专利名称：具有单独滑片加热器的自动化的分子病理学装置的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种用于诊断分子病理学的装置，尤其是关于用来对装在显微镜载片上的组织样品自动进行染色和/或处理的装置。
背景技术：
分子病理学是对引发疾病或是与疾病相关的DNA、mRNA和蛋白质等分子量的检测学科，从这种检测到的重要信息，可以对患者的诊断，预测和治疗方案进行说明。分子病理学的实践一般分成二个主要方面(ⅰ)对完整细胞中DNA、mRNA和蛋白质的分析(就地)；(2)对从组织中提取这些生物物质后的分析。第一类分析，即本发明主要涉及到的，其优点是，可使诊断者或科学工作者在显微镜下研究组织样品的组织病理体系或组织形态，同时也能对核酸或蛋白质进行检测。这些技术包括观测蛋白质的免疫组织化学(IHC)；观测核酸的就地杂化(ISH)，观测碳水化合物的组织化学(HC)；和观测酶的化学的酶组织化学(EHC)。例如，ISH可用于探寻是否存在遗传异常现象或特别是在细胞内引起癌扩大的基团条件，即，当在显微镜下观察时，在组织形态上呈现出恶性。ISH也应用于传染性疾病的诊断中，它不仅能检测出微生物的顺序，而且也能确切地检测出被传染的细胞，这具有很重要的临床病理意义，而且也是一种排除来自无临床关系的相邻组织或来自血液或来自外界感染的正向杂化信号的可能性的有效手段。
IHC是使用专门与仅存在于一定类型的患病细胞组织中单一抗原决定基相接合的抗体。IHC对固定在玻璃片上的组织片段或细胞(如，血液或骨髓)需要一系列的处理步骤，通过对某种患病状态的形态指示者进行有选择的染色而使之突出。主要步骤包括组织片段的予处理，以去除石蜡，并减少非特异性的结合，修补因化学固定剂产生的蛋白质的交联而隐蔽的抗原，抗体的处理和培育，酶标记的第二抗体的处理和培育，与酶的基质反应以产生荧光团或生色团，以突出具有与抗体接合的抗原决定基的、复染等的组织片段。这些步骤大多数都由多次漂洗步骤间隔，以从前一步骤中除去未反应的残余试剂。培育是在高温下进行，通常约37℃，组织必须不断地防止脱水。ISH分析，取决于探测剂与来自组织样品或体液细胞的独特的或重复的核苷酸序列的特殊亲合力，它要求一个用许多不同试剂的相类似系列的工艺步骤，并进而通过不同温度要求而完成。
鉴于对IHC和ISH需要大量的重复处理步骤，必须引入自动化系统，以减少人力、费用，以及与此有关的错误率，并且要均匀引入。已成功使用的自动化系统实例包括NEXES和GenⅡ染色系统，可由Ventana医疗系统(Tucson,Arizona)以及Copeland等人的US专利No.5654199中公开的系统中获得，这些系统使用了控制系统的微处理机，该控制系统包括支撑辐射状定位载片的旋转圆盘传送带，步进电机旋转圆盘传送带，将每个载片放置在位于载片上的系列试剂分配器的下面，载片和试剂分配器上的条型码可使计算机控制分配器和载片的定位，以致通过适当的计算机程序完成对每一个不同组织样品的不同试剂处理。
上面提到的染色系统包括一个热空气吹风机，或者一个加热灯，以加热各样品到高于实验室的环境温度，以保证各步骤要求的高温。对载片的加热可通过促进化学反应而改进染色质量，并能使反应温度更接近于匹配的体温(约37℃)，在此温度下设定抗体以进行反应。而这种对流或辐射加热系统基本适用于以抗体为基础的IHC分析。而不太适用于以核酸为基础，并且要求更高更精确的温度控制的ISH。为了使目标样品和探测剂两者的DNA双螺旋变性，以致使它们变成单链，所以温度必须提高到双螺旋的熔点以上，通常约94℃。同时必须强调的是样品不能加热超过100℃，如果加热过高，会破坏细胞的形态，使它难以在显微镜下观察。在ISH分析中也要求更精确的温度控制，以在所要求的严格性下实施探测剂的杂化。所选择的温度必须足够低以便在探测剂和模板剂之间进行杂化，但是，还要使其有足以防止失配的杂化物形成的高温。因此需要一种自动化的组织染色装置，该装置对大多数ISH应用能够控制足够精确的反应温度。
通常使用的具有自动化组织染色器的加热单元的另一个缺点是它们不能够对各个片进行单独的温度控制。现有技术系统，所有的载片在处理过程中，在任何给定的时间内都加热到相同的温度。例如，在Bogen等人的US专利No.5645114中公开的，所采用的分配组件，可承载多个显微镜载片。配有一种含有电阻加热单元的各个载片的夹具。然而，因为Bogen等人提出的组件，对所有的载片都加热到同一个温度，例如没有公开能单独控制加热的装置，也没有公开能使载片屏蔽相邻载片产生的热的装置。这就不可能具有不同温度参数的方案，以在同一时间内对不同样品进行处理。例如，具有不同严格要求的DNA探测剂测定不能在同一时间有效地进行。因此，要求一种自动的组织染色装置，甚至试验有独特的加热要求时，相邻载片之间可以对它们进行不同的试验。
在IHC和ISH试验中经常遇到的困难是产生于经常要保存组织的方式。几十年来，主要支持诊断病理学实验室工作的是福尔马林固定，石蜡封存的组织块、切片并固定在玻璃片上，以这样一种保存方式固定能引起大分子氨基酸和核酸二者的交联。这些交联成分必须去除，以使探测剂能接近目标核酸，并使抗体识别相应的抗原。“去掩蔽”抗原和/或核酸主要是用人工多次予处理、质子消化和洗涤等步骤而完成。如果对细胞进行调节过程，以使它们的抗原和核酸适于检测，则可以期望自动操作。
在染色前，要求必须完全去除石蜡，以至于不干扰抗体或探测剂的结合。石蜡是一种疏水物质，在染色或使用探测剂杂化前，必须去除，连续使用2次或3次净化剂通常可获得石蜡脱除，净化剂是石蜡的溶剂，如二甲苯、二甲苯取代物或甲苯，它们可能是有毒的，易燃的，并造成环境危害，所以对载片脱蜡，采用更安全、更快速的方法是有利的。
发明简要本发明是关于对多个固定在显微镜载片上的组织样品进行自动染色或处理的装置和方法，每个样品都能接受到单独的染色或处理方案(protocol)，甚至当这种方案需要不同的温度参量，这样，基于不同DNA探测剂和/或抗体的染色步骤可同时进行，尽管在同一时间每个可有不同的加热要求。此外，样品要求的脱蜡(例如，肿瘤片段)可在同一时间自动进行，而其他样品(例如，涂片)则不要求这种初步步骤。
更具体地，该装置是一种计算机控制，条形码驱动的染色装置，能自动地将化学试剂和生物试剂施加到固定或附加在标准玻璃显微镜载片上的组织或细胞上。多达20个载片，以环形排列固定在圆盘传送带上，当计算机指令时，即可旋转，将每个载片放置在位于载片上的试剂分配器系列中的一个之下，以最佳的程序和所要求的时间周期，每一载片都能受到所选择的试剂(例如，DNA探测物)，并且进行洗涤、混合和/或加热。然后，将这样染色或处理的组织片段由使用者从装置内取出，由医务专业人员在显微镜下观测，他们研究载片以用于选择病人的诊断、推测或治疗方法，计算机控制的自动化能使装置以一种“方便”的方式进行应用，即，使用很少的人力。
根据本发明，各个载片的温度控制是由加热系统完成，该加热系统具有以辐射状安装到圆盘传送带上的加热平台，用于对每个载片的温度进行加热和传感。在载片的圆盘传送带上也装有印刷线路板，分别对每一个加热平台进行监测和控制。信息和能源借助于滑环组件而在旋转的圆盘传送带和固定装置之间通过。这些信息包括对20个载片中的每一片以所需的较高和较低的温度参数加热到适宜的时间周期。
本发明的主要优点是每个样品都能受到单独地染色或单独的处理方案，即使是这些方案要求不同的温度参数。
本发明的另一个优点是该系统能对固定有组织的载片，整个表面的温度进行精确地控制(即，在规定温度的+或-两摄氏度以内)。对于ISH中的DNA变性作用和探测剂杂化作用及相关的过程，如就地PCR，尤其需要这样的精确性。此外，根据本发明，由于能进行均匀加热，所以整个载片表面保持在狭窄的温度范围内，这样，不管它在载片上的位置如何，组织都得到均匀地加热。
本发明的再一个优点是该系统能以自动化方式进行组织样品的脱蜡，而不必依赖于如二甲苯一类的有害溶剂。
本发明的第四个优点是利用在水溶液中加热组织，该组织是通过使细胞中的目标分子更易于染色，而使染色条件更好。
本发明的第五个优点是该系统对固定有组织的载片，能迅速加热载片表面(即，不到2分钟内，从37℃到95℃，不到4分钟内，即可冷却到同一范围下)，从而能使DNA变性，而不会变性过度，和因加热过度而使细胞形态受到损失。
本发明的第六个优点是该系统能在染色后，利用热量使组织样品脱水。
本发明的第七个优点是不存在人为的误差，并因自动操作而增加产率。
参照本发明的以下的详细描述、所附的权利要求书和附图中的说明，本发明上述的和其他的目的、优点和特征将更加明显，本发明的实质也更加清楚理解。
附图的简要描述
图1是表明载片盖已打开和圆盘传送带门已去除的本发明的透视图。
图2是表明与用以操作的计算机和其他装置连接的本发明的透视图。
图3是本发明的立体分解图。
图4是表明带有试剂分配器的本发明的透视图。
图5是本发明加热系统的方框图。
图6是表明由板部分断开以暴露控制电子件部分的销子的本发明加热器/传感器单元的透视图。
图7是加热器的平面视图。
图8是表明其上有玻璃载片的加热平台的透视图。
图9是沿图8中9-9线剖开的加热平台的断面图。
图10是表明其上装有多个加热平台的滑环组件和载片的圆盘传送带的透视图。
图11是表明其上装有控制电子件印刷线路板的图10中圆盘传送带下侧的透视图。
图12是加热器的顶面视图。
图13是图5中控制电子件、加热器和传感器的方框图。
图14是控制加热各个载片的流程图。
图15是控制冷却各个载片的流程图。
图16是环组合件的断面视图。
发明的详细描述现在详细参照附图，其中用同一标号表示同一部件，图1表明了根据本发明的分子病理学装置的透视图，一般用标号10表示。所设计的装置10是以要求的顺序、时间和温度，用核酸探测剂、抗体、和/或与其有关的试剂对装在显微镜载片上的组织自动进行染色或其他形式的处理。然后，由专业医务人员在显微镜下观测这样染色或处理的组织片段，他们研究该载片，以对病人选择诊断、推测、或治疗方案。
在优选实施方案中，装置10仅是系统12(图2)中的一部分或者是一个组件，该系统还包括主机14，最好是个人计算机，监测器16、键盘18、鼠标20、整体流体容器22、废物容器23和有关的设备，另外的染色组件或其他装置可加入到系统12中，以形成用计算机14为服务器的网络。另外，这些单独部件中的某些或全部都能组装到装置10内，使它成为一个独立应用的装置。
装置10及系统12的优选结构形式描述于如1997年12月递交的US专利申请序号No.08/995052及由Ventana Medical Systems，Inc(Tuscon,AZ)获得的Ventana Nex ES User＇s Guide中，这里是两者的结合，除了下面公开的有关新型加热系统、载片支架、整体流体组件、容积调节体系和载片的擦试体系之外。为了清楚起见，在本发明和结合参考文件中见到的这些组件的详细描述都省略掉。
简单地说，装置10是一个由微处理机控制的染色装置，它能自动地向装在标准玻璃显微镜载片上的组织施加化学试剂和生物试剂。支撑辐射式定位玻璃载片的圆盘传送带由步进电机驱动旋转，以将每一个载片放在试剂分配器系列中之一的下面。装置10控制分配、洗涤、混合和加热，以优化反应动能，计算机控制的自动操作保证装置10能以“轻而易举”的方式使用，即，只用很少的人力。
尤其是，装置10包括一个由较低部分30和较高部分32形成的壳体，较低部分30可拆卸地安装或铰接到较高部分32上，载片的圆盘传送带34安装在较低部分30内，围绕着轴A-A旋转。下面将更详细地描述，在圆盘传送带34的周边处辐射状地安装多个加热平台50，在其上可以放置有组织样品的标准玻璃载片。圆盘传送带34最好用不锈钢制作。正如本文中所描述的，本发明的主要特征是通过各种传感器和微处理机分别控制每个载片的温度，在装置10(图3)中还安装有清洗分配喷嘴36，盖片(CoverslipTM)分配喷嘴37、流体刀38、洗涤容积调节喷嘴39、条形码阅读器反射镜40、和空气涡流混合器42，这些将在后文中详细描述。
在部分32上部顶上可旋转安装的是试剂圆盘传送带28。分配器26可拆卸地安装到试剂盘29上(图4)，而它又适应于与圆盘传送带28相啮合。试剂包括通常施用于各种载片的化学物质或生物物质，这些载片含有核酸探测剂或引物、聚酶、原发性抗体和继发性抗体、消化酶、予-固定剂、后-固定剂、显示(readout)化学、和复染。为了用计算机识别，试剂分配器26优选是条形码标记29。对每个载片施加单一试剂，然后，在温控环境下培育精确的时间周期。用压缩空气喷射口42瞄准载片的边缘以完成试剂的混合，因此引起试剂旋转。在适当培育后，使用喷嘴36将试剂由载片上洗掉。然后使用容积调节喷嘴39以调节剩余洗涤缓冲液的容积。然后通过喷嘴37向载片施加盖片(CoverslipTM)溶液，以防止蒸发。气刀38分隔开CoverslipTM的液池，随后使用下一个试剂，当圆盘传送带旋转时，重复这些步骤，直到方案完成为止。
除了主机14外，装置10最好包括它自己的微处理机44，由主机14的信息可以下载于此。尤其是计算机下载到微处理机44运转程序中的步骤顺序以及传感器的监测和控制，两者在逻辑上都称作“运行规则”以及方案的温度参数。来自Dallas半导体的Dallas TX的型号No.DS2251T128K就是一种微处理机的实例，它能完成这一功能。
现在再回到图5，它表明载片加热系统48的方框图。该系统一般包括约20个加热平台50，辐射状地安装到圆盘传送带34上，以加热载片，和监测其温度，并控制也安装到载片圆盘传送带上的电子件印刷线路板52，以监测传感器和控制加热器。控制电子印刷线路版52安装在旋转载片圆盘传送带34之下。信息和电源通过滑环组件56从固定装置平台传输到旋转的圆盘传送带上。该信息包括加热载片所需的温度参数(较高和较低)，从微处理机44(从计算机14下载后)传输到控制电子件52，如下面描述的，在运行期间，如果载片所测温度低于程序设定的下限，则热平台加热载片。同样，如果发现载片温度高于上限，加热停止(参看图14的方框88)。有足够容量的电能对每个加热器提供约8瓦，以满足所要求的升温速率(a/k/a“直线上升”)。
同样，在另一个方案中，同样可以控制载片的冷却，如后面描述的。在另一个方案中，在载片的下面装有冷却平台，冷却平台可以包括珀尔帖(Peltier)型热转换器。在又一个改变方案中，如果为特定用途，要求将载片迅速冷却，则可任选地提供如风扇(未图示)一类的冷却装置。冷却装置将改变所有平台的周围环境空气，迫使对应于不应冷却的各载片的加热器补偿环境空气温度的降低。
本文所描述的载片加热系统采用传导加热和分别加热各载片的方式。该系统提供更精确的载片上温度，并能通过载片基底而设定温度。现在更详细地描述加热系统48的每一个构成部件。
加热平台参照图6-10，加热平台50包括两部件加热器/传感器单元58和壳体70，以可拆卸地将加热器/传感器单元58安装在圆盘传送带34上，并支撑各载片37。
加热器/传感器58有一个平板60，约2英寸长和1英寸宽，最好由0.04英寸厚的黄铜板制成。也可以用其他材料取代黄铜，只要它是一种刚性材料，并具有足够的传导性，将热量均匀地分散在其整个表面，以致使载片可被均匀地加热，平板任选地用抗腐蚀材料覆盖，如Teflon。
本发明的一个特殊特征是在特定的时间能将相邻的载片可任意地加热到不同的温度，这是通过在加热器之间具有高热电阻而使各载片相互热隔离而完成的。正如本技术领域的人员所理解的那样，热阻是材料传导性、材料厚度、和热传播距离的函数。因此，可以使用各种类型的材料对相邻载片进行热隔离，包括橡胶、塑料、陶瓷，或金属，只要它们能提供根据文中提到的条件的热阻就可以，本文使用的术语“热隔离”，意思是来自一个加热器的热量对相邻载片的温度没有明显的影响。此外，对于热隔离相邻载片可以使用各种结构方式，包括将载片安装在热阻材料上，将热阻材料装在载片之间，和将载片放置在热阻平台上。
在优选的实施方案中，围绕着平板60的周围安装防护罩62，并由平板60的底侧垂直悬挂，该防护罩62优选用橡胶或类似材料制成，它既是防水层，又是隔热层。防护罩62的绝热特性有助于促进相邻载片之间的这些温度差异。应当指出的是可以使用各种材料以代替橡胶对相邻载片的隔热，包括能经受至少100℃温度的陶瓷和塑料，安装在加热器/传感器单元58(已描述)空穴中的部件必须与在装置进行染色运行时所使用的各种加热溶液(以油和水为主)进行屏蔽。因此，优选通过橡胶硫化或类似工艺方法将平板60连结到防护罩上，以致形成即使在高温下流体也不渗漏的密封。防护罩62的壁同样必须能抵抗住这些加热溶液。在优选的实施方案中，防护罩62的厚度是0.06英寸的橡胶材料，因此减小了热可以传播的横载面。另一方面，防护罩62也可以用金属材料制成，如黄铜，要足够薄(例如，约0.01英寸)，以提供热阻。当安装到圆盘传送带34上时，防护罩62的高度约0.5英寸，因此，提高平板60并且在其上支撑的载片也在同样高度，在操作时升高放置有载片的平台，使载片远离收集在圆盘传送带34上的各种液体，并使载片与相邻加热器产生热隔离或绝缘。
光蚀刻的阻热器64安装在由防护罩62限定的空腔中的平板60的下侧。加热器可用选自高阻抗镍基材料，如铬镍铁合金，到导热性更高的材料，如铜-镍的各种材料制成，铜-镍是优选的。光蚀刻电阻器64粘接并夹在二个0.008英寸厚的由杜邦公司购买的KaptonTM聚酰亚胺薄膜制成的塑料薄片之间，导线65焊在电阻跟踪器的端部，这些导线从两个KaptonTM层之间引出，并连接到光蚀刻的电阻器上。该夹层的一个外侧指定与加热器粘接，而另一外侧有光蚀刻线路连接，第二线路是传感温度的，并具有四个低电阻跟踪器，其终结是在加热器中心处的焊片上，该焊片与用Dallas半导体制造传感器连接，它们的部件号码是DS1721S。四个跟踪器焊接到同一面中引出的四根导线上，导线又连接到加热跟踪器上，第三层KaptonTM是粘接在控制跟踪器上并且该第三层在中心处的焊片上有中断器，以便连接传感器。如图7所示，从加热器引出六根导线，二根向加热器供电源，四根用于传感温度，六根导线接到母插头一个六孔线路插孔板67，它由多家公司制造的，如AMP(Harrisburg.PA)或Molex(Lisle，IL)。插孔连接器片覆盖六个焊在另外描述的控制电子园形PC线路板52上的匹配插头69。PC板52安装在载片圆盘传送带34之下，在其上侧对面连接载片加热器，所以六个匹配插销通过圆盘传送带内的矩形开口75向上延伸。
根据本文公开的说明，加热器64的加工来源是Minco产品(Minneapolis，MN)。正如下面更详细的公开，加热器各自通过集成线路驱动器或能够启动和关闭加热器的各个晶体管(安装到印刷线路板52上)进行控制。
正如所描述的，加热器/传感器单元能够迅速加热载片的有用面积，在2分钟内从37℃加热到95℃，并在4分钟内在同样范围冷却，以使DNA变性。而不会过渡变性，也不会因加热过度，而使细胞形态受到损失。
由于组织试样常常安放在载片的不同位置上，所以均匀加热载片表面是本发明的另一个关键目的。这就对传导加热提出一个课题，甚至当人工完成时，由于传统的加热板常常产生不规则的“热点”，使其难以知道在板上何处放置载片。如果整个组织的细胞得不到均匀地加热，则显微镜载片将得不到准确的解释。例如，如果温度达不到使探查物和组织DNA变性的温度，就有可能导致虚假的负效应而在严格洗涤时的不合理，又能导致虚假的正效应。
为了确保利用加热平台60均匀加热，所以将阻热器64安装在板60的底侧。如上所说，黄铜板具有足够的传导性，以消除因加热跟踪器不能在表面连续而引起的任何局部不均匀性，而是由不产生热量的空间所分隔相邻线路，分隔的量级为0.015英寸，所以在黄铜板的另一侧看不到热源中的这种非均匀性，通过改变加热跟踪器，使它们以非均匀方式产生热，同样可以获得载片温度的均匀性，热量损失则包括载片37的边缘和黄铜板60的边缘的所有表面的四周空气，但是，热量只由黄铜板底表面上的加热器64产生。如果在加热器的整个区域中产生的热是均匀的，所以以恒定通量进行黄铜板底部，则玻璃载片的顶部中心将明显高于能快速散热的边缘。如果减小中心处的加热器通量从而能提高玻璃载片顶部温度的均匀性，这一现象是可以调节的，可以使用由Parametric Technologies(Waltham，MA)生产的Meohanica的有限元件热量传递程序，以模拟系统中的热流动，加热器通量优选如图12所示设置，中心区63覆盖总面积的40％，产生的热能为总能量的8.3％，而外区域61产生的热能平衡。因此，由于中心区接收较少的热量，所以中心区正上方的载片上温度稍低于长方形环正上方的载片温度，当加热器制成如所述的外形则玻璃载片的有用区域的温度变化，(其上放置组织的区域一般不包括载片的最外边缘)约为0.2℃，从玻璃片中心到玻璃片有用区域边缘的温度梯度为逐渐升高0.2℃，然后逐渐下降0.2℃。1英寸宽，3英寸长的湿润玻璃载片的顶表面，在它的有用区域内保持特定的均匀的温度，该有用区的限定为集中在载片宽度为0.75英寸，长度为1.6英寸的区域，从标记的相反端开始0.25英寸。均匀性的目的是将设定的温度保持在正负2℃的范围内，有用区域内的设定温度从37℃～95℃。
可以使用Peltier型热转换器代替上述的加热元件，它所通过转换器而变换极性既能加热和又能冷却。这种冷却能力在某种潜在应用方面具有应用性，本发明的应用，如就地进行PCR(下文将讨论)。
温度传感器68也安装在空腔73中的加热器64的底侧。可使用几种不同类型的传感器，如热敏电阻，RTD＇s、或热偶。在本发明的优选方案中，使用集成线路传感器68，它可以直接将温度转换成数字信号，如从Dallas半导体(Dalias，TX)获得的型号No.DS1721型的传感器。这种传感器利用I2C方案以数字报导所感到的温度。类似的传感器也可从National半导体(SantaClara CA)获得，所选择的传感器必须精确、可重复，并具有很低的热质。
壳体70，优选由喷射模铸塑料构成，能提供将加热器/传感器58可拆卸地定位到圆盘传送带34上，并能支撑玻璃载片37。正如图9中所见到的，壳体70限定为一个基本矩形空腔71，可将加热器/传感器单元58装嵌到其里面，并由夹持器固定。在壳体70的底部，限定了一个凹槽区72，它收容沿防护罩62的端边限定的相应凸缘74，以使加热器/传感器单元58固定在应有的位置上。为了进一步密封空腔71以隔离装置操作时所用各种试剂，可提供一个向下延伸的凸出部分76，可更严密地使凸缘74啮合，为进一步密封，也可沿防护罩62的外壁提供一个凸起部分78。该凸起部分的外侧尺寸稍稍大于壳体的内侧尺寸，可产生一种干扰，防止液体从防护罩和壳体间的凸起部分的下面进入空腔71中。
在壳体的基座上限定了一组安装机器用的螺栓孔80(图8)，与限定在圆盘传送带上的孔成一直线。
玻璃载片37由四个向上的相关支柱82固定，而放置在平板60上，支柱82整体地安装在壳体70上。支柱延伸到玻璃载片厚度之上的一半，如图9所示，由于玻璃载片厚度为0.04英寸，支柱是低于玻璃载片顶面0.02英寸，重要的是支柱伸出到载片的顶面，为了防止排出溶液的水溶液表面张力。现有技术的已知装置的问题，相对载片顶部的垂直夹具，它们存在一种趋势，以毛细作用会虹吸掉载片的流体，应当指出的是可以使用其他方式固定或支撑载片。
控制电子件(印刷线路板)参照图13所示的方框图，控制电子件52包括一个具有需通过一系列数字方案57由染色装置微处理机44接受温度定点的必要部件的环形印刷线路板，并使用该信息将每个加热器64保持在其定点上。那些没有示出的部件(例如，电阻器、电容器等)，对本技术领域中技术人员容易理解的。加热器的控制可以以各种方法完成，在优选实施方案中，各加热器可以通过集成线路驱动器或单独的转换器53能开启/关闭加热器的电流通或断而单独地进行各自的控制。因此，处理器可控制加热器的运行循环，正如随后描述的，在另一个实施方案中，可通过处理器55调整加热器的电量，以至使加热器可在总容量的百分比下进行(例如，最大加热电源的50％)。在优选实施方案中，使用由Allegro微机系统(Worcester.MA)获得的集成线路(UDQ 2559)。具有微处理机44的系列信息设备57(通过滑环组件56)，优选使用由荷兰Eindhoven.Philips Labs开发的I2C(内集成线路)系列总线驱动方案。也可以使用，如RS232D、RS422等或其它的另外方案。控制电子件52起到监测传感器68和控制加热器64两种功能的作用。中心控制电子件52是一个微处理机55(它与存储器51相连)或者是以能通过I2C系统总线驱动与染色装置微处理机44连通时，能监测加热器温度传感器68和在特定时间需要提高载片温度时向加热器64供电能的其它数字的电路系统。这种微处理机的实例是由AZ,Chandler,Microchip Technology lnc.获得的PIC16C64A。当与染色系统微控制器(参看图14)提供的定点温度(或目标温度)相比较时，该程序必须控制对应于加热器温度传感器的加热器。根据存储器51中定点温度47的搜索表，微处理机55确定如何控制各加热器。从具有微处理机44的系列信息设备57接收到搜索表47中的定点温度。微处理机55从传感器68获得实际的温度，而后，根据实际温度和定点温度之间的差异改变加热器64的控制。这种加热器的控制可以严格开关(即，如果其传感器温度低于定点，则开启加热器，如果其传感器温度高于定点，则关闭加热器)，或者可利用百分比、积分和/或微分控制系统计算以提供更可控制的和精确的应答。
电源分配和控制反馈系统必须是以使热平台能够精确地调整以模拟热循环工艺中的特征(例如，就地PCR)并能够迅速递升温度和冷却降低温度(例如，在3分钟内从37℃～95℃，在5分钟内冷却到同一范围)，这些特征对于成功地ISH染色，尤为重要。
为了使各载片的温度调到目标温度，处理器通过改变对各载片的加热以控制载片的温度，在优选实施方案中，通过改变加热器的输出功率以实施对各片的加热改变。参照图14，该图给出了各个载片加热控制的流程图。如方框84所示，获得各个载片的目标加热温度(或设定点温度)。在优选实施方案中，目标温度是从微处理机42传送到控制电子件52。目标温度也可以由操作人员另外输入或通过载片上的条型码读出。如方框86所示，通过温度传感器68指示，确定载片温度是否高于目标温度。如果是，关闭加热器，如方框88所示，另一方面，根据实际温度和目标温度之间的不一致，可以改变由加热器产生的加热量。例如，可以减少加热器的工作循环。通过脉冲宽度调节，可以改变加热器的工作循环(例如，可以减少加热器的工作循环，从50％(此时加热器运行时间的50％)到25％工作循环(此时加热器运行时间的25％))。在另一变化方案中，如果实际温度明显高于目标温度或如果想要更精确的温度控制则在关闭加热器之后，打开冷却器。
在另一实施方案中，处理器通过改变加热器和载片之间的热的传递量而控制传递到各载片的热量。作为一个实例，微处理机可改变加热器和载片之间缓冲剂的热传递特性，来改变传递到载片的热量，并改变载片的温度。
如果载片温度低于目标温度，加热器打开，如方框90所示，加热器的控制可利用百分比的、积分的，和/或微分的控制系统的计算以提供更可控制和更精确的应答。在优选实施方案中，由加热器产生的热量是基于实际温度和目标温度之间的差异。例如，根据电流温度和目标温度之间的温差，加热器可以启动100％，50％，等的工作循环。因此，如果实际温度高于目标温度2℃以上，则加热器启动为满负荷循环。当实际温度接近目标温度，则减少加热器的工作循环，以使对载片产生低的总热量。此外，一旦加热器达到目标温度，则处理器55通过确定实际温度和目标温度之间的差异而维持控制，如方框86所示。这种循环继续直到载片的加热时间已到达为止，如方框92所示。因此，如果载片计划要加热到预定的时间，则载片的温控制要进行到预定时间量完全结束为止。
然而，根据载片的特定目标温度，以实验方式确定维持载片在目标温度时所需要的热量，例如，当根据改变加热器的工作循环而改变热量时，则根据目标温度确定加热器的特定工作循环。将这些值存储在搜索表47中。因此，当载片的实际温度接近目标温度时，工作循环减少到搜索表47中的实验值。以这种方式，载片温度可以从当前温度转变成目标温度。
另一方面，温度的控制可以是严格地开关(即，加热器的传感器温度低于目标温度，启动加热器，而当加热器的传感器温度等于或高于目标温度，则关闭加热器)或温度的控制可以是按比例的(即，改变加热器产生的热量，而不是工作循环；以至于使加热器输出其总加热电能的一部分，例如加热器总输出功率的50％)。
参照图15，表明单个载片的冷却控制流程图作为本发明的另一种实施方案。如方框94所示，得到对单个载片的目标冷却温度。目标温度从微处理机42传送到控制电子件52，目标温度可以由操作人员输入或通过载片上的条形码读出。如方框95所示，根据系统的操作，载片可以由环境空气冷却，或者由冷却平台冷却，等等。
如方框96所示，类似于图14，当由温度传感器68指示，确定载片温度是否低于目标温度，如果是，则关闭冷冷却器，如方框94所示，另一方面，根据实际温度和目标温度之间的差异，可以改变冷却器产生的冷却量，例如，可以减少冷却器的工作循环，通过调节脉冲宽度，可以改变冷却器的工作循环。
如果载片温度高于目标温度，则冷却器启动，如方框98所示。冷却器的控制，类似于加热器的控制，可以使用比例、积分、和/或微分控制系统计算，以提供更可控制和更精确的应答。在一个实施方案中，产生的冷却能力是基于实际温度和目标温度之间的差异。例如，根据电流温度和目标温度之间的温度差异，冷却器可以启动100％、50％，等工作循环。因此，如果实际温度高于目标温度2℃以上，则启动的冷却器为满负荷循环。当实际温度接近目标温度，则减小冷却器的工作循环，从而对载片产生较低的总冷却能量。此外，一旦冷却器达到目标温度，则处理器55通过确定实际温度和目标温度之间的差异而维持控制，如方框96所示，这个循环继续直到超过载片冷却时间已达到为止，如方框100所示。
滑环组件滑环组件56是使用旋转的银环和银-石墨刷的技术。滑环必须有足够的尺寸(约3″直径)和容量(每个环约20安培)以承载I2C数字控制信号(2环)、对逻辑的电能(2环)和对加热器的电能(2环)。适于这种用途的滑环可从Fabricast,Inc South ElMonte CA,Airflyte Electronics,Bayonne,New Jersey,Litton Poly-Scientific,Blacksburg,VA和其它地方获得。电缆57可操作地将滑环转动体连接到控制电子件52(图11)。定子支架59是使用机器螺栓或类似部件(未示出安装)，将定子固定到装置10上。参照图16，表示滑环组件56的纵向部分视图，具有传输数据的导件49，逻辑电能和加热器电能，如图5和16所示。
参照图3，在装置10中一般安装有如下部件，如美国专利申请序号No.08/995052中描述的液体CoverslipTM分配喷嘴37、步进电机61、淋洗分配喷嘴36，液刀38、条形码阅读器40、空气涡流混合器42、和洗涤容量调节器39。以上参考申请中公开的缓冲加热器已被去除。整体液体组件22(图2)优选制成能容纳许多液体的接收器，像ISH分析所需要的，包括SSC、DI水，和细胞调节缓冲剂。容积调节喷嘴39是制成可使用多种液体的。
本发明的方式与美国专利申请序号No.08/995052中公开的方式不同，其中，在使用了洗涤缓冲剂后从片上被擦掉，以致使其不稀释下一次使用的试剂。本发明喷嘴36的目的是将液体喷射到载片的端部，由此形成液体真空从而引起通过毛细作用而抽吸液体。
定义本文中所用的如下术语具有如下意义“组织”是指能够安装在标准玻璃显微镜载片上的细胞集合体，包括，并不仅限于，器官切片、肿瘤切片、体液、涂片、冻片、细胞学制剂、和细胞系。
“目标的分子”是指在细胞中发现的可检测的分子，包括，但不仅限于核酸，蛋白质、碳水化合物、脂类、和小分子。
“染色”是指任何生物的或化学的实体，当应用到组织中的目标分子上时，使得分子在显微镜下可以检测。染色包括，但不仅限于可检测的核酸探查物，抗体，和染料。
“进行处理”或“处理”都是指对组织使用染色，以及与这些使用有关的其他工艺方法，包括，并不限于，加热、冷却、洗涤、漂洗、干燥、蒸发抑制、脱蜡、调节细胞、混合、培育，和蒸发。
“使自动化”或“自动化”是指活动主要由计算机或机器驱动完成，基本没有人工介入。
应用和操作在操作中，装置10可用于进行就地杂化(ISH)，就地PCR，免疫组织化学分析(IHC)，以及各种化学(非生物的)的组织染色技术。而且，本发明的加热系统，在单一运行时，不管它们要求不同的温度，仍可以使用上述技术中的2种或多种。
就地杂化显然是一项使用本发明而有利应用的技术，它可以单独地，也可以与其他技术组合地使用，由于ISH分析中的许多步骤，在精确的时间周期内必须仔细控制温度，对于充分地使DNA变性，在精确的时间的周期内需要精确的加热量，以使之产生后续的杂化，而不使过热到使细胞形态降解的温度点。不同的样品对于变性要求不同的温度，这取决于怎样去制备和固定组织。变性，杂化，和后继杂化洗涤等步骤，都要求单独的温度，这取决于要试验的探查物和组织的特定要求，这些温度要求如上述讨论的可通过加热器的单个控制面进行控制。DNA探查物要求，并主要是在30～55℃间进行杂化，而RNA探查物主要是在高温下杂化，杂化时间从30分钟到24小时，这取决于目标拷贝数，探查物大小和样品类型，对于细胞遗传学制剂的标准变性是在约72℃下进行2分钟，而对于组织片段，条件是从55℃～95℃,2～30分钟。后继杂化洗涤温度，从37℃～72℃，2～15分钟，盐浓度为0.1×～2×55C。探查物检测温度，可从环境温度变到42℃,2～30分钟。
低重量的平板60和加热器能使载片迅速地加热和冷却，结果使载片上的组织也加热(即，在180秒内，从37℃～95℃)。加热和冷却的迅速增加，可增加就地变性的效率。通过迅速加温促使探查物迅速退火到目标，使探查物特性增加，伴随而来的是，本底降低，所得试验的质量大大改进。ISH可以用于检测DNA，cDNA，和高复制的mRNA也可以应用于涂片、组织、细胞系，和冷冻片段。通常，将样品固定在1″×3″的玻璃载片上。
DNA的杂化或变性对于组织染色过程是绝对需要的，要求温度迅速达到92-100℃，并进行精确地控制和维持，热平台使显微镜载片上的待处理组织，在低于180秒内达到所要求的温度范围，其精确度为±2℃。在杂化组织中迅速降低温度对成功的染色和诊断也是重要的。为使要求的温度在420秒以内达到37℃，可以加入风扇或其他快速冷却的特征。
本发明的装置可以在同一次试验中放置多种类型的样品并进行ISH试验，而不必考虑每个ISH试验的单独要求(即，杂化温度37-45℃的严格要求，和洗涤浓度)。该系统在同一试验中可对不同载片进行一个以上的化学检测。本文所用的“ISH”包括荧光检测(FISH)和非荧光检测(例如，明视野检测)。
也可以使用装置10，以对某组织片段同时使用ISH和IHC染色，而可在同时观察遗传变异和蛋白变异。这是有利的，例如，在检测乳腺肿瘤切片中，对于HER-2/neu的基因增殖和蛋白质表现，两者都已评价为具有临床的意义，参看Oncologist 1998；323 7-253,Ross等人的“The Her-2/neuOncogene in Breast Cancer”。
通过加热平台的迅速加热和冷却使得本发明也能够用于就地PCR(聚合酶链反应)，该反应要求高和低温度的重复循环。PCR的限定是要求在增殖之前提取目标DNA或RNA，以排除相关分子导致样品的细胞学或组织学的特征。就地PCR排除了因ISH的细胞定位能力与PCR的极端敏感性相结合而受的限制。该技术已描述于Nuovo等人的美国专利No.5538871中，引入本文作参考。
装嵌在石蜡中的片段，第一步要求对装嵌组织进行脱蜡。使用加热平台，排除使用苛刻的化学药品，如二甲苯，通过使用精确控制的各个载片的加热，使嵌入组织中的石蜡溶出，漂浮在水溶液中，再将它漂洗出去。石蜡的密度低于水，一旦液化，通过液体缓冲剂上升到组织样品上面，并漂浮在该液体顶部。然后，将液体石蜡从显微镜载片中除掉，并通过液体流而离开组织样品，它可以是液体或气体，在液体石蜡上面，该步骤的详细情况已公开于美国专利申请序号No.60/099018中(1998,9,3递交)，引入本文作为参考。也可以使用类似技术以去除嵌入材料，不是石蜡，而是如塑料，虽然加入蚀刻试剂是必要的。
已发现在适当的水溶液中用加热平台50以加热组织能够改进对细胞中的目标分子(蛋白质、核酸、碳水合物、脂类、或小分子)染色的可达性。通过因保藏组织中所用的乙醛的分子交联或固定剂引起的确定中的其他变化，而可能引起的缺乏可达性，由于抗原蛋白的化学变态，抗原的交联会使抗原性丧失。这种改进(生物的或化学的)对目标分子染色的可达性的方法本文中称为“细胞调节条件”。对于DNA目标，优选的调节溶液是柠檬酸盐缓冲剂，优选的温度可高达约95℃，优选的加热时间约为1小时。对于蛋白目标，优选的调节溶液是柠檬酸盐缓冲剂，优选的温度高达100℃，约42分钟。使用加热平台加热组织样品可降低乙醛处理组织中的交联度，这样改进的抗原通过相应抗体而逆转到可识别的形式，因此提高了染色。对于RNA目标，优选的调节溶液是柠檬酸盐缓冲剂，优选的温度高达75℃，约1小时，作为细胞的调节溶液，可以使用许多替代物取代柠檬酸盐缓冲剂。这种溶液的目录列于Analytical Morphology,Gu,ed,Eaton PublishingCo.(1997).PP.1-40。溶液一般是已知的克分子浓度、PH、和组成。优选向调节溶液中添加十二烷基硫酸钠盐(SDS)、乙二醇。
用本发明的装置完成的就地杂化(ISH)、就地PCR、免疫组织化学(IHC)、免疫化学(HC)，或酶化学(EHC)方法，主要包括如下步骤。
1)将条形码加到指明就地杂化、就地PCR免疫组织化学、免疫化学、或酶化学的过程的载片而制备载片。
2)将一批载片插入装置中，将每个载片装到载片支架上。
3)关闭装置，开始处理过程。
4)如果载片要在装置被脱蜡而作为予处理，则每个载片将干燥加热到60℃以上，随后干燥加热，用约7ml的DI水洗涤载片，残留下约300μl的水溶液，然后用约600μl的蒸发抑制液覆盖各片，再使各载片在60℃以上保持6分钟，然后再用约7ml DI水漂洗，再用600μl蒸发抑制液覆盖。温度降低到37℃。载片已被脱蜡，并准备作为指出过程的下一项。
5)要细胞调节的各载片，用约7ml DI水漂洗涤。装置中容积减少的固定物，从300μl残存容积降到约100μl，使用装置中的容积调整的定位器，将200μl细胞调节溶液加到载片上，然后，载片将接受约600μl的蒸发抑制液，载片温度将升高到37～100℃范围的预定温度，而流体循环将开始，并每6-8分钟重复循环，时间达2小时，如在方案中设定的，将各载片冷却到37℃，并用约7ml APK洗涤液漂洗。在这时，各载片可为指出过程的下一项备用。
6)当各载片暂停在试剂应用区时，适宜的试剂容器由试剂圆盘传送带移动到试剂应用站。向载片上提供计量容积的试剂。试剂液体通过蒸发抑制液层而到达位于下面的液层。
7)然后载片的圆盘传送带开始，将各载片直接移动到涡流混合站的前面，涡流混合器喷射搅动在蒸发抑制液层下面的载片表面上的试剂。
8a)对就地杂化如果方法需要蛋白质消化，则将各载片用约7ml APK洗涤漂洗，残留～300μl的缓中剂。然后，载片再接受～600μl的蒸发抑制液，重复步骤6和7中描述步骤，以消化酶的应用。37℃下，可选择的培育时间为2～32分钟。各载片用～7ml的2×SSC缓冲液漂洗，残留～300μl缓冲剂，使用容积减少的固定物使容积从～300μl降到～100μl。重复6-7中描述的步骤以使用探查物。然后，载片接受～600μl的蒸发抑制液，升高载片温度到37℃～95℃范围的特定温度，以使目标物和/或探查物分别变性或伸展。
可选择的培育时间为2分钟到18小时。
使用杂化后开始漂洗，使用者严格选择，包括可选择的盐浓度，为2×,1×,0.5×,0.1×SSC，温度范围37～75℃。
随后探查步骤，用1×APK洗涤缓冲剂洗涤各载片，然后接收～600μl的蒸发抑制液。在某些标记的探查物中，就如在FISH中那样，直接检测探查物，并使用下面的适当检测技术，对ISH用抗半抗原抗体间接检测。
如果要求净化，则在对探查物的检测步骤之后，用DI水漂洗各载片，并用去污剂净化各载片的蒸发抑制液。再次用DI水漂洗各载片，并使用容量降低定位器去除残留的容量。在37℃或高于37℃下，加热干燥各片，直到所有水份从组织、细胞或涂片中蒸发掉。
8b)对就地PCR如果方法要求蛋白质消化，则将各载片用～7ml的APK洗液漂洗，残留～300μl的缓冲剂。然后，载片接受～600μl的蒸发抑制液，重复步骤6和7中所述步骤以消化酶的应用。37℃下可选择的培育时间范围为2分钟到32分钟。
各载片用～7ml的DI水漂洗，残留～300μl的缓冲剂，使用容积减少定位器，使容积从～300μl降到～100μl。重复步骤7中所述步骤以加强试剂的应用。为在37℃或之上输送到100μl残留的载片容积，配置加强试剂。然后，载片将接受～600μl的蒸发抑制液。在2分钟以上，将载片温度升高到37～95℃的特定温度范围，开始PCR反应，加热循环达到30个循环，由55℃的1.5分钟开始到89℃的45秒。
在就地PCR之后，各载片进行就地杂化，如在有关部分中描述的。
8c)对IHC、HC、EHC的方案，将各片用～7ml的1×APK洗液或适当缓冲剂进行漂洗，残留～300μl的缓冲剂。可以使用或不使用容积减少定位器，使容积从～300μl降低到～100μl。然后，载片将接受～600μl的蒸发抑制液。重复步骤7中所述步骤以使用抗体或其他试剂。
可选择的培育时间范围为2～32分钟。
可选择的培育温度范围为37～95℃，这取决于是否要求细胞调节或脱蜡。
整个工艺，各载片都用1×APK洗液或适当的缓冲剂进行漂洗，然后接受～600μl的蒸发抑制液。当用荧光时，蛋白质、碳水化合物、和酶可直接标记，或者使用适当的检测技术间接地标记。在规定的染色工序结束时，制备载片以用自动净化工序以盖玻片、已盖玻片、在显微镜下观察以适当染色，它们是DNA/RNA、蛋白质、碳水化合物或酶。
以上列出的工序，包括各步骤的顺序，各试剂的应用，和上述温度参数，优选是由生产者预先编好的程序输入到主机内。某些参数，如反应时间，可由使用者任意变动的。试验的初始程序是灵活的，足以允许方案的复杂操作，并在将探查物添加到目标组织或样品之前或之后添加多种试剂(5-6种试剂)。
在试验运行中或运行之间，温度控制为目标温度的±1％，并如上已描述的可以控制。操作者在同一试验中可进行多个复合的ISH方案，这包括能够对ISH方法设计方案程序，该方法是在相同的变性温度下运行。同样，该系统也便于操作者校正载片温度，而不必使装置有重大拆卸。通过可靠的选取而保护使用者限定的ISH方案的方案变化。该系统对于载片和试剂系统是条形码驱动。也还有一个选择余地，操作者对所有主要的硬件功能可进行人工控制，包括试剂分配、洗液分配、液盖片(高低温度)分配、载片的转位和温度控制，这就使使用者有助于查找故障。使用者限定的方案可使操作者控制反应各相的温度，除了检测温度。软件包括预先编制的优化方案存储在软件中，以使连续引入优化的全部探查物。
实施例以下非限定性的实施例是进一步说明本发明并其详细使用和应用实施例1使用自动的就地杂化对人类papaloma病毒的高危害菌株的检测一种颈涂片，通过标准收集装置，如细胞刷或Thin PrepTM载片法(CytecInc)收集的，通常用巴帕尼科拉乌染剂(papanicolau)染色法染色(PapSmear)，用探查物就地杂化设置特定的高危害HPV型菌体。将样品载片按照本发明装入装置的载片夹持器上(以下称“染色装置”)。设置该系统运行HPV就地程序。该程序完成就地反应的所有步骤，一旦程序开始，不需要来自使用者的介入。
染色装置首先进行载片的予处理室温下，1×APK(10×APKVentana P/N250-042)漂洗和使用CoverslpTM，然后，在37℃下，用蛋白酶I(Protease 1)进行4分钟的蛋白酶消化，随后以2×SSC漂洗步骤。2×SSC漂洗后，使残留的载片容积从300μl减少到约100μl，并使用CoverslipTM。从Ventana确定分配器向载片中加入与杂化溶液予混合(cocktail premixed)的FITC-标记DNA探查物合剂，使样品和载片加热到72℃，4分钟，对探查物和样品DNA进行变性。然后染色装置迅速将载片温度降至37℃,37℃下杂化2小时。染色装置从载片上去除探查物混合物和CoverslipTM，并进行后杂化洗涤。向载片添加后杂化洗液(2×SSC)和盖片(coverslip)，装置将载片加热到45℃,10分钟。染色装置去除后杂化洗液，并开始检测步骤。首先，染色装置用1×APK漂洗各载片，并施加盖片。然后，由分配器向载片施加抗-FITC(SerotecP/N MCA1320)抗体，并将载片培育20分钟，同时加热载片37℃，接着通过APK漂洗和使用盖片，加入生物素标记的第二抗体，并在37℃下培育8分钟，接着也进行APK漂洗，使用盖片，将Streptavidin-Alkaline磷酸盐共轭物放置在载片上，染色装置将载片在37℃下培育30分钟，APK漂洗后，向载片加入Ventana Blue检测剂，并在室温下培育20分钟，Ventana Blue Kit(P/N760-060)是生物素标记的第二抗体、Streptavidin-Alkaline磷酸酶和NBT/BCIP基质。用DI水漂洗片，利用装置加热干燥载片，在这点，在片上施加核速红(Nuslear Fast Red)复染剂，室温下培育5分钟，载片再用水漂洗。
实施例2利用自动就地杂化对石蜡内嵌组织中的埃-巴二氏病毒(EBER)的mRNA进行检测将脾(Spleen)#EBV 37A切成5μm的切片，并放置在超过霜冻(supperfrost)的玻璃染色片上。将样品载片按照本发明装置载到装置的载片夹具上(以后本文称为“染色装置”)。将染色装置程序编制以就地设计进行EBER。该程序将完成就地反应的所有步骤，一旦程序开始，不要求使用者的介入。
染色装置首先进行脱蜡将各载片干式加热到65℃，6分钟，室温DI水漂洗载片，残留300μl容积和600μl液盖片，防止蒸发并保护载片样品不干燥，温度保持在65℃以熔掉石蜡。用DI水漂洗载片完成细胞调节，然后，降低残留容积，并加入200μl细胞调节缓冲剂(柠檬酸盐缓冲剂)和600μl液体CoverslipTM，将载片加热到75℃,40分钟内每8分钟重新施加一次调节缓冲剂和CoverslipTM，将载片温度冷却到37℃，并用室温的1×APK洗液(Ventana 10×APK P/N250-042)漂洗载片，留下≈300μl残留载片容积，并施加≈600μl液体盖片。在37℃下用蛋白酶I(Protease 1)(Ventana P/N250-2018)进行8分钟的蛋白酶消化。消化之后，用室温2×SSC(20×SSCVentana P/N650-012)漂洗载片，使用染色装置中的容积减少定位器，将残留载片容积从≈300μl降到≈100μl，并向载片施加≈600μl的液体盖片，用于目标mRNA进行EBER的Dig-标记的(Boehringer Mannheim cat#1417231)寡核苷酸探测剂，与杂化溶液进行混合，并将试剂放置进Ventana使用者限定的分配器(Ventana P/N 551-761)中。向样品施加探测剂，并将载片加热到75℃,4分钟，使寡核苷酸和样品mRNA解链，染色装置将载片温度调到37℃，以杂化2小时，染色装置从载片上去除探测剂溶液和CoverslipTM，并进行3次后续杂化洗涤。后续杂化洗液包括在42℃下用2×SSC洗涤载片4分钟，然后用1×SSC,42℃下洗涤4分钟，最后42℃下用0.5×SSC洗涤4分钟。然后，染色装置进行检测步骤。用1×APK洗涤载片，并施加盖片。向载片施加抗-Dig抗体(Sigma P/ND-8156)，并在37℃下培育16分钟，接着用1×APK洗涤并使用CoverslipTM。然后向载片加入生物素标定的第二抗体，在37℃下培育8分钟，接着用1×APK洗涤和使用盖片，第二抗体后，施加Streptavidin-Alkaline磷酸盐共轭物，并在37℃下培育30分钟。在APK洗涤和使用盖片后，向样品施加Ventana Blue检测试剂，并在37℃下培育20分钟。然后将载片用水洗涤，并用装置加热干燥，生物素标定的第二抗体、Streptavidin-Alkaline磷酸酶，和检测试剂是Ventana Blue Kit(Ventana P/N 760-060)的组份。样品脱水后，用玻璃盖片盖住载片，并进行显微镜观测。
虽然本文描述了本发明的某些优选实施方案，但是，很明显，本技术领域的技术人员对所述实施方案的变动和改进，不偏离本发明的精神和范围的都归属于本发明。因此，认为本发明是仅限定到所附权利要求和法律适用条款所要求的范围。
权利要求
1．一种对载带在许多载片上的组织样品进行处理的方法，包括对所述各载片提供多个加热器用以加热，其中，每个载片的温度可独立控制，和处理所述组织样品，其中，所述处理包括至少通过所述加热器之一加热一载片。
2．根据权利要求1的方法，其中所述处理步骤还包括使用选自核酸探测剂、核酸引物、抗体和染料中的一种可检测的染色。
3．根据权利要求1的方法，其中所述的处理步骤还包括选自洗涤、漂洗、干燥、覆盖、混合、培育、和冷却中之一的自动过程。
4．根据权利要求1的方法，其中至少所述加热器中之一能够将载片加热到至多达94℃的温度。
5．根据权利要求1的方法，其中所述组织样品是选自肿瘤切片、器官切片、冷冻切片、体液、涂片、细胞学制剂、和细胞系中的样品。
6．根据权利要求1的方法，其中所述处理步骤还包括施加流体以去除石蜡的步骤。
7．一种向多个生物材料自动施加的装置，该装置包括对多个载片中的每一个的单独加热单元，其中，每个单独加热单元具有监测和控制生物材料温度的装置。
8．加热生物材料的装置，包括固定到平台上的多个加热器，其中每个所述加热器都进行热隔离，防止来自相邻加热器的热传递。
9．根据权利要求8的装置，其中所述平台是圆盘传送带。
10．一种同时处理二个或多个装有组织样品的载片的方法，包括步骤(ⅰ)配有二个或多个加热单元以对需要处理的载片进行加热，其中每个单元的温度由计算机单独控制，(ⅱ)用所述处理的温度参数编制计算机程序；(ⅲ)从计算机选择二个或多个要进行的处理；(ⅳ)同时进行所述处理。
11．根据权利要求10的方法，其中所述的处理选自DNA变性、DNA复原，探测剂杂化、和后杂化洗涤。
12．一种从固定在载片上的组织切片中去除内嵌介质的方法，包括步骤(a)加热载片，和(b)自动向载片施加流体流。
13．一种改进对固定到载片上细胞中的目标分子的染色的可达性的方法，包括步骤(a)加热载片，和(b)自动向载片施加水溶液。
14．一种进行就地PCR的方法，以对固定在显微镜载片上的细胞中的目标核酸进行扩增，包括步骤有(a)提供权利要求7的装置；(b)向所述细胞施加一组PCR试剂；(c)使用所述加热单元以使所述细胞受到热循环，足以扩增目标核酸；知(d)检测所述扩增的目标核酸。
15．一种用于对多个显微镜载片保持不同目标温度的显微镜载片加热系统，包括用于多个载片的每一片产生热输出的加热单元，用于多个载片的每一片的温度传感器；和与温度传感器连通的处理器；和用于对多个载片的每一片改变加热单元热输出的装置，用于改变与处理器连通的装置。
16．权利要求15中的显微镜载片加热系统，其中用于改变加热的装置包括用于改变加热单元的工作循环的装置。
全文摘要
本发明提供一种自动操作对多个固定在显微镜载片(37)上的组织样品进行染色或处理的装置和方法,根据本发明通过加热系统单独进行各载片的温度控制,该装置包括辐射状固定在用于加热各载片(37)和传感每个温度的圆片传送带(34)上的加热平台(64),如果需要,加热系统也能自动脱蜡。
文档编号G01N35/10GK1297529SQ99805028
公开日2001年5月30日 申请日期1999年2月26日 优先权日1998年2月27日
发明者威廉·理查兹, 查尔斯·D·莱米, 金伯利·克里斯坦森, 埃塞尔·R·麦克雷 申请人:文塔纳医疗系统公司