专利名称：：分析方法及其所用的装置的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种改进的分析方法及其所用的装置，尤其涉及滴定方法和装置。许多化合物都具有随其物理或化学环境而变化的物理化学性质，可通过改变物理化学环境并观测环境对待测化合物的影响来研究这些性质。这些性质的实例是电离状态、溶解度、在例如有机相和水相之间的分配、或向胶束或脂质体中的分配、配位链或金属结合作用的强度和疏水性，它们可随一些环境参数例如pH、离子强度或系统中其它物质的浓度而变化。研究化学分子或生物分子性质的分析化学家长期以来就把滴定看成是其行业中的主要工具，因为它能通过滴加一种或多种试剂来改变系统的一个参数，例如溶液的pH，而系统的其它参数基本上保持不变，它能单独地有效研究变化的影响。可通过滴定测定的性质的实例是化合物可电离基团的pKa(或离解常数)，pKa可定义为该基团的50％发生电离的pH。在准确地知道pKa时，就可直接计算在任一pH下指定可电离基团的电离程度。如果一个指定分子包含一个以上的可电离基团，该分子就具有多个pKa。由于一个分子的电离状态可以改其它的性质，例如疏水性和水溶性，所以了解潜在药物分子的pKa是非常重要的。到目前为止，由于传统的滴定技术方面的困难，一直未能充分地利用pKa资料。下文将对属于测试化合物的物理化学性质的范围内讨论一般的原理和方法。为了简化起见，在讨论pKa时假定分子只有一个可电离基团，因此只有一个pKa，然而这些讨论将同样适用于具有多个pKa的分子。还将具体地描述多个pKa的存在具有非常重要的场合。传统的滴定方法具有许多缺点。它们很慢，每个每天能测定的样品数非常少。费力大，在取读数之前，滴加每滴试剂后都要停一会，等混合物平衡。常规方法的准确度受加入液滴大小的限制，而液滴的大小又随操作人员的经验而异，而且，由于加入的每一滴试剂都会稀释待测样品，所以待测化合物的浓度也发生了改变。此外，标准的滴定方法需要待测化合物的量较大，例如，如果滴定分析是要测定一种化合物的pKa，并用紫外分光光度计进行监测，则可能需要1mg待测化合物，如果同样的分析用pH计监测，则可能需要3mg以上的化合物。分光光度滴定一般不是自动的，而电位滴定是自动的，即使最近在自动化方面的尝试已提供一些缓慢的(每天1-5种化合物)、连续的方法，可并未排除需要一个有经验的试验室技术员在场。Yarnitzky(亚尼茨基)叙述了一种自动滴定系统(仪器科学和技术，Vol.23(2)，91-102(1995))，该系统采用二个蠕动泵、一个混合蛇管和二个三通阀门。该系统要求泵驱动器准确匹配，采用电导或电位检测，并需要补偿由泵引起的管路损耗、混合蛇管的延迟和检测器的响应时间。Ando(安托)和Heimbach(海姆巴赫)(药物和生物医学分析杂志，16(1997)，31-37)叙述了采用高性能液相色谱(HPLC)仪器作为混合器和泵，将一系列分别缓冲到不同pH的样品送入分光光度检测器中。在制药工业中，和在化学的其它分支中一样，目前向组合化学和重组遗传工程的发展趋势，正在越来越快地产生越来越多的新化合物。在制药工业上，需要迅速评价这些新化合物作为潜在药物的适宜性。可能每天需要测定几百个pKa。可用于检测的每种化合物的量可能是非常少的。因此需要有比较灵敏的方法，为了提高分析数量，优选易自动化的方法，和优选能由未经专门训练的试验室化学家来操作的方法。因此，本发明提供一种连续的滴定方法，当混合物的组成连续变化时，采用这种方法可以监测待测混合物中至少一种化合物的至少一种参数。连续变化的特性是改变混合物中一种或多种物质或成分的浓度，例如优选这些物质或成分的浓度连续线性的增高或降低。在本方法中，把至少二种流体的液流连续地混合成一个流过分光光度检测区的待测混合物液流。通过改变组成待测混合物成分液流的相对比例，使进入检测区的混合物中至少二种成分液流的体积比可随时间连续地变化。优选把三种或多种成分流体的液流连续地混合成待测混合物液流，通过改变它们组成待测混合物的相对比例，使这些成分液流中二种液流的体积比随时间连续地变化。在传统的电位和电导滴定中，检测器的响应时间经常是速度限制步骤。采用分光光度检测能大大地加速滴定过程，本发明优选分光光度检测。本方法还有另一个优点，由于不是逐滴地加入溶液，而是以变化的比例连续地混合溶液，所以准确度不再受加入液滴大小的限制。此外，由于混合是连续的，没有加入每滴后等待混合物平衡的时间，所以可明显地加快分析过程。因而限制步骤可能是通过所用的泵、混合器和导管可能达到的流量。本方法的另一个优点是能较好地利用在检测器上的数据应答速率，在现代仪器，例如在具有固定几何形状镜片的二极管阵列分光光度检测器中，数据应答速率非常高，例如每秒可取100个读数，然而在实用的实施方案中，每秒可取10-30个读数，例如每秒取20个读数。数据应答速度高，就能选择“数据修匀”或减噪。例如如果每秒取20个读数，可将这些读数按10个一组平均，提供的有效采样速率为每秒2个。这种平均可提供比常规分光光度检测更灵敏的检测方法。因此，在某些实施方案中，本发明提供一种连续滴定的方法，其中使包含待测化合物的流动的流体流与至少一种附加的流动的流体流混合，形成待测混合物液流并使待测混合物液流优选以恒定的流量流过分光光度检测区，在该区读取与待测化合物的至少一种物理或化学参数有关的读数。优选待测混合物液流是由三种流体成分混合组成的第一种包含待测化合物，优选其体积占待测混合物液流总体积的百分数保持不变。因而混合物液流中该测化合物的浓度也保持不变。优选第二种和第三种成分的体积％可互相成反比例变化，另一种成分的体积％升高时，另一种成分的体积％就下降，以保持混合物的总体积恒定。可变的成分可包括缓冲剂溶液、溶剂、检测试剂、有机相和水相、或其它流体成分，这些成分可彼此相对改变，以改变待测化合物的物理或化学环境。在待测混合物中还可包含另一些流体成分，其体积是恒定的或可变的。例如可采用盐溶液保持所选择的离子强度，可加入指示剂或可调节水(或其它溶剂)量来补偿其它流体成分体积发生的变化。在特别优选的实施方案中，可变的成分包括二种线性化的缓冲剂-即其相对比例可改变的二种缓冲剂，以产生线性的pH梯度。要求这些缓冲剂由同一种化合物的酸式和碱式盐一类的成分组成，使混合物的总化学组成在滴定过程中保持不变，也不引入其它种类的离子。这种化学环境的一致性为预测引入滴定系统的化合物行为提供一种手段，因为如果化学环境发生明显地变化，某些化合物的行为能发生改变，在罕见的情况下，甚至会导致化合物以固态盐的形式从溶液中沉淀。因此，在一个实施方案中，其中待测化合物的pKa是要被测定，待测混合物液流由三种成分组成体积恒定的样品溶液和体积彼此按反比变化的二种线性化的缓冲剂溶液。在改变缓冲剂的比例，以产生线性pH梯度，测定吸光度(在一种或多种波长下，至少其中之一是在此波长下电离形式和未电离形式的化合物吸光度不同)。待测化合物的pKa是吸光度变化中点的pH。如果待测化合物具有一个以上的可电离基团，就可观测到一处以上的吸光度变化。因而第二处变化的中点就相应于第二个可电离基团的pKa。在第二方面，本发明提供一种分析装置，其包括至少二个与公共通道流体相通的入口和一个具有与公共通道流体相通的入口和出口的检测区，该装置还包括一个分光光度检测器，用于监测流过检测区的流体并产生关于该流体成分的至少一种化学或物理特性的数据。可将控制装置与二个入口联接，控制通过每个入口加入公共通道的流体的相对量。检测器可以是任一种适宜的分光光度(即检测辐射的)分析检测器，例如紫外或可见光范围的分光光度计、荧光计、旋光计、比色计或光散射、光旋转或圆形二色性检测器。控制通过每个入口加入到公共通道的流体的相对量的控制装置，可以是例如通常与HPLC仪器一起使用的那种泵控制器。采用另一种方案，一个或多个入口与注射器连接，可利用注射器通过入口将流体加入公共通道，这些注射器的柱塞能在例如计算机的控制下机械移动。有经验的人员能设想出一些其它装置，可利用这些装置来控制流体向公共通道的加入，以能控制构成待测混合物的各流体的比例和待测混合物沿公共通道流过检测区的流量。采用基于在HPLC仪器中采用的那些注射器泵或泵混合器与小口径导管和微量分析检测器例如具有固定几何形状镜片的分光光度计串联，意味着可以采用体积非常小的待测混合物。因此，所需待测化合物的量比传统的滴定法所需的量少。特别是自动注射器，具有死体积小(避免了隔离泵的死体积)和自动化容易编程的优点。在一个优选的实施方案中，HPLC混合器泵与待测混合物每一种流体成分的贮存容器连接。混合器泵以恒定流量吸取包含待测化合物的流体，并将其与在逐渐增高的流量下泵送的第一种缓冲剂溶液和在逐渐降低的流量下泵送的第二种缓冲剂溶液混合，使所得混合物的总体积和总流量保持不变，但流动的混合物的每种成分的相对量随时间而改变。在混合物中二种线性化缓冲剂溶液比例的变化，优选引起作为整体的混合物pH的变化，并按所需控制所述比例的变化，使pH随时间发生线性变化。可以采用这样的系统测定例如待测化合物的pKa。在另一个实施方案中，自动采样器的转盘包含许多溶解的待测化合物的贮存容器和许多自动注射器，每个注射器都包含待测混合物的一种另外流体成分例如第一和第二种缓冲剂溶液的贮存容器。然后将第一种缓冲剂溶液在逐渐增加的流量下从第一个自动注射器泵送入混合室，并在逐渐降低的流量下将第二种缓冲剂溶液泵送入混合室，使所得混合物的总体积和总流量保持不变，但流动的混合缓冲剂液流的每一种成分的相对量都随时间而变化。混合物中二种线性化缓冲剂溶液比例的变化，优选引起整体混合物pH的变化，而且按所需控制比例的变化，使pH随时间发生线性变化。自动采样器吸取包含一种待测化合物的流体样品，并以恒定的流量将其注入混合的缓冲剂液流中，形成流过检测器的待测混合物液流。可以采用这样的系统测定例如待测化合物的pKa。为了制备待测混合物而混合的各种流体的性质和数目，取决于所要进行的分析。例如，如果要测定分子的分配系数，包含待测化合物的流体加入装置的流量可保持恒定，分子将在其中分配的二相的流量可以改变，优选以反比和线性地改变。可采用的相分配流体的实例包括水包油型乳浊液或水溶剂包其它有机溶剂在水相溶剂中的乳浊液(例如水中的辛醇)、表面活性剂胶束(例如十二烷基硫酸钠(SDS)胶束)和磷脂，例如DMPC脂质体，但有经验的人员能根据本人的知识选择适合待测化合物的适宜的混合物。采用另一种方案，可按照上面讨论的方法制备pH呈线性梯度的待测混合物液流，并使其与流动的有机相(例如辛醇)液流接触，例如采用由CRL(与EMIGroupplc联合的中央研究实验所)和BNFL(英国核燃料有限公司)开发的微量化学处理装置。这种装置专门用于使水相和有机相在流动中互相接触，然后完全分离。详细情况可在“Eureka(龙雷卡)，传输技术”1997年10月，第42页上找到。可根据与有机相接触和未与有机相接触的待测化合物的pKa差值来计算分配系数。如果要测定的参数是待测化合物与第二种分子或其它试剂的结合系数，则其比例要改变的流体可包含一种或二种其本身结合的试剂，和/或用于控制混合物离子强度和/或pH的盐溶液或缓冲剂。例如可用上面讨论的方法，以待测混合物的恒定的比例加入待测的溶质。不是通过例如混合二种缓冲剂使pH随时间变化，而是在溶质存在下用水或相关的溶剂滴定所研究的配位体，因此给出连续的，优选线性的配位体浓度梯度。这种系统的一个实例是镍(II)乙二胺。采用本发明的方法和装置能够研究的可能的相互作用，包括在酶和它们的基质或辅因子、螯合剂和金属离子、受体和它们的兴奋剂或拮抗剂、抗体和它们的抗原之间的相互作用，或以任何络合或特定结合对形式的相互作用强度。可采用传统的方法分析所产生的数据。这种方法可能比其它方法有利，因为不需要校正稀释倍数。如果正在研究化合物在不同溶剂中的溶解度，则可调节二种或多种不同溶剂的浓度并观测其对待测化合物的影响。有经验的人员会很容易地发现一些其它的实例。在某些实施方案中，可用能以高精度和准确度输送非常小体积的其它泵送系统代替上面讨论的自动注射器、或贮存容器和混合器泵。其它适宜的泵送系统包括蠕动泵(尽管，这些泵可造成被泵送混合物的脉动)和在微型导管中的数字开-关阀泵。当然，该装置也可包括二种或多种不同类的泵。在不采用混合器泵的场合，需要采用某些足以混合待测混合物液流成分的其它装置，例如混合蛇管、T形管混合器或螺旋混合器。如上面所讨论的，在分子具有单一的可电离基团，且电离和未电离的形式又具有不同的紫外吸收光谱的场合，在电离和未电离形式的混合物从电离占优势发展到未电离占优势时，将检测出吸收的变化(反之亦然)。见图11的概括性示意图，对于具体的实施例，见图14和15。对于这种单个的可电离基团，相应于吸光度变化中点的pH为该化合物的pKa(50％的分子发生电离的pH)。可采用曲线拟合法或对pH取吸光度读数一阶导数的方法确定该曲线的中点(拐点)，一阶导数的峰值相应于拐点。应用一阶导数曲线能够确定位置靠近pH梯度二端的pKa，因为pH梯度只需经过很短的距离就能通过一阶导数曲线达到顶峰又开始下降的拐点。与此相反，只有能在迹线上看到最低和最高吸光度时，才能很容易地确定曲线拟合法的吸光度迹线上的拐点，正如从图11上所看到的，这要求pH梯度的跨度较长。对于一步电离的过程，在拐点或在一阶导数曲线峰值的pH与pKa是等价的，Irving(欧文)等人在“分析家”80，83-94(1955)中提出采用一阶导数的方法确定包括二步电离过程的pKa值。然而，这种方法向二个以上的电离步骤推广，在代数学上是很复杂的。另一种数据分析方法是目标因式分析(TFA)。可用TFA根据在滴定过程中在不同时间点(不同pH)记录的多波长吸收光谱推导出pKa值。采用主要成分分析(PCA-参见D.Perez-Bendito(佩雷斯-本迪托)，“分析家”，Vol.115，689-698(1990)和E.R.Malinowski(马利诺斯基)，“化学中的因式分析”，第二版，1991，Wiley出版社，纽约)将吸光度数据矩阵Ns(吸收光谱)×Nw(波长)分解成主要成分的线性组合，并在假定的反应模型(如上述的马利诺斯基)基础上，通过采用TFA进行数学解转换，将这些成分视为一个。Allen(艾伦)R.I.等人在“药物和生物医学分析杂志”，1998，vol.17，699-712中结出在测定药物化合物pKa方面应用TFA的实例，在Tam(塔姆)，K.I.和(Tacacs-Novak(塔卡克斯-诺瓦克)，K.提交的“药物研究”中可以找到这种方法与上面讨论的一阶导数分析的比较。采用下述适宜缓冲剂的连续滴定方法能在很宽的pH范围内产生迅速的pH线性梯度。这反过来又能加速pKa值的测定。除了分光光度检测器外，一般还会为分析装置配上pH计，以便能对时间或对pH测定吸光度。然而，如果pH梯度的速度很快，pH电极不能足够快地响应，产生的读数会有误差。在这种情况下，可采用已知pKa的化合物来校准梯度。标准化合物的已知pKa，对采用连续滴定方法对这种化合物得到的吸光度曲线的一阶导数峰最大值时间的线性回归，产生一条校准曲线，利用这条校准曲线可不经pH测定就能确定未知化合物的pKa。测定待测化合物通过相同梯度的“峰最大值时间”，并从校准曲线上读出pKa。由于方便，这个“峰最大值时间”可从装置循环的开始或从梯度的开始测定，重要的准则是，涉及相同的梯度的所有标准化合物和待测化合物采用一致的起始时间。虽然采用梯度校准来代替直接的pH测定，但可将pH电极作为一种诊断工具安装好，例如用来校核仪器的操作，例如检查pH梯度是否保持线性。本发明对分析溶解性差的化合物是特别有利的，因为只需要非常低的溶液浓度和非常小的溶液体积，即100-10μg/ml和100μl，而不是传统方法的100ml。此外，采用高灵敏度检测器与高的数据应答速率相结合能够引入减噪技术和装置，所以可以采用浓度低得多的待测溶液。而且，不必知道待测化合物的浓度，因为输出可用曲线来表示，例如吸光度的变化不是用绝对值标绘出来，而是用表示待测化合物电离状态、相或其它变化的图形形状变化表示出来。只要浓度能使发色团可被分光光度计检测出来就足够了。在近代，分析化学家一直在处理组合化学库中产生的化合物，这已导致日渐减少的待测化合物的数目日益增多的问题。如上所述，本发明提供一些有助于解决这些问题的方法和装置。当一些化合物作为库中的一部分被合成后，还可能有涉及样品纯度的问题，采用本文所述的连续滴定方法所能达到的自动化水平还可提供解决那些问题的手段。例如可能有将HPLC色谱分离与连续滴定“连锁”的场合，使采用HPLC仪器纯化的样品收集在自动采样器的管形瓶内，以便直接注入本文所述连续滴定装置的待测混合物液流中。不需操作人员干预。此外，如果HPLC仪器和连续滴定装置的循环时间是一致的，就存在将被纯化的库化合物的峰值部分直接转入连续滴定装置的待测混合物液流中的范围。下面参照附图通过最适宜的实施例说明本发明具体的实施方案，其中图1是根据本发明第一个实施方案的装置示意图；图2是根据本发明第二个实施方案的装置示意图；图3是图2装置的管路连接示意图；图4是图2装置的电接线示意图；图5是控制图2装置的电触发动作示意图；图6是说明图2装置接线板接线的详图；图7是根据本发明第三个实施方案的装置示意图；图8是根据本发明第四个实施方案的装置示意图；图9是图8的装置检测器接线示意图；图10是描述图8的装置自动采样器控制程序的流程图；图11是具有单个可电离基团物质的pKa、吸光度和吸光度一阶导数之间关系的示意图，其中电离和非电离的形式有不同的吸光度分布。图12示出对已知pKa的化合物根据按照本发明获得的滴定数据推导的标准(校准)曲线；图13是线性梯度的pH-时间曲线；图14是涉及图13梯度的4-氰酚的吸光度曲线；图15是标绘在图14中的吸光度读数的一阶导数曲线；图16是终点滴定的吸光度曲线(实施例4)；图17是终点滴定的校准曲线(实施例4)；图18是对产生图12标准(校准)曲线的线性梯度的pH对酸％的曲线；图19是终点滴定的校准曲线(实施例5)；图20是络合滴定的校准曲线(实施例6)；图21-24示出曲线拟合法作为数据处理方法的应用；图25是对10种化合物采用图8的装置测定的pKa对文献pKa值的曲线；图26是对另外10种化合物采用图8的装置测定的pKa对文献pKa值的曲线；和图27是对35种化合物采用图8的装置测定的pKa对文献pKa值的曲线。实施例实施例1A.图1和2的装置在第一个实施方案中，分析装置是由试验室中现有的设备组装的，它由以下单元组成GilsonAspecXL自动采样器；HewlettPackard1050四道HPLC泵；Kontron440二极管阵列检测器(DAD)分光光度检测器；66MHz486PC计算机，带有草莓树数据采集插件(StrawberryTreeDataacquisitioncard)；Dynares8超(+71-TC)接线板；Dasylab软件，用于数据收集；PEEK导管(外径(OD)1/16″)。在图1和2中可以看到该装置二种配置的示意图，下面采用在图2的配置中各单元之间的导管连接(示于图4)和电接线(示于图5)对其做进一步地说明。缓冲系统的改进最初开发的缓冲系统采用四种溶液混合形成线性的梯度(图1)。用酸(如图1所示)或碱滴定体积％恒定的样品，盐溶液的体积％随酸或碱的增加而下降，保持离子强度在可接受的限度内。该系统是由体积％不变的缓冲剂溶液缓冲的。缓冲系统的改进已将其减少到三种成分一种样品溶液，其量不随梯度经过的时间而改变，二种线性化的缓冲剂溶液，一种是酸性的，一种是碱性的，它们互相以反比随时间呈线性变化。见图2。图2装置的操作在试求梯度的过程中，以恒定的流量将包含待测化合物的样品从自动采样器吸入HP1050泵的通道A中。同时也将数量变化的其它成分吸收泵中。通用的缓冲剂成分B(碱性成分，详见下文)从贮存容器吸入到通道B。类似地将通用的缓冲剂化合物A(酸性成分)吸入通道C。在梯度开始时缓冲剂的一种成分从零或占待测混合物低的体积％提高到结束时的例如占混合物80％或以上。另一种缓冲剂从例如占混合物的80％或以上下降到零或低的最终浓度。对pH逐渐升高的梯度，缓冲剂B的比例随梯度时间而增高，而缓冲剂A的比例则下降。混合物的其余部分是待测化合物溶液(通道A)，必要时，还可有其它所需成分(例如水、表面活性剂胶束和反应剂)，它们可由HPLC泵的通道D提供。被混合的成分从HPLC泵的出口送入分光光度计(Kontron440DAD)，然后废弃，还可通过pH计，该pH计可用来监测系统的正确操作，例如校核所形成的pH梯度的线性。适宜的导管是外径1/16″的PEEK或不锈钢导管。在要测试许多样品时，可将装置调到重复循环运行，在循环过程中，有四个不同的阶段1)采用HPLC泵以恒定流量按固定的比例泵送缓冲剂和任何其它成分，为梯度提供稳定的起点。2)改变缓冲剂成分的比例，以试求梯度。3)在4)之前可在短时间内维持梯度的最终条件。4)系统再循环(其中可包括在循环结束时用水或其它适宜溶剂冲洗)，准备吸取下一个样品。图2装置的电接线正如从图4给出的电接线简图所看到的，将来自分光光度计和pH计的模拟数据提供给接线板，并从那里输入专用微机，以便由Dasylab软件收集和分析。能收集和处理模拟据数的任一其它软件都是适宜的。这个实施方案被限制于分光光度计的四个模拟输出，将分光光度计的四个数据通道与接线板上的屏蔽输入1-4连接，pH计的模拟信号与端子5连接。电缆的屏蔽能降低高频仪表噪声的干扰，在图6中更详细地示出接线板内的接线。正如从图4所看到的，自动采样器与泵、分光光度计和接线板连接。这些触点都是数字信号，它们规定了试验循环的开始和结束，这些触点的闭合动作是由自动采样器驱动的。触点闭合是送往泵和分光光度计的信号。触点打开是送往接线板的信号。在图5中更详细地表明了这一点。B.另一些实施方案图7示出一个与图2的相似的装置配置，但缓冲剂成分是从自动注射器加入混合器的，而不是由混合器泵从贮存容器吸取的。如果需要，如作分配试验的任何附加成分例如胶束悬浮液，也可象检测的样品一样由注射器加入，然而如果要检测多个样品，则采用自动采样器代替泵或注射器提供了一种方便的自动化装置。图8和9示出另一种装置的实施方案，该方案采用自动注射器输送形成梯度的成分。这种装置采用以下单元Sirius梯度系统(Sirius分析仪器有限公司)有混合作用的T形管(ThamesRestek)袖珍超微流通式吸收池(Hellma-参见178.713)氟化乙丙烯(FEP)导管，外径1.6mm，内径0.8mmMSP9000/XL3000/注射口(Cavro)脉冲灯电源(Cathodeon-C720)氘灯，210nm-700nm(Cathodton-J27)遥控吸收池架(Hellma-664.000)紫外/可见光光纤电缆，带镜头(Hellma-041.002紫外/可见光)MMS分光光度计，256二极管阵列(Zeiss-224000-9001.000)MMS12-位适配器电子设备(Zeiss-792200-9009.000)计算机主板12-位CIO-DAS16Jr(Talisman)正如在图8所看到的，采用有混合作用的T形管混合来自注射器分配器的二种流动液流，T形管的总体积为4μl。流动液流接着通过促进混合的蛇管，然后送到位于自动采样器的注入口。在此自动采样器将样品注入流动液流中。液流从注入处流到分光光度计的遥控流通式吸收池，然后流出废弃。在图9中可以看到图8的装置所采用的电接线和光纤接线与检测器的连接。氘灯是由晶体管-晶体管逻辑(TTL)信号控制的，该信号又控制电源电路。在试验开始之前应将氘灯加热。一般加热约半小时。由计算机控制TTL信号，使灯自动地打开或关闭。传输光纤以灯为动力运行，将光从灯传送到吸收池架。采用吸收池架将流通式吸收池插入光路中，将接收光纤的位置可在吸收池架的范围以内调节，然后用锁定螺钉固定。再将这些光纤与MMS分光光度计连接。MMS12-位适配器电子设备在CIO-DAS16Jr计算机主板信号的控制下执行分光光度计的数据获取。控制按照LabviewVirtual仪器编制主控程序，采用主控程序控制主要外围设备分光光度计的灯(即开/关)梯度线模块(发送触发信号并起协调作用)自动采样器(发送校正控制信息串)分光光度计(提供时钟脉冲和接收触发信号)开始，主控程序协调所有的外围设备，并使它们进入准备状态。对于用户需要从试验开始就储存所有数据的场合，用户可以选择文件的名称，在完成这一步骤之后，仪器就进入储存状态，这时用户可在自己的控制下单个地进行全部试验，或者他们可以设定样品的编程号码，连续运行到完成为止。Sirius梯度系统包括80C552微处理机基本控制板，二个Sirius注射器分配器、数据图象液晶显示器(LCD)和键盘。液晶显示器和键盘提供简单的用户界面，使用户能为流动液流的梯度控制变量编制程序。也可通过RS-232界面控制速变线系统。梯度模块有嵌入式软件程序，使用户能为产生梯度确定试验参数。为梯度控制确定的参数是总流量，以ml/min表示。梯度复位时间，以s表示(例如如果梯度是从低到高，在注入下一个样品之前，需使梯度复原到低)。总梯度时间，以s表示。梯度后时间，以s表示(这是将梯度结束延长到通过流通式吸收池)。这些参数也可通过一系列的端口由控制计算机预置。可同时控制二个注射器。在梯度模块进入待用状态后，可采用由主控计算机自动提供的外部触发信号起动梯度控制规程。在检测到这个信号时，梯度模块就开始其操作运行。在运行结束时，模块自动地重新装入，然后等待下一个触发信号，以开始下一个试验。在采样操作开始时，自动采样器将样品装入蛇管中。图10示出自动采样器的控制流程图。然后悬臂移到注入点。向梯度模块发送开始梯度流动的触发信号，也向氘灯发送触发信号。在预定的时间，数据收集开始，间隔为0.5秒。将样品注入梯度液流。该仪器实际上捕获取分光光度计的六个扫描，将后五个扫描平均，并采用平均值作为存储扫描。这样做是通过调入CIN(代码界面节点)进行的，CIN与CIO-DAS16/Jr板配合，收集256-吸收光谱，并将这一数据阵列返回到可视指示器(VI)，可视指示器以指定文件的形式将其存在磁盘上。数据获取和数据处理通过补充用来控制和调节对二极管阵列信号执行数据采集的硬件，简化了数据获取的程序。该硬件与信号波形加工器电子设备一起包括在Zeiss电子设备中。要求数据获取程序发送指示要求扫描的触发信号。Zeiss电子设备控制二极管阵列和数据获取插板。Zeiss电子设备还将信号波形从0伏调高到+2.5伏，使得能充分利用模-数转换器(ADC)的解。为了提高信号对噪声的比例，进行暗扫描(关灯)，并从所有的其它扫描(开灯)中减去这一结果。每次扫描都对信号采样六个，第一个扫描废弃，然后将剩下的五个扫描平均，再将平均的扫描存到磁盘上，这花费约300毫秒。扫描按500ms间隔记录，所得的数据文件包含每个样品的256波长数据。将包含每个波长480个数据点的数据文件转换成适合用一阶导数或TFA分析进行数据处理的格式。二极管阵列数据是采用“能量计数”表示的，需采用下式将其转换成吸光度数据A＝log10((1(参比)-1(暗))/(1(样品)-(暗)))式中1(样品)是样品对特定通道或波长的强度或能量计数；1(暗)是暗电流；和1(参比)是初始参比计数(缓冲剂B+样品)。转换程序使用户能够确定需要抽取哪些波长用于数据处理规则系统，并使所得的数据文件格式化。然而，为了使用TFA，必须首先执行一阶导数程序以计算pH梯度。pH梯度是采用具有明确定义的pKa并因而将其称作“标准”的化合物的数据计算时。随后这将为TFA规则系统提供所需的pH尺度。在任何样品通过该系统之前，必须先进行空白样品(只是水或适宜的溶剂)和校准标准试验，空白样品提供空白曲线，它所提供的吸收信息是由梯度和水产生的。必须从所有标准/样品的试验中将其减去。因而由此提供了纯粹由标准/样品产生的吸收曲线。为了得到这些数据的吸收峰，数据处理规则系统采用线性拟合规则系统以修匀数据，然后对线性拟合的斜率求导数。用户能够确定进行拟合的点数(点数必须是奇数)。将数据处理规则系统应用于数据文件中的每一个点。在完成这步之后，需求出峰值。这是将数据分组(由用户规定组的大小)进行的，在每一组中寻找符合最小或最大峰标准的峰。实施例2A.pKa的测定-采用图2的装置图2示出形成缓冲线性pH梯度所用装置的示意图。下面测定pKa的试验就是采用这个装置进行的。线性pH梯度是由混合样品溶液产生的，样品溶液的量不随递变经过的时间而改变，二种缓冲剂溶液，一种是酸性的，一种是碱性的，它们互相以反比随时间发生线性变化。这二种缓冲剂具有一种共同的成分，向其中加入酸性成分就形成缓冲剂A，加入碱性成分就形成缓冲剂B。这些缓冲剂的配制如下溶液C共同成分(11)向1升水中加入硼酸(Fluka15660)24.732g(Mw61.83)＝0.4MTRIS(Fluka93350)48.456g(Mw121.4)＝0.4M(三(羟甲基)氨基甲烷)丁胺(Fluka19480)29.256g(39.696cm3)＝0.4M(Mw73.14，密度0.737)缓冲剂A-1升向500cm3溶液C中加入KH2PO4(BDHAnalar10203)27.218g(Mw136.09)柠檬酸一水合物42.028g(Mw210.14)HCl350cm3(1M溶液)用H2O补充到总体积1000cm3，产生KH2PO40.2M柠檬酸一水合物0.2MHCl0.35MpH＝～2.8缓冲剂B-1升向500cm3溶液C中加入K2HPO4(Fluka60356)34.836g(Mw174.18)柠檬酸三钾(一水合物)64.884g(Mw324.42)(Fluka60153)KOH(Aldrich31,936-8)400cm3(0.5M)用H2O补充到总体积1000cm3，产生K2HPO40.2M柠檬酸三钾0.2MKOH0.2MpH～11.58在用于HPLC梯度之前，需将缓冲剂成分A(酸性的)和B(碱性的)以1∶10稀释。稀释后缓冲剂的pH值如下酸性的(缓冲剂A)＝3.01碱性的(缓冲剂B)＝11.19逐步检测这个缓冲剂系统线性的方法是，采用HP1050HPLC泵以5cm3min-1的流量混合缓冲剂，采用流通式PharmaciapH电极监测pH。缓冲剂A和缓冲剂B的相对量保持不变，直至pH读数稳定为止，然后变到其下一个值，再保持相对量不变，直到读数达到稳定为止，然后再变到下一个值。重复这一步骤，直至梯度完成为止。测定的结果如下，并用曲线示于图18。<t>图18表明，从pH3到pH11，pH梯度基本上是线性的。采用图2的装置对已知pKa的化合物进行连续梯度(而不是跃变)试验，其中缓冲剂A的量在4分钟内从占待测混合物的80％下降到0％，而缓冲剂B的量从0％增加到80％。样品溶液的量保持恒定，为20％。通过通道B加入缓冲剂B和通过通道C加入缓冲剂A也是采用HP1050泵。待测混合物液流从混合器到检测器的流量为1cm3min-1。记录在240nm、265nm、290nm和315nm处的吸光度变化，并确定一阶导数曲线峰最大值。由峰最大值的时间和标准的已知pKa值(由常规滴定测定的)产生校准曲线(图12)，还将已知pKa的化合物作为待测溶质进行了测定。测定的校准结果如下峰最大值的时间是从仪器循环开始(自动采样器第一次进入新样品容器时)算起。标准邻苯二酸氢二钾的pKa值碱性较强。*是采用SiriusPCA101仪器用0.15KCl进行电位滴定测定的。结果对检测溶质测定的结果和偏差如下*是采用SiriusPCA101仪器用0.15KCl进行电位滴定测定的。从标准校准曲线上所取的导出的pKa值非常接近于预期值。图13、14和15示出4-氰酚对上述梯度在290nm的校准曲线(图13)、吸光度曲线(图14)和一阶导数曲线(图15)。可从这个pH梯度的校准曲线上读出相应于峰最大值时间(361s)的pKa值，导出的pKa为7.64。预期值为7.7(采用SiriusPCA101仪器根据传统的逐步滴定结果推导的)。将校准曲线加入数据处理程序可进一步改进本方法，例如使储存由检测器产生的吸光度读数的计算机按程序运行，求出这些读数的一阶导数，确定峰值读数的时间，例如从根据校准曲线推导的表中查出吸光度读数，就能产生给出样品pKa的输出读数。那时pKa读数是唯一的输出-就操作人员而言，不需要进行任何运算。B.pKa的测定-采用图8的装置梯度进一步地最佳化缓冲剂的配方，以改进梯度的线性，而且在保持生理离子强度的同时又不显著地降低缓冲剂的缓冲能力。还选择对紫外/可见光吸收性能最小的成分。下面示出这些配方，并将其与上述实施例2A的配方进行比较成分A(酸性缓冲剂)成分B(碱性缓冲剂)梯度组合物方法开始，缓冲剂B是在1ml/min的流量下注入的，样品在下游以0.25ml/min的流量注入(从Cavro自动采样器)，产生的总流量为1.25ml/min。在每个试验之前记录暗光谱(关灯)。在液流达到Hellma流通式吸收池(178.713型，光径长度10mm，容积8μl)后，由CathodeonC720氘脉冲灯电源打开氘灯(Cathodeon)，记录在样品和缓冲剂B存在下的参比能谱。梯度开始并经过240秒，在此期间缓冲剂成分互相以反比随时间发生线性变化，从成分B(碱性缓冲剂)开始，在240秒结束时变化到成分A(酸性缓冲剂)。总梯度流量保持在1ml/min。在梯度结束后，使缓冲剂A和样品通过一段短时间，推动梯度的末端通过流通式吸收池，然后进行转换，返回到缓冲剂B，以储存为下一个样品准备的初始条件。在打开灯后，采用Zeiss256波长的光电二极管阵列和12-位数据获取电子设备在梯度期间以0.5秒的间隔记录光谱。每个光谱都由总共花费50毫秒的五个扫描的平均值组成，还对每个光谱记录了每个二极管通道的能量计数减去暗电流的差值。标准和校准对已知(文献)pKa的四个标准苯甲酸(pKa3.96)、邻苯二酸氢钾(pKa4.87)、对硝基酚(pKa6.90)和苯酚(pKa9.72)采用每个自动采样器盘进行试验，以建立pH刻度。标准化合物的已知pKa对标准化合物吸光度曲线一阶导数峰最大值时间的线性回归产生一条校准曲线，可用这条曲线确定未知化合物的pKa。还采用每个盘进行几个空白(无离子水)试验，以便能从缓冲剂成分的吸光度曲线中减去本底。样品准备一般称取1-10mg样品放入管形瓶中，再将1ml甲醇加入其中，以促进样品的溶解，然后加入10ml无离子水(＞1014MΩ)。将溶液吸入5ml的一次性注射器中并通过一次性尼龙过滤器将其直接送入试管中，以除去未溶解的固体。将试管直接转移到Cavro自动采样器单元上进行样品分析。样品的流量占总流量的20％，使在流通式吸收池检测器处的典型样品浓度为10-3-10-3M。数据处理第一步是采用吸光度曲线一阶导数峰最大值时间确定pH刻度。采用几种波长(苯甲酸-235nm；KHP-278nm；对硝基酚-321nm；苯酚-235nm)并将能谱转换成吸光度A＝log10((1(参比)-1(暗))/(1(样品)-1(暗)))式中1(样品)是样品对特定通道或波长的梯度强度或能量计数；1(暗)是暗电流；和1(参比)是初始参比计数(缓冲剂B+样品)。首先处理空白，并从所有的样品和标准的光谱中减去空白。以标准的峰值时间对已知的pKa值绘图，并将校准曲线存入文件。对一组指定的试验条件已经证明，校准的回归方程在几周的期间内是非常一致的，减少了每天多次校准的必要性。在用导数方法确定梯度开始和结束时的pH以后，就可处理样品的数据。对于样品分析，一般选择达20个平均波长间隔，波长范围为210-350nm，并将能量计数按上述方法转换成吸光度。也可通过选择光谱的非吸收区(通常为420-440nm)和建立空白基准线，应用内标校正任何漂移。应用目标因式分析(TFA)确定样品的pKa值。也可将一阶导数方法应用于pKa值不重叠的样品。为了选择吸收紫外线的化合物，下面给出采用图8的装置和最佳的缓冲剂以及采用一阶导数和TFA数据处理方法进行的几次自动采样器试验的结果，并将其与文献的pKa值比较。这些结果表明，对范围广泛的化合物能准确地测定pKa，其中有些化合物具有多个pKa，而且pKa很接近，已经证明，对此采用传统方法很难解决。我们发现，往往可采用连续滴定以及TFA数据处理确定它们，有时也可采用一阶导数数据分析方法。校准曲线pH＝-0.021×时间+12.49(R2＝0.9950)pKaKHP4.878苯酚9.721苯甲酸3.964对硝基酚6.869结果(还可见图25)a是在25℃和离子强度0.15M下用pH测量测定的b1984年艾伯特和萨金特对离子强度0.15M修正的c是在25℃和离子强度0.2M下用分光光度法测定的，Mchedlovpetrosyan等人，分析化学杂志，苏联，1984，39，1105d没有可利用的校准曲线pH＝-0.022×时间+12.66(R2＝0.9955)pKaKHP4.878苯酸9.721苯甲酸3.964对硝基酚6.869结果(还可见图26)<>a1984年艾伯特和萨金特对离子强度0.15M修正的b是在25℃和离子强度0.15M下用pH测量测定的c没有可利用的类似地，采用图8的装置和在试验2A中设定的缓冲剂对35种化合物进行试验。采用一阶导数处理数据。对这些结果与这些化合物的文献pKa进行比较。为了证明连续滴定方法在很宽的pH范围内的准确性，挑选一些pKa范围很宽的化合物。试验结果绘于图27。正如从图25-27所看到的，已经证明，在很宽的pH范围内和对用传统方法一直难以测定的具有多个pKa的化合物，连续滴定方法是一种测定pKa的准确方法。实施例3对分配进胶束的测定某些药物分子的重要特性是它们可透过某些阻挡层例如磷脂膜分配。给定分子的一种电离状态一般会比其它状态更有效地透过阻挡层。在一定pH下，在自由溶液中分子以某一恒定比例电离。但个个分子会在电离状态和未电离状态之间发生转换这就是动力学平衡。例如，如果未电离的形式分配进胶束的倾向较大，那么胶束的加入就会引起自由溶液中这种质点浓度的下降，因为有一些分子会进入胶束中。自由溶液中电离和未电离形式的动力学平衡就起调节作用，使电离质点浓度的降低和未电离质点浓度的升高，直至重新建立初始的平衡比为止。因此在有胶束存在下进行pH梯度试验时，所观测的吸光度中点(表观pKa)会发生偏移。这造成所观测的化合物pKa的偏移，对于酸pKa增加，对于碱pKa降低。已知二相的体积比，可直接从表观pKa的这一偏移推导出该化合物的logP。这种方法的一个假设是，分子的吸收性质在两相之间不会发生显著的变化。可采用连续滴定方法和上述的装置，通过在梯度混合物中包含第四种成分来研究这种行为。这种成分包含由表面活性剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)形成的胶束。在第四种成分中表面活性剂的浓度必须足够高，以致在由四种成分混合成的最终待测液流中，表面活性剂的浓度超过其临界胶束浓度(CMC)并生成胶束。为了确定分配作用，在进行pH梯度试验时，保持胶束悬浮液和样品溶液的量不变。可根据下式确定分配系数logP＝log(△pKa(Vw/Vo))式中△pKa是在有胶束存在下和没有胶束存在下pKa的差值，Vw是水相体积，Vo是有机相(胶束)体积。Vo可根据CMC、胶粒半径和表面活性剂聚集数(每个胶粒所需的分子数)以及有经验的人员很容易得到或可以计算的一些系数计算。苯甲酸进入SDS胶束中的分配采用连续滴定进行这个试验，以观测进入胶束中的分配。按照实施例1(图2)的方法设置连续滴定装置。采用四种浓度的SDS，它们是由0.1M的原料水溶液配制的。配制下列样品，总体积为20ml。</tables></tables>*～0.5mg固体苯甲酸连续滴定装置按下列样品次序安排1.空白(只有水)10.E2.空白(只有水)11.F3.空白(只有水)12.G4.标准113.H5.标准214.I6.A15.标准17.B16.标准28.C17.空白(只有水)9.D18.空白(只有水)不包含苯甲酸(SDS空白)的管形瓶未示出滴定曲线，所以在进一步处理时略去(管形瓶7、9、11和13)。结果列于下表标准曲线截距＝-4.9325斜率＝0.0326样品logP的计算logP＝log(△pKa×Vw/vo)式中Vw＝水相体积Vo＝有机相体积对于这种应用，Vo取SDS胶束的体积。在0.1M离子强度(缓冲剂液流的离子强度)下胶粒半径＝2.5×10-9m聚集数～100临界胶束浓度1.5mM(根据VanCs(范奥斯)N.M.等人“所选的阴离子型、阳离子型和非离子型表面活性剂的物理化学性质”。ElsevierISBN0-444-89691-0)。在CMC以上存在的所有表面活性剂都是以胶束形式存在的，所以根据上述的资料，我们就可以计算在每种溶液中存在的SDS胶束体积。球体积为V=4πr33=6.54×10-26m3]]><<p>这个试验看来进行得非常好，观测到pKa的偏移是一致的，这在所有的SDS浓度下都给出合理的结果。这些结果表明，连续滴定可用于测定进入具有机体构造的有机相例如胶束中的分配。实施例4终点滴定-采用图2的装置许多传统的定量滴定方法，例如溶液中化合物浓度的测定，依赖于目视终点指示剂的使用。这种方法的准确度非常依赖操作人员的经验和终点指示剂的目视判断。采用分光光度检测终点的连续梯度滴定，使这种方法的准确度与操作人员的经验无关。这种方法特别适用于具有一个可电离基团或少数不重叠pKa的化合物。这种方法的应用实例是采用酚酞作指示剂通过终点测定邻苯二甲酸氢钾(KHP)的浓度。KHP在溶液中是强酸。它可用强碱滴定定量地测定，在滴定完所有的KHP以后，pH急剧升高，pH由存在的酚酞指示剂检测。指示剂在pH8.4-10.0发生颜色变化，从无色变成粉红色。和上述的实施例2一样，在图2装置的样品液流中加入待测的溶质(KHP)，样品量保持恒定，为最终混合物的20％。二种梯度的成分(分别从80％变到零和从零变到80％)是0.05MKOH和水。通过样品液流(在20cm3样品中加入2滴酚酞溶液)加入终点指示剂。采用KOH液流滴定待测的溶质KHP。一旦滴定完所有的化合物，pH就大幅度地升高，指示剂的电离状态迅速地改变，因而颜色迅速地发生变化。该系统是采用已知浓度的KHP标准校准的。化学试剂·0.05MKOH-通道B用H2O将50cm30.5-KOH(Aldrich)稀释到500cm3称出0.27g酚酞指示剂，将其溶解在10cm3MeOH和10cm3H2O中。有些沉淀生成。·KHP溶液0.1416M进行一系列的稀释，配制出下列的KHP溶液0.1416M0.0708M0.0354M0.0177M0.0089M将这些标准液倒入闪烁管形瓶中，加入2滴指示剂。然后对样品和空白进行试验。测定在240nm的吸光度。在图16中示出这个实施例所得的迹线。将对空白和标准所获的峰值时间输入Excel电子数据表中，执行KHP浓度对梯度时间的回归。由连续梯度滴定测定KHP<>采用非常有效的统计方法获得良好的回归，r2＝0.9996F＝10337-标准的校准曲线示于图17。采用这条校准曲线，就可根据其一阶导数峰值的吸收时间，确定对同一梯度的KHP未知浓度。这个试验证明了连续梯度滴定对经典终点滴定的适用性。这种方法比传统的方法有几个优点。1.分析速度快，分析数量大；2.终点的检测非常显明，准确度高；3.不需要用户的经验；4.动力学范围宽。实施例5KHP终点的确定-采用图8的装置溶液酚酞指示剂将0.33g酚酞溶解在10cm3MeOH和10cm3H2O中。过量的酚酞逐渐沉淀出来。KOH滴定剂将50ml0.5NKOH(Aldrich)用二次蒸馏H2O稀释到500cm3，配制成浓度0.05N的KOH原料溶液。KHP原料溶液将7.723gKHP(Mw204.23)溶解在250cm3H2O中，配制成浓度为0.15126M的溶液。由KHP原料溶液配制成一系列的标准。<>KHP样品由原料溶液配制一组KHP样品，在试验后求出样品的组成为<试验装置DAD440检测器设置检测540nm、550nm、560nm和570nm四种波长的二极管阵列检测器。注射器模块溶剂AH2O溶剂B0.05NKOH溶剂是由5cm3注射器注入的。通过流通式吸收池的流量为0.8cm3min-1。梯度时间240秒，预梯度流动时间75秒和梯度后流动时间90秒，接着是梯度后复位时间45秒，总循环时间7.5分。设置注入流量为0.2cm3min-1、循环时间为7.5分钟的自动采样器。按下列顺序对空白、标准和样品进行试验。采用Dasylab获取数据，在将3个数据点修匀后，采用一阶导数方法分析数据。分析在540nm的数据。绘制标准曲线图(见图19)，该曲线图可由下式表示y＝0.009×-0.1166R2＝0.998采用根据标准溶液绘制的校准曲线，可将每个样品一阶导数最大值的时间转换成上表中的样品浓度。将这些结果(对双样的平均值)与计算的样品组成进行比较实施例6Zn++的EDTA络合滴定-采用二甲酚橙作指示剂这种方法大体上是基于S.G.Novick(诺维克)为测定喉糖片中的锌而研究的方法(化学教育杂志，Vol.74(12)1463(1997))。锌离子与二甲酚橙形成的络合物产生在580nm处吸收的深红色，在用EDTA(乙二胺四乙酸)滴定时，Zn++优选与EDTA形成络合物。一旦所有的Zn++都生成EDTA-Zn++络合物后，二甲酚橙又变成游离的形式，在表观上是黄色，所以观测到在580nm处的吸光度相应降低。溶液二甲酚橙指示剂0.1％的H2O溶液＝100mg/100cm3EDTA溶液将3.485gEDTA·2Na·2H2O(Mw372.24)溶解在500cm3的H2O中，配制成500cm3的18.75mM的原料溶液。锌标准选择硝酸锌作为标准配方中的盐。在待测混合物液流中的锌浓度必须低于EDTA的最高浓度，以确保所有的锌都被EDTA所络合，而留下游离的未络合形式的指示剂。在EDTA浓度最高时，EDTA溶液占液流的80％，所以其浓度为18.72×O.8＝14.976mM。因此在测定液流中的Zn++浓度必须低于14.976mM。锌样品占液流的20％，所以样品中锌离子的最高浓度必为14.976×100÷5＝74.88mM。称出1.03gZn(NO3)2·6H2O并将其溶解在50cm30.1N乙酸盐缓冲剂(pH4.9)中，配制成浓度为69.25mM的锌原料液。由这种原料液配制标准*向每个标准中加入200μl二甲酚橙指示剂梯度注射器AH2O注射器B18.72mMEDTA原料液流量0.8cm3min-1梯度时间100％A到100％B为240秒，预梯度注入时间75秒(注射器A)，梯度后注入时间90秒(注射器B)和梯度后复位时间45秒(注射器A)。循环时间共7.5分钟。自动采样器循环时间7.5分钟、注入流量0.2mlmin-1的，采用EDTA梯度进行标准试验，以建立校准曲线(见图20)。在570nm处的吸光度数据的一阶导数的峰值时间如下>NF＝一阶导数曲线未拟合一阶导数曲线不可能与高浓度标准的吸光度数据拟合。认为这是由于标准溶液的缓冲作用不够造成的，因此溶液中二甲酚橙指示剂不能产生清晰的颜色变化。对于第三种标准，在能够得到结果的场合，得到线性的校准曲线(图20)。这个试验清楚地表明，连续滴定方法可以用于络合滴定。在此所示的实施例中，缓冲能力不够，但这可采用缓冲剂配制EDTA溶液来改进。实施例7曲线拟合方法对由连续滴定产生的pKa数据的应用可由上面讨论的一阶导数方法分析由连续滴定方法和装置产生的吸光度数据。为了成功地采用这种方法，吸光度数据需要修匀，这会失去滴定的过高和过低数据。然而，在吸光度变化大、pH梯度的线性非常好又没有重叠的pKa时，一阶导数方法能处理得很好。可用于数据分析的第二种方法是目标因式分析(TFA)。这种方法更适合多个、特别是重叠的pKa，但计算强度大，需要在几种波长处的光谱数据。此外，在能处理数据之前，尚需了解样品分子的电离行为。能适用于本发明的连续滴定分光光度方法产生的数据的第三种分析方法，是“曲线拟合法”。这种分析方法可应用于光谱变化非常小的场合，它对非线性的pH梯度是相当不灵敏的，这种方法只需一种波长的数据，并不需要数据修匀，计算强度也不是很大。在下面的实施例中，由样品化合物S滴定的吸收数据，是采用实施例2的方法形成的线性pH梯度得到的，按照下面所述的方法将其归一化。采用四种波长处的数据。测定每种波长的最小和最大的吸光度，在0和1之间采用下式换算数据光谱的变化可定义为对数函数式中A、B和D是常数，x是因变量。在下面的实施例中A、B和D是由试差法拟合求出的，x是时间。采用微软ExcelTM中的“求解程序”功能，通过使残差平方和最小和将A、B和D拟合，使这个函数与光谱数据拟合。下面列出四种波长的数据如果B大，则吸光度随时间而增加。如果B小，则吸光度随时间而下降。该对数的一阶导数被定义为通过求出相应于一阶导数最大值的数据点，我们就能采用这些数据作为根据已知pKa的标准校准的标准一阶导数数据。样品S的数据如下</tables>正如所看到的，所有光谱的变化都是非常小的。</tables>可采用在归一化过程中所采用的范围将这些值加权</tables>*加权平均值是采用微软ExcelTM中的“和积”功能产生的在图21-24中对每一波长标绘出原始数据、拟合曲线和(为了对比)一阶导数曲线。实施例8对分配系数测定的理论研究在不溶混的溶剂存在下测定pKa时，所得的“表观”pKa值有偏移。这种偏移是由于化合物向有机相中分配引起的。偏移的大小取决于化合物的分配系数和二相的体积比。可根据下式求出分配系数(logP)logP＝log(10ch(pKa-pKa′)-1)/R式中pKa＝在H2O中的pKapKa＇＝在有机相存在下的pKach＝分子的电荷(对酸为-1，对碱为+1)R＝体积比＝有机相体积÷水相体积这一模型只对一元化合物是正确的。如果体积比相等，则logP约等于pKa与pKa′之差。采用连续滴定装置进行二次滴定可用于测定logP值，第一次是与实施例1相同的标准连续滴定，第二次滴定加入与水性样品液流接触的辛醇或其它有机相液流。当在水相和有机相液流之间有足够的接触面积时，在二相之间就会发生分配。然后分离水相和有机相并使水相液流通过检测器。实现此目的的一种手段是采用由CRL和BNFL开发的微量化学处理装置。这种装置是专门用于使水相和有机相流动互相接触，然后完全分离。其详情可在“Eureka，传输技术”1997年10月，42页上找到。如果采用相同的流量，就相当于等於在传统的分配试验中的体积比。根据这一试验预测的光谱数据可模拟如下对任一指定的pH，一元化合物的logD可模拟如下式1logD＝log(10logP+10logP·△+ch(pKa-pH))-log(1+10(ch(pKa-pH)))式中logP＝未电离质点的logP△＝未电离质点的logP减去电离质点的logPch＝电荷(对酸为-1，对碱为+1)pKa＝分子的pKa在任一指定的pH下溶液的吸光度都可由下式模拟式2式中A1＝电离质点的吸光度A0＝未电离质点的吸光度在分配试验中，水相中的化合物浓度可由下式模拟式3浓度水相＝1/10logD+1而辛醇相的浓度由下式模拟式4浓度辛醇＝1-浓度水相将式2和3合并，我们可模拟在分配试验中水相的吸光度。对典型的酸和碱，预测的结果与图28和29中所示的相似。变更方法显然，有经验的人员对上述发明进行更动是可能的，例如可在样品溶液中包含已知pKa的标准化合物提供内标，代替在采样前或采样过程中采用几个标准试验校准系统。它们会给出与待测化合物比较的已知pKa的吸光度变化时间。显然有经验的人员还可借助于标准的试验室技术，在没有过重负担的情况下采用其它一些修改方案。权利要求1.一种连续滴定的方法，其中在改变混合物中一种或多种物质的浓度使混合物的组成连续地变化时，可监测待测混合物中至少一种化合物的至少一种参数，该方法包括以下步骤连续混合至少二种成分流体液流，形成待测混合物液流，并使待测混合物液流通过分光光度检测区，其特征在于形成待测混合物液流的至少二种成分液流的体积比是通过改变形成待测混合物的成分液流的相对比例而随时间连续地变化。2.根据权利要求1的方法，其中待测混合物液流是由三种成分流体的液流形成的，一种成分流体液流的比例保持恒定，第二种和第三种成分流体液流的比例互相以反比变化。3.一种连续滴定的方法，其中包括将包含待测化合物的流动的流体液流与至少一种附加的流动流体液流混合，形成待测混合物液流，并使待测混合物液流在恒定的流量下通过分光光度检测区，在该区读取关于待测化合物的至少一种物理或化学参数的读数。4.根据权利要求1或2的方法，其中可变的成分液流包括缓冲剂溶液、检测试剂、水或有机溶剂。5.根据权利要求4的方法，其中具有至少二种可变的成分，其中包含二种线性化的缓冲剂溶液。6.一种分析装置，其中包括至少二个与公共通道以流体相通的入口，一个具有与公共通道以流体相通的入口和出口的检测区，该装置还包括一个分光光度检测器，用于监测通过检测区流动的流体，并产生关于流体至少一种化学或物理特性的数据。7.根据权利要求6的分析装置，还包括与入口连接的控制装置，用于控制通过每个入口引入公共通道的流体的相对量。8.根据权利要求6或7的分析装置，其中分光光度检测器是紫外或可见光范围的分光光度计、荧光计、旋光计、比色计或光散射、光旋转或圆形二色性检测器。9.根据权利要求8的分析装置，其中分光光度检测器是紫外或可见光范围的分光光度计。10.根据权利要求7-9任一项的分析装置，其中与入口连接的控制装置包括自动注射器、混合器泵、蠕动泵或数字开-关阀泵、或它们的组合。11.根据权利要求6-10任一项的分析装置，还包括适合将多个样品相继送入公共通道的自动样品输送装置。12.根据权利要求11的分析装置，其中自动的样品输送装置包括自动采样器。全文摘要本发明涉及一种改进的分析方法及其所用的装置,具体涉及连续滴定的方法和装置,其中在混合物的组成连续变化时,可监测待测混合物中至少一种化合物的至少一种参数。文档编号G01N31/16GK1278331SQ9881068公开日2000年12月27日申请日期1998年9月9日优先权日1997年9月9日发明者C·D·贝范,A·P·希尔,D·P·雷诺申请人:葛兰素集团有限公司