得的提取物和物质的蛋白质浓度。在甘油梯度上进一步纯化端粒酶制剂馏分。
通过甘油梯度离心，如实施例8所述确定端粒酶的沉降系数。
下面的表1是根据本实施例的方法纯化的端粒酶的纯化表。如比较全部细胞提取物，在核提取物中富集了12倍的端粒酶，基于提取，从核物质中回收的端粒酶的80％；85％被溶解了。
表1.端粒酶的纯化<
*NA＝没有获得**这一值是从端粒酶的测量值(680皮摩尔)通过假设50％的纯度(基于蛋白质凝胶)计算的。
实施例4端粒酶活性在纯化端粒酶的每个步骤中，通过三个单独的测试步骤分析制剂，如这一实施例所述其中一个是活性。通常，在40微升含有0.003-0.3微升核提取物，50毫摩尔浓度Tris-Cl(pH7.5)，50毫摩尔浓度KGlu，10毫摩尔浓度MgCl2，1毫摩尔浓度DTT，125微摩尔浓度dTTP，125微摩尔浓度dGTP，和约0.2皮摩尔5’-32P标记的低聚核苷酸底物(即，约400,000cpm)中进行端粒酶测试。在它们加入反应混合物之前使低聚核苷酸引物热变性。在冰上进行反应，在25EC温育30分钟。加入200微升10毫摩尔浓度Tris-Cl(pH7.5)，15毫摩尔浓度EDTA，0.6％SDS，和0.05毫克/毫升蛋白激酶K，并在45EC温育至少30分钟终止反应。在乙醇沉淀后，在变性的8％PAGE凝胶上分析产物，如本领域已知(参见，例如Sambrook等人，1989)。
实施例5端粒酶活性的定量测定在这一实施例中，叙述了通过纯化方法定量测定端粒酶活性。通过测试在存在dGTP和[γ-32P]dTTP时低聚核苷酸引物的延长完成定量测定。简要地说，在存在2微升[γ-32P]dTTP(10毫居里/毫升，400居里/毫摩尔；1居里＝37GBq)，和125微摩尔浓度dGTP如上所述的20微升反应混合物，延伸低聚核苷酸(Lingner等人，基因发展，81984)，并且加样到8％PAGE测序凝胶上，如本领域已知。
图3显示了这一研究的结果。在泳道1，没有端粒酶存在(即，阴性对照)；泳道2，5，8和11含有0.14fmol端粒酶；泳道3，6，9，和12含有0.42fmol端粒酶；和泳道4，7，10和13含有1.3fmol端粒酶。利用PhosphorImager(分子动力学)根据制造商的说明定量活性。确定在这些条件下，1fmol亲和纯化端粒酶在30分钟掺入了21fmol dTTP。
如图3所示，端粒酶的特异性活性通过纯化方法没有明显改变。亲和纯化的端粒酶是完全活化的。但是，可以确定在高浓度时，检测到抑制活性，并且粗提取物的活性不是线性的。所以，在图3中显示的测试中，粗提取物稀释了700-7000倍。通过纯化，除去了抑制活性，在纯化的端粒酶制剂中没有检测到抑制效果甚至在高的酶浓度也没有检测到。
实施例6凝胶电泳和Northern影印如图4表明，在纯化端粒酶的每个步骤中，通过三个单独的测试分析制剂。这一实施例叙述了用于定量存在于各馏分中的端粒酶RNA的凝胶电泳和影印方法，并且分析端粒酶核糖核蛋白颗粒的完整性。
变性凝胶和Northern影印在这一实施例中，以已知浓度的合成T7转录端粒酶RNA作为标准。通过这一研究，将RNA成分用作端粒酶的量度。
利用PCR产生了E.aediculatus端粒酶RNA的噬菌体T7RNA聚合酶转录的构建体。利用与基因的末端退火的引物扩增端粒酶RNA基因。在5’末端退火的引物也编码锤头核酶序列以便在转录RNA的裂解后产生天然5’末端，T7启动子序列，和用于亚克隆的EcoRI位点。这一5’引物的序列是5’-GCGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGAAACTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACTCCACGAAAGTGGAGTAAGTTTCTCGATAATTGATCTGTAG-3’(SEQ ID NO31)。3’引物包括在天然的3’末端用于终止转录的EarI位点，和用于克隆的BamHI位点。这一3’引物的序列是5’-CGGGGATCCTCTTCAAAAGATGAGAGGACAGCAAAC-3’(SEQID NO32)。利用EcoRI和BamHI裂解PCR扩增产物，并亚克隆进入pUC19(NEB)的相关位点，得到“pEaT7”。通过DNA测序证明了这一插入片段的准确性。如Zaug生物化学(1994)3314935所述，利用EarI-线性化质粒进行T7转录。凝胶纯化RNA和确定浓度(1的A260为1＝40纳克/毫升)。这一RNA用作标准确定存在于各种端粒酶制剂中的端粒酶RNA。
杂交的信号与端粒酶RNA的量成正例，衍生的RNA浓度一致于但轻微高于那些通过天然凝胶电泳获得的。在整个细胞RNA中的全部端粒酶的量与已知的T7RNA转录物浓度的系列稀释比较表明每个E.aediculatus细胞含有约300,000端粒酶分子。
利用所述的方法(Linger(1994)基因发展，81984)通过与它的RNA成分的Northern影印杂交完成端粒酶的观察。简要地说，在8％PAGE上分辨RNA(小于或等于0.5微克/道)并且电影印到Hybond-N膜(Amersham)上，如本领域已知的(参见例如，Sambrook等人，1989)。在10毫升4×SSC，10×Dehardt溶液，0.1％SDS，和50微克/毫升变性鲸精子DNA中过夜杂交印迹。在预杂交3小时后，加入2×106cpm探针/毫升杂交溶液。任意标记的探针是覆盖全部端粒酶RNA基因的PCR产物。于2×SSC，0.1％SDS利用几个缓冲液变化洗涤印迹30分钟，然后在0.1×SSC和0.1％SDS在45EC洗涤1小时。
天然凝胶和Northern印迹在这一实验中，在3.5％聚丙烯酰胺和0.33％琼脂糖的天然(即非变性)凝胶上电泳纯化的端粒酶制剂，如本领域已知的和描述的(Lamond(1994)出处同上)。端粒酶与二甲苯氰蓝染料共迁移。
天然凝胶的结果表明在整个纯化方案中，端粒酶保持为RNP。图2是Northern印迹的照片，显示了在非变性凝胶上的不同馏分中的端粒酶以及体外转录的端粒酶的迁移率。在这一图中，泳道1含有1.5fmol端粒酶RNA，泳道2含有4.6fmol端粒酶RNA，泳道3含有14fmol端粒酶RNA，泳道4含有41fmol端粒酶RNA，泳道5含有核提取物(42fmol端粒酶)，泳道6含有亲和-肝素-纯化端粒酶(47fmol端粒酶)，泳道7含有亲和纯化端粒酶(68fmol)，和泳道8含有甘油梯度纯化端粒酶(35fmol)。
如图2所示，在核提取物中，端粒酶组装成为RNP颗粒，这些颗粒比未组装的端粒酶RNA迁移更慢。通过这一方法检测到低于1％的游离RNA。但是，在提取物中有时检测到迁移更慢的端粒酶RNP复合物。在亲和-凝胶-肝素柱上纯化后，端粒酶RNP颗粒的迁移率没有改变(图2，泳道6)。但是，通过亲和纯化，RNA颗粒的迁移率稍微增加(图2，泳道7)，可能表明已经失去了蛋白质亚单位或片段。在甘油梯度上，亲和纯化的端粒酶的大小没有改变，但约2％的游离端粒酶RNA是可检测的(图2，泳道8)，表明已经出现了RNP颗粒的小量分解。
实施例7端粒酶蛋白质组合物在这一实施例中，叙述了纯化端粒酶蛋白质组合物的分析。如实施例8中叙述获得甘油梯度馏分是在4-20％聚丙烯酰胺凝胶(Novex)上分离的。在电泳后，利用考马斯亮蓝染色凝胶。图4显示了凝胶的照片。泳道1和2含有分子量标记(Pharmacia)，如图4显示的凝胶的左边表示的。泳道3-5含有甘油梯度组分合并液，如凝胶的顶部表示的(即，泳道3含有9-1，泳道4含有组分15-22，和泳道5含有组分23-32)。泳道4含有合并液与1皮摩尔端粒酶RNA。在泳道6-9中，以图4中凝胶顶部表示的浓度电泳BSA标准(即，泳道6含有0.5皮摩尔浓度BSA，泳道7含有1.5皮摩尔浓度BSA，泳道8含有4.5BSA，和泳道9含有15皮摩尔浓度BSA)。
如附图4所示，具有120和43千道尔顿分子量的多肽与端粒酶共纯化。观察到43千道尔顿多肽为双链体。注意到泳道3的约43千道尔顿的多肽的迁移与泳道4的双链体不同；它可能是不相关的蛋白质。当与BSA标准相比时，120和43千道尔顿双链体各用1皮摩尔水平的考马斯亮蓝染色。由于该组分含有1皮摩尔的端粒酶RNA，所有的组分装配为RNP颗粒(参见附图2，泳道8)，似乎是具有端粒酶RNA化学数量的两个多肽亚单位。但是，两个约43千道尔顿的蛋白质与酶亚单位分离也是可能的。没有在甘油梯度上级分的亲和性纯化的端粒酶含有分别具有35和37千道尔顿表观分子量的另外的多肽。估测该后一组分是至少50％纯化的。但是，通过甘油梯度离心不能再生性地分离存在于亲和性纯化的物质中的35和37千道尔顿的多肽。这些多肽可能是污染物，因为它们在所有含有活性的制剂中没有看到。
实施例8沉积系数通过甘油梯度离心测定端粒酶的沉积系数。在该实施例中，将核提取物和亲和纯化的端粒酶在含有20毫摩尔浓度Tris-乙酸盐，1毫摩尔浓度氯化镁，0.1毫摩尔浓度EDTA，300毫摩尔浓度KGlu和1毫摩尔浓度DTT，pH 7.5的15-40％甘油梯度中级分。将甘油梯度倾倒到5毫升(13×51毫米)试管，和利用SW55Ti离心机(Beckman)，以55000rpm，在4EC离心14小时。
在平行的梯度将标记物蛋白质电泳并且对于乙醇脱氢酶(ADH)该标记物具有7.6S的沉积系数，对于过氧化氢酶沉积系数为113，对于脱铁铁蛋白沉积系数为17.3，对于甲状腺球蛋白沉积系数为19.3。通过梯度部分的天然凝胶电泳接着与它的RNA成分影印杂交鉴定端粒酶峰。
图5是显示端粒酶的沉降系数的图解。如图所示，亲和纯化端粒酶与催化酶在11.5S共沉淀，而在核提取物中的端粒酶沉淀稍微快，峰在12.5S周围。所以，与天然凝胶中的酶的迁移率一致的是，纯化端粒酶似乎是已经损失了蛋白水解片段或疏松连接的亚单位。
如果确定含有一个120千道尔顿蛋白质亚单位，一个43千道尔顿亚单位，和一个66千道尔顿的RNA亚单位，，端粒酶的计算分子量总共是229千道尔顿。这与过氧化氢酶的232千道尔顿的分子量非常一致。但是，沉降系数是分子量，以及颗粒特异性体积和分子的摩擦系数的函数，后面两者是Euplotes端粒酶RNP是未知的。
实施例9底物利用在这一实施例中，研究了Euplotes端粒酶的底物要求。DNA末端复制的一个简单模型预示了在DNA半保留复制后，端粒酶显示了双链，末端平齐化DNA分子。在这一模型的变异中，通过螺旋酶或核酸酶在复制后产生单链3’末端。然后，端粒酶利用该3’末端用于结合和延伸。
为了确定是否端粒酶能够延长末端平齐化的分子，利用在它们的3’末端定位的端粒重复合成发夹模型。这些引物底物经过凝胶纯化，利用聚核苷酸激酶在5’末端标记，在0.4微摩尔浓度时在5分钟内加热到80EC，然后，慢慢在热封闭中冷却到室温，允许发夹复性和形成螺旋。在非变性凝胶上的底物的迁移率表明与二聚体化相比，发夹形成非常有效。
利用未标记的125微摩尔浓度dGTP，125微摩尔浓度dTTP，和0.02微摩尔浓度5’末端标记的引物(5’-32P-标记的低聚核苷酸底物)于10微升含有20毫摩尔浓度Tris-乙酸，与10毫摩尔浓度MgCl2，50毫摩尔浓度KGlu，和1毫摩尔浓度DTT，pH7.5的反应混合物中进行测试。在25EC温育这些混合物30分钟。加入甲酰胺加样缓冲液(即，TBE，甲酰胺，溴酚兰，和cyanol，Sambrook，1989，出处同上)终止反应。
没有端粒酶(“-”)，含有5.9fmol亲和纯化端粒酶(“+”)，或含有17.6fmol亲和纯化端粒酶(“+++”)温育引物。在这一测试中利用的亲和纯化端粒酶在具有分子截止大小100千道尔顿的膜上透析，以便除去替代低聚核苷酸。在含有36％甲酰胺的8％PAGE/脲凝胶上分离反应产物，以便变性发夹。用于这一研究的引物的序列以及它们的泳道分配如表2所示。
表2引物序列
图6显示了凝胶结果。泳道1-15含有四个G残基为末端的端粒重复的底物。泳道16-30含有四个T残基为末端的端粒重复的底物。图7中表明了端粒酶RNA模板上推断的排列(分别是SEQ ID NOS43和44，和45和46)。假定引物系列在图7显示的模板中的两个不同位置(即，分别是组A和B)退火。这可能影响它们的结合和/或延长速度。
图8显示了图6中泳道25-30的更亮的曝光照片。图8的更亮的曝光照片能够看见加入的核苷酸和在延长的产物中终止的位置。在PhosphorImager上定量的每个系列中第三泳道的延长的底物的百分数如图6的底部所示。
这些发夹的底物效率可以与带有不同长度的突出的双链端粒状底物比较。以四个G残基结尾的底物模型(参见图6的泳道1到15)当末端平齐化时不再延长(参见泳道1-3)。但是，观察到有2个碱基长度的轻微延伸；当突出至少4个碱基长度时延长有效。端粒酶以同样的方式作用于四个T残基结尾的双链底物，高效率延长需要6个碱基的突出。在图6中，在泳道10-15中引物下面的弱带与端粒酶无关，表示了引物制剂中更短的低聚核苷酸。
图8中泳道25-30的更亮的曝光照片显示了延长产物的阶梯，最暗的谱带是与模板推测的5’边界相关(如Lingner等人，基因发展，81984所述)。对应于模板中其它位置的丰富的产物表明终止和/或分解发生在纯化的端粒酶易位的位点以外的位点。
图6中所示，双链，末端平齐化的低聚核苷酸不是端粒酶的底物。为了确定是否这些分子将结合端粒酶，进行了一个竞争实验。在这一实验中，利用了0.125纳摩尔浓度端粒酶延伸了含有序列(G4T4)2(SEQ IDNO61)的5’末端标记的底物，或含有6个碱基突出的发夹底物(图6，泳道25-27)。虽然同样的未标记低聚核苷酸底物有效地与用于延伸的标记的底物竞争，当双链的末端平齐化的发夹低聚核苷酸用作竞争物时没有观察到活性的减少，甚至在存在100倍过量的发夹时。
这些结果表明双链的，末端平齐化的低聚核苷酸在这一实施例的浓度和条件下不能结合端粒酶，而单链3’末端是结合所需要的。这似乎是3’末端是碱基与端粒酶RNA模板配对所需要的。
实施例10123千道尔顿多肽的克隆和测序在这一实施例中，叙述了端粒酶的Euplotes123千道尔顿多肽(即，123千道尔顿蛋白质亚单位)的克隆。在这一研究中，通过PCR扩增端粒酶基因的内部片段，低聚核苷酸引物设计为从上面的实施例3中获得的纯化多肽获得的肽序列匹配。利用本领域已知和Calvio(1995)RNA1724-733中所述的nanoES串联质谱学方法确定多肽的序列。在这一实施例中使用的低聚核苷酸引物具有下面的序列，圆括号中显示的是简并的位点参见128页50微升的反应混合物含有0.2毫摩尔浓度dNTP，0.15微克E.aediculatus染色体DNA，0.5微升Taq(Boehringer-Mannheim)，0.8微克每种引物，和1×反应缓冲液(Boehinger-Mannheim)。在热循环器中温育反应(Perkin-Elmer)，利用下面的循环-5分钟95EC，随后30次循环；94EC 1分钟，52EC 1分钟和72EC 2分钟。在72EC温育10分钟完成反应。
通过将末端平齐化DNA克隆到pCR-Script质粒载体(Stratagene)的SmaI位点从染色体E.aediculatus DNA制备基因组DNA文库。利用了放射性标记的凝胶纯化的PCR产物通过菌落杂交筛选这一文库。通过二脱氧方法(Sanger等人，美国科学院年报，745463)，或人工地通过利用自动测序仪(ABI)制备和测序阳性克隆的质粒DNA。图9显示了编码这一多肽的基因的DNA序列(SEQ ID NO1)。从DNA序列推断的这一序列中的起始密码定位于核苷酸位置101，开放读码框架在位置3193结尾。Euplotes的遗传密码与其它生物体的区别在于“UGA”密码编码了半胱氨酸残基。图10显示了从DNA序列推断的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO2)，确认在翻译过程中没有异常的氨基酸插入和没有发生翻译后的修饰。
实施例1143千道尔顿的多肽的克隆和测序本发明提供了Euplotes p43(43千道尔顿)端粒酶的同工型和类似物，包括人p43(千道尔顿)类似物。这样的43千道尔顿核酸和相应的蛋白质作为端粒酶亚单位属的成员也可以利用本发明提供的试剂鉴定和分离，本文叙述了该方法。下面叙述的Euplotes43千道尔顿多肽的鉴定和克隆提供了进一步分离43千道尔顿亚属的成员的方法的说明性实施例。
在这一实施例中，叙述了43千道尔顿的Euplotes端粒酶的多肽(即，43千道尔顿蛋白质亚单位)的克隆。在这一研究中，通过PCR扩增了对应的端粒酶基因的内部片段，利用了设计成匹配从上面的实施例3中获得的纯化多肽中获得的肽序列的低聚核苷酸引物。利用本领域已知和Calvio，出处同上叙述的nano串联质谱学方法确定的多肽序列。用于这一实施例中的低聚核苷酸引物具有下面的序列-5′-NNNGTNAC(C/T/A)GG(C/T/A)AT(C/T/A)AA(C/T)AA-3′(SEQ ID NO49)，5′-(T/G/A)GC(T/G/A)GT(C/T)TC(T/C)TG(G/A)TC(G/A)TT(G/A)TA-3′(SEQ ID NO50).在这一序列中，“N”表示四个核苷酸(即，A，T，G，或C)的任何一个的存在。
如上面实施例10中叙述的一样进行PCR。如上面实施例10中叙述的制备基因组DNA文库和测序。在图11中显示了编码这一多肽的基因的DNA序列(SEQ ID NO3)。如图12所示，显示了这一序列的三个潜在的读码框架。为了说明，在所有三个读码框架中的核苷酸序列的下面表示了氨基酸序列。三个读码框架命名为“a”，“b”，和“c”，也表示在SEQID NO4，5和6。在读码框架“c”中的核苷酸位置84编码了可能的起始密码。它们的编码区可能在读码框架“b”中的1501位置结尾。在这一图中的最早的终止密码子以星号表示，存在于核苷酸位置337-350之间的所有三个读码框架中。
“La-区”以黑体类型表示。进一步在下游，蛋白质序列似乎是由不同的读码框架编码的，正如三个框架中没有一个不被终止密码子中断。另外，在所有三个框架中编码了来自纯化的蛋白质的肽序列。所以，这一基因似乎是含有干扰序列或另一种方式，该RNA剪接了。其它可能性包括核糖体框架移变或序列错误。但是，与La-蛋白质的同源性仍然十分需要。再次，在Euplotes中，“UGA”密码子编码了半胱氨酸残基。
实施例12氨基酸和核酸比较在这一实施例中，在各种报道的序列和Euplotes123千道尔顿和43千道尔顿端粒酶亚单位多肽的序列之间进行了比较。
与123千道尔顿E.aediculatus端粒酶亚单位的比较123千道尔顿Euplotes aediculatus多肽的氨基酸序列与Tetrahymenathermophila(GenBank登记号#U25641)的80千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的序列进行了比较以便研究它们的相似性。从编码这一蛋白质的基因库(SEQ ID NO51)获得的核苷酸序列表示在图19。从GenBank(SEQID NO52)获得的这一蛋白质的氨基酸序列表示在图20。123千道尔顿E.aediculatus和80千道尔顿T.thermophila之间的序列比较表示在图13。在这一图中，E.aediculatus序列是上面的序列(SEQID NO2)，而T.thermophila序列是下面的序列(SEQID NO52)。在这一图，以及图14-16中，等同性表示为垂直的条，而序列之间单一的点表示有些相似的氨基酸，序列之间的双点表示更相似的氨基酸。观察到的等同性确定约为19％，而相似百分数约为45％，这些值与任意蛋白质序列中观察到的一样。
将123千道尔顿Euplotes aediculatus多肽的氨基酸序列也与Tetrahymena thermophila(基因库登记号#U25642)的95千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的序列比较，以便研究它们的相似性。如从基因库(SEQ IDNO53)得到的编码这一蛋白质的核苷酸序列表示在图21。如基因库(SEQ ID NO54)中获得的这一蛋白质的氨基酸序列表示在图22。将这一序列的比较表示在图14。在这一图中，E.aediculatus序列是上面的序列(SEQID NO2)，而T.thermophila序列是下面的序列(SEQ ID NO54)。观察到的等同性确定为约20％，而相似性百分数约为43％，这些值与任意蛋白质序列中观察到的相同。
很明显，123千道尔顿E.aediculatus多肽的氨基酸序列含有5个逆转录酶的特征基序(SEQ ID NO13和18)。将123千道尔顿多肽也与各种逆转录酶的聚合酶区(SEQ ID NO14-17，和19-22)比较。图17表示了123千道尔顿多肽与推断的酵母类似物(L8543.12或EST2p)(SEQ ID NO17和22)的序列比较。从基因库获得的L8543.12(或EST2p)的氨基酸序列表示在图23(SEQ ID NO55)。
四个基序(A，B，C，和D)包括在这一比较中。在这一图17中，高度保守的残基表示为黑背景上的白字母。在其它序列中保守的E.aediculatus序列的残基表示为黑体；“h”表示疏水氨基酸的存在。在基序的氨基酸残基之间定位的数目表示在序列中的裂口的长度。例如，表示在基序A和B之间的“100”反映的是在这些基序之间的序列中的100个氨基酸裂口。
如上面注意到，基因库检索鉴定了酵母蛋白质(基因库登记号#U20618)，和基因L8543.12(Est2)，它们含有或编码与E.aediculatus123千道尔顿端粒酶亚单位具有一些相似性的氨基酸序列。基于两个蛋白质在它们的C末端区含有逆转录酶基序，两个蛋白质在逆转录酶基序以外的区中具有相似性；这些蛋白质是相似的碱性(属于E.aediculatus pI＝10.1和对于酵母pI＝10.0)，和两个蛋白质是大的(123千道尔顿对于E.aediculatus和对于酵母103千道尔顿)的发现，这些序列含有它们各自的端粒酶的催化核心。根据在两个系统发育远缘的生物体如E.aediculatus和酵母的同源性的发现，涉及的是人端粒酶将含有具有同样特征的蛋白质(即，逆转录酶基序，碱性，大[＞100千道尔顿])。
与43千道尔顿E.aediculatus端粒酶亚单位的比较将43千道尔顿Euplotes aeduculatus多肽的“La-区”的氨基酸序列与Tetrahymena thermophila的95千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位(上面所述)的序列比较以便研究它们的相似性。这一序列比较表示在图15。在这一图中，E.aediculatus序列是上面的序列(SEQ ID NO9)，而T.thermophila序列是下面的序列(SEQ ID NO10)。观察到的等同性确定为约23％，而相似性百分数约为46％，这些值相似于任意蛋白质序列中观察到的。
将43千道尔顿Euplotes aediculatus多肽的“La-区”的氨基酸序列与Tetrahymena thermophila的80千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位(上面所述)的序列进行比较以便研究它们的相似性。这一序列比较表示在图16。在这一图中，E.aediculatus序列是上面的序列(SEQ ID NO11)，而T.thermophila序列是下面的序列(SEQ ID NO12)。观察到的等同性确定为约26％，而相似百分数约为49％，这些值相似于任意蛋白质序列中观察到的。
将43千道尔顿E.aediculatus多肽(SEQ ID NO23)区域的氨基酸序列也与来自各种其它的生物体的La蛋白质(SEQ ID NO24-27)比较。图18显示了这些比较。在这一图中，高度保守的残基用黑底上的白色字母表示。在其它序列中保守的E.zediculatus序列的残基表示为黑体。
实施例13在Oxytricha trifallax中的端粒酶蛋白质亚单位的鉴定在这一实施例中，将在上面前面的实施例中鉴定的序列用于鉴定Oxytricha trifallax的端粒酶蛋白质亚单位，该生物体是与E.aediculatus远缘相关的纤毛虫。基于E.aediculatus123千道尔顿多肽的保守区选择引物，该多肽含有逆转录酶区基序。合成了适当的引物并用于与来自Oxytricha的总DNA得到PCR反应。根据本领域已知的方法制备Oxytricha DNA。然后，利用本领域已知的方法克隆和测序PCR产物。
用作引物的低聚核苷酸序列如下5′-(T/C)A(A/G)AC(T/A/C)AA(G/A)GG(T/A/C)AT(T/C)CC(C/T/A)(C/T)A(G/A)GG-3′(SEQ ID NO56)and 5′-(G/A/T)GT(G/A/T)ATNA(G/A)NA(G/A)(G/A)TA(G/A)TC(G/A)TC-3′(SEQ ID NO57).在圆括号中表示了简并的位置，在圆括号内的是可选择的碱基。“N”代表四个核苷酸的任何一个。
在PCR反应中，50微升反应混合物含有0.2毫摩尔浓度dNTPs，0.3微克Oxytricha trifallax染色体DNA，1微升Taq聚合酶(Boehringer-Mannheim)，2微摩尔每种引物，1×反应缓冲液(Boeringer-Mannheim)。在热循环器中，在下面的条件下温育反应混合物95EC5分钟；30个循环包括94EC 1分钟，53EC 1分钟，和72EC 1分钟；接着72EC10分钟。通过二脱氧方法凝胶纯化和测序PCR产物(例如，Sanger(1977)美国科学院年报745463-5467)。
确定PCR产物的推断的氨基酸序列并与E.aediculatus序列比较。图24显示了这些序列的排列，上部的排表示了O.trifallax序列(SEQ IDNO58)，底部的排表示了E.aediculatus序列(SEQID NO59)。正如从这一图中可以看到，在这一实施例鉴定的O.trifallax多肽序列与E.aediculatus多肽序列之间有很大的同源性。所以，很清楚在本发明中鉴定的序列可用于鉴定其它真核生物中的同源端粒酶蛋白质亚单位。确实，本发明的发展已经如上所述鉴定了在多重，多样种类中的同源端粒酶序列。
实施例15鉴定四膜虫端粒酶序列在这一实施例中，产生的四膜虫克隆与Euplotes序列和EST2p的共有同源性。
这一实验利用了抗保守基序的简并低聚核苷酸引物的PCR，从而鉴定了四膜虫，Euplotes，和EST2p序列之间的同源的区。用于这一实施例的PCR方法是设计特异性地扩增来自复合混合物的特别稀少的DNA序列的新方法。这一方法避免了用PCR克隆方法中通常遇到的在两个末端具有相同的PCR引物(即，单个引物产物)扩增DNA产物的问题。这些单个引物产物产生了不希望的背景并且经常可能障碍需要的两引物产物的扩增和检测。特别是，一个引物是生物素化的，另一个不是。在几轮PCR扩增后，利用链霉素抗生物素磁化小珠纯化产物，利用热变性特异性地洗脱两个引物产物。这一方法发现在设置中而不是这一实施例中叙述的实验中有用途。确实，这一方法发现可用于需要特异性地扩增稀少DNA序列的应用中，包括在克隆方法中如5’和3’；RACE，和PCR中使用简并引物的任何方法中的最初步骤。
利用本领域已知的方法分离四膜虫模板大核DNA进行第一轮PCR，24-聚体正向引物具有序列5’-生物素-GCCTATTT(TC)TT(TC)TA(TC)(GATC)(GATC)(GATC)AC(GATC)(GA-3’(SEQ ID NO70)命名为“K231”，对应于FFYXTE区(SEQ ID NO71)，和23-聚体反向引物具有序列5’-CCAGATAT(GATC)A(TGA)(GATC)A(AG)(AG)AA(AG)TC(AG)TC-3’(SEQ ID NO72)命名为“K220”，对应于DDFL(FIL)I区(SEQ IDNO73)。这一PCR反应含有2.5微升DNA(5纳克)，4微升每种引物(20微摩尔浓度)，3微升10×PCR缓冲液，3微升10×dNTP，2微升Mg，0.3微升Taq，和11.2微升dH2O。该混合物进行8个循环，每循环为94EC45秒，37EC45秒，和72EC1分钟。
这一PCR反应结合200微升链霉素抗生物素磁化小珠，利用200微升TE洗涤，再悬浮于20微升dH2O，然后在100EC煮沸2分钟热变性。除去小珠，移取洗脱物。然后，利用上面的条件再扩增2.5微升洗脱物，不同的是包括了0.3微升γ-32PdATP，PCR进行了33个循环。在5％变性聚丙烯酰胺凝胶上进行将这一反应物，切出凝胶的适当区。然后，再扩增这些产物另外34个循环，条件如上列出，不同的是使用了42EC的退火温度。
利用Tetrahymena大核DNA模板进行了第二轮PCR，其中，利用的方法是本领域已知的，利用的引物是23-聚体正向引物含有序列5’-ACAATG(CA)G(GATC)(TCA)T(GATC)(TCA)T(GATC)CC(GATC)AA(AG)AA-3’(SEQ ID NO74)，命名为“K228”，对应于区R(LI)(LI)PKK(SEQID NO75)，和反向引物含有序列5’-ACGAATC(GT)(GATC)GG(TAG)AT(GATC)(GC)(TA)(AG)TC(AG)TA(AG)CA3’(SEQ ID NO76)，命名为“K224”，对应于CYDSIPR区(SEQ ID NO77)。这一PCR反应含有2.5微升DNA(50纳克)，4微升每种引物(20微摩尔浓度)，3微升10×PCR缓冲液，3微升10×dNTP，2微升Mg，0.3微升γ-32PdATP，0.3微升Taq，和10.9微升dH2O。在5％变性聚丙烯酰胺凝胶上将这一反应物电泳，切出凝胶的适当的区。再扩增这些产物34个循环，条件如上面列出，另外使用了42 EC退火温度。
将第1轮的10微升反应产物结合200微升TE中的链霉素抗生物素蛋白包衣磁化小珠。利用200微升TE洗涤小珠，然后再悬浮于20微升蒸馏水中，热变性，除去洗脱物。其次，利用上面指出的条件再扩增2.5微升这一洗脱物33个循环。来第2轮的反应产物加入到小珠，利用30微升0.5×SSC稀释。在94EC到50EC加热混合物。除去洗脱物，在0.5×SSC，在55EC洗涤小珠三次。然后，在20微升蒸馏水中再悬浮小珠，热变性，除去洗脱物，命名为“第1轮洗脱物”并储藏。
为了分离Tetrahymena谱带，将第1轮洗脱物利用正向引物K228(SEQ ID NO74)和反向引物K227(SEQ ID NO78)，含有的序列5’-CAATTCTC(AG)TA(AG)CA(GATC)(CG)(TA)(CT)TT(AGT)AT(GA)TC-3’(SEQ ID NO78)，对应于DIKSCYD区(SEQ ID NO79)再扩增。如上所述进行PCR反应。在5％聚丙烯酰胺凝胶上将反应产物电泳，从凝胶切出对应于约295核苷酸的谱带并测序。
对命名为168-3的克隆测序。发现DNA序列(包括引物序列)为GATTACTCCCGAAGAAAGGATCTTTCCGTCCAATCATGACTTTCTTAAGAAAGGACAAGCAAAAAAATATTAAGTTAAATCTAAATTAAATTCTAATGGATAGCCAACTTGTGTTTAGGAATTTAAAAGACATGCTGGGATAAAAGATAGGATACTCAGTCTTTGATAATAAACAAATTTCAGAAAAATTTGCCTAATTCATAGAGAAATGGAAAAATAAAGGAAGACCTCAGCTATATTATGTCACTCTAGACATAAAGACTTGCTAC(SEQ ID NO80)利用设计成匹配来自168-3(“K297”含有序列5’-GAGTGACATAATATACGTGA-3’；SEQ ID NO111)的序列的一个独特引物和K231(FFYXTE)引物，通过PCR获得这一基因的其它序列。从这一反应获得的片段的序列，与168-3一起如下(没有引物序列)AAACACAAGGAAGGAAGTCAAATATTCTATTACCGTAAACCAATATGGAAATTAGTGAGTAAATTAACTATTGTCAAAGTAAGAATTTAGTTTTCTGAAAAGAATAAATAAATGAAAAATAATTTTTATCAAAAAATTTAGCTTGAAGAGGAGAATTTGGAAAAAGTTGAAGAAAAATTGATACCAGAAGATTCATTTTAGAAATACCCTCAAGGAAAGCTAAGGATTATACCTAAAAAAGGATCTTTCCGTCCAATCATGACTTTCTTAAGAAAGGACAAGCAAAAAAATATTAAGTTAAATCTAAATTAAATTCTAATGGATAGCCAACTTGTGTTTAGGAATTTAAAAGACATGCTGGGATAAAAGATAGGATACTCAGTCTTTGATAATAAACAAATTTCAGAAAAATTTGCCTAATTCATAGAGAAATGGAAAAATAAAGGAAGACCTCAGCTATATTATGTCACTCTA(SEQ ID NO81)对应于这一DNA片段的氨基酸序列发现是KHKEGSQIFYYRKPIWKLVSKLTIVKVRIQFSEKNKQMKNNFYQKIQLEEENLEKVEEKLIPEDSFQKYPQGKLRIIPKKGSFRPIMTFLRKDKQKNIKLNLNQILMDSQLVFRNLKDMLGQKIGYSVFDNKQISEKFAQFIEKWKNKGRPQLYYVTL(SEQID NO82)然后，将这一氨基酸序列与其它端粒酶基因(EST2p，和Euplotes)序列比较。图31显示了这一比较。在这一图中表示了共有序列。
实施例16鉴定粟酒裂殖酵母端粒酶序列在这一实施例中，鉴定粟酒裂殖酵母的tezl序列为E.aediculatus p123和啤酒酵母Est 2p的同系物。
图33提供了这些实验的全部简要。在这一图中，顶部(组A)表示了两个交迭的基因组克隆的关系，并且测序了5825bp的部分。命名为“tezl+”的区是蛋白质编码区，含有标明的侧接区，在5825bp区下面的盒是约2kb的HindIII片段，可用于产生tezl裂解构建体，如下所述。
图33底下的一半(组B)是DNA的这一同样区的“关闭”的图解。命名为“原始PCR”的序列是原始简并PCR片段，如上所述利用基于Euplotes序列基序4(B’)和基序5(C)设计的简并低聚核苷酸引物对产生了该片段。
利用简并引物进行PCR将利用简并引物的PCR用于在粟酒裂殖酵母中寻找E.aediculatusp123的同系物。图34表示了用于这一反应的简并引物序列(命名为“poly4”和“poly1”。利用前面的实施例中叙述的同样缓冲液(参见，例如实施例10，如上所述)，在94EC蔓延5分钟时间，接着30个循环，每个循环为94EC30分钟，50EC45秒，和72EC30秒，和72EC7分钟进行PCR循环，结束循环后储藏在4EC。利用各种条件(即，各种浓度的粟酒裂殖酵母DNA和MgCl2浓度)进行PCR循环。在琼脂糖凝胶上电泳PCR产物，如上所述利用溴化乙锭染色凝胶。几个PCR产生了三条谱带(命名为“T”，“M”和“B”)。利用如上所述同样的条件再扩增这些谱带并在凝胶上电泳。图35表示了在这一扩增后观察到的四条谱带(“T”，“M1”，“M2”，和“B”)。然后，利用如上所述同样的条件再扩增这四条带。鉴定图35中的泳道的顶部的第三条谱带含有端粒酶蛋白质的准确序列。命名为M2的PCR产物发现显示了如图36所示与其它端粒酶蛋白质的合理的匹配。除了显示的序列比较，这一图也显示了tezl的基本序列。在这一图中，星号表示了所有四个序列共有的残基(Oxytricha“Ot”；E.aediculatus“Ea-p123”；啤酒酵母“Sc-p103”；和M2)，而圆环(即，点)表示了相似的氨基酸残基。
3’RT PCR为了获得其它序列信息，对图36中鉴定的端粒酶候选物进行了3’和5’RT PCR。图37提供了使用的3’RT PCR方案的图解说明。首先，利用低聚核苷酸引物“QT”，从mRNA制备cDNA，引物序列如(5’-CCA GTG AGC AGA GTG ACG AGG ACT CGA GCT CAA GCTTTT TTT TTT TTT TT-3’；SEQID NO102)，然后，利用这-cDNA作为用“Qo”(5’-CCA GTG AGC AGA GTG ACG-3’；SEQ ID NO103)，和基于原始简并PCR反应设计的引物(即，“M2-T”，含有序列5’-G TGT CAT TTC TAT ATG GAA GAT TTG ATT GAT G-3’(SEQ ID NO109)进行的PCR的模板。第二个PCR反应(即，嵌套PCR)，用“Q1”(5’-GAG GAC TCG AGC TCA AGC-3’；SEQ IDNO104)，和另一个基于起源于原始简并PCR的序列或“M2-T2”设计的PCR引物(5’-AC CTA TCG TTT ACG AAA AAG AAA GGATCA GTG-3’；SEQ ID NO110)进行。用于这一PCR的缓冲液与上面相同，扩增反应开始于94E5分钟的蔓延，接着30个循环每个循环94E30秒，55EC30秒，72EC3分钟)，接着在72EC7分钟。将反应产物储藏在4EC直到使用。
筛选基因组和cDNA文库在获得这一附加的序列信息后，筛选几个基因组和cDNA文库以便鉴定含有这一端粒酶候选物基因的任何文库。图38显示了利用的途径以及文库和结果。在这一图中，组A列出了这一实验中产生的文库，组B显示了利用的区域；组C和D显示了利用这些文库获得的点影印杂交结果。然后，通过菌落杂交筛选阳性文库以便获得基因组和tezl基因的cDNA版本。在这一实验中，筛选了来自HindIII基因组文库的约3×104个菌落，鉴定了6个阳性克隆(约0.01％)。然后，从两个独立的菌落中制备DNA(A5和B2)。图39显示了利用HindIII消化的A5和B2阳性基因组克隆获得的结果。
另外，使用了cDNA REP文库。筛选了约3×105个菌落。鉴定了5个阳性克隆(0.002％)。从三个独立的克隆(2-3，4-1和5-20)制备DNA。在后面的实验中，确定了2-3和5-20含有同一插入片段。
5’RT PCR
因为此时产生的基因的cDNA版本不是完全的，进行5’RT-PCR以便获得全长的克隆。图40中图解表示了该方案。在这一实验中，利用DNA低聚核苷酸引物“M2-B”(5’-CAC TGA TCC TTT CTTTTCGT AAA CGA TAG GT-3’；SEQ ID NO105)和“M2-B2”(5’-C ATC AAT CAA ATC TTC CAT ATA GAA ATG ACA-3’；SEQ IDNO106)制备cDNA，这些低聚核苷酸引物是从前面鉴定的tezl的已知区设计而成的。然后，将含有磷酸化5’末端(“P”)(P-GGG CCG TGTTGG CCT AGT TCT CTG CTC-3’；SEQ ID NO107)的低聚核苷酸接头PCR Adapt SfiI连接到这一cDNA的3’末端，利用这一构建体作为嵌套PCR的模板。在第一轮PCR中，利用PCRAdapt SFI和M2-B作为引物；而PCR Adapt SfiII(5-GAG GAG GAG AAG AGC AGA GAA CTAGGC CAA CAC GCC CC-3’；SEQ ID NO108)，和M2-B2(SEQ IDNO106)用作第二轮中的引物。利用嵌套PCR增强反应的特异性。
序列排列一旦鉴定了tezl的序列，将它与前面叙述的序列比较。图41显示了来自粟酒裂殖酵母(“S.p.Tezlp”)，啤酒酵母(“S.c.Est2p”)，和E.aediculatusp123(“E.a.p123”)的端粒酶催化亚基的RT区的序列对比。在这一图中，“h”表示疏水残基，而“p”表示小的极性残基，和“c”表示带电的残基。在上面对比表示的氨基酸残基显示了Xiong(1990)EMBOJ.93353-3362叙述的共有RT基序。星号表示了所有三个蛋白质中都保守的残基。“基序O”在本文中鉴定了，并且在图41中作为特异于这一端粒酶亚基的基序，通常在逆转录酶中没有发现。所以，它在作为端粒酶催化亚基的其它氨基酸序列的鉴定中是有价值的。
图42显示了来自Euplotes(“Ea-p123”)，啤酒酵母(“Ec-Est2P”)，和粟酒裂殖酵母(“Sp-Tezlp”)的整个序列的对比。在组A中，阴影区域表示了两个序列中共有的残基。在组B中，阴影区域表示了所有三个序列共有的残基。
tezl的遗传裂解在这一实施例中，研究了tezl的裂解效果。因为端粒酶参与了端粒的生存维持，存在假说，如果tezl确实是端粒酶成分，tezl的裂解将引起端粒的逐渐缩短。
在这些实验中，利用同源重组特异性地裂解粟酒裂殖酵母中的tezl基因。图43图解说明了这一途径。如图43所示，用含有ura4或LEU2标记的片段替代了野生型tezl。
通过PCR证明了tezl基因的裂解(图44)，进行了Southern影印以检测端粒的长度。图45显示了这一实验的Southern影印的结果。因为ApaI限制酶位点在粟酒裂殖酵母中紧接端粒序列。粟酒裂殖酵母基因组DNA制剂的ApaI消化允许分析端粒的长度。所以，利用ApaI消化了来自粟酒裂殖酵母的DNA，在琼脂糖凝胶上电泳消化产物和利用特异于端粒的序列的探针探测确定是否裂解的粟酒裂殖酵母细胞的端粒缩短了。图45显示了结果。从这些结果，可以明了tezl基因的裂解引起了端粒的缩短。
实施例17克隆和鉴定人端粒酶逆转录酶蛋白质和cDNA在这一实施例中，确定了人端粒酶逆转录酶的核酸和氨基酸序列的信息。首先在dbEST(表达的序列标记)基因库数据库的BLAST检索中鉴定了部分同源的人序列命名为Genbank AA28196(SEQ ID NO121)，这是利用Euplotes123千道尔顿肽和核酸序列以及裂殖酵母蛋白质和相应的cDNA(tezl)序列进行的。EST GenBank登记号#AA281296，也称为“hTCP1.1”，是部分cDNA克隆。
AA281296EST(SEQ ID NO121)是389个核苷酸长，它在hTRTcDNA克隆(SEQ ID NO117)中的残基位置是从残基1679到20671679G GTTGGCTGTG TTCCGGCCGCAGAGCACCGT CTGCGTGAGG AGATCCTGGC CAAGTTCCTG CACTGGCTGA 1700TGAGTGTGTA CGTCGTCGAG CTGCTCAGGT CTTTCTTTTA TGTCACGGAG 1750ACCACGTTTC AAAAGAACAG GCTCTTTTTC TACCGGAAGA GTGTCTGGAG 1800CAAGTTGCAA AGCATTGGAA TCAGACAGCA CTTGAAGAGG GTGCAGCTGC 1850GGGAGCTGTC GGAAGCAGAG GTCAGGCAGC ATCGGGAAGC CAGGCCCGCC 1900CTGCTGACGT CCAGACTCCG CTTCATCCCC AAGCCTGACG GGCTGCGGCC 1950GATTGTGAAC ATGGACTACG TCGTGGGAGC CAGAACGTTC CGCAGAGAAA 2000AGAGGGCCGA GCGTCTCACC TCGAGGGTGA AGGCACTGTT CAGCGTGCTC 2050AACTACGAGC GGGCGCGGCG CCCCGGCCTC CTGGGCGCCT CTGTGCTGGG 2100CCTGGACGAT ATCCACAG2150 |2067 (SEQ ID NO121)从I.M.A.G.E.共生体(人基因组中心，DOE，Lawrence Livermore国家实验室，Livermore，CA)获得命名为克隆#712562的含有AA28196EST序列的克隆。从扁桃体细胞的流动分拣派生的胚B细胞的cDNA文库获得这一克隆。这一hTRT cDNA克隆#712562(SEQ ID NO122，图59)的完整测序，和推断的翻译产物(SEQ ID NO123，图59)的分析显示它编码了所有8个端粒酶RT(TRT)基序，如图1所示。与pGRN121(下面讨论)中的cDNA的hTRT读码框架编码的多肽，相反克隆#712562不编码TRT的邻近部分，因为在克隆712562中丢失了182个碱基对，这些碱基对存在于pGRN121中编码的hTRT中。克隆#712562中的编码序列编码具有计算分子量约为30千道尔顿的259个残基的蛋白质(下文中的，“712562 hTRT”)。该712562 hTRT多肽含有基序T，1，2，和A，但不是基序B’，C，D，和E，因为RT基序B’，C，D和E包含在不同的开放读码框架中而不是多个N末端的RT基序中。另外，RT基序A和B之间的距离基本上比前面已知的三个TRT(非人)更短。
来自克隆#712562(SEQ ID NO123)的氨基酸序列与前面所示的实施例中确定的序列一起对比。图25显示了Euplotes(“p123”)，裂殖酵母(“tezl”)，Est2p(即，Est2核酸序列编码的啤酒酵母，同时也称为“L8543.12”)的序列对比。在这一比较研究中鉴定了人同系物。SEQ IDNO61提供了这一排列的部分的氨基酸序列(SEQ ID NO62提供了cDNA序列)，而图25中显示的tezl部分是SEQ ID NO63提供的。在这一图中显示的Est2部分也是SEQ ID NO63提供的，而显示的p123的部分也提供在SEQ ID NO65。图29显示了tezl的氨基酸序列(SEQ IDNO68)，而图30显示了tezl的DNA序列(SEQ ID NO69)。在图30中，在下面显示了内含子和其它非编码区，而在上面显示了外显子(即，编码区)。
如图25所示，在这些蛋白质之间存在高度保守的区域。例如，在这一图中所示，在“基序0”，“基序1”，“基序2”，和“基序3”中存在相同的区域。相同的氨基酸表示为星号(*)，而相似的氨基酸残基表示为点(.)。这表明各种真核生物，范围从酵母到纤毛虫到人之间在端粒酶基序中存在保守的区域。涉及的是其它生物体的TRT基因同样含有这样的序列的保守区。图27显示编码人端粒酶基序的部分氨基酸序列(SEQ ID NO67，参见图25，SEQ ID NO61)，而图28显示了相应的DNA序列(SEQ ID NO62)。
如本领域已知，利用Sanger二脱氧测序和其它方法以便获得克隆712562的完全的序列信息。表3中显示了用于测序的一些引物。设计这些引物以便与基于质粒骨架序列或克隆中的人cDNA插入片段的序列互补的序列的克隆杂交。
表3引物
从这些实验，可以确定克隆712562的EcoRI-NotI插入片段只含有人端粒酶蛋白质的部分开放读码框架，虽然它可以编码该蛋白质的活性片段。在AA281296克隆中的开放读码框架编码约63千道尔顿的蛋白质。在图47中显示了鉴定的最长的开放读码框架的序列(SEQ ID NO100)。在图中ORF在以“met”表示的ATG密码子处开始。同时可知序列的3’末端的聚A末尾。
图48显示了基于初步的序列分析，来自克隆712562(人端粒酶核心蛋白质1，“HsTCP1”)，E.aediculatus p123(“Ep p123)，粟酒裂殖酵母tezl(“Sp Tezl”)，啤酒酵母EST2(Sc Est2”)的端粒酶逆转录酶蛋白质编码序列和共有序列的深度性序列对比排列。在这一图中，指明了各种基序。
为了获得全长的克隆，将cDNA文库和5’-RACE的探针用于获得编码前面未克隆的区域部分的克隆。在这些实验中，将RACE(cDNA末端的快速扩增；参见例如，M.A.Frohman，“RACEcDNA末端的快速扩增”，在Innis等人，PCR方案，方法和应用的指导，第28-38页；和Frohman等人，美国科学院年报，858998-9002)用于产生序列分析的物质。产生了四个这样的克隆并用于提供其它的5’序列信息(pFWRP5，6，19和20)。
另外，利用克隆712562(含有AA281296)的EcoRI-NotI探测人cDNA文库(插入到λ)。鉴定一个命名为“λ25-1.1”(ATCC登记号#209024)的一个λ克隆为含有互补序列。图54显示了这一λ克隆的限制性图谱。将来自这一克隆的人cDNA插入片段作为EcoRI限制片段亚克隆到商业可得的噬菌粒pBluescript II SK+(Stratagene)的EcoRI位点，以便产生质粒“pGRN121”。该质粒保藏于ATCC(ATCC登记号#209016)。初步的结果表明质粒pGRN121含有编码人端粒酶蛋白质的全部开放读码框架(ORF)的序列。
利用本领域已知的技术对质粒pGRN121的cDNA插入片段进行测序。图49提供了基于这一初步工作鉴定的质粒pGRN121的限制性位点和功能性图谱。这一初步序列分析的结果表示在图50。
从这一分析，和图49所示，鉴定了推断的编码区的起始位点约为从EcoRI位点开始约50个核苷酸(定位于第707位)，并且特异于端粒酶基序的定位，“FFYVTE”(SEQ ID NO112)，“PKP”，“AYD”，“QG”和“DD”被鉴定了，除了推断的在核苷酸#3571的终止位点(参见，图51)。图51显示了序列中的开放读码框架的DNA和相应的氨基酸序列(“a”(SEQ ID NO114)，“b”(SEQ ID NO115)，和“c”(SEQ ID NO116))。但是，由于早期的分析工作的初步性质，发现各种基序的读码框架没有在序列对比中。
在pGRN121上进行的其它分析表明该质粒含有从712562克隆上不存在的编码序列的5’末端的明显的部分。另外，发现pGRN121含有各种编码序列，包括约182个核苷酸的插入片段。这一插入片段发现如上所述，是克隆712562中缺乏的。正如E.aediculatus序列，这样的变异体可以在功能测试中测试，如端粒酶测试，以便检测样品中功能端粒酶或部分TRT活性的存在。
初步的序列分析显示了cDNA序列和开放读码框架分别是(SEQ IDNO119和120，如图58所示)。如图53所示，序列分析分辨了pGRN121的cDNA序列(核苷酸序列)(SEQ ID NOS117)。图52提供了基于这一分析的pGRN121的限制性和功能图谱。这一cDNA的分析显示了编码约127,000道尔顿的分子量的蛋白质和1 132氨基酸(SEQ ID NO118)的邻近开放读码框架MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD SEQ ID NO118
从相似于pGRN121cDNA但缺乏克隆712562中丢失的182个碱基对的核酸可以表达具有治疗和其它活性的变异hTRT多肽(SEQ IDNO22)。这一核酸(下文称为“原90 hTRT”)，可以利用本文所述的常规合成或重组方法合成，它编码了807个残基的蛋白质(计算分子量约为90千道尔顿)，具有与SEQ ID NO118编码的hTRT蛋白质相似的氨基末端序列，但在羧基末端区不同(开始763个残基是相同的，原90hTRT残基后面44个与“全长”hTRT不同)。原90 hTRT多肽含有基序T，1，2，和A，但不含有基序B，C，D，E，并且所以预期具有一些，但不是全部端粒酶活性。
本发明仍然提供其它重组的，分离和纯化形式的天然存在hTRT种类或非天然存在变异体。前面没有讨论的天然存在hTRT种类的一个例子来自克隆712562(SEQID NO122)编码的mRNA的核糖体移码突变或hTRT cDNA(SEQ ID NO117)序列可以导致含有所有TRT基序的hTRT多肽的合成(参见例如，Tsuchihashi(1990)美国科学院年报872516；Craigengen(1987)细胞，501；Weiss(1990)细胞62117)。核糖体移码突变发生在当特异性的mRNA序列和次级结构引起核糖体“拖延”，并且在序列中向前或向后跳了一个核苷酸。所以，甚至在对应于克隆712562的hTRT序列的mRNA上的核糖体移码突变将引起约523个残基的多肽的合成。甚至原90的序列上的核糖体移码突变将导致含有约1071个残基的蛋白质。令人满意的是从核糖体移码突变产生的假说蛋白质也可以通过常规合成或重组技术表达。
实施例18端粒酶种类的克隆和测序本发明提供了包括人和非人起源的端粒酶种类的端粒酶的属。本发明提供了该属的端粒酶种类的代表数目和待用于检测和鉴定真核生物体的端粒酶同工型和同系物和其它种类和属的端粒酶的该属的成员通常引证的结构特征。本发明的端粒酶种类的属的成员包括从Euplotesaediculatus p123(SEQID NO1)，Oxytricha(编码SEQ ID NO58)，啤酒酵母(SEQ ID NO66)，四膜虫，和粟酒裂殖酵母，trtl(SEQ ID NO69)分离的端粒酶。
本发明提供了用于鉴定和克隆新TRT的试剂和方法，其中利用了从用于克隆TRT基因和cDNA的TRT聚核苷酸产生和起源的核酸探针和引物；和特异性地识别TRT包括用于表达TRT基因的克隆或鉴定和纯化TRT多肽的属的基序或其它TRT表位的抗体。
hTRT核酸序列(来自SEQ ID NO117的cDNA)和蛋白质序列信息(SEQID NO118)提供用于鉴定端粒酶基因和cDNA的PCR引物和低聚核苷酸。可以扩增TRT属成员之间的保守序列的PCR引物对是本发明的优选的试剂以便扩增直接来自其它生物体的新TRT同工型和TRT种类。
可选择地，低聚核苷酸可利用各种杂交技术和条件检测端粒酶编码核酸。可以利用任何已知技术包括PCR，分离DNA的酶限制消化，或有机合成产生这些低聚核苷酸。这些核酸可以标记用于通过如上所述的任何已知技术检测和杂交DNA。
利用QuickPrep Micro mRNA纯化试剂盒根据制造商的说明(Pharmacia，Piscataway，NJ)提取总RNA和富集mRNA。任何将mRNA用于通过逆转录例如Sambrook所述的禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶(Pharmacia)产生cDNA模板。利用例如Techne PHC-3热循环器(Techne，Princeton，NJ)利用其列基于已知的hTRT序列的引物系列进行PCR。也可将PCR用于扩增基因组DNA的端粒酸序列。可以使用如上所述的传统PCR的另一种可选择的变异形式，例如RACE。PCR也可以使用各种退火条件。例如，利用下面的循环方案扩增hTRT在94℃变性45秒；在60℃退火45秒；在72℃延伸90秒。这重复了总共30-40个循环，产生纯化的DNA产物。通过任何已知的技术如二脱氧链终止方法，利用染料终止循环测序试剂盒TMReady Reation试剂盒(AppliedBiosystems，Foster City，CA)和373A型DNA测序仪(Applied Biosystems)可以对PCR产物测序。PCR产物一旦鉴定为人端粒酶序列可以进一步被标记并如上所述可用作杂交探针。
本发明提供特定的用于筛选包括全长的TRT cDNA(即，SEQIDNO1，3，53，55，117)和各种片段的TRT cDNA的TRT的探针。一个这样的探针包括含有约cDNA的起始的三分之一的TRT部分(SEQIDNO117)(图53)。这一区比TRT的其余部分具有更多的GC，并且可以特定地用于检测非人端粒酶序列。所以，可以利用探针筛选这一区域以便使不需要的克隆降到最少。这一区域的有用的例子包括pGRN121的1203个碱基对Eco47III片段(SEQID NO117的位置729到1932)，和pGRN121的1530个碱基对的Pmll/Sphl片段(SEQ ID NO117的位置748到2278)。
另一个实施方案提供了包括含有约TRTcDNA的中间的三分之一的TRT部分(即，SEQ ID NO117)探针。这一区域编码RT基序，并且被认为是高度保守的区域。一个有用的端粒酶RT区的例子包括pGRN121的1143bp Sphl/Xmnl片段(SEQID NO117的位置2278到3421)。
另一个实施方案提供了含有TRTcDNA的后面三分之一的TRT的部分的探针(即SEQ ID NO117)。这一区域编码了至少在TRT之间保守的hTRT区域。这一区域的有用的例子包括pGRN121的760bpXmnl/Mscl片段(SEQ ID NO117的3421到4594)。
利用探针的混合物可以进行实验以便保证至少一个克隆被检测。一旦鉴定了克隆，它可以独立地利用每个探针筛选以便鉴定它包含的区域。然后，可以独立地利用探针发现其它相关的区域。当克隆鉴定后，利用mTRT克隆作为探针可以进行小鼠(和其他哺乳动物)基因组文库的筛选。利用TRT探针的最初杂交应该在降低的严格性下进行。因为预期TRT基因同I型与TRT探针序列有60-95％的等同性，参见例如Sambrook计算适当的杂交条件。
可以利用计算机数据库和程序分析得到的DNA序列与已知的端粒酶序列的序列等同性，或同源性，如上所述。例如，PC/Gene TM软件(IntelliGenetics公司，Moutain View，CA)将序列比较并且显示了开放读码框架。可以应用BLAST N和BLAST D研究算法检索GenBank数据库(NIH，Bethesda，MD)中在派生端粒酶序列和已知序列之间的任何匹配。
小鼠端粒酶编码序列的克隆可以使用hTRT和其它TRT聚核苷酸(例如，euplotes123和43千道尔顿编码序列，pGRN121)以便克隆来自其它种类的同源TRT。在这一实施例中，叙述了利用hTRT探针的小鼠TRT的克隆。
为了从另一个生物体中获得端粒酶的克隆，通常进行杂交实验。来自TRT的探针，可能是TRTcDNA或TRT基因的区域的PCR片段，或质粒如pGRN121的限制性片段，并包括所有或部分TRT编码序列，该探针可以与来自靶生物体的DNA杂交。可选择地，如上所述可以使用抗体探针。
通过小鼠λgt10 cDNA文库(利用来自多能的胚胎躯干细胞的D3系的RNA产生)的噬菌斑筛选获得小鼠TRTcDNA的克隆，其中利用了pGRN121的1203bpEco47III片段(pGRN121的位置729到1932)和pGRN121的1143bp Sphl/Xmnl片段(pGRN121的位置2278到3421)作为探针。将小鼠TRT(mTRT)克隆序列亚克隆到pBluescript IIKS(Stratagene，圣地亚哥，CA)的EcoRI位点。测序亚克隆获得约2kbp的5’序列(SEQID NO124的核苷酸1-2009，图60中所示)。
将来自低聚dT引导的小鼠睾丸RNA的PCR扩增产生的小鼠cDNA的用于克隆另外的mTRT基因序列。使用的引物是mTRT.9(5’-CTTTTACATCACAGAGAGCAC)(SEQIDNO125)和hTRT.28(5’-CTCGGACCAGGGTCCTGAGGAA)(SEQIDNO126)。设计的探针mTRT.9位于mTRT的1682-1702位(图60)。设计的探针hTRT.28是在hTRT的位置2702-2723。利用从人TRT基因序列设计的引物扩增的小鼠TRT基因是利用本发明的TRT序列在从其它生物体，特别是哺乳动物，如小鼠，和其它非人动物(如灵长类)获得克隆的说明。扩增的DNA得到克隆和测序(SEQID NO124，如图60所示的核苷酸1682-2695)。
从通过利用pGRN121的760bp Xmnl/Mscl片段(pGRN121的位置3421-4181)杂交筛选合并的BAC文库从鉴定的BAC克隆获得另外的mTRT序列。鉴定来自阳性BAC克隆(BAC495-M5)的1.3kb PstI片段为含有mTRT的编码序列，其中利用了Southern杂交实验和760bpXmnl/Mscl片段作为探针。将Pst I片段亚克隆到pBluescript IIKS(Stratagene)的PstI位点并测序(SEQID NO124的核苷酸2890-3050，如图60所示)。克隆4950-2A2的其它部分含有与hTRT的非同源序列，并被认为是内含子或载体序列。
在图60中，“X”代表mTRT基因的非克隆区，“Xs”代表克隆但未测序区(通过hTRT的类似物确定的长度)。可以延伸mTRT基因的序列以便利用本领域已知的标准方法编码mTRT蛋白质plus的羧基末端和3’未翻译区。
小鼠端粒酶编码序列的应用本发明提供了小鼠cDNA和端粒酶的基因组克隆，并且可以用于构建mTRT的纯合缺失；鉴定mTRT生物化学和生物特性；构建mTRT和hTR(mTR)的小鼠等当物的敲出体和在mTRT或mTRT/mTR的小鼠转基因敲出体中表达hTRT和hTR。小鼠DNA可以是基因组DNA，基因组DNA文库，RNA，cDNA，cDNA文库，或其它。在一个实施方案中，筛选小鼠cDNA文库以便获得mTRTcDNA的片段。这一序列依次可以用于寻找基因组克隆和其它cDNA克隆。这一途径可能在hTRT探针因为基因组DNA文库中的内含子而与小鼠cDNA而不是小鼠基因组DNA杂交的事件中是优选的。cDNA文库的来源是重要的；它应该优选地来自己知具有端粒酶活性的组织。小鼠胚胎躯干细胞cDNA文库是特别好的选择，正如端粒酶在躯干细胞中的表达比正常二倍体细胞相对高。
，根据是上面关于敲出方法的讨论。小鼠基因组克隆提供用于mTRT基因的靶和敲出体的构建体为了克隆整个端粒酶基因组，如mTRT，大的多体基因组λ克隆可以用于延伸整个基因组序列。用于分离小鼠克隆的小鼠ES文库是小鼠胚胎躯干细胞5’STRETCHcDNA文库，cat#ML1049a，来自CLONTECH，平均插入大小1.6kb(0.8-4.5kb范围)，载体＝lgt10，寡dT和任意六聚体用EcoRI接头引导，RNA来源＝D3细胞系(多能ES细胞)(Doetschman，T.C.，等人(1985)胚胎实验形态学杂志，8727-45)。
实施例1843千道尔顿端粒酶的人同系物的鉴定可以利用编码43千道尔顿多肽(SEQID NO4-6和SEQID NO9)的Euplotes aediculatus多核苷酸序列(SEQID NO3)克隆来自其它种类的同源TRT。另外，特异性地识别TRT，包括43千道尔顿TRT的抗体可以用于鉴定来自其它生物体的同工型和种类。科学和专利文献叙述了利用各种技术将抗体用于鉴定关系密切，交叉反应的种类，例如，TRT基因的克隆的表达或43千道尔顿TRT多肽的鉴定和纯化可以用于分离Euplotes p43(43千道尔顿)端粒酶亚基基因的人同系物。
在这一说明性例子中，叙述了利用E.aediculatus低聚核苷酸探针克隆编码E.aediculatus43千道尔顿(p43)TRT的基因和与E.aediculatus43千道尔顿TRT反应的抗体。
产生43千道尔顿特异性抗体为了生产与43千道尔顿多肽反应的抗体，设计了下面的肽用作免疫原CGGQKQLEFYFSDANLYNDSFL(SEQ ID NO127)。这一肽与KLH(钥孔戚血蓝蛋白)和BSA(小牛血清白蛋白)共轭。将肽免疫原用于产生小鼠和兔多克隆抗血清。在两次取血后，含有最高效价的抗血清是4.1×104。利用同样的方案，加强免疫这些动物。最高血液效价是8×105或更好。利用常规技术如免疫原肽亲和柱从抗血清分离抗体。利用标准技术包括从噬菌体或在细胞上同样显示的重组抗体的文库中选择抗体的技术可以产生与43千道尔顿多肽反应的多克隆抗体，如上所述。
实施例19设计和产生酵母TRT特异性肽编码酵母TRT多肽(SEQ IDNO64)的啤酒酵母TRT聚核苷酸序列(SEQ ID NO66)也可以用于从其它种类克隆同源TRT。特异性地识别酵母TRT的抗体可以用于鉴定来自其它生物体的另外TRT同工型和种类。在这一说明性实施例中，产生了特异于酵母TRT多肽的抗体。
为了产生与啤酒酵母TRT多核苷酸反应的抗体，设计了下面的肽用作免疫原NFNHSKMRIIPKKSNNEFRII(命名为“yIPKK”)(SEQ IDNO128)和CLPELYFMKFDVKSCYDSIPRMECMRILK(命名为“yCYDS”)(SEQ ID NO129)。这些肽与KLH(钥孔戚血蓝蛋白)和BSA(小牛血清白蛋白)共轭。将该肽免疫原用于产生小鼠和兔多克隆抗血清。免疫接种这些动物并且利用生产Euplotes抗-p43(43千道尔顿)抗体叙述的同样方案加强免疫。最高血样效价是8×105或更好。利用常规技术如免疫原肽亲和柱从抗血清分离抗体。利用如上所述的标准技术产生与啤酒酵母TRT聚核苷酸反应的单克隆抗体。
实施例20设计和构建用于TRT肽和聚核苷酸的表达的载体。
这一实施例详细叙述了表达TRT的细菌和真核细胞表达载体的设计，从而产生大量的全长，生物活性TRT。以这一方式产生生物活性TRT蛋白质可用于端粒酶再构成测试，测试端粒酶活性调节物，分析TRT的新分离种类的活性，鉴定和分离特异性地与TRT相关的化合物，分析已经位点特异性突变的TRT变异体蛋白质作为免疫原的活性，如几个实施例中所述。
TRT在细菌中的表达pThioHis A/hTRT细菌表达载体为了生产大量全长TRT，选择细菌表达载体pThioHis A(Invitrogen，圣地亚哥，CA)作为表达系统。编码hTRT的插入片段包括质粒pGRN121中的hTRT插入片段(SEQ ID NO117)的核苷酸707到4776。这一核苷酸序列包括hTRT蛋白质的完整的编码序列。
设计本发明的这一表达载体用于细菌中的可诱导表达。该载体可以诱导大肠杆菌中表达高水平的融合蛋白，该融合蛋白由可裂解的，HIS标记的硫代还原氧化成分和全长hTRT蛋白质组成。利用表达系统基本是根据制造商的说明的。下面表示了本发明得到的载体编码的融合蛋白的氨基酸序列；(*)表示内激酶裂解位点(SQ ID NO130)MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAHWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLRIDHNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGDDDDK-*-VPMHELEIFEFAAASTQRCVLLRTWEALAPATPAMPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDALVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKIQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD含有pGRN121的hTRT的核苷酸3272到4177的pGEX-2TK本发明的这一构建体可用于产生融合蛋白，例如为了产生TRT蛋白质的多克隆和单克隆抗体的目的。TRT的片段也可以用于其它目的，如调节端粒酶活性，例如，作为阴性显性突变体，或防止端粒酶成分和其它蛋白质或核酸的结合。
为了生产大量的TRT蛋白质片段，选择大肠杆菌表达载体pGEX-2TK(Pharmacia Biotech，Piscataway N.J.)，并基本根据制造商的说明使用产生本发明的表达载体。得到的构建体含有起源于质粒pGRN121的hTRT插入片段核苷酸第3272到4177位的(SEQ ID NO117)的插入片段。该载体指导大肠杆菌中高水平的融合蛋白的表达，该融合蛋白由谷胱苷肽-S-转移酶序列(下面划线)，凝血酶裂解序列(下面划双线)，热肌肉蛋白质激酶的识别序列(斜体)，通过在括号[GSVTK]中克隆导入的残基和hTRT蛋白质片段(黑体)组成，如下显示(SEQ ID NO131)MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGG
RDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASVTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD当表达融合蛋白时，形成了可溶的聚集体。通常如上在题目为从内含体纯化蛋白质的部分中所述处理。特定地，在PBS(20毫摩尔浓度磷酸钠，pH 7.4，150毫摩尔浓度NaCl)中悬浮诱导细胞，并通过超声波裂解。将NP-40加到0.1％，温和搅拌，在4℃，温育混合物30分钟。通过在4℃，25,000g离心收集不溶物质30分钟。用4M的PBS中的脲洗涤可溶物质一次，通过离心收集，然后用PBS再次洗涤。估计收集的沉淀含有大于75％的融合蛋白。在快速真空中干燥这一物质，然后，悬浮于助剂中，用于注射到小鼠和兔中，用于生产抗体。
含有HIS-8标记的pGRN121的hTRT核苷酸2426-3274的pGEX-2TK为了生产大量的TRT片段，制备了另一个大肠杆菌表达载体pGEX-2TK构建体。这一构建体含有起源于质粒pGRN121中的hTRT插入片段的核苷酸2426-3274(SEQ ID NO117)的插入片段。和编码8个构成性组氨酸残基的序列(HIS-8标记)。为了插入HIS-8TAG，利用BamHI使含有pGRN121的hTRT核苷酸2426到3274的pGEX-2TK载体线性化。这在GST-凝血酶心肌蛋白激酶和hTRT编码序列之间的接合处打开了质粒。将含有BamHI的相容末端的双链低聚核苷酸连接到线性化的质粒导致在hTRT序列的上游的框架内导入8个组氨酸残基。
该载体指导融合蛋白在大肠杆菌中的高水平表达，该融合蛋白由谷胱苷肽-S-转移酶序列(下面划线)；凝血酶裂解序列(下面划双线)；心肌蛋白质激酶的识别序列(斜体)；在括号中的由克隆导入的3个残基的系列和5个残基的系列([GSV]和[GSVTK])；8个构成性组氨酸(也是下面划双线)；和hTRT蛋白质片段(黑体)(SEQ ID NO132)MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGG TETTFQKNRLFFYRPSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGI本发明的每个pGEX-2TK载体可以用于产生融合蛋白以便产生hTRT蛋白质的多克隆和单克隆抗体。另外，这一融合蛋白可以用于亲和纯化抗TRT肽的抗体，该肽包括在融合蛋白中。根据制造商的说明通过利用凝血酶的位点特异性蛋白质水解可以完成来自谷胱苷肽S-转移酶成分的重组蛋白质分离。
含有pGRN121的hTRT核苷酸2426-3274的pGEX-2TK，没有HIS8-标记为了生产大量的TRT片段，制备另一个大肠杆菌表达载体pGEX-2TK构建体。
这一构建体含有起源于质粒pGRN121中的hTRT插入片段的核苷酸2426到3274的插入片段(SEQ ID NO117)，但没有如上所述的构建体的HIS-8标记。该载体指导融合蛋白在大肠杆菌中的高水平表达，该融合蛋白由谷胱苷肽-S-转移酶(下面划线)，凝血酶裂解序列(下面划双线)，心肌蛋白激酶的识别序列(斜体)，在括号中的由克隆导入的残基([GSVTK])和hTRT蛋白质片段(黑体)(SEQ ID NO133)组成
为了生产大量的TRT蛋白质片段，制备了另一个大肠杆菌表达载体pGEX-2TK构建体。
这一构建体含有起源于质粒pGRN121中的hTRT插入片段的核苷酸1625-2458(SEQ ID NO117)的插入片段。该载体指导大肠杆菌中高水平的融合蛋白的表达，该融合蛋白由谷胱苷肽-S-转移酶(下面划线)，凝血酶裂解序列(双线)，心肌蛋白质激酶的识别序列(斜体)，在括号中的由克隆导入的残基([GSVTK])和hTRT蛋白质片段(黑体)(SEQ IDNO134)组成MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLIKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGG
STSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRS含有pGRNl2l的hTRT核苷酸782-1636的pGEX-2TK为了产生大量TRT蛋白质片段，制各了另一个大肠杆菌表达载体pGEX-2TK构建体。
这一构建体含有起源于质粒pGRNl21中的hTRT插入片段的核苷酸782到1636(SEQ ID NO117)的插入片段。载体指导大肠杆菌中高水平的融合蛋白的表达，该融合蛋白由谷胱苷肽-S-转移酶(下面划线)，凝血酶裂解序列(下面划双线)，心肌蛋白激酶识别序列(斜体)，括号中的由克隆导入的残基([GSVTK])和hTRT蛋白质片段(黑体)(SEQ ID NO135)组成MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSKIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGG
RRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEATTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSL
含有缺乏5’非编码序列的hTRTcDNA的pT7FLhTRT如上所述，在一个实施方案中，本发明提供了以位点特异性的方式修饰的TRT以便有助于克隆到没有任何5’未翻译TRT序列的细菌，哺乳动物，酵母和昆虫表达载体。在一些情况中，减少非蛋白质编码序列的量减到最小允许提高蛋白质生产(产量)和增高mRNA的稳定性。在本发明的这一实施方案中，在克隆到细菌表达载体之前除去TRT基因5’非编码区。
通过在紧接hTRT编码序列(图53，SEQ ID NO117)的起始(ATG)密码上游(5’)工程化另外一个限制内切酶位点达到目的。在蛋白质的编码区的5’紧接的限制位点的产生允许有效地产生许多种类的编码融合蛋白的载体，如融合蛋白含有标记和肽TAG，用于免疫检测和纯化。
特异性地，利用低聚核苷酸5’-CCGGCCACCCCCCATATGCC GCGCGCTCCC-3’(SEQ ID NO136)如上所述修饰hTRTcDNA(SEQ IDNO117)的hTRTcDNA核苷酸779-781，GCG到CAT。这三个核苷酸是在ATG起始密码子之前的最后的核苷酸，所以它们不修饰蛋白质序列。在序列中的变化导致在hTRTcDNA中产生独特的NdeI限制位点。将单链hTRTDNA用作位点特异性诱变的DNA来源。测序得到的质粒证明成功的诱变。
这一修饰允许构建下面本发明的质粒，命名为pT7FLhTRT。利用NdeI和NotI消化(利用Klenow片段填充以便产生末端平齐化的DNA)位点特异性修饰的hTRT序列(加入NdeI限制位点)，以便产生编码hTRT的核酸片段。然后，将该片段克隆到预先用NdeI和SmaI(也是末端平齐化裂解)限制消化的质粒pSL3418。pSL3418是修饰的pAED4质粒，其中FLAG序列(Immunex公司，西雅图，WA)，和内激酶序列插入紧接上面提到的NdeI位点的上游。这一质粒命名为pT7FLhTR，允许在表达T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株中表达全长的hTRT(在它的5’末端含有Flag-Tag)。
含有缺乏3’非编码序列的hTRTcDNA的质粒如上讨论，本发明提供了含有TRT编码核酸的表达载体，其中已经缺失一些或所有非编码序列。在一些情况中，将非蛋白质编码序列的量降到最小可以提高蛋白质生产(产量)和增强mRNA稳定性。在本发明的这一实施方案中，在克隆到细菌表达质粒之前将TRT的3’未翻译区缺失。
如上讨论，首先在含有全长hTRTcDNA的质粒pGRN121中缺失所有Apa1位点。接着使含有3’UTR的MscI-HincIIhTRT限制消化酶片段缺失。然后，将含有hTRT的终止密码的NcoI-XbaI限制消化片段插入到pGRN121的NcoI-XbaI位点，命名为pGRN124，除了缺乏3’UTR。
利用抗生素选择标记物的细菌表达载体本发明同时提供了可能含有选择标记物使转化细胞上具有可选择表现型和附加体维持和复制的编码序列的细菌表达载体，以致这些序列是整合到寄主基因组不需要。例如，该标记物可以编码抗生素抗性，特别是氯霉素抗性(参见Harrod(1997)核酸研究251720-1726)，卡那霉素，G418，博来霉素和潮霉素，允许选择这些含有需要DNA序列的转化细胞，参见例如，Blondelet-Rouault(1997)基因，190315-317；和Mahan(1995)美国科学院年报92669-673。
在本发明的一个实施方案中，将全长的hTRT克隆到修饰的Bluescript质粒载体(Stratagene，圣地亚哥，CA)，命名为pBBS235，其中已经插入了氯霉素抗生素抗性基因。来自含有hTRT ORF的pGRN124(上面讨论)的NotI片段(亚克隆)到pBBS235的NotI位点，以致TRT ORF是在载体的Lac启动子的相反方向上。这使质粒适用于诱变质粒插入片段，如本发明的TRT核酸。将这一质粒构建体命名为pGRN125，可以用于本发明的方法，该方法包括端粒酶和TRT蛋白质编码序列的诱变和用于利用T7启动子的hTRT的体外转录(和利用T3启动子的反义hTRT的体外转录)。
在本发明的另一个实施方案中，来自含有hTRT ORF的pGRN124的NotI限制片段可以亚克隆到pBBS235(如上所述)的NotI位点，以致TRTORF是在载体的Lac启动子的相同方向上。这产生的质粒命名为pGRN126，可以用于大肠杆菌中表达全长hTRT。表达产物含有载体pBBS235编码的29个氨基酸，跟随着hTRT的5’UTR编码的18个氨基酸，后面跟随全长的hTRT蛋白质。
在本发明的另一个实施方案中，进行了pGRN125的体外诱变将hTRT起始ATG密码转化为Kozak共有和产生EcoRI和BgIII限制消化位点以便有助于克隆到表达载体。将低聚核苷酸5’TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCcaCcATGCCGCGCGCGCTCCCCGCTG-3’(在下面的情况中改变了核苷酸)(SEQ IDNO137)用于诱变方法。得到的表达载体命名为pGRN127。
在本发明的另一个实施方案中，将TRT“DD基序”的第二个Asp转化成丙氨酸以产生非功能端粒酶，所以产生突变TRT蛋白质用作显性/阴性突变体。利用低聚核苷酸5’CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGTTGGTGACACCTCACCTCACC-3’(SEQ ID NO138)体外诱变hTRT编码序列以便将编码第869位残基(Asp869)的天冬酰胺密码子转变成为丙氨酸(Ala)密码子。这也产生了MluI限制酶位点。得到的表达质粒命名为GRN130，它含有Kozak共有序列如pGRN127所述。
在本发明的另一个实施方案中，将低聚核苷酸5’-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3’(SEQ ID NO139)用于体外诱变方法以便将hTRT起始ATG密码子转化成为Kozak共有序列并且产生用于克隆的EcoRI和BglII限制位点。
本发明同时提供了设计为表达hTRT的反义序列片段的载体。利用MscI和SmaI限制酶完全切割pGRN126质粒并且再连接使95％以上的hTRT ORF缺失。在该过程中再插入一个SmaI-MscI片段以再创造CAT活性。然后，利用SalI和EcoRI再消化这一未纯化质粒，将含有hTRTORF的起始密码的片段插入pBBS212的SalI-EcoRI位点以便产生反义表达质粒，它表达跨越5’UTR和hTRT ORF的73碱基对残基的反义序列。这一质粒命名为pGRN135。
酵母中表达hTRT端粒酶本发明同时提供了表达TRT酵母表达载体以便产生大量的全长，生物活性TRT。
巴斯德毕赤氏酵母表达载体pPICZ B和全长hTRT为了产生大量的全长，生物活性TRT，选择巴斯德毕赤氏酵母表达载体pPICZ B(Invitrogen，圣地亚哥，CA)。hTRT-编码序列插入片段起源于质粒pGRN121的hTRT插入片段的核苷酸659-4801(SEQ IDNO117)。这一核苷酸序列包括编码hTRT的全长序列。这一表达载体设计用于在巴斯德毕赤氏酵母中高水平可诱导表达全长，未修饰hTRT蛋白质。表达通过酵母启动子驱动，但表达序列利用了hTRT起始和终止密码。没有外源密码子通过克隆导入。将得到的pPICZ B/hTRT载体用于转化酵母。
巴斯德毕赤氏酵母表达载体hTRT-His6/pPICZ B
起源于pPICZ B的本发明的第二个巴斯德毕赤氏酵母表达载体也含有起源于质粒pGRN121中的hTRT插入片段(SEQ ID NO117)的核苷酸659-4801的编码hTRT的全长序列。这一hTRT-His6/pPICZ B表达载体编码在C末端与Myc表位和His6报道标记物序列融合的全长hTRT蛋白质。通过编码Myc表位的载体序列和His6报道标记物以及终止密码可以除去和替代hTRT终止密码子。这一载体设计为在酵母中指导高水平可诱导表达下面的融合蛋白，该融合蛋白包括hTRT序列(下面划线)，括号中的载体序列([L]和[NSAVD])Myc表位(下面划双线)，和His6标记物(斜体)(SEQ ID NO140)组成MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTA
根据制造商的说明利用凝血酶位点特异水解蛋白质可以完成来自谷胱苷肽S-转移酶成分的重组蛋白质的分离。
在昆虫细胞中表达TRT本发明同时提供，产生大量的全长，生物活性TRT的表达TRT端粒酶的昆虫表达载体。
杆状病毒表达载体pVL1393和全长TRT将需要的TRT编码序列克隆到杆状病毒表达载体pVL1393(Invitrogen，圣地亚哥，CA)。这一构建体随后与来自Autographcalifornia核型多角体病毒(Baculogold-AcMNPV)的线性DNA共转染到Spodoptera fungupeida(sf-9)细胞。随后，将获得的重组杆状病毒的噬菌体纯化并根据标准方案扩展。
这一病毒载体提供了昆虫细胞中高水平表达全长TRT蛋白质。表达是通过杆状病毒多角体基因启动子驱动的。没有外源密码子是通过克隆导入。
杆状病毒表达载体pBlueBacHis2 B和全长hTRT为了生产大量全长，生物活性TRT，选择杆状病毒表达载体pBlueBacHis2B(Invitrogen，圣地亚哥，CA)作为对照元素的来源。hTRT编码插入片段由质粒pGRN121中的hTRT插入片段(SEQ ID NO117)的核苷酸707到4776组成。
同时构建的是含有His6和抗Xpress标记物的全长hTRT(Invitrogen)。这一载体同时含有来自质粒pGRN121的hTRT插入片段的核苷酸707到4776组成的插入片段。该载体指导昆虫细胞中高水平表达全长hTRT蛋白质，与可切割的6-组氨酸和抗X-press标记物融合，融合蛋白的氨基酸序列在下面显示，(*)指内激酶切割位点(SEQ IDNO141)MPRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDL-*-DPSSRSAAGTMEFAAASTQRCVLLRTWEALAPATPAMPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD杆状病毒表达载体pBlueBac 4.5和全长hTRT蛋白质为了生产大量全长，生物活性TRT，构建了第二个杆状病毒表达载体pBlueBac4.5(Invitrogen，圣地亚哥，CA)。hTRT编码插入片段也由质粒pGRN121的hTRT的核苷酸707到4776(SEQ ID NO117)组成。
杆状病毒表达载体pMelBacB和全长TRT蛋白质为了生产大量全长，生物活性TRT，构建了第三个杆状病毒表达载体pMelBacB(Invitrogen，圣地亚哥，CA)。hTRT编码插入片段也由来自质粒pGRN121的hTRT插入片段的核苷酸707到4776组成。
pMelBacB通过利用蜂毒肽信号序列的分泌途径指导昆虫细胞中的全长TRT利用到细胞外的介质中。因此分泌了高水平的全长TRT。在分泌时蜂毒肽信号序列切割，但它是仍然在细胞内的部分蛋白质合并液。为了这一原因，表示在下面的序列中的圆括号中。下面显示了载体编码的融合蛋白的序列(SEQ ID NO142)(MKFLVNVALVFMVVYISYIYA)-*-DPSSRSAAGTMEFAAASTQRCVLLRTWEALAPATPAMPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD哺乳动物细胞中表达TRT本发明同时提供了在各种哺乳动物细胞系中产生大量全长，生物活性蛋白质TRT的载体，可用于本发明的许多实施方案，如上讨论。
MPSV-TRT表达质粒本发明同时提供了用于哺乳动物细胞的表达系统，产生表达重组蛋白，如端粒酶，而没有真正修饰编码序列(例如，最佳化密码用途)的最大可能性。在一个实施方案中，本发明提供了能够表达本发明的TRT的MPSV哺乳动物表达质粒(利用Lin J-H(1994)基因47287-292叙述的系统)。MPSV质粒可以以稳定或短暂克隆表达。
在这一表达系统中，当hTRT编码序列本身未改变，可以将外源转录控制元素掺入载体。骨髓增殖肉瘤病毒(MPSV)LTR(MPSV-LTR)启动子，由细胞肥大病毒(CMV)增强子加强，可以掺入用于转录起始。这一启动子同样显示在细胞系中高水平的表达(参见，Lin J-H(1994)出处同上)。将Kozak共有序列掺入用于转录起始(参见Kozak(1996)哺乳动物基因组7563-574)。可以除去所有外来5’和3’未翻译hTRT序列以便保证这些序列不干扰表达，如上讨论。含有完全的hTRT编码序列，但含有除去的所有外来序列的MPSV质粒命名为pGRN133。同时构建了对照，hTRT“反义”质粒。这一载体与pGRN133相同，不同的是TRT插入片段是hTRT的反义序列(反义，对照可以用作载体，命名为pGRN134)。
两个选择标记物，存在PAC(吡咯霉素-N-乙酰-转移酶＝吡咯霉素抗性)和HygB(潮霉素B＝潮霉素抗性)用于在转染后选择质粒(参见上面可选择标记物的讨论)。在载体多接头两边的标记物的双重选择应该增强hTRT编码序列的稳定性。包含DHFR(二氢叶酸还原酶)编码序列包含于允许进行在产生稳定克隆后的表达盒的扩增。基因扩增的其它手段也可以用于增加重组蛋白质的产量。
本发明同时提供了含有TRT融合蛋白的MPSV哺乳动物表达质粒。在一个实施方案中，将保留5’未翻译区的TRT序列与表位旗，如IBIFLAG(国际生物技术公司(IBI)，Kodak，New Haven，CT)连接，并插入MPSV表达质粒(命名为pGRN147)。这一特别的构建体含有Kozak翻译起始位点。该表达融合蛋白可以利用M-1抗FLAG八肽单克隆抗体纯化(IBI，Kodak，出处同上)。
在另一个实施方案中，TRT是位点特异改变的。诱变了一个氨基酸残基密码子，改变了在位置869的天冬氨酸成为丙氨酸。这一Asp869-＞Ala hTRT突变体，保留了它的5’未翻译区，并掺入了Kozak序列，并插入到MPSV表达质粒，命名为pGRN146。Asp869-＞Ala hTRT突变体进一步工程化含有FLAG序列，如上面讨论，并且插入片段克隆到MPSV表达质粒。这一表达质粒命名为pGRN154。特定地，对于pGRN154，将来自pGRN146的Eaml1051限制消化片段克隆到pGRN147(参见上面)的Eaml1051位点以便产生能够表达含有Kozak序列，上面叙述的D869-＞A突变，和IBI旗的hTRT的MPSV表达质粒，pGRN146含有包括hTRT的“前末端”(5’部分)的Kozak序列。
本发明的另一个实施方案是起源于pGRN146的表达质粒。该哺乳动物表达质粒命名为pGRN152。通过从质粒pGRN146切出EcoRI片段(含有哺乳动物中的TRT ORF)产生并克隆到pBBS212的EcoRI位点以便除去hTRT的5’UTR。hTRT的定向使它的表达受到MPSV启动子的控制。这使哺乳动物表达质粒表达了含有Kozak共有序列和D869-＞A突变的hTRT，并且使用的是MPSV启动子。
本发明提供了哺乳动物表达载体，其中TRT的定向使TRT编码序列受到MPSV启动子的驱动。例如，将来自含有hTRT开放读码框架(ORF)的pGRN137的EcoRI限制消化片段克隆到pBBS212的EcoRI位点(参见下面)，从而除去hTRT的5’未翻译区(5’UTR)。而构建了pGRN137通过从如下所述含有hTRT的Kozak突变的pGRN130切出SalI-Sse3871片段到pGRN136的Sal 1-SSE83871位点，使表达hTRT的哺乳动物表达质粒含有离开MPSV启动子的Kozak共有序列。通过从含有hTRT OF的pGRN126中切出HindIII SalI片段，并克隆到质粒pBBS242的HindIIISalI片段构建质粒pGRN136，产生表达脱离MPSV启动子的hTRT的哺乳动物表达质粒。这产生了哺乳动物表达质粒，命名为pGRN145，利用MPSV启动子表达含有Kozak共有序列的hTRT。同时参见下面所述的pGRN152MPSV启动子驱动的哺乳动物表达载体。
利用游离载体pEBVHis在293细胞中表达的TRT
工程化游离载体pEBVHis(Invitrogen，圣地亚哥，CA)以便表达含有与N末端延伸表位标记物，Xpress-表位融合的hTRT的TRT融合蛋白(Invitrogen，圣地亚哥，CA)(命名为pGRN122)。将来自含有hTRT ORF的pGRN121的NotI hTRT片段克隆到pEBVHisA的NotI位点，以致hTRT ORF的方向与载体的Rous肉瘤病毒(RSV)启动子的相同。在这一方向上，His6旗与hTRT的N末端相当接近。
同时构建的载体含有作为插入片段的TRT的反义序列和表位标记物(该质粒命名为pGRN123，可以用作对照)。将该载体转染到293细胞，并翻译利用特异于Xpress表位的抗体分离和鉴定的hTRT。pEBVHis是潮霉素抗性EBV游离载体，表达与N末端肽融合的需要的蛋白质。选择和延伸携带载体的细胞，然后，制备核和细胞质提取物。利用抗Xpress抗体免疫沉淀这些和对照提取物，通过常规测试对免疫沉淀小珠的端粒酶活性进行检测。
在可灭的，正常二倍体人细胞中表达重组TRT在本发明的一个实施方案中，在正常二倍体可灭细胞中可以表达重组TRT和需要的端粒酶复合物成分以便增强它们的增殖能力或使它们不灭，或简化它们的不灭。这允许人们利用获得具有正常表现型和核型的二倍体不灭细胞。
将有意义hTRT(图16)和反义hTRT克隆到CMV载体。纯化这些载体，并短暂转染到两个正常，可灭，二倍体人细胞克隆中。人克隆是年轻的通道二倍体人BJ和IMR90细胞菌株。
利用TRAP测试的端粒酶活性的分析(利用TRAPezeTM试剂盒(Oncor公司，Gaithersburg，MD)显示，有意义hTRT的转染但不是反义hTRT的转染在B了和IMR90细胞菌株中都产生端粒酶活性。
在不灭IMR90人细胞中重组TRT的表达利用克隆到用于上面叙述的二倍体人BJ和IMR90细胞菌株研究的CMV载体的同样的TRT有意义构建体，短暂转染了不灭SW13ALT途径细胞系(含有SV抗原IMR90细胞不灭)。TRAP测试(TRAPeze Oncor公司，Gaithersburg，MD)证明在有意义构建体转染细胞中产生了端粒酶活性。
在哺乳动物细胞中hTRT的调节表达的载体可诱导和可阻遏表达hTRT可以将本发明提供的载体进行操作以诱导或阻遏本发明的TRT如hTRT的表达。例如，hTRT编码序列可以克隆到来自Invitrogen的脱皮激素可诱导表达系统(圣地亚哥，CA)和来自克隆技术实验室公司(PaloAlto，CA)的Tet-On和Tet-Off四环素调节系统。这一可诱导表达系统提供用于本发明的方法，其中重要的是控制转染TRT的转录水平或速度。例如，本发明提供通过TRT的表达成为不灭的细胞系，如可以通过转录控制抑制载体表达TRT得到“可灭性”的细胞，如那些Tet-Off系统提供的。本发明同时提供短暂表达TRT的方法以便避免TRT的组成性表达，这种表达可以导致转染细胞中不需要的“不灭性”，如上面讨论。
脱皮激素可诱导哺乳动物表达系统设计为允许在哺乳动物细胞中调节需要的基因的表达。该系统是通过它的严格调节机制为特点的，该机制允许几乎检测不到的基本表达，并且在哺乳动物细胞中的可诱导性大200倍。该表达系统是基于果蝇的杂二聚体脱皮激素受体的。脱皮激素可诱导表达系统使用了类固醇激素脱皮激素类似物，muristeroneA，以便通过杂二聚体核受体活化TRT的表达。表达水平已经报道超过基本水平的200倍而没有对哺乳动物细胞生理的影响“在哺乳动物细胞和转基因小鼠中脱皮激素可诱导基因表达”(1996)美国科学院年报933346-3351)。一旦受体结合脱皮激素或muristerone，脱皮激素的类似物，受体激活脱皮激素应答启动子以获得需要的基因的控制表达。在脱皮激素可诱导哺乳动物表达系统中，杂二聚体受体的单体是从同一载体pVgRXR中构成性表达的。脱皮激素应答启动子最终驱动需要的基因的表达，该启动子定位于第二个载体pIND，驱动了需要的基因的转录。
TRT编码序列克隆在pIND载体中(Clontech实验室公司，PaloAlto，CA)，含有5个最小热休克启动子和多克隆位点上游的修饰脱皮激素应答元素(E/GRE)。然后，将该构建体转染到已经预先工程化以稳定表达脱皮激素受体的细胞系中。在转染后，利用muristerone A处理细胞以便诱导从pIND细胞内表达。
Tet-on和Tet-off表达系统(Clontech技术，Palo Alto，CA)达到受调节的，高水平基因表达系统，如Gossen(1992)“四环素诱导启动子在哺乳动物细胞中紧密控制基因表达”美国科学院年报，895547-5551中所述的Tet-Off转录表达系统；和Gossen(1995)“在哺乳动物细胞中四环素活化转录”科学，2681766-1769中所述的Tet-On可诱导转录系统。在“Tet-Off”转化细胞系中，当从培养基中除去四环素或强力霉素(“Dox”；Tc衍生物)时驱动了基因表达。相反，在Tet-On细胞系中通过在培养基中加入Tc或Dox驱动了表达。两个系统应答各种浓度的Tc或Dox，允许紧密调节的克隆基因表达。
这一系统利用“pTRE”作为应答质粒，该质粒可以用于表达需要的基因。质粒pTRE含有在Tet应答PhCMV*-1启动子的下游紧接的多个克隆位点(MCS)。插入在MCS的一个位点中的需要的基因或cDNA将分别应答Tet-Off和Tet-On系统中的tTA和rtTA调节蛋白质。PhCMV*-1含有Tet-应答元素(TRE)，由7个拷贝的42bptet操纵子序列(tetO)组成。TRE元素紧接最小CMV启动子(PminCMV)的上游，缺乏在pTet质粒中的完全CMV启动子的部分的增强子。结果，PhCMV*-1在缺乏调节蛋白与tetO序列的结合时是沉默的。克隆插入片段必须具有起始密码。在有些情况中，加入Kozak共有核糖体结合位点可以提高表达水平；但是，许多cDNA已经有效地在Tet系统中表达而没有加入Kozak序列。pTRE-Gene X质粒与pTK-Hyg共转染以便允许选择稳定的转染体。
设定Tet-Off或Tet-On表达系统通常需要两个构成性稳定转染以便产生“双倍稳定”细胞系，该细胞系含有在TRE的控制下的编码适当调节蛋白质和TRT的整数拷贝的基因。在第一个转染中，将适当的调节蛋白通过转染“调节质粒”如pTet-Off或pTet-On载体导入选择的细胞系中，该载体表达适当的调节蛋白质。然后，将在pTRE“应答质粒”中克隆的hTRT导入在第二次转染中，产生双倍稳定的Tet-Off或Tet-On细胞系。两个系统给出非常紧密的基因表达on/off控制，调节剂量依赖诱导，和高度绝对水平的基因表达。
含有DHFR和腺病毒序列的重组TRT的表达设计pGRN155质粒构建体用于在哺乳动物细胞中表达hTRTcDNA。将Kozak共有插入hTRT序列的5’末端。hTRT插入片段不含有3’或5’UTR。将hTRTcDNA插入p91023(B)的EcoRI位点(Wong(1985)科学，228810-815)。hTRT插入片段是在DHFR ORF的相同方向上。这产生了特定地用于瞬时表达的表达载体。
质粒pGRN155含有SV40原点，和紧接腺病毒启动子上游的增强子，四环素抗性基因，大肠杆菌原点，和腺病毒VAI和VAII基因区域。这一表达盒含有下面顺序的腺病毒主要晚期启动子；腺病毒三分引导序列；包括来自第一个三分引导序列的外显子的5’拼接位点和来自小鼠免疫球蛋白基因的3’拼接位点；hTRTcDNA；小鼠DHFR编码序列；和SV40多聚腺苷酸化信号的杂合内含子。
已经报道腺病毒三分引导序列和VARNA能够增强翻译多聚顺反子mRNA的序列的效率。已经报道DHFR序列能够增强杂合mRNA的稳定性。DHFR序列也可以提供选择和扩增载体序列的标记物。参见Logan(1984)美国科学院年报，813655)；Kaufman(1985)美国科学院年报82689；和Kaufman(1988)焦点(生命技术公司)，10卷，3号)。
为了说明目的叙述本发明的其它表达质粒pGRN121将含有编码hTRT蛋白质的整个cDNA的λ克隆25-1.1.6中的EcoRI片段插入pBluescript IISK+的EcoRI位点，以致cDNA的5’末端接近载体中的T7启动子。这一载体利用的选择标记物是氨苄青霉素。
pGRN122将来自含有hTRT ORF的pGRN121的NotI片段插入pEBVHisA的NotI位点以致该编码序列可操作地连接RSV启动子。这一质粒表达与hTRT蛋白质的N末端融合的His6旗组成的融合蛋白质。这一载体利用的选择标记物是氨苄青霉素或潮霉素。
pGRN123将来自含有hTRT ORF的pGRN121的NotI片段插入pEBVHisA的NotI位点，以致该编码序列是在RSV启动子的相反方向上，从而表达反义hTRT。
pGRN124，通过缺失含有3’UTR的MscI-HincII片段之后，将质粒pGRN121缺失所有的ApaI位点。含有hTRT编码序列的终止密码子的Nco-XbaI片段然后插入pGRN121的Nco-XbaI位点，以便产生相当于pGRN121的质粒，除了缺乏3’UTR，该质粒可以优选地在一些细胞中增强表达水平。
pGRN125
将来自含有hTRT编码序列的pGRN124的NotI片段插入pBBS235的NotI位点，以致开放读码框架是在Lac启动子的相反方向上。这一载体利用的选择标记物是氯霉素。
pGRN126将来自含有hTRT编码序列的pGRN124的NotI片段插入pBBS235的NotI位点，以致插入的hTRT编码序列是在Lac启动子的相同方向上。
pGRN127将低聚核苷酸5’-TGCGCACGTGGGAAGCCTGGCagatctgAattCCaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTCG-3’(SEQ ID NO143)用于pGN125的体外诱变，以便转化hTRT编码序列的ATG密码子成为Kozak共有序列并产生用于克隆的EcoRI和BglII。同时，将低聚COD2866用于转化AmpS成为AmpR(氨苄青霉素抗性)，并且将低聚核苷酸COD1941用于转化CatR(氯霉素抗性)成为CatS(氯霉素敏感)。
pGRNl28将低聚核苷酸5’-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCCaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3’(SEQ ID NO144)用于体外诱变以便转化hTRT的起始ATG密码子成为Kozak共有序列和产生EcoRI和BglII位点用于克隆。
同时低聚5’-CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAATGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3’(SEQ ID NO145)用于在C末端插入IBI Flag(国际生物技术公司(IBI)，Kodak，New Haven，CT)并产生EcoRI和BglII位点用于克隆。利用COD2866转化Amps成为AmpR，并且将COD1941用于转化CatR成为CatS。
pGRN129低聚核苷酸5’-CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACC-3’(SEQ ID NO146)用于体外诱变转化Asp869成为Ala密码子(即，将DD基序的第二个Asp转化成为Ala以便产生显性/阴性hTRT突变体)。这也产生MluI位点。同时将低聚核苷酸5’-CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGG1ACGACGATGACAAATGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3’(SEQ ID NO147)用于在C末端插入IBI Flag和产生EcoRI和BglII位点用于克隆。同时，COD2866用于转化AmpS成为AmpR，并且将COD1941用于转化CatR成为CatS。
pGRN130将低聚核苷酸5’-CGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGAcGcgTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACC-3’(SEQ IDNO148)用于在体外诱变，以便转化Asp869密码子成为Ala密码子(即，将DD基序的第二个Asp转化成为Ala以便产生显性/阴性变异体蛋白质)。这也产生了MluI位点。
同时，将低聚核苷酸5’-TGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCagatctgAattCcaCcATGCCGCGCGCTCCCCGCTG-3’(SEQ ID NO149)用于体外诱变以便转化hTRT编码序列的起始ATG密码子成为Kozak共有序列并且产生EcoRI和BglII位点用于克隆。同时，COD2866可用于转化AmpS成为AmpR，并且将COD1941用于转化CatR。
pGRN131将来自含有Kozak序列和IBI Flag突变的hTRT ORF的pGRN128的EcoRI片段插入pBBS212的EcoRI位点，以致hTRT ORF脱离MPSV启动子而表达。质粒pBBS212含有MPSV启动子，CMV增强子，和SV40多聚腺苷酸化位点。
pGRN132将来自含有具有Kozak序列和IBI Flag突变的hTRT ORF的pGRN128的EcoRI片段插入pBBS212的EcoRI位点，以致反义hTRTORF脱离MPSV启动子而表达。
pGRN133将来自含有hTRT编码序列的pGRN121的EcoRI片段插入pBBS212的EcoRI位点，以致hTRT蛋白质在MPSV启动子的控制下表达。
pGRN134将来自含有hTRT编码序列的pGRN121的EcoRI片段插入pBBS212的EcoRI位点，以致，反义hTRT编码序列在MPSV启动子的控制下表达。这一载体利用的选择标记物是Chlor/HygB/PAC。
pGRN135利用MscI和SmaI完全消化质粒pGRN126并且再连接以便缺失95％的插入的hTRT编码序列。在该过程中再插入一个SmaI-MscI片段以便再创造用于选择的Cat活性。然后，利用SalI和EcoRI再消化这未纯化的质粒，并且将含有hTRT的起始密码的片段插入pBBS212的SalI-EcoRI位点。这产生了表达反义5’UTR和73个碱基对的编码序列的反义表达质粒。用于这一载体的选择标记物是Chlor/HygB/PAC。
pGRN136将来自含有hTRT编码序列的pGRN126的HindII-SalI片段插入pBBS242的HindII-SalI位点。
pGRN137将来自含有Kozak序列的pGRN130的SalI-Sse3871片段插入pGRN136的SalI-Sse8371位点。
pGRN138将来自含有hTRT没有3’UTR的pGRN124的EcoRI片段插入pEGFP-C2的EcoRI位点，以致hTRT的方向与EGFP区相同。
pGRN139将低聚核苷酸5’-CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGACTACAAGGACGACGATGACAAATGAATTCAGATCTGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGC-3’(SEQ ID NO150)用于在pGRN125的hTRT的C末端插入IBI Flag，并且产生EcoRI和BglII位点用于克隆。同时，利用COD2866转化AmpS成为AmpR，并且利用COD1941转化CatR成为CatS。
pGRN140将含有基因组hTRT的上游序列的NcoI片段和来自λG55的hTRT第一个内含子插入pBBS167的NcoI位点。该片段的定向是hTRT的方向与Lac启动子相同。
pGRN141将含有基因组hTRT的上游序列的NcoI片段和来自λG55的hTRT的第一个内含子插入pBBS167的NcoI位点。该片段的定向是hTRT的方向与Lac启动子相反。
pGRN142构建载体用于在大肠杆菌中表达和诱变TRT序列。利用来自λGN5(lac方向)的启动子克隆。这一载体中利用的选择标记物是氨苄青霉素。将来自λGphi5的NotI片段插入质粒pGBS185的NotI位点。这一Not片段含有包括hTRT基因的启动子区的完整的～15kbp基因组插入片段。该片段的方向是hTRT ORF的方向与Lac启动子的方向相反。
pGRN143构建这一载体用于在大肠杆菌中表达和诱变TRT序列。将来自λGphi5的NotI片段插入质粒pBBS185的NotI位点，该NotI片段含有包括hTRT基因的启动子区的完整的～15kbp基因组插入片段。该片段的定向使hTRT ORF的方向与Lac启动子相同。这一载体利用的选择标记物是氨苄青霉素。
pGRN144pGRN140缺失SAL1以便除去λ序列。
pGRN145构建这一载体用于在哺乳动物细胞中表达hTRT序列。将来自含有hTRT编码序列的pGRN137的EcoRI片段插入pBBS212的EcoRI位点以便除去对应于hTRTmRNA的5’UTR的序列的部分。hTRT的编码序列的方向是它在MPSV启动子的控制下表达。这一载体的选择标记物是Chlor/HygB/PAC。
pGRN146构建这一载体用于在哺乳动物细胞中表达hTRT序列。将来自来自含有hTRT的D869A突变的pGRN130的Sse83871-NotI片段插入pGRN137的Sse83871-NotI位点。用于这一载体中的选择标记物是氨苄青霉素/HygB/PAC。
pGRN147将来自含有IBI Flag的pGRN139的Sse83871-NotI片段插入pGRN137的Sse83871-NotI位点。
pGRN148将来自含有hTRT启动子区的pGRN144的BglII-Eco47III片段插入pSEAP2的BglII-NruI位点，以便制备hTRT启动子/报道分子构建体。
pGRN149构建这一载体用于在大肠杆菌中表达和诱变TRT序列。通过pGRN125的体外诱变将突变的低聚5’-cttcaagaccatcctggactttcgaaacgcggccgccaccgcggtggagctcc-3’用于在hTRT的C末端加入CSP451位点。利用Csp45I位点缺失和替代hTRT的终止密码子。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素。
pGRN150将来自含有hTRT的启动子区的pGRN144的BglII-FspI片段插入pSEAP2的BglII-NruI位点以便产生hTRT启动子/报道分子构建体。
pGRN151构建这一载体用于在哺乳动物细胞中表达hTRT序列。将来自含有hTRT编码序列的pGRN147的EcoRI片段插入pBBS212的EcoRI位点以便除去对应于hTRTmRNA的5’UTR的序列部分。hTRT编码序列的方向使它的表达在MPSV启动子的控制下。用于这一载体的选择标记物是Chlor/HygB/PAC。
pGRN152将来自含有hTRT编码序列的pGRN146的EcoRI片段插入pBBS212的EcoRI位点以便除去对应于hTRT的5’UTR的序列部分。hTRT编码序列的方向是它的表达在MPSV启动子的控制下。
pGRN153将来自含有hTRT的D869-＞A突变(hTRT突变体编码序列)的pGRN130的StyI片段插入pGRN158的StyI位点以便产生含有hTRT编码序列的质粒，在hTRT编码序列的5’末端含有Kozak共有序列，在它的3’末端是IBI FLAG序列(C末端编码区)，并含有D869…＞A突变。
pGRN154构建这一载体用于在哺乳动物细胞中表达hTRT序列。将含有hTRT基因的pGRN153的EcoRI片段插入质粒pBS212的EcoRI位点，插入的方向使hTRT ORF的方向在MPSV启动子的相同方向。这产生的MPSV指导的表达质粒，表达hTRT蛋白质，该蛋白质在它的氨基酸末端含有Kozak共有序列，在它的羧基末端含有IBI FLAG，并且含有D869…＞A突变。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素/HygB/PAC。
pGRN155构建这一载体用于在哺乳动物细胞中表达hTRT序列。插入片段包括减去5’和3’UTR的hTRT的全长cDNA和Kozak序列。将来自含有hTRTcDNA的pGRN145的EcoRI片段插入p91023(B)的EcoRI位点使hTRT的方向与DHFR ORF相同。hTRTcDNA含有Kozak序列，没有3’和5’UTR。这产生了hTRT的短暂表达载体。用于这一载体的选择标记物是四环素。
pGRN156构建这一载体是用于在哺乳动物细胞中表达hTRT序列。将来自含有hTRTcDNA的D869A突变的pGRN146的EcoRI片段插入p91023(B)的EcoRI位点以致hTRT的定向与DHFR ORF的相同，hTRTcDNA含有Kozak共有序列而没有3’或5’UTR。这产生了hTRT的短暂表达载体。插入片段包括减去了5’和3’UTR的全长hTRT的cDNA和D869A和Kozak序列。用于这一载体的选择标记物是四环素。
pGRN157构建这一载体是用于在哺乳动物细胞中表达hTRT序列。将来自含有hTRTcDNA的pGRN147的EcoRI片段插入在p91023(B)的EcoRI位点以致hTRT的方向与DHFR ORF的相同。hTRTcDNA在C末端含有IBI FLAG；含有Kozak共有序列而没有3’或5’UTR。这产生了hTRT的短暂表达载体。插入片段包括减去了5’或3’UTR的全长hTRT的cDNA和IBI FLAG序列，和Kozak序列。用于这一载体的选择标记物是四环素。
pGRN158构建这一载体是用于在大肠杆菌中表达和诱变TRT序列。将来自含有hTRT ORF的pGRN151的EcoRI片段插入pBBS183的EcoRI位点使hTRT ORF的方向与Lac启动子的相反。插入片段包括减去5’和3’UTR的全长hTRTcDNA和IBI FLAG序列，和Kozak序列。hTRT编码序列是T7启动子驱动的。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素。
pGRN159构建这一载体用于在大肠杆菌中表达和诱变TRT序列。将来自含有EGFP与hTRT融合体的pGRN138的NheI-KpnI片段插入pBluescriptIIKS+的XbaI-KpnI位点。这产生了编码融合蛋白质的T7表达载体(编码序列由T7启动子驱动)。插入片段包括减去3’UTR的hTRT，它作为EGFP的融合蛋白的cDNA。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素。
pGRN160构建这一载体用于在哺乳动物细胞中表达反义hTR序列。编码序列可操作地结合MPSV启动子。将来自含有全长hTR ORF的pGRN90的XhoI-NsiI片段插入pBBS295的SalI-Sse83871位点。这产生了表达hTR反义RNA的短暂/稳定载体。在载体中掺入了GPT标记物。用于这一载体的选择标记物是Chlor/gpt/PAC。
pGRN161构建这一载体用于在哺乳动物细胞中表达有意义hTR序列。将来自含有全长hTR ORF的pGRN89的XhoI-NniI片段插入pBBS295的SalI-Sse83871位点。这产生了在有意义方向表达hTR的短暂/稳定载体。编码序列由MPSV启动子驱动。在载体中插入了GPT标记物。用于这一载体的选择标记物是Chlor/gpt/PAC。
pGRN162将来自含有全长hTR ORF的pGRN87的XhoI-NniI片段插入pBBS295的SalI-Sse83871位点。这产生了表达在有意义方向截短的hTR(从+108到+435位置)的短暂/稳定载体。
pGRN163构建这一载体用于在大肠杆菌中表达和诱变TRT序列。编码序列由T7启动子驱动。将低聚核苷酸RA45(5’-GCCACCCCCGCGCTGCCTCGAGCTCCCCGCTGC-3’)(SEQ IDNO151)用于体外诱变以便改变hTRT中的起始met成为Leu，并且在Leu的后面的两个密码子中导入Xho位点。同时，利用COD1941改变CatR到CatS，并且导入BSPH1位点，并且利用COD2866改变AmpS成为AmpR。导入FSP1位点。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素。
pGRN164构建这一载体用于在大肠杆菌中表达hTR序列。将引物hTR+15’GGGGAAGCTTTAATACGACTCACTATAGGGTTGCGGAGGGTGGGCCTG-3’和hTR+455’-CCCCGGATCCTGCGCATGTGTGAGCCGAGTCCTGGG-3’(SEQ ID NO152)用于通过PCR扩增来自含有在5’末端具有T7启动子的全长hTR(正如hTR+1)的pGRN33的片段。将PCR产物的BamHI-HindIII消化物装进pUC119的BamHI-HindIII位点。编码序列可操作地连接T7启动子。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素。
pGRN165构建这一载体用于在大肠杆菌中表达和诱变hTRT序列。编码序列可操作地连接T7启动子。将来自含有具有Kpzak前末端的hTRT ORF的pGRN145的EcORI片段插入pBluescriptIISK+的EcoRI位点，以致hTRT的方向与T7启动子的相同。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素。
pGRN166构建这一载体用于在哺乳动物细胞中表达和诱变TRT序列。编码序列可操作地连接T7启动子。将来自含有hTRT ORF的pGRN151的EcoRI片段插入pBluescriptIISK+的EcoRI位点，以致hTRT ORF的方向与T7启动子的方向相同。hTRT ORF含有Kozak前末端和IBI旗后末端。插入片段包括减去5’和3’UTR，但含有FLAG序列(Immunex，Corp，西雅图，WA)，和Kozak序列的全长hTRTcDNA。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素。
pGRN167将来自含有5’末端的hTRT ORF的pGRN144的AvRII-StuI片段插入pBBS161的XbaI-StuI位点。
pGRN168构建这一载体用于表达哺乳动物细胞中的hTRT序列的表达。将来自含有最佳化的hTRT表达盒的pGRN145的EcoRI片段插入pIND的EcoRI位点以致hTRT编码序列的方向与最小CMV启动子的方向相同。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素/新霉素/卡那霉素。
pGRN169
构建这一载体用于在哺乳动物细胞中表达反义hTRT序列。将来自含有最佳化hTRT表达盒的pGRN145的EcoRI片段插入pIND的EcoRI位点以致hTRT是在最小CMV启动子的相反方向上。hTRT克隆到来自Invitrogen的脱皮激素可诱导表达系统中。插入片段包括减去5’和3’UTR但含有Kozak序列的全长hTRTcDNA。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素/新霉素/卡那霉素。
pGRN170构建这一载体用于在哺乳动物细胞中表达反义hTRT序列。将来自含有最佳化hTRT表达盒的pGRN145的EcoRI片段插入pIND(spl)的EcoRI位点以致hTRT的方向与最小CMV的启动子相反。将hTRT克隆到来自Invitrogen的脱皮激素可诱导表达系统中。该系统含有pIND(spl)序列。插入片段包括减去5’和3’UTR但含有Kozak序列的hTRT的cDNA。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素/新霉素/卡那霉素。
pGRN171将来自pGRN163的Eco47III-NarI片段插入pGRN167的Eco47III-NarI位点，将M1L突变置于hTRT基因组cDNA的片段中。
pGRN172将来自在hTRT ORF中含有Met到Leu突变的pGRN171的BamHI-StuI片段插入pSEAP2-Basic的BglII-NruI位点。
pGRN173构建这一载体以便分析TRT序列的转录活性；特定地，这是内含子构建体可以确定是否第一个hTRT内含子具有启动子活性。将来自含有hTRT启动子区的5’末端的pGRN144的EcoRV-ECO47III片段插入pGRN172的SrfI-Eco47III位点。这产生了含有hTRT的启动子区的启动子报道质粒，该hTRT启动子区是从hTRT ORF的起始位置的上游约2.3kb到编码序列的第一个内含子后，含有Metl-＞Leu突变。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素。
pGRN174构建这一载体用于在哺乳动物细胞中表达hTRT序列，并且是可诱导hTRT表达载体。将来自含有“最佳化”hTRT表达盒的pGRN145的EcoRI片段插入pIND(spl)的EcoRI位点，以致hTRT是在最小CMV启动子的相同方向上。这产生了启动子报道质粒，含有hTRT基因的启动子区，该区是从hTRT ORF的起始位置的约2.3kb上游到编码序列的第一个内含子后。插入片段包括减去了5’和3’UTR的hTRT全长cDNA和Kozak序列。用于这一载体的选择标记物是氨苄青霉素/新霉素/卡那霉素。
从上面，可以明了本发明提供了有关大量端粒酶，端粒酶蛋白质亚单位的核酸和氨基酸序列，以及其它信息，和来自各种生物体的基序，另外提供了在除了本文叙述的那些的其它生物体中鉴定同源结构的方法。
上面的说明书中提到的所有公开物和专利引入本文作为参考。本发明叙述的方法和系统在不脱离本发明的范围和精神时的各种修饰和变化是本领域技术人员可以理解的。虽然本发明已经通过特定的优选实施方案叙述了，应该理解如权利要求要求的发明不应该限制于这些特定的的实施方案。确实，分子生物学或相关领域的技术人员明了的实施本发明的叙述的模式的各种修改是在下面的权利要求的范围内的。
权利要求
1.TRT蛋白质、或其变异体、或其片段的分离的、基本纯化的或重组蛋白质制剂。
2.分离的、基本纯化的或重组TRT蛋白质、或其变异体或其片段，所述蛋白质的特征是具有与TRT蛋白质至少75％的序列等同性的氨基酸序列，所述TRT蛋白质具有SEQ ID NO2，4-6，52，58，61，63，64，65，67，68中阐述的序列。
3.分离的TRT蛋白质，或其变异体，或其片段，所述蛋白质(i)具有约为50到150千道尔顿的计算分子量；和(ii)(a)特异地结合抗蛋白质或其免疫原性片段的抗体，这些片段具有SEQ ID NO2，4-6，52，58，61，63，64，65，67或68中阐述的序列；或(b)具有与SEQ ID NO2，4-6，58，61，63，64，65，67或68的序列的蛋白质60％的氨基酸等同性。
4.根据权利要求1到3所述的蛋白质、或其变异体、或其片段，具有SEQ ID NO2，4-6，52，58，61，63，64，65，67或68中阐述的序列，。
5.根据权利要求1到3所述的TRT蛋白质，其中TRT蛋白质通过重组手段或合成手段产生。
6.根据权利要求1到3所述的TRT蛋白质，其中TRT蛋白质是由特异地杂交SEQ ID NOS1，3，19，53，62，66或69的核酸分子编码的。
7.根据权利要求1到3所述的TRT蛋白质，其中所述蛋白质、变异体或片段具有端粒酶催化活性。
8.根据权利要求1到3所述的TRT蛋白质，其中所述蛋白质、变异体或片段不具有端粒酶催化活性。
9.根据权利要求1到3所述的TRT蛋白质片段，至少含有6个氨基酸残基。
10.分离的、合成的、基本纯化的、或重组的聚核苷酸，其含有编码TRT蛋白质或其变异体，或其片段的核酸序列。
11.分离的、合成的、基本纯化的、或重组聚核苷酸，其选自(a)具有SEQ ID NOS2，4-6，52，58，61，63，64，65，67或68中阐述的序列的DNA；(b)至少10核苷酸的与前面的DNA杂交并且编码TRT蛋白质或变异体的聚核苷酸；(c)具有编码由聚核苷酸(a)或(b)编码的多肽的序列的DNA。
12.编码TRT蛋白质的分离核酸，所述的蛋白质如下定义(I)具有50到150千道尔顿之间的计算分子量；和(ii)(a)特异地结合抗TRT蛋白质或其免疫原性片段的抗体；或(b)具有与TRT蛋白质至少60％的氨基酸序列等同性。
13.根据权利要求10-12所述的分离核酸，其中TRT蛋白质是来自Euplotes、裂殖酵母、四膜虫、Oxytrichia、小鼠或哺乳动物。
14.根据权利要求10-12所述的分离核酸，其中编码的端粒酶逆转录酶蛋白质的计算分子量约为123到127千道尔顿。
15.根据权利要求10-12所述的分离核酸，其中编码的TRT蛋白质具有与包括SEQ ID NOS2，4-6，52，58，61，63，64，65，67或68的TRT蛋白质至少80％的氨基酸序列等同性。
16.在严格条件下特异地与SEQID NO1，3，19，53，62，66，或69杂交的分离核酸。
17.编码特异地结合抗蛋白质或其免疫原性片段的抗体，并且具有SEQ ID NO2，4-6，52，58，61，63，64，65，67或68中阐述的序列的蛋白质的分离核酸。
18.具有编码TRT的至少5个邻近氨基酸的核苷酸序列的分离核酸或其变异体，所述TRT具有SEQ ID NO2，4-6，52，58，61，63，64，65，67或68中阐述的氨基酸序列。
19.具有权利要求10到18任一项所述的核酸序列的表达载体。
20.含有权利要求10到19任一项定义的聚核苷酸的细胞。
21.具有编码至少10个TRT蛋白编码核酸的核苷酸的异源基因的转染细胞。
22.已经导入外源核酸序列的转染细胞，其中的外源核酸序列在严格条件下特定地与权利要求10到18的核酸杂交，该转染细胞表达外源核酸为TRT蛋白质。
23.根据权利要求21或22所述的转染细胞，其中转染细胞是可灭的、核型正常的二倍体细胞。
24.根据权利要求21或22所述的转染细胞，其中所述的细胞起源于细菌、昆虫、植物、真菌、酵母或哺乳动物。
25.根据权利要求21或22所述的转染细胞，包含在非人动物或其子代中。
26.非人动物或其子代，其中已经导入了在严格条件下特异地杂交权利要求10到19的核酸的外源核酸序列，该动物表达外源核酸为TRT蛋白质。
27.转基因非人动物，具有编码至少10个TRT蛋白质编码核酸的核苷酸的异源基因。
28.权利要求26或27的非人动物，其中动物是小鼠。
29.根据权利要求26或27所述的非人动物，其中所述的动物含有重组TRT基因，其一个或多个密码子有别于天然存在的TRT基因。
30.根据权利要求29的非人动物，其中所述的基因具有替代、错义突变、无义突变、插入、或缺失，从而区别于天然存在的TRT基因。
31.根据权利要求26或27的非人动物，其中所述的动物是端粒酶活性缺陷的。
32.根据权利要求31所述的非人动物，其中所述的缺陷是编码具有与野生型端粒酶相比端粒酶活性减弱的端粒酶的基因引起的。
33.抗体或其结合片段，其中抗体或片段特异地结合TRT蛋白质或其免疫原性片段。
34.在免疫反应条件下与TRT蛋白质或其免疫原性片段进行特异免疫反应的抗体，所述蛋白质具有SEQ ID NO2，4-6，52，58，61，63，64，65，67，或68中阐述的氨基酸序列。
35.在免疫反应条件下特异地与TRT蛋白质或其免疫原性片段免疫反应的抗体，包括权利要求10到18的核酸编码的蛋白质。
36.至少10到10kb核苷酸长度并且含有至少10个核苷酸的邻近序列的聚核苷酸在测试或筛选TRT基因序列或TRT mRNA中的用途，所述邻近序列与天然存在TRT基因或TRT mRNA中的邻近序列相同或准确互补。
37.聚核苷酸在制备重组寄主细胞中的用途，所述聚核苷酸是至少10到10kb长度的核苷酸，并且含有至少10个核苷酸的邻近序列，所述邻近序列与天然存在的TRT基因或TRT mRNA的邻近序列相同或准确互补。
38.确定化合物或治疗是否是TRT活性或表达的调节物的方法，包括在给药该化合物或治疗后检测细胞、动物、或含有TRT重组蛋白质或聚核苷酸的组合物中活性或表达的变化。
39.确定测试化合物是否是TRT活性的调节物的方法，所述方法包括下述步骤(a)将权利要求1到9的TRT蛋白质与测试化合物接触；和(b)测量TRT蛋白质的活性，其中存在测试化合物时测量的TRT活性与缺乏测试化合物时的活性相比的变化提供了确定测试化合物调节端粒酶逆转录酶活性的指标。
40.制备重组端粒酶的方法，所述方法包括将权利要求1到9的重组TRT蛋白质与端粒酶RNA成分在各种条件下接触，以使所述的重组蛋白质和所述的端粒酶RNA成分结合形成能够催化端粒酶底物中核苷酸的加入的端粒酶。
41.检测样品中TRT基因产物的方法，包括(a)将样品与探针接触，该探针特异地结合基因产物，其中探针和基因产物形成复合物，并且检测该复合物；或(b)特异地扩增生物样品中的基因产物，其中所述的基因产物是核酸，并且检测该扩增产物；其中复合物或扩增产物的存在是与生物样品中TRT基因产物的存在相关。
42.检测包括人细胞的生物样品中的至少一个端粒酶阳性人细胞的存在的方法，所述的方法包括下述步骤(a)测量所述的样品中TRT基因产物的量，(b)将测量的量与相应于缺乏端粒酶阳性细胞的样品的对照值比较，其中所述样品中与所述对照值相比存在较高水平的TRT基因产物与生物样品中存在端粒酶阳性细胞有关。
43.诊断哺乳动物中端粒酶相关状况的方法，包括(a)从哺乳动物获得细胞或组织样品；(b)在细胞或组织中确定TRT基因产物的量；和(c)将细胞或组织中TRT基因产物的量与相同生物类型的健康细胞或组织中的量比较；其中来自哺乳动物和健康细胞或组织的样品中TRT基因产物的不同量是端粒酶相关状况的诊断特征。
44.通过增强细胞中TRT的表达增强脊椎动物细胞体外增殖能力的方法。
45.在用于治疗脊椎动物细胞的增殖能力增强的症状的药剂的制造中，增强TRT的表达或活性的试剂的用途。
46.权利要求45中定义的用途，其中所述药剂是用于抑制老化效果。
47.包括可接受载体和权利要求1到9的TRT蛋白质、变异体或片段，权利要求33到35的TRT抗体或结合片段，如权利要求10到18定义的编码TRT蛋白质、变异体或片段的聚核苷酸，或编码TRT蛋白质或其亚序列的核酸的药物组合物。
48.在治疗哺乳动物细胞内端粒酶活性水平升高相关的症状的药剂的制造中端粒酶表达或活性的抑制剂的用途，所述的抑制剂是权利要求10到9的聚核苷酸或权利要求1到8的多肽或利用上述任何一种物质发现的化合物。
49.权利要求1到9任一项所述的蛋白质、变异体或片段用作药物。
50.权利要求1到9任一项所述的蛋白质、变异体或片段在药剂的制造中的用途。
51.权利要求1到9任一项所述的蛋白质、变异体或片段在抑制老化或癌症的影响的药剂的制造中的用途。
52.用作药物的权利要求10到18的聚核苷酸或片段。
53.在药剂的制造中权利要求10到18的聚核苷酸或片段的用途。
54.权利要求10到18的聚核苷酸或片段在抑制老化或癌症的影响的药剂的制造中的用途。
55.根据权利要求51和54的用途，其中药剂对老化的抑制作用增大了药剂给药的细胞或动物的生命期。
56.在生物样品中检测编码至少TRT的一部分的聚核苷酸序列的存在的方法，包括步骤a)提供i)怀疑含有对应于TRT的聚核苷酸序列的核酸的生物样品；ii)含有能够与来自生物样品的端粒酶逆转录酶杂交的TRT的核苷酸序列或其片段的探针；b)在一定条件下合并含有所述的核酸的生物样品与所述的探针，以使在所述的核酸和所述的探针之间形成杂交复合物和c)检测所述的杂交复合物。
57.权利要求56所述的方法，其中所述的生物样品中的核酸是核糖核酸。
58.权利要求56所述的方法，其中所述的被检测的杂交复合物与所述的生物样品中TRT的表达相关。
59.权利要求56所述的方法，其中在所述生物样品中的所述核酸是脱氧核糖核酸。
60.权利要求56所述的方法，其中所述杂交复合物的检测包括检测所述生物样品中的TRT的核苷酸序列中的变化。
61.在药剂的制造中含有纯化的反义核苷酸的聚核苷酸或片段的用途，其中的反义核苷酸具有与权利要求10到18的TRT聚核苷酸的至少一部分互补的核酸序列。
62.权利要求61的用途，其中聚核苷酸或片段具有与SEQ IDNO1，3，19，53，62，66或69中阐述的核酸序列互补的核酸序列。
63.权利要求61的用途，其中聚核苷酸插入在重组表达载体中。
64.生产含有由权利要求10到18的核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽的方法，该方法包括在适于表达编码多肽的条件下培养含有权利要求10到18的核苷酸序列的寄主细胞。
65.权利要求64的方法，进一步包括将多肽分离或纯化的步骤。
66.在生物样品中检测TRT的表达或存在的方法，包括下述步骤a)提供i)怀疑表达TRT蛋白质的生物样品；和ii)权利要求33到35的抗体；b)合并所述的生物样品和所述的抗体，以形成抗体/TRT蛋白质复合物；和c)检测所述的复合物，其中所述的复合物的存在与所述的生物样品中所述的TRT的表达或存在相关。
67.基本纯化的多肽，含有选自包括SEQ ID NO4-6的氨基酸序列的至少一部分，或其变异体、或其片段。
68.权利要求67所述的多肽，其中所述的多肽的所述部分包括SEQ ID NO4-6的片段，具有大于6个氨基酸的长度。
69.权利要求67所述的多肽序列，其中所述的变异体是起源于人细胞的同系物。
70.编码权利要求67所述的多肽、或其变异体或其片段的分离的聚核苷酸序列。
71.权利要求70所述的聚核苷酸序列，包括SEQ ID NO3的核酸序列的至少一部分，或其变异体，或其片段。
72.权利要求70所述的聚核苷酸序列，其中所述聚核苷酸的所述部分包括SEQ ID NO3的片段，具有大于10个核苷酸的长度。
73.根据权利要求70所述的聚核苷酸序列，其中所述的变异体是起源于人细胞的同系物。
74.端粒酶复合物，包括i)纯化的TRT蛋白质亚单位，或其变异体；ii)纯化的43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位或其同系物，或其变异体，和iii)纯化的端粒酶的RNA。
75.权利要求74所述的端粒酶复合物，其中所述的TRT蛋白质亚单位是从Euplotes aediculatus获得的。
76.权利要求74所述的端粒酶复合物，其中所述的TRT蛋白质亚单位是由SEQ ID NO1编码的。
77.权利要求74所述的端粒酶复合物，其中所述的端粒酶复合物具有全部或部分端粒酶活性。
78.权利要求74所述的端粒酶复合物，其中所述的端粒酶复合物能够复制端粒DNA。
79.权利要求74所述的端粒酶复合物，其中所述的43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位同系物或变异体起源于人细胞。
80.包括权利要求1到8所述的TRT蛋白质和RNA的组合物。
81.权利要求80所述的组合物，其中所述的RNA是端粒酶RNA(TR)。
82.权利要求80所述的组合物，其中TRT蛋白质和TR形成具有全部或部分端粒酶活性的核糖核蛋白复合物。
83.包括TRT和TR的基本纯化的端粒酶。
84.权利要求83所述的端粒酶，至少具有95％的纯度。
85.权利要求83所述的端粒酶，已经从细胞中分离。
86.分离的TRT多肽，它包括的氨基酸序列包括选自包括下面序列的邻近氨基酸序列的基序 a)AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-AA9-AA10-AA11-AA12-AA13；b)AA14-AA15-AA16-AA17-AA18AA19-AA20-AA21-AA22-AA23-AA24-AA25-AA26；c)AA27-AA28-AA29-AA30-AA31-AA32-AA33-AA34-AA35-AA36，d)AA37-AA38-AA39-AA40-AA41-AA42-AA43-AA44；and，e)AA45-AA46-AA47-AA48-AA49-AA50-AA51-AA52，其中AA1是疏水氨基酸或半胱氨基酸；AA1是任何氨基酸；AA3是任何氨基酸；AA4是疏水氨基酸或天冬氨酸；AA5是天冬氨酸；AA6是疏水氨基酸或酪氨酸；AA7是任何氨基酸；AA8是任何氨基酸；AA9是任何氨基酸；AA10是疏水氨基酸或酪氨酸；AA11是任何氨基酸；AA12是任何氨基酸；AA13是疏水氨基酸；AA14是疏水氨基酸，谷氨酰胺，精氨酸，或甘氨酸；AA15是任何氨基酸；AA16是任何氨基酸；AA17是任何氨基酸；AA18是任何氨基酸；AA19是任何氨基酸；AA20是谷氨酰胺；AA21是甘氨酸；AA22是任何氨基酸；AA23是任何氨基酸；AA24是任何氨基酸；AA25是丝氨酸；AA26是任何氨基酸；AA27是疏水氨基酸，组氨酸或酪氨酸；AA28是任何氨基酸；AA29是任何氨基酸；AA30是任何氨基酸；AA31是疏水氨基酸或苏氨酸；AA32是天冬氨酸；AA33是天冬氨酸；AA34是疏水氨基酸或酪氨酸；AA35是疏水氨基酸，酪氨酸或赖氨酸；AA36是疏水氨基酸；AA37是甘氨酸；AA38是疏水氨基酸或半胱氨酸；AA39是任何氨基酸；AA40是疏水氨基酸，赖氨酸，或苏氨酸；AA41是任何氨基酸；AA42是任何氨基酸；AA43是任何氨基酸；AA44是赖氨酸；AA45是疏水氨基酸，半胱氨酸，丝氨酸，或酪氨酸；AA46是任何氨基酸；AA47是疏水氨基酸，色氨酸，丝氨酸，或酪氨酸；AA48是任何氨基酸；AA49是甘氨酸；AA50是疏水氨基酸或酪氨酸；AA51是任何氨基酸；和AA52是疏水氨基酸或精氨酸或谷氨酰胺。
87.权利要求86所述的TRT多肽，包括含有邻近氨基酸的基序的氨基酸序列，所述邻近氨基酸包括AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-AA9-AA10-AA11-AA12-AA13
88.权利要求87的TRT多肽，其中AA1是疏水氨基酸，或半胱氨酸；AA2是任何氨基酸；AA3是苏氨酸，赖氨酸，酪氨酸，或谷氨酸；AA4是疏水氨基酸或天冬氨酸；AA5是天冬氨酸；AA6是疏水氨基酸或酪氨酸；AA7是谷氨酸，赖氨酸，或甘氨酸；AA8是任何氨基酸；AA9是半胱氨酸或丙氨酸；AA10是疏水氨基酸，酪氨酸或苯丙氨酸；AA11是天冬氨酸或苯丙氨酸；AA12是丝氨酸或苏氨酸；和AA13是疏水氨基酸。
89.权利要求88所述的TRT多肽，其中AA1是苯丙氨酸；AA2是任何氨基酸；AA3是苏氨酸或赖氨酸；AA4是甲硫氨酸，苯丙氨酸，缬氨酸；AA5是天冬氨酸；AA6是异亮氨酸或缬氨酸；AA7是谷氨酸或赖氨酸；AA8是任何氨基酸；AA9是半胱氨酸或丙氨酸；AA10是酪氨酸；AA11是天冬氨酸；AA12是丝氨酸或苏氨酸；和AA13是异亮氨酸或缬氨酸。
90.权利要求86到89所述的TRT多肽，其中多肽是通过重组手段产生的。
91.编码权利要求86到89所述的多肽的分离的核酸或其变异体。
92.分离的、基本纯化的、或重组TRT多肽，所述多肽的特征是具有下述氨基酸序列Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8-9-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp其中X是任何氨基酸，下标指连续的残基的数目，R1是亮氨酸或异亮氨酸，R2是谷氨酰胺或精氨酸，R3是苯丙氨酸或酪氨酸，和R4是赖氨酸或组氨酸。
93.编码TRT多肽的分离的、基本纯化的或重组核酸，所述多肽的特征是具有下述氨基酸序列Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8-9-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp其中X是氨基酸，下标指连续的残基的数目，R1是亮氨酸或异亮氨酸，R2是谷氨酰胺或精氨酸，R3是苯丙氨酸或酪氨酸，和R4是赖氨酸或组氨酸。
94.含有具有邻近氨基酸的基序的氨基酸序列的分离的TRT多肽，所述邻近氨基酸的基序选自包括下面基序的组图55的基序T，图55的基序1，图55的基序2，图55的基序A，图55的基序B’，图55的基序C，图55的基序D，和图55的基序E。
95.含有具有邻近氨基酸的基序的氨基酸序列的分离的TRT多肽，所述邻近氨基酸的基序选自包括下面基序的组基序T，包括W-X12-FFY-X-TE-X10-11-R-X3-W-X7-I；基序T′，包括序列E-X2-V-X；基序1，包括序列X3-R-X2-PK-X3；基序2，包括序列X-R-X-I-X；基序A，包括序列X4-F-X3-D-X4-YD-X2；基序B’，包括序列Y-X4-G-X2-QG-X3-S-X8；和基序C，包括序列X6-DD-X-L-X3；其中X是任何氨基酸，X2是任何两个氨基酸，X3是任何三个氨基酸，以此类推。
96.含有具有下面序列的氨基酸序列基序的分离的TRT多肽W(L/I)XXXXhhXhh(Q/R)XFFYXTEXXXXXXXXXX(F/Y)(F/Y)RXXXWXX(L/I)XXhXIXXXX(K/M)其中X是任何氨基酸，h是疏水氨基酸。
97.含有具有序列FFYXTE的氨基酸序列基序的分离的TRT多肽，其中X是任何氨基酸。
98.含有具有序列hRhIPKK的氨基酸序列基序的分离TRT多肽，其中h是疏水氨基酸。
99.含有具有序列hXXXXhRhIPKK的氨基酸序列基序的分离的TRT多肽，其中h是疏水氨基酸，其中X是任何氨基酸。
100.含有具有序列P(K/E)(K/L)(Y/F)FhXhDh的氨基酸序列基序的分离的TRT多肽，其中h是疏水氨基酸，其中X是任何氨基酸。
101.含有具有序列KXYXQXXGIPQGSXLSXhLXXhXYXDL的氨基酸序列基序的分离的TRT多肽，其中h是疏水氨基酸，和其中X是任何氨基酸。
102.含有具有序列(L/I)L(R/K)(L/V)XDD(F/Y)Lh(I/V)(T/S)的氨基酸序列基序的分离的TRT多肽，其中h是疏水氨基酸，其中X是任何氨基酸。
103.含有具有序列(NH2)-X300-600-W-X12-FFY-X-TE-X10-11-R-X3-W-X7-I-X5-20-E-X2-V-X-X5-20-X3-R-X2-PK-X4-10-R-X-I-X-X60-80-X4-F-X3-D-X4-YD-X2-X80-130-Y-X4-G-X2-QG-X3-S-X8-X5-35-X6-DD-X-L-X3-X10-20-X12-K的氨基酸序列基序的分离的TRT多肽，其中h是疏水氨基酸，其中X是任何氨基酸。
104.权利要求92到103的多肽，其含有天然存在TRT蛋白质的氨基酸序列。
105.权利要求104的TRT蛋白质，其选自包括Euplotes、四膜虫、裂殖酵母、Oxytricha、小鼠和哺乳动物的生物体的组。
全文摘要
本发明涉及新的端粒酶核酸和氨基酸。特别是,本发明涉及编码包括Euplotes aediculatus的123千道尔顿和43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的各种端粒酶蛋白质亚单位和基序的核酸和氨基酸序列,和来自裂殖酵母、酵母序列和人端粒酶的相关序列。本发明同时涉及含有这些端粒酶蛋白质亚单位的多肽,以及含有这些亚单位的功能多肽和核糖体蛋白质。
文档编号G01N33/566GK1254376SQ97199534
公开日2000年5月24日 申请日期1997年10月1日 优先权日1996年10月1日
发明者托马斯·R·切赫, 约阿希姆·林纳, 托鲁·纳卡穆拉, 卡伦·B·查普曼, 格雷格·B·莫林, 卡尔文·B·哈利, 威廉·H·安德鲁斯 申请人:杰龙公司, 大学技术公司