专利名称：霍乱毒素b和肠毒素b的肽片段作为疫苗佐剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种物质。
具体而言，涉及一种医药中十分有用的能展示一种或多种性质的物质。
例如此物质能作为毒素引起的腹泻的免疫调制剂和/或佐剂和/或者抑制剂。
具体而言，本发明涉及免疫调制物质在调节免疫应答，例如和自身免疫疾病相关应答的中的应用。
再具体而言，本发明涉及此物质作为佐剂和一种相关或无关抗原时一起的应用。
更具体而言，本发明涉及这种物质在抑制毒素引起的腹泻中的应用。
本发明还涉及对能和此物质相互作用的试剂筛选的分析。
背景技术：
大肠杆菌(大肠杆菌)热不稳定肠毒素(Etx)和它的同源物来源于霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的霍乱毒素(Ctx)都是和宿主细胞表面糖脂受体结合的蛋白毒素。每种毒素由六个非共价结合的多肽链组成，一个A亚基(27kDa)和五个B亚基(11.6kDa)，B亚基能和哺乳动物细胞表面GM-1神经节苷脂受体结合(Nashar et al 1996Proc Natl Acad Sci 93:226-230)。A亚基为毒性基团，有腺苷二磷酸(ADP)ADP-核糖基转移酶活性，而B亚基(EtxB和CtxB)为无毒寡聚体，能结合和交联细胞表面普遍存在的神经节糖苷脂GM-1，促使A亚基进入细胞。
同A亚基的弱免疫原性相比，EtxB和CtxB都有很强的免疫原性和各自的全毒素，当和无关抗原结合时，Etx和Ctx(包含A亚基和B亚基)是强有效的佐剂(Ruedl et al 1996 Vaccine 14:792-798；Nashar et al 1993 Vaccine 11:235；Nashar and Hirst 1995Vaccine 13:803；Elson and Ealding 1984 J Immunol133:2892；Lycke and Holmgren 1986 Immunology 59:301)。因为它们的免疫原性，EtxB和CtxB已被用作其它抗原决定簇和抗原的载体(Nashar et al 1993 ibid)，还被用作霍乱和大肠杆菌介导的腹泻疾病的疫苗组分(Jetborn et al 1992 Vaccine 10:130)。
为了开发抗霍乱毒素和大肠杆菌热不稳定肠毒素的疫苗，一些关于EtxB和CtxB亚基的优势免疫表位的研究已经进行。下面的公开内容显示了这个领域已经进行的工作。
英国专利申请2415419A公开了一个霍乱毒素和大肠杆菌热不稳定肠毒素的合成疫苗，它包含一个载体和一段相当于CtxB序列的合成肽段的偶联物。
WO85/02611公开了一个相当于EtxB特定序列的合成肽，被认为是一个有效的偶联物或是产生抗B亚基抗体的活化组分，可以保护宿主动物不受肠毒素的侵染。
WO89/10967公开了一个氨基酸序列，代表CtxB的50-64位氨基酸，在疫苗形成中能和一个异种有机体，如鞭状体(Flagellum)和沙门氏菌属(salmonella)的表位结合，提供保护，从而不受异种有机体的侵染，或是有机体抗原引起的条件变化或紊乱。
WO90/03437涉及一个CtxB亚基与异种抗原的活性序列融合形成的杂种蛋白，异种抗原被认为在接种疫苗时有意义，尤其利于异种抗原在肠环境中的稳定。
WO94/06465涉及一个氨基酸序列，通过或不通过一连接物而连接到一个合适的载体上，这样，连接了载体的氨基酸序列便能产生一个调理或保护性的免疫应答。
WO95/29701公开了一个霍乱弧菌(Vibrio cholera)的疫苗，它是一个包含霍乱毒素B亚基(CTB)或是它的一个合成肽段的偶联物，例如CTP3，它包含连接到一个惰性载体上的B链的50-64位上的氨基酸。
WO96/26282公开了一个表达系统，它表达源于重组菌株博德特氏菌属(Bordetella)的基因产品，这个基因产品可以是霍乱毒素分子。
WO96/34893公开了一个EtxB和CtxB的杂合分子，它能作为有效的疫苗阻止或治愈个体的肠毒素引起的疾病。
WO98/21344公开了一个插入了一个抗原肽的EtxB亚基，在宿主动物中，这个嵌合的抗原-EtxB分子能引起这个抗原肽的抗体反应。
这些研究涉及的是以下运用(ⅰ)包含CtxB/EtxB部分序列的肽段或(ⅱ)包含偶联于第二实体(譬如一个抗原)的CtxB/EtxB序列的肽，第二实体能引起或放大对于该肽的免疫应答。因此这些文献涉及优势免疫表位CtxB/EtxB或其一部分在引起对这些亚基的免疫应答中的作用，增强由霍乱或大肠杆菌引起的腹泻疾病的免疫性。WO91/07979公开了一个包含部分CtxB和一个目标抗原的表位的嵌合蛋白，其目的是作为疫苗在受试者中引起对这个抗原的免疫应答。在这一点上，CtxB的部分被用作佐剂而不是免疫调制剂。因此，上述文献中没有涉及到CtxB/EtxB或其一部分作为调节免疫应答的免疫调制剂的运用。
我们已指出在免疫紊乱时EtxB亚基能作为免疫调制剂。例如，我们已经在WO97/02045中公开了EtxB亚基能结合在哺乳类细胞表面的GM-1神经节苷脂受体上，这种结合对不同淋巴细胞有不同效果，包括CD8+T细胞的衰竭(depletion)和B细胞的激活。而EtxB蛋白突变体(G33D)(缺乏GM-1结合活性)则无上述效果。由于缺乏GM-1受体的结合能力的突变体(例如EtxB(G33D))不能作为佐剂或免疫调制剂，因而，这些实验结果表明所有CtxB和EtxB相关的功能都在于CtxB和EtxB亚基和GM-1受体的结合能力，。这样，到此为止可以说明CtxB和EtxB的免疫调制作用和其它作用都是通过和GM-1的结合介导的。直到现在，仍然没有关于保留了GM-1受体结合能力却没有免疫调制作用的CtxB/EtxB突变体的报道。然而我们却惊奇的发现，并不是所有的CtxB和EtxB的作用都通过GM-1的结合来介导。
发明概述根据本发明，我们发现CtxB和EtxB的免疫调制作用和其它一些功能并不是通过GM-1结合介导。本发明的各方面将在权利要求书和以下描述与讨论中述及。
在本发明的一个方面，本发明提供了一种物质，该物质包括如下一或多种一段包含有SEQ ID No.2中的氨基酸序列的序列，或其变体，或其同源物，或其片段，或其衍生物，或其模拟物；此物质能以相同或相似于CtxB或EtxB的方式起作用；但这种物质没有GM-1的结合活性。
在本发明的一个优选的方面，本发明提供了一种物质，该物质包括如下一或多种包括SEQ ID No.2所示序列的氨基酸序列，或其变体，或其同源物，或其片段，或其衍生物，或其模拟物；该物质能以EtxB和/或CtxB环相同或相似的方式起作用；但该物质不和GM-1结合。
在本发明高度优选的一个方面，本发明提供了一种物质，该物质包括如下一或多种包含有SEQ ID No.2中的氨基酸序列的序列，或其变体，或其同源物，或其片段，或其衍生物，或其模拟物；此物质能以相同或相似于CtxB和/或EtxB上的β4-α2环的方式起作用；但这种物质没有GM-1的结合活性。
本发明中的物质可以是一段氨基酸序列或其化学衍生物。这个物质可以是一段合成肽或合成肽的变体，譬如retroinverso D肽。这种物质甚至可以是一个有机化合物或其它化学物质。以下的实例为SEQ ID No.2的模拟物。
本发明中的物质以相同或相似于CtxB或EtxB的方式作用。
“相同或相似”是一个定性而不是定量的含义。从这一点来讲，它可以有增强的结合力。
一种物质是否以相同或相似于CtxB或EtxB的方式作用的测定可以由本领域的技术人员很容易的确定。例如，这个测定可以是测量或决定它对细胞种群的影响，如淋巴细胞种群。这种影响可以包括但不仅仅局限于CD8+T细胞凋亡的诱导，CD4+T细胞激活的增强和B细胞的多克隆激活。另外，这种测定也可以建立在细胞表面标志物的决定和测量的基础上，这些标志物能显示胞内一定事件的激活(例如测定CD25表达的增加)。
本发明中的物质没有GM-1的结合活性。
GM-1结合活性的缺乏由本领域的测定可以由本领域的技术人员很容易的确定。例如，可以将GM-1结合在一个固相支持物上，让这种物质流过已被结合的GM-1，这种物质的洗脱液显示其不能和GM-1结合。在一个更优选的方面，该测定如WO97/02405中所述。
应当指出这种结合能力并不必依赖于全长CtxB或EtxB亚基的原初结合事件。带有全长CtxB或EtxB亚基时，原初结合活性是GM-1的结合活性。从这一点来讲，这种物质可以执行单一的结合事件。然而，这种物质可以拥有一种或多种结合能力。
优选地，这种物质是基本上分离的和/或基本上纯的。
这里，“分离的”和“纯的”是指分子，无论是核酸或氨基酸序列，它们被从其自然环境中分离，或至少从它们原本结合的成分中隔离或分离出来。一种蛋白可以和载体或稀释剂混合，但不影响这种物质所需的特性且还可以被看作是基本上分离的。
此发明基于这样一个惊人的发现一些能和GM-1受体结合的突变体缺乏免疫调节作用。这些突变体促进了CtxB或EtxB亚基作用机制，尤其是它们的免疫调节作用的阐明。
本发明的其它方面如下所述本发明的物质应用于医药。
本发明的物质用作免疫调节剂。
本发面的物质用作佐剂。
本发明的物质用作毒素引起的腹泻的抑制剂。
本发明的物质，其中该物质还包括一个抗原或抗原决定簇。
一种药物组合物，包括本发明的物质，视需要而定还可以混合有一或多种药学上可以接受的载体，稀释剂或赋形剂。
本发明的物质在制备用于治疗和/或预防和/或调节免疫紊乱和/或毒素介导的紊乱相关的疾病和/或紊乱的药物中的应用。
一种用于确定一种或多种能够和本发明的物质相互作用和/或影响本发明的物质的试剂的测定方法；其中所述测定包括将本发明的物质和待测试剂相接触；以及然后确定是否该试剂能够影响该物质。
一种用来本发明的测定方法所鉴定的试剂。
一种治疗方法，包括向需要治疗和/或预防和/或调节免疫紊乱和/或毒素介导紊乱相关的疾病和/或紊乱的受试者施用本发明的物质。
这些方面将在以下各段的标题中有所呈现。但是，每一段落讲授的内容并不局限于标题。
免疫调节剂这里的“免疫调节剂”指一种物质能通过诱导调节免疫应答，例如，对细胞如淋巴细胞的不同影响——优选地诱导CD8+细胞凋亡和/或CD4+细胞激活的增强和/或B细胞的多克隆激活。
“对白细胞的不同影响”可以包括但不仅仅局限在CD8+T细胞的耗尽(例如通过凋亡)，CD4+T细胞激活的增强和/或B细胞的相关激活。
优选地，免疫调节剂能对Th1和/或Th2相关的免疫应答病理反应进行负调。
优选地，免疫调节剂也能对粘膜表面抗体的产生进行正调。
佐剂这里，佐剂是指能非特异性增强对抗原的免疫应答的物质。
它也包括能影响一个实体，譬如抗原和/或抗原决定簇免疫应答程度的任一物质，通过改变抗原的抗原性，或是改变特定的反应力或宿主相关机制非特异性效应物，诱导宿主细胞中的免疫应答和/或是引导其到特定的方向。更为优选的一面，佐剂能用作粘膜佐剂。
优选地，佐剂能延长哺乳动物的抗原呈递或是提供一个持续的免疫记忆。
抗原这里，“抗原”指一个实体，当它被引入免疫活性宿主中，能刺激产生特定的抗体或是能和此实体结合的抗体。这个抗原可以是纯的物质，该物质的混合物或可溶性或颗粒状物质(包括细胞或细胞碎片)。从这一点来说，这个词包括任一适合的抗原决定簇，自身抗原(auto-antigen)，自身抗原(self-antigen)，交差反应抗原，同种抗原，异种抗原，耐受原，变应原，半抗原和免疫原，或为其一部分，也可以为其组合物，这些词通篇可以相互换用。
“变应原”包括任一能刺激变应反应及I型超敏反应的抗原。
一般的变应原来源于但不仅仅局限于豚草，黑麦，偃麦草，野燕麦，梯牧草，狗牙根(Bermuda)，旱地早熟禾，mugwortalder，桦树，欧洲榛，山毛榉，柏树，栎，橄榄，曲霉类，枝孢类，链格孢类，担孢子，子囊菌麦，黑麦，oatcat，狗，马，兔，豚鼠，仓鼠，鹦鹉，鸽子，鸭子，鸡，屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)，粉尘螨(D.farinae),Euroglyphus maynei，蟑螂，苍蝇，蝗虫，蠓，海鲜，豆科植物，花生，坚果，谷类，日用农产品，蛋，水果，西红柿，蘑菇，酒精饮料，咖啡，巧克力，青霉素，磺胺药物和其它抗生素，柳氮磺胺吡啶，氨甲酰苯，蜜蜂，黄蜂，蚂蚁和蚊子，血清，疫苗，造影剂，药物(包括抗气喘药物和抗生素)。抗原决定簇“抗原决定簇”在这里指抗原上能被抗体或T细胞受体识别的位点。优选地，它是来自蛋白抗原的小肽或其一部分。该术语也包括糖肽和糖类表位。它还包括被修饰了的氨基酸序列或能刺激识别整个有机体反应的碳水化合物。
如果这个抗原决定簇是一个能引起传染病的感染原(譬如细菌和病毒)的抗原决定簇，那将更为有利。
例如，如果这个感染原是EBV，那抗原决定簇将是gp340或gp350或一个潜伏蛋白的抗原决定簇(譬如EBNAs 1,23A,3B,3C和-LP,LMP-1,-2A和2B或是EBER)。如果感染剂是流感病毒，那抗原决定簇可以是一个外壳蛋白的(例如血细胞凝集素和神经氨酸酶)抗原决定簇，或是内部蛋白(如核蛋白)的抗原决定簇。如果感染剂是挑选自致肠病的，产肠毒素的，侵袭肠粘膜的，肠出血的，肠聚集性大肠杆菌中的，那抗原决定簇可以是细菌毒素或是粘连因子的抗原决定簇。
如果抗原决定簇来源于自身抗原，也是有利的。
试剂试剂可以是氨基酸序列或其化学衍生物。这种物质可以是有机化合物或其它化学物质。这种试剂可以是有义或反义核苷酸序列，也可以是抗体。在一个优选的方面，这种试剂可以是能与这种物质结合的细胞受体。
毒素引起的腹泻的抑制剂术语“毒素引起的腹泻的抑制剂”包括任一能影响Etx/Ctx全毒素活性的物质，它可避免Etx/Ctx的病理效果，譬如腹泻。
发明详述本发明展示以下的惊人发现(ⅰ)本发明的物质能作为毒素引起的腹泻的免疫调节剂和/或佐剂和/或抑制剂，它能影响肠毒素介导的腹泻。
(ⅱ)本发明的物质能以相同或相似于CtxB/EtxB的方式作用。本发明涉及的物质的活性由“所谓的”CtxB和EtxB上的β4-α2环来介导，这个环很灵活，含有45-65个氨基酸序列。
(ⅲ)EtxB分子在β4-α2环上的三个不同的位点发生突变(51,56和57位)，它保持GM-1结合活性，但是缺少其它活性，譬如毒性，对CD25的正调能力，和对CD8+T细胞凋亡的诱导。另外，包含突变B亚基的Ctx全毒素也能诱发生电氯化物的分泌，这是介导腹泻的最初分泌事件。这些结果是出人意料的，因为通常认为易变的环只在连接二级结构的两个部分时起作用，本身很少具有重要的功能。
(ⅳ)这种物质的结合能力并不必依赖于全长的CtxB和EtxB的初始结合事件。带有全长的CtxB和EtxB时，初始结合活性是GM-1的结合活性。
CtxB/EtxB毒素这里，“Ctx”是指霍乱毒素，“CtxB”指霍乱毒素的B亚基。在其它文章里，它们可能被分别称作CT,Ct,CTB或CtB。
这里，“Etx”是指大肠杆菌热不稳定肠毒素，“EtxB”指Etx的B亚基。在其它文章里，它们可能被分别称作LT,Lt,LTB或LtB。
β4-α2环一方面，本发明涉及一种包含EVPGSQH(SEQ ID No2)序列的物质，它的作用方式与EtxB或CtxB相同或相似，或其变体，或其同源物，或其片段，或其衍生物，或其模拟物，但缺乏GM-1结合能力。
不拘于原有理论的基础上，我们认为五个EtxB/CtxB亚基对GM-1的结合力为一种很强的相互亲和力，这使得EtxB/CtxB有相对较弱的第二结合力。这种结合是由EtxB/CtxB上的β4-α2环来介导的。EtxB/CtxB上的β4-α2环的结构可参见(Sixma etal.J.Mol.Biol(1993)230；890-918)上的Etx分子结构，如
图1所示。
总之，Etx或Ctx的每一个B亚基都包含一个N-末端螺旋(α1)，两个三链反向平行折叠(折叠Ⅰ，包括链β2,β3,β4；折叠Ⅱ，包括链β1,β5,β6)和一个长的α-螺旋(α2)。这两个β折叠组成一个β桶。根据折叠的两个末端，B亚基中连接二级结构这些部分的环被分为两类。亚基的一个末端，“窄”(或“A”)端，环比较短，包括β1-β2,β3-β4和α2-β5连接及C-末端；亚基的另一端较宽，环较长，连接二级结构元件α1-β1,β2-β3,β4-α2。连接β4-α2的长环(以下称β4-α2环)，包括51位谷氨酸(Glu 51)到59位的天冬氨酸(Asp59)，一直延伸到β折叠平面下。这个环非常灵活，但据(Sixma et al(Nature(1992)355；561-564)，当此环和乳糖结合后，灵活性会明显降低。本发明展示EtxB/CtxB的β4-α2环，有第二结合活性，所以当它被从EtxB/CtxB分子的其它部分(例如肽)分离出来即缺乏第一结合活性时，它会展示第二结合活性。有选择性地突变β4-α2环，或环上一肽段，可以来开发增强第二结合力。通过增强第二结合力，和GM-1的相互作用可以进一步排除。
这里，“EtxB/CtxB的β4-α2环”是负责毒素如霍乱毒素和大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基第二结合活性的实体。当β4-α2环被从EtxB/CtxB分子的其它部分(例如肽段)分离出来即缺乏第一结合活性时，它会展示第二结合活性并在下文中称为活性或结合活性。
优选地，本发明的物质包含一个分离的EtxB/CtxB β4-α2环。
优选地，这种物质包含一个分离的EtxB/CtxB β4-α2环的模拟物。
优选地，这种物质包含有高度亲和结合活性的分离的EtxB/CtxBβ4-α2环的模拟物。
优选地，这种物质包含一段5-40个氨基酸的肽。
优选地，该肽所含氨基酸少于25个。
如果该肽是融合蛋白，优选地，该肽含有25个以上氨基酸。
优选地，这种物质包含序列VEVPGSQHIDSQ(SEQ ID No3)。
优选地，这种物质包含序列GATFQVEVPGSQHIDSQKKAI(SEQ IDNo4)。
优选地，这种物质包含大肠杆菌表达的猪的EtxB45-65残基衍生物序列GETFQVEVPGSQHIDSQKKAI(SEQ ID No5)。
优选地，这种物质包含大肠杆菌表达的人的EtxB45-65残基衍生物序列。
氨基酸序列本发明提供一种包含本发明的氨基酸序列的物质，这段氨基酸序列能作为由毒素引起的腹泻的免疫调节剂和/或佐剂和/或抑制剂，这种物质能影响肠毒素介导的腹泻疾病。这种物质也能用于对能与这种物质相互作用的和/或影响该物质一种或多种试剂的测定。
这里，“氨基酸序列”指肽，多肽序列，蛋白序列或其部分。
影响术语“影响”包括物质活性的调节，例如处理，阻抑，遏制，提高，恢复，升高，修饰。
术语“修饰”包括但不仅仅局限于物质活性的消失，沉默，突变，去除，增强，增高，刺激，拮抗，减少或阻滞。
变体/同源物/衍生物发明优选的氨基酸序列为SEQ ID No2,SEQ ID No3,SEQ ID No4,SEQ ID No5或源于本发明物质的序列，也包含了从其他来源而得的同源物如相关的病毒/细菌蛋白，细胞同源物和合成肽，以及其变体和衍生物。
因而，本发明涵盖了这里所述氨基酸序列的变体，同源物或衍生物，也包含了编码这些氨基酸序列的核苷酸序列的变体，同源物或衍生物。
在本发明的上下文中，指在氨基酸水平上和如序列表所示的SEQID No 2的至少7个氨基酸有至少75％,85％或90％，优选至少95或98％一致性的氨基酸序列。尤其是，特别要考虑到对于与EtxB/CtxB相同或相似活性有重要作用的区域(如51,56,57位的氨基酸)，而不是临近非重要区域的序列同源性。尽管同源性可以被认为是相似性(例如氨基酸残基具有相似的化学性质/功能)，但本发明中，序列相同尤指表达的同源性。同源性比较可用肉眼或使用已有的序列比较软件。这些商业化的计算机软件可以比较两个或更多的序列间的同源百分比。
同源百分比也可以通过连续序列进行计算，如一个序列与其他序列对比，其氨基酸序列直接同其他序列中相应的氨基酸进行比较，每次比较一个氨基酸残基，这称为“无缺口对比“，很明显，这种方法仅适用于相对较少的残基数。
尽管这种方法相对简单和一致，但它没有考虑到，如在相同配对的序列中，一个插入或缺失便会导致随后的氨基酸残基置于对比之外，因此当采用总体序列对比时，会导致同源性百分比的降低。相应地，大部分的序列比较方法考虑到了可能的插入和缺失，设计了最适的对比，而对整体同源性得分没有过分的减分。这通过在序列对比中插入“缺口”(gap)，来增大局部同源性而完成。
然而这些更为复杂的方法对对比过程中的每一个缺口设计了“缺口补偿”(gap penalty)，因而对于相同数目的相同氨基酸，尽可能使用少量缺口的序列对比反应两个比较序列之间的相关性-要比具有更多缺口的对比比率高。“远交缺口值”显著用作缺口的存在和缺口中每个随后氨基酸的较小补偿时所要的相对较高的值。这是很常用的缺口得分系统。高的缺口补偿当然会产生具有少数缺口的合适对比。大多数的对比允许缺口补偿被修饰。然而，使用这些软件时，最好使用缺省值。例如使用GCG Wisconsin Bestfit程序包(见下)，氨基酸序列的缺省缺口补偿是每一缺口为12，每一延伸为4。
考虑到缺口补偿，最大同源性的计算首先需要合适的对比的产生。携带如此对比的计算机程序有GCG Wisconsin Bestfit程序包(University of Wisconsin,U.S.A；Devereux et al,1984，核酸研究12:387)其它可以用来进行序列对比的软件包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等.,1999 ibid-chapter 18)),FASTA(Atschulet al,1990,J.Mol.Bio.,403-410)和GENEWORKS对比工具，BLAST和FASTA都可以在线或不在线检索。(见Ausubel et al.,1999ibid,pages 7-58到7-60)。然而，优选使用GCG Bestfit程序。
尽管最终同源性可以以相同性来测量，对比过程本身显然不建立于全部或全无的配对比较上，事实上，在化学相似性和进化距离的基础上，规模化的相似值矩阵常用于每一配对比较的排列值。此矩阵的实例如常常使用的BLOSUM62矩阵——BLAST程序的缺省矩阵。GCGWisconsin程序使用公共缺省值，如果可能，还可使用用户符号对比表。(见用户手册详述)。优选运用GCG程序包的公共缺省值，或其他软件中的缺省矩阵，如BLOSUM62。
一旦软件生产出合适的对比，便可能计算同源性百分比，尤其是序列相同百分比。软件将此作为序列比较的一部分去完成，得出一数值结果。
与本发明物质，SEQ ID No 2,SEQ ID No 3,SEQ ID No 4和SEQID No5相关的“变体”或“衍生物”包含了保留活性的实体序列的任何替代，变体，修饰，取代，或一个或(多个)氨基酸的缺失，增加，优选至少要具有相同和/或相似与CtxB和EtxB的活性。
本发明中SEQ ID No 2,SEQ ID No 4或SEQ ID No 5可以被修饰。显然，修饰用于加强物质的活性。氨基酸可以被替代，如从1,2或3到10或20的替代使修饰的序列保持活性。
本发明中的物质也可以发生氨基酸残基的缺失，插入或替代，产生沉默的变化和功能相同的物质。可以在保留物质的第二结合活性的前提下，具有相似极性，电荷，溶解性，疏水性和/或亲水性的氨基酸残基进行替代。例如带负电荷的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；带正电荷的氨基酸有赖氨酸和精氨酸；还有具有相同疏水性非极性基团的氨基酸亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，甘氨酸，丙氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。
保守替代可以根据下表进行。第二列中同一方块中的氨基酸可以互相替代，优选第三列中的同一方块中的氨基酸进行替代。
核苷酸序列一方面，本发明提供编码本发明物质的核苷酸序列，本发明的物质，可以作为模板或靶向物用于分析(例如酵母双杂分析)鉴定影响此物质的一种或多种试剂和/或其衍生物。
这里，术语“核苷酸序列”指核苷酸序列，寡核苷酸序列，多聚核苷酸序列，变体，同源物，片段和其衍生物(例如其一部分)。核苷酸序列可以是基因组或重组的单链或双链DNA和RNA，或为有意链或为无意链或其结合，优选地，核苷酸序列通过重组DNA技术进行制备(如重组DNA)。
优选地，“核苷酸序列”意指DNA。
编码核苷酸序列的物质可以同于其天然发生的形式。优选地，编码此物质的序列为非天然的核苷酸序列，或为其变体，同源物，片段或衍生物。因而，优选实施方案中，本发明不包括天然环境下，由其天然启动子控制的相应与本发明的核苷酸编码序列。我们将此优选方案称为“非天然核苷酸序列”。
这里，“天然发生”指具有自然界发现的一种氨基酸序列的物质。
这里，“生物学活性”指具有天然物质的调节或生物化学功能的物质。
变体/同源物/衍生物与本发明的SEQ ID No1核苷酸序列相关的“变体”，“同源物”，“衍生物”，包括了编码具有活性的物质的合成核苷酸序列的一个或多个核苷酸的替代，变异，修饰，替换，丢失或增加，具有活性的物质至少具有与序列表中的SEQ ID No 2,SEQ ID No 3,SEQ ID No 4及SEQ ID No 5相同的活性。
如上所述，与序列表所列序列有同源性的序列，至少有70％同源性，优选80％的同源性，或者更优选有90％的同源性。更优选具有95％的同源性，进一步优选具有98％的同源性。核苷酸同源性比较可以如上进行。如上所述的序列比较程序即GCG Wisconsin Bestfit程序。缺省值矩阵对于每一个相同的核苷酸的匹配值为10，对每一非匹配氨基酸值为9。对每一个核苷酸而言，缺省缺口产生补偿为50，缺省缺口延伸补偿为3。
本发明也包括能够选择性与这里的序列杂交的核苷酸序列，或任何其变体，片段或衍生物，或上述的组合。核苷酸序列优选至少15个核苷酸，更优选地，至少20,30,40或50个核苷酸。
这里“缺失”指核苷酸序列或氨基酸序列中一个或多个核苷酸或氨基酸残基的变化，尤其是缺失。
这里，“插入”或“增加”指核苷酸序列或氨基酸序列中，与天然的物质相比，一个或多个核苷酸或氨基酸残基的增加。
这里，“替代”指一个或多个核苷酸或氨基酸为不同的核苷酸或氨基酸代替。
杂交这里，术语“杂交”包括“一条核苷酸链与另一条链碱基互补配对的过程”，以及以多聚酶链式反应(PCR)技术进行的扩增过程。
本发明的核苷酸序列可以选择性地同这里公开的核苷酸序列或其互补序列杂交。一般至少与这里公开的核苷酸有75％，优选至少85％或90％，更优选地有95％或98％的同源性。包括至少20个，优选25或30个，更优选至少40,60或100或更多的连续核苷酸。本发明优选的核苷酸序列包含与SEQ ID No1核苷酸同源的区域，优选至少与SEQ ID No1有80％或90％，更优选有95％同源性的区域。
“选择性杂交”指本发明的模板核苷酸序列在显著高于本底情况下与探针杂交时，核苷酸序列作为探针。本底的产生是由于其他的核苷酸序列例如cDNA或基因组DNA文库被检测到。在这一事件中，本底包含有探针同文库中非特异性DNA相互作用产生的信号，这一信号要比靶DNA的特异性反应低10倍，优选地，低100倍。反应的强度可以检测，如；通过放射性标记如32P。
如Berger和kimmol所讲，杂交条件基于核苷酸结合复合体的解链温度(Tm)(1987,Guide to Molecular CloningTechniques,Methods in Enzymology,Vol 152,Academic Press,SanDiego CA)，象如下所述，被称为“严紧性”。
最大严紧性大约发生在Tm-5℃(低于探针的Tm值5℃)；高严紧性大约低于Tm5℃到10℃；中等严紧性大约低于Tm10℃到20℃；低严紧性大约低于Tm20℃到25℃。如本领域技术人员所周知的那样，最大严紧性杂交用于鉴定或检测相同核苷酸序列，而中等严紧性杂交(或低严紧性)用于鉴定或检测相似或相关核苷酸序列。
优选地，本发明包括了在严紧情况下(如65℃,0.1×SSC{1×SSC=0.15NaCl,0.015 M柠檬酸钠pH7.0｝)与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。无论本发明的核苷酸序列为双链，双螺旋的双链，还是两者的复合物，均包含于本发明中。核苷酸序列为单链时，可以认为核苷酸序列的互补序列也被包含于本发明中。
表达载体本发明的核苷酸序列可以被参入到一个重组复制载体中。载体可以用于复制和/或表达相适宿主细胞中的或源于其的核苷酸序列。使用包含启动子/增强子和其他表达调节信号来控制表达。启动子可以为原核启动子或在真核细胞中起功能的启动子。也可以使用组织特异性或刺激特异性启动子。源于上述两种或更多不同的启动子的嵌合启动子也可以使用。
依赖于所用序列和/或载体，宿主重组细胞产生的物质可以被分泌出或包含于胞内。物质编码序列可以被设计为含有直接将物质编码序列分泌穿过真核或原核细胞细胞膜的信号序列。
融合蛋白为了便于提取和纯化，本发明的物质也可以以融合蛋白的形式生产，融合蛋白的配对体(partners)可以为谷胱甘肽S-转移酶(GST),6×组氨酸，GAL4(DNA结合和/或转录激活区域)和β-半乳糖苷酶。可以在融合蛋白配对体(partners)和所感兴趣的蛋白之间加入一个蛋白水解位点以便于融合蛋白序列的去除。优选地，融合蛋白不应阻碍包含本发明氨基酸序列的物质的活性。
本发明的一个实施方案中，融合蛋白包含了和本发明物质融合的抗原或抗原决定簇。在该实施方案中，融合蛋白是包括能够做为广泛刺激免疫系统的佐剂的物质的非自然产生的融合蛋白。抗原或抗原决定簇粘附于该物质的氨基或羧基末端。
本发明的另一实施方案中，本发明的物质可以被连接到一个编码融合蛋白的异源序列上，例如为了筛选影响物质活性的试剂的肽库，极有用的是编码一个可以表达被工业化抗体识别的异源表位的嵌合物质。
另一实施方案中，使用结合融合蛋白可以分析鉴定如靶受体等试剂，或是能够调节CD25转录活性的试剂。
抗体本发明的一个实施方案中，本发明的物质可以是抗体。该抗体可以作为本发明的模拟物。
抗体可以通过标准的技术，如利用本发明物质进行免疫或运用噬菌体展示文库而生产。
“抗体”，除非具体指某一相反的意思，包括但不仅仅局限于多克隆抗体，单克隆抗体，嵌和物，单链，Fab片段和由Fab表达文库产生的片段。这些片段包括与靶物质具有结合活性的完整抗体的片段，Fv,F(ab’)和F(ab’)2，以及单链的抗体(scFv)，构成抗体的抗原结合位点的融合蛋白和其他的合成蛋白。此外，抗体和其片段可以为人源化的抗体，例如物质A-239400中所述。中和抗体，如抑制物质多肽生物学活性的抗体，尤其适用于诊断和治疗。
在一个实施方案中，本发明也为本发明的物质如多肽和其片段提供了单克隆抗体或多克隆抗体。因而，本发明为物质的单克隆抗体或多克隆抗体如本发明的多肽，提供了一个生产途径。
多克隆抗体如果要制备多克隆抗体，选择哺乳动物(如小鼠，兔子，山羊，马等)，以从可鉴定的试剂和/或本发明的物质而得到的具有表位的免疫源性多肽进行免疫，依据所用宿主的种属性，加入不同的佐剂提高免疫反应。这些佐剂包括但并不局限于，弗式佐剂，矿质胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂和pluronic多元醇，聚阴离子，肽，油乳剂，匙孔血蓝蛋白，二硝基苯酚，BCG(卡介苗)和白喉毒素(小棒状杆菌)。如果纯化的多肽物质运用于免疫损伤的个体，刺激其系统防御，上述物质将是极有潜力的人类佐剂。
免疫血清收集后以已知的程序进行处理，如果含多克隆抗体的血清中，除了含有源于某一可鉴定的试剂和/或本发明物质的表位外，还包含其他抗原的抗体，可以经过免疫亲和层析对其进行纯化。生产和纯化多克隆抗体抗血清的技术在本领域是众所周知的。为了制备这类抗体，本发明还提供了作为动物及人免疫原的其他多肽半抗原化的本发明多肽及其片段。
单克隆抗体直接结合于源于可被鉴定的试剂和/或本发明物质的表位的单克隆抗体也可以以本领域技术人员熟知的技术生产。通过杂交瘤制备单克隆抗体的方法已广为人知，永久抗体生产细胞系可以通过细胞融合，也可以通过其他技术如B淋巴细胞同致癌DNA或EB-病毒的直接转化来产生，所产生的一系列结合orbit表位的单克隆抗体可以被筛选用于不同的性质测定如同种型和表位亲和性。
物质和/或本发明试剂的单克隆抗体的制备可以通过培养连续细胞系中抗体分子的生产技术而获得。这包括但不仅仅包括Koehler,Milstein(1975 Nature 256:495-497)所述的杂交瘤技术，人类B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，〔1983〕Immunol Today 4:72,Cote et al(1983)Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030)和EBV-杂交瘤技术(Cote et al(1985)Monoclonal AntibodiesTherapy,Alan R Liss Inc,pp77-96)，此外，也可运用“嵌合抗体”生产技术，鼠抗体基因与人抗体基因的剪接获得具有适宜抗原特异性和生物学活性的技术(Morrison et al(1984)Nature 312:604-608；Takeda et al(1985)Nature 314:452-454)。单链抗体生产的技术(美国专利号4,946,779)适用于生产物质特异性单链抗体。
直接结合源于可鉴定试剂和/或本发明物质的表位的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，尤其在诊断中被加以运用。那些中和抗体则在被动免疫治疗中有运用。单克隆抗体尤其适用于抗独特型抗体的种植(raising)。抗独特型抗体是一种具有设计被保护的物质和/或试剂“内部影象”(“internal image”)的免疫球蛋白。种植抗独特型抗体的技术在本领域中已广为人知，这些抗独特型抗体因而很有意义。
抗体也可以通过淋巴细胞群的体内诱导或筛选重组免疫球蛋白文库或如Orlandi et al(1989,Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837)和Winter G和Milstein et al(1991,Nature 349:293-299)所展示的具有高度特异性结合试剂的一组实验获得。
包含物质特异性结合位点的抗体片段也可以产生。例如这种片段包括但不局限于经胃蛋白酶水解抗体分子而得的(Fab’)2片段，Fab片段可以通过减少(Fab’)2的二硫键而获得。Fab表达文库利于使具有所需特异性的多克隆Fab片段的鉴定简单，易行(Huse WD et al(1989)Science 256:1275-1281)。
免疫调制物质分析免疫反应的免疫调制可以通过转录情况进行测定，如通过测定相连接的报道基因的信号分析CD25细胞表面标记物的转录活性。
报道基因优选的报道基因可以提供方便的可测信号，可被用于本发明的分析方法中，(例如光谱学)。例如一个报道基因可编码一种可催化改变光吸收特性的酶。
报道基因的实例包括但不仅仅局限于β-半乳糖苷酶，转化酶，绿色荧光蛋白，荧光素酶，氯霉素，乙酰转移酶，β-葡糖醛酸糖苷酶，外切葡聚糖酶和葡糖淀粉酶。放射性标记或者荧光标记的核苷酸可以参入到新生的转录本中，在结合到寡核苷酸探针时被鉴定出来。
在一优选的实施方案中，报道基因分子的产生由报道基因产物的酶活性如β-半乳糖苷酶来测定。
毒素诱导腹泻的抑制剂的分析本发明的物质或其衍生物或同源物和/或表达本发明的物质或其衍生物或同源物的细胞系可用于能够影响物质活性的试剂的筛选(如抗体，肽，有机分子或非有机分子)。例如任何可以抑制物质活性的试剂可以作为毒素诱导的腹泻的抑制剂来筛选，从而鉴定可以影响霍乱和/或肠毒素介导的腹泻疾病。
在一个实施方案中，本发明的筛选可以鉴定本发明物质的拮抗剂，如能够作为毒素诱导的腹泻抑制剂的抗体，肽，或小有机分子试剂分析噬菌体展示可以用于试剂的鉴定，例如通过可与相结合的细胞表面受体。这种受体的阳性鉴定利于运用组合文库鉴定具有同本发明物质相同或相似功能的模拟物。
噬菌体展示是一个运用重组细菌噬菌体的分子筛选的程序，本技术包括了将可以同目的物质(或其衍生物或同源物)或编码相同序列的核苷酸序列(或其衍生物或同源物)反应的适宜配基(本例中为候选试剂)的编码基因转化到细菌噬菌体中。转化的细菌噬菌体(优选粘附于一固相支持物)表达合适的配体(例如候选试剂)，并且展示于其噬菌体外壳。具有识别候选试剂的目的物质分子的实体(如细胞)被分离和扩增。获得的候选试剂进行特征鉴定。噬菌体展示相对于标准的配基亲和力筛选技术有优势。噬菌体表面以三维构相，更接近于其自然构相的形式展示候选试剂，这便使得筛选的目的更具有特异性和更高的结合亲和力。
模拟分析在一实施方案中，本发明的筛选可以鉴定本发明物质的模拟物，如抗体或其他具有免疫调制和/或佐剂效果的化合物。
这类模拟物可以单独或与其他治疗法共同用于本发明的疾病的治疗。
筛选本发明的物质可以在任何一类药物筛选技术中用于鉴定免疫调制剂，佐剂，类似物或/和毒素引起的腹泻抑制剂。运用于筛选的物质可以是溶液状的，固着于固相的支持物，承载于细胞表面，或位于细胞内。物质活性的丧失或物质与待测试剂间结合复合体的形成可以被检测。
另一个用于高通量筛选的技术具有同物质的适宜结合力，依据于在WO84/03564中详述的方法。
本发明的分析方法将适于待测化合物的小量或大量筛选及定量分析。
药物组合物本发明还提供一种药物组合物，包括施用治疗有效量的本发明的物质和药学上可以接受的载体，稀释剂或赋形剂(包括其组合)。
药物组合物包括应用于人或动物的人用药或兽用药，一般还包括一种或几种药学上可以接受的载体，稀释剂或赋形剂。药学上可以接受的载体，稀释剂或赋形剂广为药学领域人员所熟知，并被记载在诸如Remington’s Pharmceutical Sciences,Mack PublishingCo.(A.R.Gennaro 1985年版)中。药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂的选择依赖于欲给药方式和标准的药学实践。药物组合物还可能包含(或额外包含)载体，赋形剂或任何合适的粘合剂，润滑剂，悬浮剂，包埋剂，增溶剂。
防腐剂，稳定剂，染料甚至加味剂都可被应用于药物组合物中。防腐剂的例子包括苯甲酸钠，山梨酸和对羟基苯甲酸酯。抗氧化剂和悬浮剂也可被用于药物组合物之中。
根据不同的给药系统，可能有不同的组成/配方要求。例如，本发明的药物组合物可制成小泵或因黏膜途径而制成喷鼻，或制成气雾剂而吸入，或制成可摄入的溶液，或因肠胃外吸收而制成可注射试剂，例如静脉，肌肉或皮下注射。或者，药物组合物也可设计成两种给药方式。
当药剂经由胃肠黏膜给药时，它应该在转运至胃肠道的过程中保持稳定。例如，它必须抗蛋白水解，酸性pH稳定和抵抗胆汁的降解。
配伍合适的话，此药物组合物可被以下列方式施用吸入，栓药或阴道药栓，一般是洗液，溶液，霜剂，油膏或撒布粉，皮肤贴剂，以加入淀粉或乳糖等赋形剂制成的药片的形式口服，加入或不加赋形剂制成的胶囊，阴道栓剂，添加增色剂或加味剂的酏剂或悬浮液；也可肠胃外注射，例如，静脉、肌肉或皮下注射。对于肠胃外给药，药物组合物最好制成无菌水溶液的形式，该水溶液还可能含有其他物质，如足量的盐和单糖以维持溶液和血液等渗。对于口服或舌下给药，组合物可据常规方法制成片剂或锭剂给药。
疫苗在本发明实施方案之一中，此物质作为佐剂掺入到用来对抗自身免疫疾病、人T细胞白血病、器官移植排斥和过敏性或传染性疾病的疫苗组合物中。
在本发明的另外的实施方案中，疫苗组合物还可能额外的包含抗原或抗原决定簇。适合的抗原或抗原决定簇公开在WO99/34817。
优选地，疫苗组合物包含有抗原或抗原决定簇。
优选地，抗原为自身抗原或其同源物。
优选地，本发明的一种或多种物质被用于治疗性或预防性疫苗的制备。
“预防性疫苗”是指被用于正常个体来阻止疾病发展的疫苗。
“治疗性疫苗”是指被用于已感染个体来祛除或减少感染，或者被用来取消疾病的免疫病理学过程的疫苗。
包含一种或多种物质作为活性成分的疫苗的准备方法是广为此领域技术人员所知的。代表性地，这种疫苗被用于注射，那它应该是液体溶液或悬浮液；而在用于注射的液体溶液或悬浮液之前的固体形式也应该准备。疫苗也可以制备成乳化或被脂质体包被的蛋白的形式。活性组分常常与药学上接受的且和活性成分相容的赋形剂混合。例如，适合的赋形剂有水，盐溶液，葡萄糖，甘油，乙醇等等，或其组合。
另外，如果愿意，疫苗还可包含微量的润湿剂或乳化剂和pH缓冲剂等辅助物质。
疫苗化合物还可能包含用来增强疫苗效果的佐剂。有效的佐剂有如下几种，但不限于这几种氢氧化铝，磷酸铝，硫酸铝钾，硫酸铍，二氧化硅，高岭土，碳，油包水乳化剂，水包油乳化剂，胞壁酰二肽，细菌内毒素，脂类X，疮疱丙酸杆菌(Propionbacterium acnes)，百日咳杆菌，多核糖核苷酸，藻酸钠，羊毛脂，溶血磷脂酸，维生素A，皂苷，脂质体，左旋咪唑，DEAE-葡聚糖，嵌段共聚体或其他合成佐剂。这些佐剂可从多种商业途径得到。例如，Merck Adjuvant65(Merck and Company,Inc.,Rahway,N.J.)或Freund’s IncompleteAdjuant and Complete Adjuvant(Difco Laboratories,Detroit,Michigan)典型的，一般使用Amphigen(水包油)，Alhydrogel(氢氧化铝)，或两者的混合物。只有氢氧化铝被允许用于人类。
给药一般地，适合个体的实际剂量由医生决定，并随年龄、体重、具体病人而变化。下列剂量是平均个例的典型用量。当然，个别例子中也可能出现高或低于上述剂量。
本发明化合物可被用于直接注射。此组合物可经由肠胃外，黏膜，肌肉，静脉，皮下或经皮给药。典型地，每种蛋白质的给药量为每公斤体重0.01-30毫克，优选为0.1-10毫克，每公斤体重0.1-1毫克最为优选。
“给药”包括经过病毒和非病毒途径。病毒递送机制包含但不限于以下几种载体腺病毒载体，腺相关病毒载体，疱疹病毒载体，反转录病毒载体，慢病毒载体和杆状病毒载体。非病毒递送机制包括脂介导的转染，脂质体，免疫脂质体，脂转染试剂，表面阳离子亲水脂分子及其组合。这些递送机制路径包括但不限于从黏膜，鼻，口，肠胃外，胃肠，局部或舌下递送。
“给药”包括但不限于利用喷鼻或气雾剂吸入的经黏膜的途径；通过静脉、肌肉或皮下的注射形式的肠胃外途径。
“共给药”是指为获得必要的免疫系统调整而额外加入抗原和/或抗原决定簇，它们和本发明的任一种物质在同一时间，同一位点施用于个体。然而，虽然此物质可与抗原在同一时间，同一位点共给药，但此物质和抗原在不同时间，不同位点给药也会有一定优点。此物质和抗原甚至可被在同一媒介物内递送。此物质和抗原可以耦连和/或非耦连和/或基因水平上耦连和/或非耦连。
抗原决定簇和肽或同源物或模拟物可以以单一剂量或多剂量单独给药或共给药。
本发明中的疫苗组合物可通过不同的途径给药，如注射(包括肠胃外给药，皮下和肌肉注射)，经鼻，黏膜，器官，阴道内，尿道或眼部给药。
包含本发明中物质的疫苗一般通过胃肠外给药，例如通过皮下或肌肉注射。适合另外给药方式的配方包括栓剂和在某些个例中应用的口服剂等。对栓剂而言，传统的粘合剂和载体包括聚亚烷基二醇或甘油三酯；这些栓剂大都制成活性组分占0.5％-10％，一般在1％-2％的混合物。对口服剂而言，正常应用的赋形剂包括药用级的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等等。这些复合物的形式可以为溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释或粉剂。这些制剂含10％到95％的活性成分，优选25％至70％。当疫苗组合物制成冻干粉时，在给药前冻干粉应重建成诸如悬浮液的形式。优选在缓冲液中的重建过程。
有关疾病本发明中涉及的物质常被用于治疗或阻止自身免疫病，人T细胞白血病，器官移植排斥，异源或异种移植，移植物抗宿主病(GVHD)，过敏或传染性疾病。传染性疾病是指在感染过程中，感染性因子象其他免疫病理学机制疾病一样结合到结肠，尤其是黏膜的疾病。
本发明涉及传染性疾病包含但不限于HSV-1,HSV-2,EBV,VZV,CMV,HHV-6,HHV-7和HHV-8，肝炎A,B,C,D和E，奈瑟球菌脑膜炎，流感嗜血杆菌B和肺炎链球菌，嗜肺军团菌和结核分枝杆菌，奈瑟球菌淋病，HIV-1,HIV-2和沙眼衣原体，大肠杆菌，轮状病毒，肠炎沙门氏菌，伤寒杆菌，幽门螺杆菌，螺杆菌，空肠弯曲菌和霍乱弧菌，金黄葡萄球菌，脓链球菌，齿斑葡聚糖链球菌，疟疾，锥虫病，Taxoplasma gondii,Leishmaniadonovani和盘丝虫病。
本发明涉及的过敏性失调的例子包含但不限于下列疾病哮喘，过敏性咳嗽，过敏性鼻炎和结膜炎，特异性湿疹及皮炎，荨麻疹，昆虫叮咬过敏症，饮食及药物过敏。
自身免疫疾病的例子包含但不限于以下几种，如类风湿性关节炎，多发性硬化及糖尿病。
试剂盒本发明进一步提供了包含本发明物质的诊断用试剂盒。这些试剂盒被应用于阻止和/或治疗和/或调整本发明的疾病。
在本发明的实施方案之一中，试剂盒还包含有抗原和/或抗原决定簇和/或单独的佐剂，以供治疗和预防的共给药。
另外地，试剂盒还可能以本发明涉及的抗体的形式提供本发明的模拟物，它可结合到固体支持物和/或同合适的试剂，对照，说明等一起包装到试剂盒中。
小结简言之，本发明涉及一种物质，它包含下列一种或几种一种氨基酸序列，其中包含公开在SEQ ID NO.2中的序列，或它的变体，同源物，片段，衍生物，模拟物，这些物质能够以与EtxB和CtxB相同的方式起作用；但同时这些物质不具有GM-1结合活性。
本发明还涉及一种测定方法，此方法用于测定一或多种试剂是否可以和本发明的物质相互作用或影响本发明的物质，其中所述测定包括所述物质与待测试剂相接触，然后确定这些试剂是否影响所述物质。
本发明涉及另外一些方面被列举如下1．一种肽，包含EVPGSQH序列，或它的同源物或模拟物。
2．1中的肽段，包含EVPGSQHIDSQ序列。
3．2中的肽，包含GATFQEVPGSQHIDSQKKAI或GETFQEVPGSQHIDSQKKAI序列。
4．一种预防或治疗性组合物，包含上述1-3中的肽或他们的同源物或模拟物。
5．一种4中所述的预防或治疗性组合物，还包含抗原或抗原决定簇。
6．一种4或5中所述的预防或治疗性组合物，同时应用治疗性或预防性试剂作为佐剂和免疫调节剂。
7．一种4或5中所述的预防或治疗性组合物，同时应用治疗性或预防性试剂来向上调节粘膜表面的抗体的产量。
8．一种4或5中所述的预防或治疗性组合物，同时应用治疗性或预防性试剂来延长抗原呈递并维持哺乳动物受试体的免疫记忆。
9．一种4或5中所述的预防或治疗性组合物，同时应用治疗性或预防性试剂来下调与Th1和Th2相连的免疫反应的病理学成分。
10．一种4到9中所述的预防或治疗性组合物，被用于治疗或阻止自身免疫疾病，人T细胞白血病，器官移植，GVHD或传染性疾病。
11．一种预防或治疗性组合物，包含能特异性结合到EtxB或CtxB的β4-α2环上的试剂组分。
12．一种11中所述的预防或治疗性组合物，其中的试剂组分为抗体。
13．一种11或12中预防或治疗性组合物，被用于治疗腹泻。
14．一种被用于疾病治疗的疫苗组合物，包含1-3种所述的肽段或它的同源物或模拟物。
15．一种14中所述的疫苗组合物，还包含抗原决定簇。
16．一种14或15中所述的疫苗组合物，用于治疗或阻止传染性疾病，自身免疫疾病，人T细胞白血病，器官移植，GVHD等。
17．一种试剂盒，包含任何4-13所述的治疗或预防性组合物。
本发明将被通过下列实施例具体描述，并参考附图。
图1显示了EtxB/CtxB的B亚单位立体带形图。(引自Sixma等，J.Mol.Biol.(1993)230:890-918，图标引者所加)。
图2显示了与CD8+T细胞凋亡有关的CtxB的环状残基。
图3显示了CD8+T细胞凋亡缺陷B亚基突变体仍保留有结合细胞表面受体的能力。
图4显示了10ugB亚单位经鼻免疫时，小鼠血清的EtxB和CtxB(H57S)的整体免疫球蛋白水平。
图5显示了EtxB和CtxB的His-57决定佐剂活性必须的区域。
图6显示了E51-158B亚基肽段具有诱导CD8+T细胞免疫调节的能力。
实施例实施例1Glu-51-Ile-58环上残基触发白细胞免疫调节作用的鉴定NIH雄性小鼠处死，取肠系膜淋巴结组织放入Hanks平衡盐溶液(HBSS中无钙离子和镁离子，并加入20mM Hepes)。通过尼龙筛轻轻挤压从纤维组织中分散出淋巴细胞，HBSS洗三次，将淋巴结细胞用Eagle改良培养基(Gibco)悬浮，此培养基含20mM Hepes,4mM L-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素，5×10-5M2-巯基乙醇，细胞浓度控制在2*106细胞/ml。然后加入或不加入3.45μM(40μg/ml)的野生型EtxB或CtxB，或各种B亚单位突变体，如EtxB(G33D),CtxB(E51A),CtxB(V52A),CtxB(P53A),CtxB(G54A),CtxB(S55A),CtxB(Q56A),CtxB(H57A)或CtxB(I58A)37℃温育96小时。然后，用0.4ml HBSS/20mM Hepes/0.1％NaN3/10％小鼠血清洗并悬浮细胞，按1/400加入藻红素(PE)耦连的抗-CD8和FITC-耦连的抗-CD4，冰浴30分钟。抗体孵育后，细胞悬液用ISOTON洗一次，并用ISOTON 0.4ml重悬。每组样品挑10,000例做FACS分析，结果用WinMDI软件处理。图2左上示FITC-耦连的抗-CD4；右下示藻红素耦连的抗-CD8。每图表示出百分数。
结果1如图2所示，野生型EtxB或CtxB使CD8+T细胞减少；而在PBS(对照)或EtxB突变体(EtxB(G33D)不能结合到细胞表面的神经节苷脂上)存在的情况下则不发生此现象。CtxB(E51A)和CtxB(H57A)也不能触发CD8+T细胞减少；另外，CtxB(V52A)和CtxB(I58A)引起触发CD8+T细胞减少的部分缺陷。这些结果显示E51和H57在触发对淋巴细胞的调节作用上起重要作用，而V52和I58则起着辅助作用。
实施例2B亚单位缺陷突变体在CD8+T细胞凋亡中保持结合细胞表面受体的能力
NIH雄性小鼠处死，取肠系膜淋巴结组织放入Hanks平衡盐溶液(HBSS中无钙离子和镁离子，并加入20mM Hepes)。通过尼龙筛轻轻挤压从纤维组织中分散出淋巴细胞，HBSS洗三次，淋巴细胞重悬于300ml预冷并脱气的MACS缓冲液(PBS,5mM EDTA,0.5％BSA,pH7.2)中。向细胞中加入50ml抗CD4和抗B220MACS抗体，通过磁性MACS负性选择纯化出CD8+T细胞。将CD8+T细胞用Eagle改良培养基(Gibco)悬浮，此培养基含20mM Hepes,4mM L-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素，5×10-5M2-巯基乙醇，细胞浓度控制在2×106细胞/ml。然后加入或不加入3.45μM(40μg/ml)的野生型EtxB或CtxB，或各种B亚单位突变体，如EtxB(G33D),CtxB(E51A),CtxB(V52A),CtxB(P53A),CtxB(G54A),CtxB(S55A),CtxB(Q56A),CtxB(H57A),EtxB(H57S)或CtxB(I58A)37℃冰育20分钟。然后，用冰上预冷的0.4ml HBSS/20mM Hepes/0.1％NaN3/10％小鼠血清洗并悬浮细胞，按1/500加入抗EtxB单克隆抗体118-8和EtxB,EtxB(G33D),EtxB(H57S)孵育；按1/800加入抗CtxB单克隆抗体LT-39和CtxB及其突变体孵育。30分钟后，用0.4mlHBSS/20mM Hepes/0.1％NaN3/10％小鼠血清洗并悬浮细胞，并加入FITC标记的抗鼠IgG抗体，二抗孵育30分钟。细胞悬液用ISOTON(Becton-Dickinson)洗一次，并用ISOTON 0.4ml重悬。FACS分析显示的FITC荧光强度代表EtxB,CtxB及其突变体结合CD8+T细胞的能力。每组样品的10,000例显示CD8+T细胞在不存在B亚单位的荧光对结合在B亚单位的荧光强度。
结果2如图2所示，所有B亚单位，除无结合能力突变体EtxB(G33D)外结合CD8+T细胞能力相同。结合了CtxB(H57A)和EtxB(H57S)的可探测荧光强度稍高于野生型B亚单位说明这两种突变体有着更高的细胞表面亲和力。本结果和CtxB(H57A)、EtxB(H57S)与GM-1包埋的微量滴定板有更高的亲和性，胞质团表面共振测定其与GM-1有更高的Kd值的结果一致。(数据未显示)实施例3EtxB的His-57残基为诱导强烈的抗EtxB反应所必须取8组NIH雌小鼠经鼻免疫10ugEtxB或EtxB(H57S)20μl，在一周内分三次免疫。第三次免疫后的14天处死经心穿刺取血。用1μg/mlEtxB包被的微量滴定板经GM-1-ELISA的方法分析抗EtxB IgG的水平。终点滴定法确定。(等于吸收值高于本底0.1的稀释)结果3如图4所示经鼻免疫接种EtxB出现高抗EtxB IgG抗体滴定血清(滴度为5757+/-785)；而免疫接种EtxB(H57S)则诱导出显著(p=0.001)低的反应(滴度为1205+/-222)。
实施例4EtxB和CtxB的His-57残基为B亚单位作为黏膜佐剂所必须取8组NIH雌小鼠经鼻免疫10ug卵清蛋白或在混有EtxB,CtxB,EtxB(H57S)或CtxB(H57A)的情况下免疫10μg卵清蛋白，20μl,在一周内分三次免疫。另外，两组仅经鼻免疫EtxB或CtxB，作为阴性对照。第三次免疫后的14天处死经心穿刺取血。用5μg/ml卵清蛋白包被的微量滴定板经ELISA的方法分析抗卵清蛋白IgG的水平。终点滴定法确定。(等于吸收值高于本底0.1的稀释)结果4如图5所示，和仅用卵清蛋白免疫小鼠相比，野生型EtxB和CtxB作为黏膜佐剂，大大地增加了抗卵清蛋白反应(比较泳道4,5和泳道1)。相反，当卵清蛋白混有EtxB(H57S)(泳道6)或CtxB(H57A)(泳道7)时，抗卵清蛋白反应强度小于野生型B亚单位触发的反应。数据显示CtxB(H57A)无佐剂活性。本结果更证明B亚单位E51一I58环的重要性和H57残基在介导分子的免疫调节功能上的重要作用。
实施例5和EtxB和CtxBE51-I58环相对应的一段合成肽段EVPGSQHI具有免疫调节功能。
为研究和EtxB和CtxBE51-I58环相对应的一段合成肽段是否引起CD8+T细胞减少，按实施实例1中的方法分离肠系膜淋巴细胞，加不同浓度(0.1μM-20μM)合成肽段EVPGSQHI或随机选择的对照肽段IRNETTTTKGDYC温育。37℃,96小时后用0.4ml HBSS/20mMHepes/0.1％NaN3/10％小鼠血清洗并悬浮细胞，然后经FACS分析得出CD4+和CD8+细胞的相对比例，具体方法见例1。经合成肽段EVPGSQHI(实心圆点红色曲线)或随机选择的对照肽段(实心墨色正方形曲线)处理后CD8+细胞的百分比对不同浓度做图(图6)。
结果5图6中所示结果说明合成肽段EVPGSQHI引起CD8+T细胞减少，而对照处理则无。这说明和EtxB和CtxBE51-I58环相对应的一段合成肽段EVPGSQHI对淋巴细胞产生免疫调节功能。
本说明书提到的所有出版物在此引入作为参考文献。在不违背本发明范围和精神的前提下由本领域技术人员所做的多种修改和变化显而易见是合适的。尽管本发明在描述时结合具体的实施方案，也不应据此认为本发明仅局限于上述具体的实施方案。实际上，对分子生物学或相关领域熟练人员来说，本发明的上述实施方案是显见的。多种多样的修改将被包含在随后的权利要求书内。
序列表SEQ ID No 1GAA GTA CCA GGT AGT CAA CAT ATA GATSEQ ID No 2EVPGSQHSEQ ID No 3VEVPGSQHIDSQSEQ ID No 4GATFQVEVPGSQHIDSQKKAISEQ ID No 5GETFQVEVPGSQHIDSQKKAI
权利要求
1．一种包括下列一种或几种的物质一段包含SEQ ID No.2所示序列的氨基酸序列，或它的变体，或其同源物，或其片段，或其衍生物，或其模拟物；这种物质能以EtxB和/或CtxB相同或相似的方式起作用；但这种物质不具有GM-1结合活性。
2．权利要求1中定义的一种物质用于药物。
3．权利要求1中定义的一种物质用于免疫调节剂。
4．权利要求1中定义的一种物质用做佐剂。
5．权利要求1中定义的一种物质用于毒素导致的腹泻的抑制剂。
6．上述任一项权利要求所定义的物质，其中该物质还含抗原或抗原决定簇。
7．一种药物组合物，包括权利要求1-6任一项中所述的物质，视需要而定，还可与一或多个药学上可接受的载体、稀释剂或赋形物混合。
8．权利要求1-7任一项所定义的物质在制备用于治疗和/或预防和/或调节免疫紊乱和/或毒素诱导的腹泻相关的疾病和/或紊乱的药物中的应用。
9．一种测定方法，用于确定能够和权利要求1-7任一项的物质相互作用和/或能够影响权利要求1-7任一项所述物质的一或多种试剂；其中所述测定包括将所述物质和待测试剂相接触，然后确定是否该试剂能影响所述物质。
10．权利要求9中所述的测定方法所确定的物质。
11．一种治疗方法，包括向需要治疗和/或预防和/或调节免疫紊乱和/或毒素介导的紊乱相关的疫病和/或紊乱的受试者施用权利要求1-7任一项所定义的物质。
全文摘要
本发明涉及一种物质，此物质包含包括SEQ IDNo2所示序列所含的一个或多个氨基酸序列，或其变体，或其同源物、或其片段、衍生物或模拟物，其作用形式与EtxB和/或CtxB相同或相似，但不表现GM－1结合活性。
文档编号G01N33/50GK1317013SQ9981066
公开日2001年10月10日 申请日期1999年9月7日 优先权日1998年9月7日
发明者N·A·威廉斯, T·R·希尔斯特 申请人:布里斯托尔大学