专利名称：筛查巨大后代综合征的方法
技术领域：
本发明涉及一种筛查动物胚胎或胚胎衍生的多能细胞系异常发育的方法，并涉及在结合该筛查方法的体外培养中操作动物胚胎或细胞的方法。本发明也涉及该筛查方法在确定细胞培养环境或操作方法是否诱导动物胚胎异常发育中的应用。
在胚泡期之前暴露于不同异常环境的牛及绵羊胚胎导致异常巨大后代的发育(Young等人，生殖综述(Reviews of Reproduction)待出版(1998))，其也可能显示多种器官缺陷，包括骨骼和面部畸形(Walker等人，动物生殖学(Theriogenology)45111-120(1996))、过度肌肉化(over-muscling)和肌纤维成份的改变(Maxfield等人，生理学杂志(J.Physiol.)274E1121-E1123(1998))、小脑发育不全(Schmidt等人，动物生殖学46527-539(1996))、肝及心血管缺陷(van Soom等人，动物生殖学41855-867(1994)；Wilmut等人，自然(Nature)385810-813(1997)；Campbell等人，自然380383(1996)；Cibelli等人，科学(Science)2801256-1258(1998))、泌尿生殖道缺陷(Campbell等人，自然380383(1996))、肺缺陷(Cibelli等人，科学2801256-1258(1998))和胎盘缺陷，包括羊水过多、水尿囊和胎盘瘤增大(Cibelli等人，科学2801256-1258(1998))。曾报道了几种器官的增大(Farin,P.W.和Farin,C.E.,生殖生物学(Biology of Reproduction)52676-682(1995)；Cibelli等人，科学2801256-1258(1998))，相关特征包括妊娠延长、难产(Kruip,T.A.M.和den Haas,J.H.G.，动物生殖学4743-52(1997))和尤其与体温调节、能量平衡、呼吸及代谢pH调节有关的生理缺陷(Garry等人，动物生殖学45141-152(1996))。围生期死亡率是一个特殊问题，产前死亡率较高(Walker等人，动物生殖学45111-120(1996))。这组症状现已通称为巨大后代综合征(Large Offpring Syndrome,LOS)，但有时被称为巨牛综合征(Willadsen等人，动物生殖学35161-170(1991))。不是在每例LOS中都能观察到所有这些特征，有时，在没有明显体积增大时可观察到这些特征。
当对母体施用高尿素饮食时(McEvoy等人，动物生殖科学(AnimalReproduction Science)4771-90(1997))，核移植中植入前胚胎的操作、胚胎的体外培养、异步胚胎移植或排卵后不久母体的孕酮处理现在都与这些问题有关(Walker等人，动物生殖学45111-120(1996)综述)。虽然体内胚胎环境的改变是实验性的，但与LOS有关的问题在商业上是特别重要的，这与核移植和体外生产中植入前胚的体外处理有关。体外产生可包括任一或全部下列三个阶段(1)卵母细胞的体外成熟(IVM)；(2)卵母细胞的体外受精(IVF)；和/或(3)受精卵母细胞的体外培养(IVC)，通常至胚泡期。核移植也可包括操作过程之前、期间和之后的卵母细胞或重建的胚胎的体外培养阶段。核移植-重建胚胎的培养能在体外或在生殖道内体内进行，哺乳动物(通常是绵羊或兔)输卵管通常结扎。这两者都可提供异常的胚胎环境，并与LOS的症状有关。
也曾描述了人和小鼠的胎儿生长综合征。但是它们与植入前胚胎操作无关，而分别是染色体及其他遗传异常或实验遗传操作的结果。胚胎操作或培养后人及小鼠中不发生胎儿过度生长可能是由于牛与绵羊固有的物种差异，或由于所用方法的不同。例如，家畜胚胎通常作为胚泡被移植到受体中，而历史上也曾将四细胞期的人胚胎移回母体中，因此人胚在关键时期能不接触干扰因素。小鼠胚胎常规培养至胚泡期，但常用的所有培养基都不含血清。与体外胚胎培养有关的大多数牛和绵羊LOS病例都包括接触共培养细胞和/或血清(例如，见Walker等人，动物生殖学45111-120(1996))，它们可能产生和/或含有干扰因素。因此，如果培养条件明显改变，则影响牛和绵羊胚胎的相同因素也能以类似的方式影响其他物种的胚胎。
就分娩和后代的存活而言，受干扰的胎儿生长具有重要的临床意义。在商业上，通过包括体外成熟(IVM)或体外受精(IVF)的体外产生(IVP)与牛和绵羊胚胎的产生是十分相关的。该技术可能与该技术在其他物种中的广泛应用越来越相关，如有价值的个体如马(Hinrichs动物生殖学4913-21(1998))以及濒临灭绝的物种如大熊猫(Saegusa自然394409(1998))。LOS也可能在利用核移植技术产生转基因动物中有更大的重要性。LOS的征兆可能与人IVF有关，假定植入前期间的事件能影响后代的前景。例如，常规人IVF能产生具有相对较低出生体重的婴儿。由于该技术越来越具侵入性(例如，胞质内精子注射、胞质减少、体外培养至胚泡期、胚胎活组织检查、植入前诊断)，后代的健康越来越危险(Walker等人，动物生殖学45111-120(1996)；Handyside等人，遗传学趋势(Trends in Genetics)13270-275(1997))。
培养的胚胎衍生的胚胎干(ES)细胞和胚胎生殖(EG)细胞也能用来产生转基因或非转基因小鼠或其他动物(Nagy等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)908424-8428(1993),Dean等人，发育(Development)1252273-2282(1998))或这些生物的细胞和组织。胚胎干(ES)细胞是从胚泡期胚胎(Evans,M.J.和Kaufman,M.H.，自然292154-156(1981))、桑椹胚(Eistetter,H.R.发育、生长与分化(Dev.Growth Differ.)31275-282(1989))的内细胞团细胞中分离的多能细胞系或分离的上胚层细胞(Brook F.A.和Gardner,R.L.美国国家科学院院刊945709-5712(1997))。来源于小鼠原始生殖细胞的这些细胞系及多能胚胎生殖(EG)细胞系的建立使得能在培养中遗传修饰这些细胞系，并能产生特定基因已被改变、导入或置换的转基因小鼠(McWhir,J.,Roslin研究所年报(Roslin Institute Annual Report)1995-1996 80-83(1996)；L.M.Houdebine(编)《转基因动物生殖与应用》，OverseasPublishers Association,Amsterdam(1997))。尽管迄今为止只有小鼠的ES和EG细胞能建成种系，从而提供转基因动物的途径，但目前对由其他物种的内细胞团或原始生殖细胞产生多能细胞系有很大兴趣。最近，已有用来源于胚泡内细胞团细胞的ES细胞样细胞产生嵌合猪(Golueke等人，动物生殖学49 238(1998))和牛(Cibelli等人，自然生物技术(Nature Biotechnology)16 642-646(1998))的报道。由于体外培养(在血清和共培养细胞的存在下)和核移植技术都可用于牛ES细胞样细胞的产生，这些技术有可导致巨大后代综合征的畸形特征的高风险。这也适用于将来从也是胚胎衍生的原始生殖细胞分离EG细胞。在小鼠中，衍生或培养期ES细胞系的改变可能足以诱发与LOS有一定相似性的畸形(Nagy等人，美国国家科学院院刊908424-8428(1993)),Dean等人，发育1252273-2282(1998))，而不需体外培养产生的胚胎(因为未报道在这些及其他小鼠研究中使用的胚胎培养技术可诱发与LOS相似的表型)。由于最近提出遗传修饰的牛ES细胞可为异种移植提供组织治疗来源以治疗人类疾病(Cibelli等人，自然生物技术16642-646(1998))，所以确保正常发育的筛查技术可能是相当有价值的。正在积极探索多能人EG细胞和ES细胞，已提出它们能提供“非限定性体外衍生分化细胞来源，以通过移植治疗特定疾病”(First,N.L.和Thomson,J.自然生物技术16620-621(1998))。此外，也已提出人或其他卵母细胞能以类似于最近在牛(Cibelli等人，科学2801256-1258)、绵羊(Campbell等人，自然38064-66(1996)；Wilmut等人，自然385810-813(1997)；和Schnieke等人，科学2782130-2133(1997))和小鼠(Wakayama等人，自然394369-373(1998))中所证明的方式重编来自分化人细胞核的发育进程，这种可能性具有重要治疗用途(First,N.L.和Thomson,J.自然生物技术16620-621(1998))。
已提出了可用于产生胚胎、细胞或组织的其他类型的干细胞，它们可以或可以不是转基因的。其包括胚和胎衍生的干细胞以及成年动物中固有的干细胞。实例包括性腺干细胞、造血干细胞、肌肉干细胞、表皮干细胞和神经元干细胞(WO94/24274)。由于这些干细胞通过如胚胎聚集、胚泡注射或核移植等方法在产生胚胎、细胞或组织中的应用都包括体外胚胎和/或细胞培养，所以这些细胞也可被强烈干扰而诱发类似于LOS的表型。
人及小鼠的胎儿过度生长起因于几种基因表达的改变。在贝-维综合征中发现的胎儿过度生长归因于H19和/或Igf2基因(Reik等人，人类分子遗传学(Human Molecular Genetics)42379-2385(1995)；Eggenschwiler等人，基因与发育(Gene and Development)113128-3142(1997)；Sun等人，自然389809-815(1997))，在Simpson-Golabi-Behmel综合征中归因于GPC3基因(Pilia等人，自然遗传学(Nature Genetics)12241-247(1996))。另外，对于H19、Igf2和Igf2r而言为无效突变体的小鼠均具有显著的生长表型。例如，相比各自的野生型对应体，H19无效突变体重了27％(Leighton等人，自然37534-39(1995)),Igf2无效突变体轻了40％(De Chiara等人，细胞64849-859(1991))。小鼠中母体Igf2r等位基因的实验性缺失也导致平均出生体重增长30％，及胚胎促分裂原-胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)血浆浓度的提高(Lau等人，基因与发育82953-2963(1994))。除GPC3之外，所有这些基因都显示将被印记，至少在小鼠中如此。亲本(基因组)印记是籍此在哺乳动物胚胎和细胞中在某些基因座处发生母体和亲本等位基因的差异表达的方法(Moore,T.和Reik,W.，生殖综述(Rev.Reprod.)173-77(1996))。印记基因的异常表达与许多胚胎和胎儿畸形有关。尽管相当比例的印记基因所编码的产物的近似功能大部分未知，但认为迄今鉴定的至少7种印记基因可影响生长。Igf2、Mas和Ins2都是亲本表达的并可提高生长率。以此类推，预计Ins1也是一种生长增强剂。Igf2r、H19、p57KIP2和Mash2均由来源于母体的基因组表达，并可降低生长率(Hurst等人，自然遗传学12234-237(1996))。另外，经过印记的几种DNA结合蛋白基因如WT1、ZNF127和Mash2已确定在其他基因组基因座处具有可能的作用，提示另一层调节(Moore,T.和Reik,W.，生殖综述173-77(1996))因此可能的反调节。印记法的一个组成步骤是CpG二核苷酸处的DNA甲基化(Moore,T.和Reik,W.，生殖综述173-77(1996))。除了已知的对胎儿生长的作用外，提示印记基因(或确定在其他物种中印记的基因)可作为参与牛及绵羊巨大后代综合征的候选物，因为当印记建立或保持时，许多印记基因在早期胚胎发生期间具有显著、等位基因特异的DNA甲基化改变(Szabo P.E.和Mann J.R.，基因与发育93097-3108(1995))。在小鼠中，印记基因DNA甲基化的这些改变发生于正常植入前胚胎发育期间，此时实际上基因组中的所有其他DNA完全脱甲基化(Li,E.《基因组印记》,1-20页，Riek,W.和Surani,A.编，IRL出版社，牛津(1997)；Kafri等人，美国国家科学院院刊9010558-10562(1993))。然而，迄今尚未确定牛或绵羊的特定基因(无论印记与否)表达与巨大后代综合征之间有明确的因果关系。
在体外成熟期间，在含有多种血清和共培养细胞的培养基中，即在与早期胚胎暴露期间LOS诱导有关的相同条件下(Thompson等人，生殖生物学(Biology of Reproduction)531385-1391(1995)；Sinclair等人，动物生殖学47380(1997))，体外培养多个牛和绵羊卵母细胞(Trounson等人，动物生殖学4157-66(1994)；Marquant-Leguienne,B.和Humbolt,P.动物生殖学493-11(1998)；Sirard,M.A.和Blondin,P.,动物生殖科学(Animal Reproduction Science)42417-426(1996)；Thompson J.G.，生殖与受精进展(Reprod.Fertil.Dev.)9341-354(1997))。尚不清楚体外成熟期是否能以诱发LOS的方式干扰卵母细胞，因为很少有研究涉及该问题。然而，Holm等人(生殖与受精杂志(Journalof Reproduction and Fertility)107175-181(1996))的研究提供了一些证据，表明该综合征可能是由于体外成熟并受精，然后置入受体母羊中经过胚胎培养期和妊娠其余阶段的卵母细胞引起的。对于多种印记基因，印记和DNA甲基化的有关改变在配子发生期间建立，卵母细胞暴露至体外成熟诱导的该阶段的任何外遗传改变也可导致LOS的典型表型，其机制类似于为胚胎培养所提出的机制。类似地，当在卵母细胞成熟前在卵泡内进行体外培养时，卵母细胞中可发生外遗传改变。卵泡培养最近已作为一种提高体外成熟的牛卵母细胞之后发育能力的方法(FouladiNashta等人，生殖生物学59255-262(1998))。至少在某些情况中，也可能是卵母细胞固有的印记基因异常负责引发LOS。与动情周期中正常体内成熟相比，利用如体外成熟或超数排卵的方法可从单个卵巢中获得更多的卵母细胞。通过这些方法成熟的大多数卵母细胞将在体内排卵之前死亡。这些方法通常用于提高卵母细胞对于体外产生或核移植的可利用性，并可“拯救”在体内无法正常存活的具有印记缺陷的卵母细胞。这种“拯救”也可在胚胎培养期间发生，尽管已知只经历胚胎培养期足以诱发LOS(Thompson等人，生殖生物学531385-1391(1995)；Sinclair等人，动物生殖学47380(1997))。
也极不了解核移植后LOS的诱发。例如，尚未证明干扰是由于核移植本身还是相关的卵母细胞或胚胎培养期。大多数核移植胚胎或利用与受干扰的生长和发育有关的方法随后在体外培养(例如，见Yazawa等人，动物生殖学48641-650(1997))，或在绵羊输卵管中结扎，而不考虑受体动物与重建胚胎的发育阶段的同步性(例如，见Willadsen等人，动物生殖学35161-170(1991))。以前已证明绵羊胚胎暴露于异步生殖道环境可导致胎儿过大(Wilmut,I.和Sales,D.I.，生殖与受精杂志61179-184(1981)；Young等人，动物生殖学45231(1996))。除可能的异步性外，输卵管结扎本身是一种异常环境。在发育至胚泡期的过程中(通常用于向牛和绵羊的妊娠受体的胚胎移植)，胚胎在子宫中自然保持3-4天，并接触子宫分泌物。因此输卵管的结扎可使胚胎与引起干扰环境的异常分泌物接触，引起LOS。在经原核注射遗传修饰的牛和绵羊胚胎中，随后的发育通常也发生于结扎的输卵管中或体外胚胎培养中。
另外，有人提出(Jaenish R.遗传学趋势13323-329(1997))，核移植中核对供体的成功应用在胎儿死亡的效率及频率方面可能部分依赖于在供体细胞的印记基因中发现的甲基化错误的发生率。可以认为，这些错误的发生率与产生供体细胞的动物年龄有关，较老的细胞具有较多的错误。这有待于直接实验证明，但尤其在印记基因中的这些错误不能在核重编程序期间被早期胚胎发生中发生的脱甲基化和从头DNA甲基化事件消除(Kafri等人，基因与发育6705-714(1992))。有时，这些错误可提供诱发巨大后代综合征的另一种可能的方法。
据信，理论上可改变这些细胞的环境或这些细胞的遗传物质(包括DNA和RNA)用来产生胚胎的胚胎或细胞的任何操作，都可诱导脆弱基因的外遗传改变。包括透明带的钻孔或穿透的方法，例如去核、胞质内精子注射(Barnes等人，人类生殖103243-3247(1995))或植入前诊断(Handyside,A.H.和Delhanty,J.D.,遗传学趋势13270-275(1997))，可使遗传物质与透明带通常不合的因子接触。如胞质转移或胞质减少的方法(Cohen等人，分子人类生殖学(Mol.Hum.Reprod.)4269-280(1998)；Cohen等人，柳叶刀(Lancet)350186-187(1997)；Eviskov等人，发育109323-328(1990)；Eviskov等人，Roux’s Arch.Dev.Biol.203199-204(1994))可改变影响DNA(Moore,T.和Riek,W.,生殖综述173-77(1996))或RNA的胞质因子的浓度。另外，如胞质内精子注射或核移植的方去，其包括向受体卵母细胞或细胞中导入外源物质，可将这些因子无意地导入可能受干扰的受体中。
因此存在几种引发牛和绵羊LOS的可能途径，它们都可通过印记基因的外遗传改变起作用。其包括卵母细胞或胚胎的体外培养诱导的外遗传改变、卵母细胞或胚胎暴露于异常环境(包括结扎的输卵管)、经超数排卵体外或体内成熟的卵母细胞的固有缺陷、用于核移植的供体细胞的固有缺陷和核移植后印记的不恰当的重编程序。
哺乳动物胎儿生长调节的关键是胰岛素样生长因子Ⅱ(IGFⅡ)。IGFⅡ调节以动态或梯级的方式发生，在转录、翻译、蛋白质结合或受体相互作用水平上具有控制作用(Zarrilli等人，分子细胞内分泌学(Mol.Cell.Endocrinol)101R1-R4(1994))。Igf2基因在小鼠(DeChiara等人，细胞64849-859(1991))、人(Giannoukakis等人，自然遗传学494(1993))和绵羊(Feil等人，《哺乳动物基因组》，待出版(1998)；Hagemann等人，分子生殖进展(Mol.Reprod.Dev.)50154-162(1998))中被印记，印记机制功能丧失引起的印记丢失导致双等位基因表达，因此导致Igf2基因的过量表达。可导致人和小鼠胎儿过度生长的该基因印记的丢失被认为是由浓度提高的胰岛素样生长因子Ⅱ(IGFⅡ)蛋白引起的(Eggenschwiler等人，基因与发育113128-3142(1997)；Sun等人，自然389809-815(1997))。在小鼠中，删除似乎与Igf2印记机制有关的相邻H19基因可诱导Igf2印记的丢失(Leighton等人，自然37534-39(1995)；Ohlsson等人，发育120361-368(1994))。小鼠Igf2基因的转基因过量表达导致出生前过度生长和类似于牛和绵羊巨大后代综合征和人贝-维综合征的其他后果。所述后果包括羊水过多、胎儿及新生儿死亡、器官及骨骼畸形(Sun等人，自然389809-815(1997))。
在人贝-维综合征的某些病例中，胎儿过度生长是由于H19/Igf2区的二体、三体或其他染色体重排引起的。但是，在该综合征的某些偶发病例中，观察到的印记的丢失和引起的Igf2基因的双等位基因过量表达与染色体异常无关。而是认为这些病例起因于种系或早期胚胎中H19/Igf2区域的“外遗传事件”(Reik等人，人类分子遗传学42379-2385(1995))，尽管尚未确定或描述，并且尚不知它们是如何发生的。环境诱导的印记基因外遗传改变，如DNA甲基化改变，被认为是由体外培养的ES细胞衍生的小鼠胎儿中观察到的出生前及围生期死亡和较大体积的可能原因(Nagy等人，美国国家科学院院刊908424-8428(1993))。虽然还不知哪种(些)基因负责这一作用，但最近已显示，由小鼠胚胎干(ES)细胞的衍生或培养引起的DNA甲基化和印记基因表达的外遗传改变在植入后发育期间不能被更正，并且与ES细胞衍生的胎儿中的异常基因表达有关(Dean等人，发育1252273-2282(1998))。该研究发现了所检测的全部4种印记基因改变的证据，虽然这在所检测的(4种)不同ES细胞系之间和之中是不一致的。特别是，通常检测到母体U2af1-rs1等位基因甲基化的丧失，这导致该基因(其编码一种具有未知生物功能的剪接因子)的双等位基因表达。H19的双等位基因甲基化也是常见的，这导致强烈抑制的H19在ES细胞胚胎中表达。在所研究的全部ES细胞系中，除亲本等位基因外，母体Igf2等位基因无法显著甲基化。在几种胚胎中，这导致两种等位基因特别是母体等位基因的Igf2的表达。最后，在所有ES细胞系和大多数ES细胞胚胎中Igf2r基因母体甲基化。在所有ES细胞系中，Igf2r表达模式是双等位基因的，而在大多数ES细胞胚胎中只来源于母体等位基因。这与在正常小鼠胚泡期胚胎(ES细胞由其产生)和胎儿中发现的Igf2r甲基化和表达模式一致。这些发现证实了以前关于小鼠ES细胞系中Igf2r印记稳定性的报道(Labosky等人，发育1203197-3204(1994))。然而，由两种ES细胞系衍生的某些ES胚胎显示Igf2r的部分双等位基因表达(小于正常沉默、亲本等位基因的表达的35％)。另外，在(24种之中的)一种ES胚胎中，观察到双等位基因Igf2r表达，在该情况中亲本等位基因的甲基化是明显的。
印记在Igf2r表达中的作用和小鼠中表达缺乏导致胎儿过度生长的事实已被用来假定Igf2r印记的相应丢失(即双等位基因表达)与Igf2具有相反的作用，并将导致胎儿生长的减缓(Moore,T.和Reik,W.，生殖综述173-77(1996))。在ES细胞胚胎中未报道有这种表型，也无任何培养诱导的Igf2r改变，这与胎儿过度生长或巨大后代综合征的其他症状一致(Dean等人，发育1252273-2282(1998))。此外，对ES细胞衍生的胚胎描述的不同发育异常，包括羊水过多、颚畸形和间质出血，迄今尚未与特异印记基因关联，并且当然与所报道的研究中未检测的基因相关。这些关于培养的、胚衍生的ES细胞中异常印记基因表达的发现，与印记基因的已知发育作用和(在某些情况中)对胎儿生长的已知表型作用一起，确定了印记基因及其外遗传改变是异常环境中胚胎培养和/或核移植后牛和绵羊巨大后代综合征的基础这一假说的可信性(Moore,T.和Reik,W.，生殖综述173-77(1996)；Walker等人，动物生殖学45111-120(1996)；Dean等人，发育1252273-2282(1998))。然而，它们未能清楚地显示哪种基因直接有关。
诊断诱发的LOS的筛查方法在鉴定和改进胚胎培养、核移植及其他与异常发育有关的胚胎操作方法中具有商业利益。因此迫切需要能有效地筛查体外培养动物胚胎中异常发育的存在，以便能适当地干预或改变培养条件。
现在有证据表明，编码胰岛素样生长因子Ⅱ受体(IGFⅡR)的Igf2r基因的改变的表达预示动物胚胎的异常发育，其具有一般与巨大后代综合征(LOS)有关的症状。具有LOS危险的胚胎包括在体外或在异常体内环境中培养的胚胎，以及通过核移植制备的重建胚胎。
根据本发明的第一方面，提供了一种为巨大后代综合征筛查动物胚胎的方法，其包括分析动物胚胎中或来源于胚胎的生物样品中胰岛素样生长因子-2受体(Igf2r)基因表达的步骤。
通过根据本发明的方法对动物胚胎的筛查能避免在体外培养的动物胚胎受巨大后代综合征症状影响时遇到的问题，在所述综合征中胚胎能生长为较大体积，或具有相关的器官缺陷或发育异常。该方法也适用于在改变的或异常环境中体内培养的动物胚胎。该筛查方法的应用将允许干预胚胎发育，以抑制或防止异常发育。可能导致产生异常后代的多能细胞和由其衍生的胚胎或细胞的检测可为嵌合体或细胞衍生的胚胎的产生选择适当的株系。根据本发明的方法也允许鉴定不引起导致巨大后代综合征的缺陷的培养条件。这些方法在农业物种中可能有相当大的商业利益，并可能在包括人类在内的其他几个物种中具有未来的用途。这可能与干细胞或用于基于人细胞的治疗的其他细胞在医学中的任何未来用途特别相关(Solter,D.，自然394315-316(1998))。
本方法的筛查方法通常适用于任何动物胚胎，包括鸟类，如家禽、鱼、真兽亚纲动物和有袋类哺乳动物，包括胚胎是核移植或体外生产(IVP)(包括卵母细胞的体外培养(IVC)和/或体外受精(IVF)和/或体外成熟(IVM))的产物，进一步包括在任何环境下的培养，其中胚胎在正常妊娠期间不能使自己位于或暴露于(例如，在临时受体动物的结扎的)输卵管中的培养。然而，该方法可在筛查哺乳动物胚胎特别是反刍动物、人或灵长类动物胚胎中具有主要用途。该方法适用的其他哺乳动物种包括但不限于非人类哺乳动物，例如，有蹄动物种，如牛、绵羊、猪、山羊、马、骆驼或野牛(包括水牛)，以及如狗、猫、马、羊驼(llamas)、羊驼(alpaca)和啮齿类动物，包括大鼠、小鼠或兔或豚鼠的物种，和多种动物(野生动物或未驯化的)物种，包括大熊猫、虎和鲸类物种，包括鲸和海豚。
该方法也可应用于转基因或遗传修饰的动物胚胎，包括经核移植法制备的嵌合体和胚胎，或者该胚胎是改变其遗传内容物的操作的对象。这些方法也可应用于利用核移植用培养的ES细胞或其他细胞进行的基于细胞的基因转移。例如，在胚胎或胚胎衍生的细胞的筛查中，特别是ES或EG细胞(Dinsmore等人，动物生殖学49145-151(1998))参与动物基因组的修饰，其中用胚胎细胞为医学治疗用途制备特异细胞型，包括这些细胞的体外分化。
应当指出，术语“转基因”与动物有关时，不应只限于指在基因组或种系中含有另一物种的一种或多种基因的动物，虽然许多转基因动物含有这些基因。相反，该术语更广泛地指其种系或基因组是重组DNA方法技术干预的对象的任何动物。因此，例如，在其种系中一种内源基因缺失、复制、激活或修饰的动物是用于本发明的转基因动物，其基因组或种系中加入一种外源DNA序列的动物也是转基因动物。在动物是转基因动物的本发明的实施方案中，可用物理技术如向合子的雄性或雌性原核中或者向卵母细胞或胚胎的细胞质或核中微注射进行遗传修饰。另外，遗传修饰也能包括使用大量转化或转染技术，如电穿孔、病毒转染(包括腺病毒、反转录病毒、腺伴随方法或合成反转录转座子的应用)、脂质体转染、微粒细胞轰击、反义技术、载体如YAC和BAC，或利用其他工具如精子。而且，这种修饰也能得益于同源重组、DNA修复机制的干预，包括限制酶的应用。细胞介导的基因转移能使用多种细胞，包括ES细胞、EG细胞和其他干细胞或来源于任何哺乳动物种的适当细胞。
利用未遗传修饰的动物的核移植可发现其他用途。例如，未修饰的克隆可用于倍增遗传上优良或有用的个体用于农业用途，包括提高牛奶和牛肉产量或质量，和提高生殖能力。其也可用于克隆濒危物种以保留品种、群体或物种(例如，虎、犀牛、大熊猫、鲸或海豚)。另外，为了LOS相关异常的可能发展筛查胚胎，也可能在用于基于细胞的治疗的植入前人胚胎或用于移植的其他胚胎的可能发育及应用中具有极大的利益。
根据本发明的方法用于筛查动物胚胎。胚胎的体外培养现在已是一种体外产生动物的完善成熟的技术，包括卵母细胞的体外成熟。其应用于解决人类不育问题和通常利用体外受精控制繁殖农畜，其中使卵母细胞和精子在受控及可观察的体外环境中聚集在一起。动物胚胎的体外培养也包括经核移植法制备的动物胚胎或是改变其遗传内容物的操作对象的动物胚胎。也常应用胚胎的体内培养，特别是在经核移植重建胚胎或经原核注射遗传修饰后。这通常包括受体动物输卵管中胚胎的手术结扎，其中胚胎可包埋于保护性、可渗透的但是惰性的培养基中，例如琼脂或相当的物质中(Campbell等人，生殖生物学501385-1393(1994))。受体动物不总是与体内培养的动物胚胎相同的物种(Wilson等人，动物生殖协会(Anim.Reprod.Soc.)3873-83(1995))。该方法也适用于筛查在可导致发生巨大后代综合征(LOS)的改变的或异常环境中培养的任何动物胚胎，包括在正常妊娠中胚胎无法使自己位于或暴露于其中的任何环境。这可包括胚胎从一种动物的生殖道向另一种动物或向同一动物生殖道的另一部分的移植。其也可包括生殖道环境的直接或间接改变。直接改变的实例包括但不限于，用适当液体冲洗生殖道或加入任何移植物、外源物质或对象。间接改变可包括但不限于饮食、内分泌或对受体动物施用药物。
术语“胚胎”用于描述受孕及合子第一次分裂后直到新生动物出生时发育的动物。因此该术语包括更专业化的描述性术语“囊胚”、“原肠胚”和“胎”。胎能用于描述植入后在软骨中出现第一个骨细胞时的胚胎。该术语也包括“胚泡”，其描述人的一个发育阶段，此时在内细胞团(ICM)作为平盘扩散到囊胚腔中时在正常妊娠中发生向子宫壁中的植入。在其他动物种如绵羊和牛中，可能直到胚泡期之后才发生植入，因此可以认为该定义扩展到包括中央囊胚腔周围内细胞团细胞和滋养外胚层细胞的发育阶段。
本发明的方法涉及对巨大后代综合征(LOS)的筛查。该综合征最常见于通过核移植法、体外遗传操作和/或包括利用体外成熟、体外受精和/或体外胚胎培养在内的体外生产技术产生的农畜中。巨大后代综合征的征状通常难以表征，因为它不仅表现于出生体重方面。也存在其他相关的异常，包括流产率提高和身体畸形、妊娠期延长和死亡率和发病率水平的提高(Walker等人，动物生殖学45 111-120(1996))。异常发育是相对于正常动物胚胎在相当的发育阶段时的发育而言。
在分析动物胚胎中编码胰岛素样生长因子-2受体(IGF2R)的基因表达后，利用根据本发明的方法筛查诊断巨大后代综合征(LOS)在胚胎中的出现。IGF2R有时也被称为甘露糖6-磷酸受体、Ⅱ型IGF受体和不依赖阳离子的甘露糖6-磷酸受体。因此应认为IGF2R蛋白和Igf2r基因包括这些定义。改变的或干扰的Igf2r基因表达是与正常水平的基因表达相比动物胚胎的异常发育的指示。改变的基因表达可看作降低水平的编码IGF2R的DNA转录。在受影响的胚胎中编码IGF2R的基因中DNA甲基化模式的改变也可证明这一改变。DNA的其他改变，包括染色质结构或组蛋白乙酰化的改变，可能也与改变的Igf2r表达有关。这一改变也可表示为与同一孕龄的正常胚胎相比，IGF2R蛋白水平的降低。动物中Igf2r表达降低时，预示胚胎具有发展为巨大后代综合征(LOS)的危险。不希望为理论所束缚，可以认为Igf2r基因表达的降低不伴随着Igf2基因表达中存在变异。也可以理解，本发明的方法也可应用于在LOS的某些特点不是很明显时筛查新生动物，可能存在出生后不久该阶段的筛查是有用的情况。
对来源于胚胎的生物样品进行基因表达分析。样品可包括取自胚胎或胎盘的羊膜或尿膜液的组织活检、细胞或细胞物质或生物液体如血液。组织或细胞样品可采自器官、肌肉、软骨、骨或皮肤。然而，在早期胚胎中，样品可方便地采自发育中的胚胎的细胞。有时，可筛查整个胚胎。样品也可以是处于从初级卵母细胞期到次级卵母细胞期的卵母细胞，或在卵原细胞的任何发育阶段引入卵母细胞的卵泡，和成熟卵子。
Igf2r基因表达的分析可以用任何标准方法包括基于PCR的方法如RT-PCR来完成。能由Genbank牛序列如序列J03527(5’-核苷酸530-551,3’-核苷酸769-750；Lobel等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263(5)2563-2570(1988))设计Igf2r引物。
有时，为了对照，能用本发明的方法进行Igf2和Igf2r表达水平的对比。Igf2外显子特异性转录物的引物能如Ohlsen等人，DNA细胞生物学(DNA Cell Biol.)13(4)377-388(1994)所述获得，IGFBP2、IGFBPE如Winger等人，生殖生物学56 1415-1423(1997)所述，IGFBP4如Armstrong等人，内分泌学(Endocrinology)139(4)2146-2154(1998)所述。Igf2以组织特异的和发育阶段特异的方式表达为一系列选择剪接的、外显子特异的转录物(Ohlsen等人，DNA细胞生物学13(4)377-388(1994))。
因此可认为本发明的方法包括编码IGF2R的核酸序列或其片段或与之互补或同源的序列在制备用于诊断动物胚胎或来自胚胎的样品中巨大后代综合征(LOS)的药剂中的应用。编码IGF2R的基因Igf2r的序列在人类(Oshima等人，生物化学杂志263(5)2553-2562(1988)；Morgan等人，自然329301-307(1987))、牛(Lobel等人，生物化学杂志263(5)2563-2570(1988))和小鼠(Ludwig等人，基因142(2)311-312(1994))中已知，技术人员能根据标准分子生物学技术选择适当的引物序列(Sambrook等人《分子克隆；实验室指南》，第二版(1989))。这些核酸序列可直接应用，或者更常用的是为基于PCR的分析用其设计适当引物。
与可用于本发明的方法中的核酸序列互补的核酸序列是在严格条件下可与这种序列杂交的序列，或在由于遗传密码简并性与这种序列同源或在严格条件下可与之杂交的核酸序列，或对任一该序列特异的寡核苷酸序列。这些核酸序列包括由核苷酸组成的寡核苷酸，也包括由肽核酸组成的寡核苷酸。在核酸序列基于编码IGF2R的基因片段时，该片段可以是该基因的至少10个连续核苷酸，或者例如是由20、30、40或50个核苷酸组成的寡核苷酸。
严格杂交条件的特征在于低盐浓度或高温度条件。例如，高严格条件可定义为在65℃下在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mMEDTA中与结合于固体载体上的DNA杂交，并在68℃下在0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤(Ausubel等人编，《现代分子生物学方法》1,2.10.3页，GreenPublishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.，纽约(1989))。有时可能需要低严格条件。在本申请书中使用时，中度严格条件可定义为包括在42℃下在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤(Ausubel等人(1989)，同上)。也可通过加入渐增量的甲酰胺使杂合核酸双螺旋去稳定而使杂交更严格。因此可容易地操作特定杂交条件，并且通常可根据希望的结果选择。通常，对于与靶DNA95-100％同源的探针，在50％甲酰胺存在时的常规杂交温度为42℃，对于90-95％同源为37℃，对于70-90％同源为32℃。
本发明方法中使用的优选核酸序列的实例是基于牛Igf2r基因序列的5’-核苷酸530-551、3’-核苷酸769-750的寡核苷酸引物(Lobel等人，生物化学杂志263(5)2563-2570(1988))。
根据本发明的方法优于以前所述的体外产生(包括体外受精和体外成熟)、遗传修饰和核移植技术。筛查异常发育的能力应能通过在胚胎发育或在出生时或在之后不久的胚胎异常发育及死亡，减少不成功妊娠的数量，来提高这些技术的效率。具有异常发育危险的胚胎的鉴定也允许进行测定以保护携带该胚胎的雌性的健康。
根据本发明的第二方面，提供了一种体外产生动物胚胎的方法，其包括下列步骤向体外培养系统的卵母细胞中导入一种精细胞，随后培养得到的胚胎，并通过分析来源于胚胎的生物样品中的Igf2r基因表达，为巨大后代综合征(LOS)筛查该胚胎。
通常，待受精的卵母细胞在靠近精细胞之前可施以体外成熟步骤。动物胚胎的体外产生一般包括动物卵母细胞的体外受精，并能根据动物种用任何适当方法完成。这些方法的实例包括但不限于，Trounson等人，动物生殖学4157-66(1994)；Thompson,J.G.，生殖与受精进展(Reprod.Fertil.Dev.)9341-354(1997)；Wilmut等人，《绵羊遗传学》,395-412页，Piper,L.和Ruvinsky,A.编，CAB International，牛津，UK(1997)；Gardner,D.K.和Lane,M，人类生殖信息(Human ReproductionUpdate)3367-382(1997)；Summers等人，生殖生物学53431-437(1995)；Weston,A.M.和Wolf,D.P.，分子生殖进展4488-92(1996)；Liu等人，分子生殖进展45157-162(1996)；Li等人，动物生殖学471103-1113(1997)；Biggers等人，人类生殖信息3125-135(1997)；Trounson,A.和Gardner,D.K.编，《体外受精手册》，CRC Press Inc.Salem,USA(1993)的方法。本发明该方面也可包括所得动物胚胎的体外培养。也应容易地理解，根据本发明该方面的方法也可包括对胚胎生存力及向最终雌性受体移植的适宜性的其他筛查步骤。另外，该方法也扩展到是正常受精结果但随后从雌性动物中取出并在重新植入受体雌性动物之前体外培养一段时间的胚胎。
适于体外成熟的卵母细胞通常利用手术腹腔镜检或超声指导的“卵子挑选”(OPU)取自于新吸出的卵巢，或供体动物或患者(Wilmut等人，《绵羊遗传学》，395-412页，Piper,L.和Ruvinsky,A.编，CABInternational，牛津，UK(1997)；Trounson,A.和Gardner,D.K.编，《体外受精手册》，CRC Press Inc.Salem,USA(1993))。有时可用激素或其他试剂预处理供体。体外成熟最常在含有多种添加物包括共培养的支持细胞、促性腺激素、雌二醇、生长因子、丙酮酸、血清和聚乙烯醇的组织培养基199中进行(Thompson,J.G.，生殖与受精进展9341-354(1997)；Barnes等人，人类生殖103243-3247(1995))，这可使卵母细胞发育至可以受精的阶段。
体外受精能在支持精子的运动性和获能但仍保持待受精的卵母细胞生存力的任何条件下进行。这些条件在物种之间变化极大。例如，不同于反刍动物，人精子不需要获能的任何特定诱导(Trounson等人，动物生殖学4157-66(1994))。对于牛卵母细胞，最常用的受精培养基是通常添加了几种获能和运动性刺激剂如肝素、肾上腺素、亚牛磺酸和青霉胺的蒂罗德白蛋白乳酸丙酮酸培养基(TALP)(Thompson,J,G.，生殖与受精进展9341-354(1997))。与母牛不同，绵羊体外受精常规使用简单培养基如合成输卵管液(SOF)。活动精子用几种方法制备，包括“游动”和利用Percoll梯度(Wilmut等人，《绵羊遗传学》，395-412页，Piper,L.和Ruvinsky,A.编，CAB International，牛津，UK(1997))。
由体外成熟和/或受精方法或超数排卵法和供体胚胎回收产生的胚胎的体外培养方法在物种之间和之中有极大不同。基本有两种培养系统共培养(或以前用于细胞的“条件”培养基)和合成(或半合成)的。牛和绵羊胚胎的共培养通常在一般添加血清的组织培养基199或MenezoB2培养基中进行。支持细胞通常是牛颗粒细胞、牛输卵管上皮细胞或水牛大鼠肝细胞。没有体细胞支持的胚胎培养系统通常称为半合成的或合成系统，这取决于是使用血清(或蛋白质源如牛血清白蛋白)还是合成大分子(如聚乙烯醇)。广泛应用的已知成份培养基包括合成输卵管液(SOF)和CR1，其中可加入多种血清及其他添加物(如生长因子、激素、维生素、氨基酸、酶和抗氧化剂)(Thompson,J.G.，生殖与受精进展9341-354(1997))。胚胎也可在体液或含有体液如卵泡液和人羊水的培养基中培养(Trounson等人，动物生殖学4157-66(1994))。除静态胚胎培养系统外，也发展了用于连续输送新鲜培养基的灌注系统的应用(Thompson,J.G.，动物生殖学4527-40(1996))。
牛和绵羊胚胎通常在移植到适当的受体动物中之前培养至胚泡期(胚胎培养5-7天后)，而人胚胎通常在发育的第2天或第3天移植到子宫中。然而，培养人胚胎至胚泡期受到更广泛的关注(Gardner,D.K.和Lane,M，人类生殖信息3367-382(1997))，或者至少直到原条发育为止。不算贮存胚胎的任何时间，从配子混合开始，在不晚于14天末时在胚胎中出现原条。需要体外胚胎培养作为许多当前及潜在用途的一部分，并用于在人和其他物种中帮助生殖。经原核注射产生的许多遗传操作的胚胎在移植到受体之前培养，通过核移植重建的许多胚胎也如此。体外胚胎培养已用于产生胚胎干细胞(ES细胞)和ES细胞样细胞的产生，并且在发展临床应用的基于细胞的治疗中是重要的。尽管进行了相当多的研究尝试并在技术效率方面取得了极大的进步，但仍没有一种以相当于体内方法的速度产生胚胎的方法(Wilmut等人，《绵羊遗传学》，395-412页，Piper,L.和Ruvinsky,A.编，CAB International，牛津，UK(1997))。
根据本发明的第三方面，提供了一种重建动物胚胎的方法，其包括下列步骤向适当受体细胞中移植供体细胞的核，通过分析来源于胚胎的生物样品中的Igf2r基因表达，为巨大后代综合征(LOS)筛查得到的胚胎。
在以上方面所述的本发明的方法中，从供体细胞向受体细胞转移核。该方法的应用不限于特定供体细胞型。供体细胞可如Wilmut等人，自然385810(1997)；Campbell等人，自然38064-66(1996)；Cibelli等人，科学2801256-1258(1998)；或Wakayama等人，自然394369-373(1998)所述。正常核型的所有细胞，包括能在核移植中成功应用的胚细胞、胎细胞和成人体细胞，原则上都可在根据本发明的方法中使用。胎成纤维细胞是特别有用的一类供体细胞。Campbell等人，动物生殖学43181(1995)、Collas等人，分子生殖进展38264-267(1994)、Keefer等人，生殖生物学50935-939(1994)、Sims等人，美国国家科学院院刊906143-6147(1993)、Wakayama等人，自然394369-373(1998)、WO-A-9426884、WO-A-9424274、WO-A-9807841、WO-A-9827214、WO-A-9003432、US-A-4994384和US-A-5057420中描述了普遍适用的核移植方法。因此本发明涉及至少部分分化的细胞包括完全分化的细胞的应用。供体细胞可以但不必培养，并且可以是静止的。静止的核供体细胞是可诱导为静止或在体内以静止状态存在的细胞。WO-A-9707669和WO-A-9707668中描述了培养的牛初级成纤维细胞、胚衍生的绵羊细胞系(TNT4)、来源于6岁成羊的绵羊乳腺上皮细胞衍生的细胞系(OME)、来源于绵羊胎组织的成纤维细胞系(BLWF1)和来源于9日龄绵羊胚的上皮样细胞系(SEC1)。WO-A-9607732中描述了本发明中有用的一类胚衍生细胞系，包括TNT4细胞系。WO-A-9737009和WO-A-9827214中描述了培养的内细胞团(CICM)细胞，WO-A-9807841中描述了胚胎或干细胞样细胞系。Zawada等人(自然医学(Nature Medicine)4(5)569-574(1998))和Cibelli等人(科学2801256-1258(1998))描述了用作核供体的转基因牛成纤维细胞。
当供体细胞表述为静止时，这些细胞不必通过有丝分裂细胞周期活跃增殖。WO-A-9707669中描述了静止供体细胞的应用。有丝分裂细胞周期具有4个不同时期G1、S、G2和M。细胞周期的开始事件，称作起点，发生在G1期，且具有独特的功能。在起点时选择或决定经历另一细胞周期。一旦细胞通过起点，其通过G1期的剩余部分，该期为DNA合成前期。第二阶段，S期，是发生DNA合成的时期。随后是G2期，它是DNA合成与有丝分裂之间的时期。有丝分裂本身发生在M期。通常认为静止细胞(包括诱导为静止的细胞，及自然静止的细胞，如某些完全分化的细胞，如支持细胞、神经元或丘细胞)不处于周期中这4个阶段的任一个；它们通常被描述为处于G0期，以表明它们不能正常地通过该周期，或者不能通过细胞周期活跃地分裂。静止G0细胞的核含有二倍DNA内容物。
能用多种方法诱导培养的细胞进入静止期，包括化学处理、营养剥夺、生长抑制或基因操作或蛋白质表达。目前已成功地利用培养基中血清水平的降低诱导绵羊及牛细胞系的静止。在该情况中，细胞在G1期时退出生长周期，并如上所述停止于所谓的G0期。这些细胞能保持该状态几天(根据细胞可能更长)，直到重新刺激才重新进入生长周期。停止于G0期的静止细胞是二倍体。G0期是细胞周期中细胞能够分化的时段。已报道了关于静止的大量代谢改变，包括一磷酸化组蛋白、纤毛中心粒、所有蛋白质合成的减少或完全停止、增强的蛋白质水解、导致总细胞RNA减少的转录减少和RNA转换增加、多核糖体的解聚、失活80S核糖体的积累和染色质浓缩(Whitfield等人，动物细胞增殖控制(Controlof Animal Cell Proliferation)1 331-365(1985)综述)。
这许多特征是向去核卵母细胞进行核移植所需的。G0状态与细胞分化相关的事实提示，这可产生一种更适于被受体细胞细胞质改建和/或重编程序的核/染色质结构。这样，利用呈静止状态的核供体细胞，可在胚胎重组或重建之前修饰供体核的染色质，以使核能直接发育。这不同于以前报道的所有核移植方法，因为其中供体细胞的染色质在用这些细胞作为核供体之前被修饰。
接受供体细胞核移植的受体细胞可以是卵母细胞或其他适当的细胞。已经证明了非卵母细胞的细胞的重编程序，包括胚胎干细胞(Matveeva等人，分子生殖进展50128-138(1998))和胚胎生殖细胞(Tada等人，EMBO J.166510-6520(1997))。
对于合子和二细胞胚可使用处于不同发育阶段的受体细胞，如从中期I到中期Ⅱ的卵母细胞(Cheong等人，日本兽医研究杂志(Jpn.J.Vet.Res.)40149-150(1992))。每一种均具有优点和缺点。受精卵的应用确保有效的活化，而卵母细胞需要单性生殖活化(见下)。在某些物种中可能更常使用卵裂期胚胎的另一种机制是需要基因表达重编程序的情况。小鼠中在第二个细胞周期中开始转录，并且直到胚泡期经双向电泳未显示合成蛋白质的性质有重要改变(Howlett和Bolton，胚胎学实验形态学杂志(J.Embryol.Exp.Morphol.)87175-206(1985))。在大多数情况中，受体细胞是卵母细胞。在牛及绵羊胚胎中，转录开始较晚，在第四个细胞周期中发生，这样晚的卵裂期胚胎在这些物种中是合适的。在大多数情况中，受体细胞是卵母细胞。
优选地受体是去核的。虽然通常假定用核移植法对受体卵母细胞的去核是必需的，但没有公开的实验证明这一判断。最初对有蹄动物所述的方法包括使细胞对半分裂为两份，其中之一可能是去核的(Willadsen，自然320(6)63-65(1986))。该方法的缺点是未知的另一半仍有中期细胞器并且认为细胞质体积的减少促进了新胚胎的分化模式(Eviskov等人，发育109322-328(1990))。
最近，用不同方法试图除去含有最少细胞质的染色体。发现吸引第一极体和相邻细胞质可除去67％的绵羊卵母细胞中的中期Ⅱ细胞器(Smith和Wilmut，生殖生物学401027-1035(1989))。只有利用DNA特异的荧光染料(Hoeschst 33342)才能提供一种保证去核而细胞质体积减少最少的方法(Tsunoda等人，生殖与受精杂志82173(1988))。在家畜物种中，这可能是目前常规使用的方法(Prather和First，生殖与受精杂志增41125(1990),Westhusin等人，生殖生物学(增)42176(1990))。
极少有用于哺乳动物去核的非侵入性方法的报道，而在两栖动物中，用紫外线照射作为常规方法(Gurdon Q，显微协会杂志(J.Microsc.Soc.)101299-311(1960))。没有在哺乳动物中使用该方法的详细报道，但应当指出，在使用DNA特异的荧光染料中，小鼠卵母细胞暴露于紫外线超过30秒种可降低细胞的发育能力(Tsunoda等人，生殖与受精杂志82173(1988))。
供体细胞核向受体卵母细胞的移植可利用本领域公知的任何适当方法。这些技术包括但不限于，融合或注射，即如Wilmut等人，自然385810(1997)；Campbell等人，自然38064-66(1996)；Cibelli等人，科学2801256-1258(1998)或Wakayama等人，自然394369-373(1998)所述的显微注射。
重建动物胚胎可在移植到受体动物之前在适当条件下体外培养。培养可达且包括胚胎发育的任何适当阶段，例如桑椹胚、原肠胚或胚泡期，或确定数量的细胞，例如16个细胞、32个细胞或64个细胞。此外，可培养至原条的发育。不算贮存胚胎的任何时间，从配子混合开始，在不晚于14天末时在胚胎中出现原条。该方法也可包括体内暂时胚胎培养。经验表明，核移植产生的胚胎不同于正常胚胎，有时受益于乃至需要不同于通常培养(至少体内)胚胎的体内培养条件。其原因不清。在牛胚胎的常规增殖中，例如，重建胚胎(其中许多立即)在绵羊输卵管中培养5-6天(如Willadsen所述，《哺乳动物卵移植》(Adams,E.E.编)185CRC Press,Boca Raton,Florida(1982))。为保护由核移植或体外受精方法产生的胚胎，在植入前将胚胎包埋于保护性培养基如琼脂中，然后在从临时受体中回收后从琼脂中切下是必要的。保护性琼脂或其他培养基的功能是双重的首先，其通过将透明带维持在一起作为胚胎的结构支持；其次，其作为受体动物免疫系统的细胞的屏障。
如果在体外发生可达胚泡期的发育，则在此阶段进行向最终受体动物中的移植。但是，如果在体内进行胚泡发育，虽然原则上胚泡能在胚泡前宿主中发育，但实际上通常从(临时)胚泡前受体中取出胚泡，并在从保护性培养基中切下后移植到(永久)胚泡后受体中，使之发育。在一个临时受体中培养大量胚胎降低了所需动物的数量，但通常将适于在相关物种中建立成功妊娠的较小量胚胎移植到永久受体中。
根据本发明的第四方面，提供了一种重建动物胚胎的方法，该方法包括向停止于第二次减数分裂中期的卵母细胞中移植二倍体核而不同时活化该卵母细胞，使核暴露于受体细胞质中一段时间，使胚胎足以能够活产，随后活化重建的胚胎而保持正确的倍性，包括通过分析胚胎或来源于胚胎的生物样品中的Igf2r基因表达，为巨大后代综合征(LOS)筛查胚胎。根据本发明该方面的受体卵母细胞在WO-A-9707668中有完整描述。其他特征如上所述。
根据本发明的第五方面，提供了一种用以上本发明第三或第四方面所述的方法制备的重建动物胚胎，或通过如本发明第二方面所述的体外产生法制备的动物胚胎。
根据本发明的第六方面，提供了一种产生动物的方法，该方法包括(a)在体外或体内环境中培养一种动物胚胎，包括经体外技术如成熟、受精和/或培养制备该胚胎，其中对该胚胎进行原核注射，或如上所述重建动物胚胎；
(b)通过分析胚胎或来源于胚胎的生物样品中的Igf2r基因表达，为巨大后代综合征(LOS)筛查胚胎；(c)使该动物从胚胎发育至足月；和(d)任选地由这样产生的动物繁殖。
步骤(a)和(b)如上详述。第三步(c)在本发明的该方法中是使该动物由胚胎发育至足月。这可直接或间接进行。在直接发育中，只是使步骤(b)产生的重建胚胎发育，而不另外进行超出发育所需范围的干预。但在间接发育中，可在发生完全发育之前操作胚胎，例如，为了提高产量可分裂胚胎，及克隆扩充细胞。此外，根据本发明的任一方面通过克隆扩充或连续核移植实现活胚胎产量的提高也是可能的。如果经核移植制备转基因或嵌合动物胚胎，其中欲向动物胚胎DNA内容物中插入超过1种的转基因，则连续核移植是有用的。例如，在从供体细胞(其本身可以是转基因的)核移植和胚胎重建后，能分裂得到的胚胎，并向细胞中插入其他转基因，以用作另一核移植中的供体细胞。在该方法的每一阶段，能用根据本发明的方法筛查胚胎，以检查异常发育。在本发明该方面的任选步骤(d)中，可由前述步骤制备的动物繁殖动物。这样，可用一只动物建立一群具有希望的遗传特征的动物。当动物是转基因动物时，可进一步进行重建胚胎的筛查，以选择转基因的稳定整合和正确的基因型/表型。
通过图例和概述，下列方案展示了一种可制备转基因和非转基因动物的典型方法。可认为该方法包括4个步骤(a)通过核移植或体外产生对体外培养胚胎的制备；(b)通过分析来源于胚胎的生物样品中的Igf2r基因表达，为巨大后代综合征(LOS)筛查胚胎；(c)筛选显示正常Igf2r基因表达模式的胚胎；(d)将胚胎移植到雌性受体动物中。
根据本发明的第七方面，提供了如上所述制备的动物。
根据本发明的第八方面，提供了一种为巨大后代综合征筛查动物细胞的方法，其包括分析动物细胞中Igf2r基因表达的步骤。
当在动物胚胎的体外产生或核移植法中使用时，如上所述的筛查方法允许鉴定具有发展为巨大后代综合征危险的动物细胞。该动物细胞可由体外或体内来源获得。
能根据本发明该方面筛查的细胞包括可在体外培养的任何动物细胞。其定义包括重建的单细胞胚或合子。例如，可筛查胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、精子衍生干细胞或来源于胚胎、新生、婴儿、青年或成年动物的其他干细胞。在本发明说明书中，动物干细胞可以是多能干细胞、胚胎干(ES)细胞、胚胎生殖(EG)细胞(原始生殖细胞衍生的或PGC衍生的细胞)、体干/祖细胞、造血干细胞、表皮干细胞或神经元干细胞。全能细胞能指导整个动物的发育(当通过从供体细胞向受体细胞如去核卵母细胞的核移植构建胚胎时，供体细胞核是全能性的)。这包括引导胚外谱系即胎盘的发育。在该定义中，受精的合子及某些物种中的卵裂球也是全能性的。与之相比，多能细胞(即胚胎干细胞)型被定义为在注射到囊胚腔后能形成孕体/后代中所有组织的细胞。在本发明优选的实施方案中，动物干细胞可以是胚胎干(ES)细胞或胚胎生殖(EG)细胞。在该定义中，术语胚胎干(ES)细胞和胚胎生殖(EG)细胞不限于来源于小鼠的细胞，而涉及任何相当的细胞，如其他物种中的胚胎干细胞样细胞。
可用本发明该方面的方法有效筛查的其他细胞包括在核移植或利用四倍体聚集、胚泡注射等的胚胎重建中使用或由其制备的任何细胞，或是连续核移植产物的细胞。这些细胞型一般包括但不限于分化或未分化细胞，其也可是转基因的适当成纤维细胞。未分化细胞可进一步用本领域已知的标准技术诱导分化。
应当理解，根据本发明第一方面的方法的特定用途在于检测培养环境，包括培养基和条件、体内环境和胚胎操作方法，以确定在这种系统中培养的动物胚胎是否具有发展为巨大后代综合征(LOS)的危险。根据本发明的第九方面，提供了一种检测用于在动物胚胎中诱发巨大后代综合征的胚胎培养环境的方法，其包括分析来源于胚胎的生物样品中Igf2r基因表达的步骤。
检测胚胎培养环境诱发动物胚胎LOS的能力的方法特别有利于提供一种方法，用于确定该系统的哪一特征负责胚胎培养中动物胚胎发育的干扰。就此而言，它可能在为商业用途优化胚胎培养方案中得到应用。因此，本发明该方面也扩展到根据本发明第一方面的方法检测用于诱发动物胚胎巨大后代综合征的胚胎培养环境的应用。
胚胎培养环境可能包括胚胎操作方法、胚胎培养方法和核移植方法。一般而言，胚胎操作方法包括透明带的钻孔或穿透，以助于胚泡孵化，例如精子导入技术如ICSI(胞质内精子注射；Barnes等人，人类生殖103243-3247(1995))、细胞质减少或置换(Cohen等人，分子人类生殖(Mol.Hum.Reprod.)4269-280(1998)；Cohen等人，柳叶刀350186-187(1997))、核、原核、线粒体或任何遗传物质的去核、移植或去除，及植入前诊断(Handyside,A.H.和Delhanty,J.D.，遗传学趋势13270-275(1997))。其他胚胎操作技术包括从一种动物的生殖道向另一种动物的生殖道或向同一生殖道的另一部分移植胚胎。在某些方法中，结扎输卵管，而胚胎在或不在琼脂块或相当物中。也可通过外源物质或植入物(如激素、饮食添加物)的冲洗或加入或母体环境的任何变化来改变胚胎环境。胚胎培养方法包括制备及保持干细胞或其他任何细胞的方法，这些细胞用于利用如四倍体聚集和胚泡注射的方法的核移植或胚胎重建。培养方法也可包括协同培养或灌注系统的应用及静止培养。核移植法和DNA的原核或胞质内注射如上所述。胚胎培养基在本领域中众所周知，一般含有养分、血清、生长因子、激素、维生素、抗氧化剂、酶及其他成份。培养基也可包含体液如卵泡液。
根据本发明该方面的方法的结果将使技术人员能通过加入或去除一种或多种成份，或改变成份的浓度，来改变胚胎培养环境的条件，以防止LOS的诱发。例如，温度、pH或空气环境的改变，如甲基化剂或去甲基化剂(如甲基转移酶、5-氮杂胞苷、多胺)等成份水平的改变，遗传或化学修饰(如基因转移或利用反义寡核苷酸)引起的Igf2r基因或IGFⅡR蛋白表达的改变，毒性物质的酶或其他清除剂的加入，例如用谷氨酸脱氢酶去除氨(Gardner,D.K.，国际细胞生物学(Cell Biol.Int.)181163-1179)。
这种筛查方法的应用能鉴定作用于胚、细胞和遗传物质(包括DNA或RNA)的因素，其通过影响Igf2r基因的表达干扰动物胚胎的发育。这使得能设计新的或改进的体外培养系统、胚胎环境，包括临时体内系统，和避免该综合征的核移植法。也能利用这种筛查确定发生生长干扰的发育阶段，这可提供改变培养方案的另一种方法。
按照本发明的方法筛查的或者用引入筛查LOS步骤的方法制备的胚胎能用作如上所述其他核供体细胞的来源。胚胎能进一步用作细胞来源，产生可以是ES细胞或ES细胞样细胞的细胞系。来源于这些胚胎的动物细胞或细胞系也能在细胞移植治疗中使用。因此，在本发明的另一方面提供一种治疗方法，其包括对患者施用动物细胞，其中这些细胞由按照上述方法筛查的胚胎制备，或者按照引入这种筛查步骤的方法制备。本发明该方面扩展到这些细胞在医学中的应用，例如细胞移植治疗，也扩展到来源于这些胚胎的细胞在制备用于移植的细胞或组织移植物中的应用。这些细胞可组成组织，例如心脏、肺、肝、肾、胰、角膜、神经(例如脑、中枢神经系统、脊髓)、皮肤，或者这些细胞可以是血细胞(例如血细胞、即红细胞、白细胞)或造血干细胞或其他干细胞(例如骨髓)。例如，可制备一种自体移植物，其中在改变之前从患者中取出细胞，随后回输。然而，本发明的方法也可用于在制备同基因移植物(同种移植物)、异基因移植物和/或异种移植物中筛查胚胎。这些方法包括用于向患者治疗性移植的胚细胞的体外分化，包括遗传修饰细胞以改正医学缺陷的情况。这些用途包括如糖尿病、帕金森氏病、运动神经病、多发性硬化症、AIDS等疾病的治疗，或特征在于患病个体细胞或器官功能丧失的病症的治疗。
因此本发明也扩展到用于诊断动物胚胎中或来自胚胎的样品中巨大后代综合征(LOS)的试剂盒的供应，其中包含检测Igf2r基因表达的试剂。这些试剂盒也可用来实施根据本发明第九方面的方法，该方法用于检测诱发动物胚胎巨大后代综合征的胚胎培养环境。Igf2r表达的分析或检测可如上所述进行。
本发明的第二及其后方面的优选特征在加以必要修改后适于第一方面。
现参照下列实施例和附图进一步描述本发明，其只是为了说明，而不应看作对本发明的限制。提到多个附图，其中
图1显示体外培养后妊娠125日胎肝(图1(a))、心(图1(b))、肾(图1(c))的不同的器官生长。对照(CONT)胎以实线(拟合数据)和虚线(预测的生长)表示，其用线性异速生长方程式logey=logea+b(loge)x得出，其中y=器官重量，x=胎重量。点(ⅰ)和(ⅱ)分别代表妊娠125日CONT胎的最小和最大重量，点(ⅲ)代表根据Gompertz方程式预测的出生体重。异速生长系数(b±s.e.m)是对于心脏(CONT b=0.91±0.18，培养物b=1.47+0.12)、肝(CONT b=0.89±0.13，培养物b=1.16±0.10)和肾(CONT b=1.10±0.29，培养物b=1.09±0.26)，(●,○)。空心数据点(○)代表出见羊水过多的妊娠。
图2显示Igf2r PCR测定的确证及IGFⅡr蛋白同一性的结果。
图2(a)显示反转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定的典型确证，其用于定量相对于18S核糖体亚单位的基因转录物水平(在本案中为肝Igf2r)。Igf2r与18S在单管内扩增，使用适当的循环数和18S引物与稀释的CompetimerTM之比，以确保至少10倍稀释的cDNA的线性扩增。数值为信号强度的主观单位。
图2(b)显示CONT和LO肝样品中Igf2r和18S的RT-PCR扩增。
图2(c)显示证实IGFⅡWestern配体印迹上的一条＞200kDa条带为IGFⅡ受体。用抗IGFⅡr蛋白的多克隆抗体对羊胎血浆的免疫印迹显示，一条带(a)与纯化和牛IGFⅡr(b)共迁移，并通过胎血浆的Western配体印迹鉴定＞200kDa条带。
图2(d)显示对CONT和LO血浆样品的IGFⅡ Western配体印迹，鉴定IGFⅡr蛋白和IGF结合蛋白(IGFBP)。
材料与方法绵羊LOS模式系统尽管该事件既不可预测又不能重现，但多种体外胚胎培养系统与综合征的程序性进展有关(Lau等人，基因与发育82953-2963(1994))。本研究中，超排卵的苏格兰黑脸母羊的受精卵在4次体外处理中培养5天。这包括两种培养系统合成输卵管液(SOF)及TCM199与牛颗粒细胞单层的共培养物(Cocult)(Lau等人，基因与发育82953-2963(1994))，其中根据不同饮食方案(处理SOFA、SOFB、CocultA和CocultB)添加从公牛获得的两种血清(A或B)之一。将胚泡期胚胎分别移植入苏格兰黑脸母羊受体内，并在妊娠125天时回收孕体(11SOFA,13SOFB,11CocultA和13CocultB)。回收1-6小时后将第六日的对照胚胎(CONT)移植入受体，回收22个孕体。胚胎培养与移植在用Chronogest阴道海绵(Intervet)引起发情同步后，用400i.u.PMSG(Intervet)和Ovagen(ICP)在成熟苏格兰黑脸母羊中诱导超数排卵。使用释放孕酮的阴道海绵(30mg乙酸荧光孕酮，Chronogest，Intervet)12天使供体与受体母羊动情周期同步。对于受体母羊同样的海绵被置于阴道内12天，而对于供体母羊则取出海绵并于7日后插入第二块海绵。受体在取出海绵时施以400i.u.PMSG(Intervet)。从停用孕酮24小时后开始，在以后三天内于08:00、12:00、16:00和24:00时对已切除输精管的公羊进行发情期观察。在从12天孕酮刺激期的第10天开始的4天中，每日两次施用等剂量的FSH(Ovagen,ICP Ltd，新西兰)，总剂量为9mg，以诱导供体的超数排卵。
在取出海绵44小时后，用从一只Suffolk公羊新鲜获得的精液进行腹腔镜检子宫内受精，以使遗传变异降到最低。精液用每ml含有1000i.u.青霉素钠及1mg硫酸链霉素的磷酸盐缓冲液以3∶1稀释。稀释的精液在受精前置于30℃下，并在每一子宫角放置大约100×106个活动精子。
受精36小时后经诱导全身麻醉(氟烷；氧气；氧化亚氮)剖腹取出胚胎。每一输卵管以20ml HEPES缓冲的合成输卵管液(HSOF)冲洗，该洗液由Tervit等人(1972)的制剂衍生，包含20.0mM HEPES缓冲液、5.0mM碳酸氢钠、1.SmM葡萄糖、3.3mM乳酸钠、0.33mM丙酮酸钠、1.0mM L-谷氨酰胺和30mg/ml牛血清白蛋白。
然后将胚胎分配于四个培养处理组。处理间的分配旨在保证就允许的卵产量而言每一供体都相同。胚胎培养按照标准技术在SOF和卵泡细胞层共培养物(Cocult)中进行。所用的共培养基为培养基199，其中含有Earle’s盐(Life Technologies，英国)、50i.u./ml青霉素、50μg/ml硫酸链霉素、10％热灭活(56℃,30min)的公牛血清(Globepharm Ltd，英国)。pH值调节到7.3，渗透摩尔浓度调节为390-310mOsm。SOF由Tervit等人(1972)的最初制剂衍生，不含HEPES缓冲液，包含25.0mM的碳酸氢钠、9.9mM乳酸钠、0.99mM丙酮酸钠、1.5mM葡萄糖、1.0mM L-谷氨酰胺、50i.u./ml青霉素和50μg/ml硫酸链霉素。SOF培养基的pH值调节为7.4，渗透摩尔浓度调节为270-280mOsm或290-310mOsm。
从喂饲分别包含120g和190g粗蛋白/kg干物质的食物的公牛中获得血清A和B。用这些血清(4∶1v/v)添加到SOF和Cocult中，形成四种胚胎培育处理(SOFA、SOFB、CocultA和CocultB)。用于协同培养的每个60mm直径组织培养皿(Bibby Sterilin)含有50μl小滴(n=8)的M199，血清上覆盖矿物油(目录号M8410,Sigma，英国)。在引入合子时(第1天)，在这些小滴中建立4日龄牛的颗粒细胞层。在引入合子之前更新培养基(50％置换，以体积计)，之后在38.5℃下在湿润环境(5％CO2，95％空气)中进行5天的培养期中以48小时更新培养基(按体积50％置换)。在合子收集当天，每个60mm培养皿用8小滴，制备添加有血清的SOF小滴(20μl，在油下)。在38.5℃低氧环境中(5％CO2,5％O2,95％N2)每滴至多可培养4个合子。之后以48小时的间隔，在更新每滴的培养基后，在相同条件下将合子移到新鲜制备的20μl液滴中。
胚胎培养5天后，通过腹腔镜检术将发育至桑椹期或胚泡期的胚胎分别移植到发情同步的母羊子宫内。该移植技术包括子宫角尖端通过腹腔镜指导的挑取通过腹壁的腹部小切口的短暂暴露。在妊娠125日时通过施用25ml 20％w/v戊巴比妥钠(Euthatal,Rhone Merieux Ltd，英国)使怀孕母羊安乐死。然后取出妊娠子宫称重。取出胚胎称重，切下肝、心脏、肾及个别肌肉并称重。
该研究中所有母羊均用2.5％尿素处理的干草饲养。各步骤均严格按Home Office规定进行。胚胎重量以ANOVA分析。然后用t检验评估平均值与异速生长系数之间的差异。结果在妊娠125天时，所有胚胎培养处理的胚胎重量均大于对照组(P＜0.01；平均值±s.e.,CONT 3907±68,SOFA 4594±248,SOFB4856±309,CocultA 4495±291,CocultB 5302±422),并且比最重对照组胚胎更重的胚胎的百分数分别为46％、54％、36％和54％。羊水过多(即胎液重量超过对照组孕体平均值3个标准差)在54％的体外培养胚胎妊娠中明显，15％显示严重的胎羊水肿(Hydrops fetalis)。培养处理的三种胚胎两倍于对照组的平均体重，表明极度的过度生长。此外，在妊娠125日时，由培养的胚产生的胎羊中有13％重于三周后147天时对照胎羊的预测出生体重。培养处理产生的许多巨胎的外形在整体形态及皮毛生长范围方面均类似于足月胎。这表明LOS使发育大大进步。
也发现过大的胎羊中主要器官的发育基本上也受到影响。对于全部处理组，用下列线性异速生长方程式将器官重量与胎体重量相关联，来估计第125日的发育logey=logea+blogex其中y=器官重量，x=胎体重。
图1所示为对照(CONT)组确定的异速生长系数(b±s.e.m.)类似于在较早研究中(Sinclair等人，动物生殖学45 223(1996))由妊娠35-135天时取出的121个相同基因型的正常胎所得到的数值(心脏b=0.92±0.01，肝b=0.86±0.01，肾b=0.99±0.01)。将体外培养的胚(培养图1)所产生的胎的相应系数与以前的研究结果相比较，因为其中观测到的较大胎重量范围可更精确地估计异速生长系数。对于体外培养的胚产生的胎肝(图1(a),P＜0.05)和心脏(图1(b),P＜0.0001)，生长系数明显较高，表明这些器官的生长速度高于由妊娠125日的正常胚胎或由同等重量的正常发育的较老胚胎所预计的。培养胚胎的肾脏重量高度可变(图1(c))。有几个肾脏明显增大，这通常与羊水过多(即胎液重量超过CONT妊娠平均值3个标准差；图1(c))及严重的胚胎水肿(Hydropsfetalis；数据未显示)有关。重要器官发育的这些改变可导致与巨大后代综合征有关的出生前及围生期死亡。实施例1Igf2r基因表达的分析在单管实验中定量相对于18S核糖体RNA的转录水平。18s引物引导的扩增由于可阻断Taq DNA聚合酶延伸的18S PCR CompetimerTM(Ambion)的竞争而减弱。用RNA IsolatorTM(Genosys)从组织中提取总RNA,2.5μg用pd(N)6随机六聚体引物和第一链cDNA合成试剂盒(Pharmacia Biotech)反转录。在25μl PCR反应中，125ng cDNA模板与0.5μM基因特异引物、0.5μM选择18S引物和18S PCRCompetimerTM(Ambion)、含2.5mM MgCl2的10×缓冲液，1mM dNTPs(InVitrogen)及0.635单位的Taq DNA聚合酶(Boehringer)混合。Igf2外显子特异性转录物的引物(Ohlsen等人，DNA细胞生物学13(4)377-388(1994)),IGFBP2、IGFBP3(Winger等人，生殖生物学56 1415-1423(1997))和IGFBP4(Armstrong等人，内分泌学139(4)2146-2154(1998))如前所述，而Igf2r引物由Genbank牛序列J03527(5’-核苷酸530-551,3’-核苷酸769-750；Lobel等人，生物化学杂志263(5)2563-2570(1998))设计。为确保该实验处于线性扩增范围内，18S PCR CompetimerTM:18S引物之比对于每一组织和基因特异引物对不同。所有Igf2引物皆跨越内含子，以提供污染DNA的对照，而在每一PCR反应中也包括不合cDNA的试管。
在所用方案中，cDNA于95℃变性5分钟，然后PCR(94℃1分钟，60-65℃ 30s,72℃ 1分钟)，共进行在溴化乙锭染色的1.7％琼脂糖凝胶上检测转录物所需的最低循环数(一般为25-27次循环)。用分子成像仪图像分析系统用Molecular AnalystTM软件(Bio-Rad)定量条带密度。结果表示为转录物18s之比，并用两样本t检验(Minitab)确定其统计学差异。经测序(序列2.0版，Amersham)证实PCR产物的鉴定。结果在所有处理组中将超过5.5Kg的胚胎确定为巨大后代(LO)，进行基因表达分析。利用相对RT-PCR(图2(a))比较CONT与LO后代胚胎的肝、肾和心脏中Igf2及Igf2r的表达水平，也用前臂桡侧腕伸肌的组织分析骨骼肌中的基因表达。Igf2以组织特异及发育阶段特异的方式表达为一系列选择剪接的、外显子特异的转录物(Ohlsen等人，DNA细胞生物学13(4)377-388(1994))。用针对每个非编码外显子的5’引物和来源于第一编码外显子-外显子8的3’引物检测所有可能的转录物的表达。未检测到在125日绵羊胎中正常表达的任何外显子特异转录物(前导外显子5、6、7的转录物)的水平有任何数量改变，如表1所示。此外，也未观察到有任何数量改变表明在妊娠125日检测的组织中非正常转录的外显子特异性转录物形式的活化(即外显子1和3-产后转录物和外显子4-胎盘转录物；数据未显示)。因此绵羊巨大后代综合征的机理似乎与人类贝-维综合征中由Igf2过量表达诱发的典型胎儿过度生长不同。相反，Igf2r基因的表达在肝脏和肌肉中明显降低约50％，在肾和心脏中降低约30％(表1)。
表1显示125日胎组织的基因转录物的表达。数值为表示为转录物18S之比的主观吸光度单位。所有数值均为至少21个CONT和10个LO胎的平均值±se。星号*、**、***表示在CONT和LO值之间有显著性差异的值(斯氏t检验，分别P＜0.05、0.01、0.001)。缩写BQ表示基因转录物的扩增低于本实验的检测极限(18S扩增不能被竞争剂充分调控，以确保转录物与18S的线性扩增)。实施例2:Western印迹分析为研究Igf2r基因表达的降低是否导致IGFⅡr蛋白水平的降低，用125I-IGFⅡ探查组织蛋白提取物和血浆样品的Western配体印迹。使用125I-IGFⅡ的Western配体印迹法如先前所述进行(Armstrong等人，内分泌杂志120 373-378(1989))，其中的改变是用于转移到硝酸纤维素膜上的阴极缓冲液含有0.5mg/ml BSA(Bhavsar等人，分析生物化学(Anal.Biochem.)221 234-242(1994))。如前所述鉴定IGFBP(Delhanty,P.J.D.和Van,V.K.M.，内分泌学132(1)41-52(1993))。使用过氧化物酶检测体系(Vector Labs，英国)用抗牛IGFⅡ受体抗体进行免疫印迹。IGFⅡr抗体及纯化的IGFⅡr由Dr PLobel提供，高等生物技术及医药中心(Centrefor Advanced Biotechnology and Medicine),Piscataway,NJ，美国。
以前的研究推测，配体印迹上显现的约250kDa的蛋白质为IGFⅡr(Butler,J.H.和Gluckman,P.D.，内分泌杂志109 333-338(1986)；Delhanty,P.J.D.和Han,V.K.M.，内分泌145 545-557(1993))，而且用抗牛IGFⅡr抗体经Western印迹证实了这一点(图2(b))。分别观察到肌肉和肝IGFⅡr蛋白水平降低61％和81％(P＜0.001，表2)，而循环形式的降低67％(P＜0.001，表2)。鉴于Igf2r表达的降低和Igf2r表达破坏的小鼠中引起的过度生长表型，这些发现提供了表明IGF2R在绵羊LOS中的直接原因作用的有力证据。循环及组织IGFⅡr水平的明显降低可解释广泛的器官效应及普遍的过度生长。
表2显示125日胎血浆和组织中IGFⅡ受体蛋白IGFBP2和IGFBP3的水平。所有数值均为由至少21个对照和10个LO胎获得的平均值±s.e.×1000。数值为IGFⅡ Western配体印迹产生的信号强度的磷成像仪吸收单位。星号(*、**、***)表示在CONT与LO值之间存在显著性差异的数值(斯氏t检验，分别P＜0.05、0.01、0.001)。实施例3血浆IGFⅡ水平的测定IGFⅡr影响胎儿生长的机理仍未完全清楚。IGFⅡr的功能之一是将IGFⅡ导向溶酶体降解。因而根据对小鼠的研究，已广泛假定IGFⅡr的减少可削弱IGFⅡ从循环中的清除。引起的强胚胎有丝分裂原水平的提高提供了一种通过细胞增殖和凋亡抑制促进胚胎生长的机理。在用抗人多克隆IGFⅡ抗血清以及人重组IGFⅡ作为标准(GroPep Pty Ltd)进行酸性HPLC(Gutierrez等人，内分泌学杂志153 231-240(1997))后测定血浆IGFⅡ。本实验的检测极限约为30pg/管。结果然而，在本研究中令人惊讶地发现，在CONT和LO绵羊胎之间IGFⅡ血浆水平无显著差异(6.08±0.57和4.63±0.67ug/ml；p=0.1)。该结果可能是由于应答被抑制的IGFⅡr的物种间特异性差异，因为据报道处于相同妊娠期(E18.5)的Igf2r无效突变小鼠的血清IGFⅡ水平比野生型高4倍(Ludwig等人，生物学进展177 517-535(1996))。然而，能通过无效去除在突变小鼠中增多的循环IGF结合蛋白引入这种差异。另外，本实验及其他小鼠研究中报道的血清IGFⅡ差异均无统计学显著性(Eggenschwiler等人，基因与发育11 3128-3142(1997)；Lau等人，基因与发育8 2953-2963(1994))。而在H19无效突变小鼠中，其中增强的Igf2表达引起胎儿过度生长，尽管组织水平提高，但血清IGFⅡ未增加(Eggenschwiler等人，基因与发育11 3128-3142(1997))。讨论IGFⅡ水平的绝对改变对于该生长因子生物学活性的改变不是必要的。胰岛素样生长因子的作用是复杂的，其由一系列结合蛋白(IGFBP)和蛋白酶介导(Jones,J.I.和Clemmons,D.R.内分泌学综述16 3-34(1995))。本研究中的Western配体印迹显示，在LO胎中与IGFⅡ最强结合的IGFBP2的循环水平(Delhanty,P.J.D.和Han,V.K.M.内分泌学132(1)41-52(1993))提高102％(表2)，而伴随有肝基因表达的86％的提高(表1)。已提出IGFBP2可延长循环中IGFⅡ的半衰期，在血液与组织液间运送IGFⅡ，以改变局部浓度及与受体的接近。因此LO胎中增加的IGFBP2可在不改变配体浓度的情况下提高IGFⅡ的生物学活性。以前报道在特大E18/19胎鼠血浆中提高的IGFBP3血浆水平在巨大羊胎中未有改变，除在肾脏中转录水平降低23％外，在检测的所有组织中表达水平均保持不变。在所有检测的组织中未检测到IGFBP4表达的差异。
巨胎中Igf2r表达的降低也可能通过不依赖于IGFⅡ的机制加速了胚胎生长。除对IGFⅡ清除的作用外，IGFⅡr还是TGFB1激活所必需的，TGFB1发挥强烈的生长抑制作用(Wang等人，癌症研究(Cancer Res.)57 2543-2546(1997))，并可解释在LOS中观察到的部分或全部过度生长。IGFⅡr也具有甘露糖6-磷酸结合域，并可向溶酶体输送大约50个6-磷酸甘露糖标记的溶酶体酶(Sklar等人，生物化学杂志264 16733-16738(1989))。报道在Igf2r无效突变小鼠中几种溶酶体酶水平降低(Wang等人，自然372 464-467(1994))，这可能是胚胎发育中组织重建的结果(Sklar等人，(1989))。因此，因LOS中IGFⅡr减少引起的溶酶体酶功能的破坏可用来解释观察到的某些器官缺陷，也可解释总体过度生长。最后，当然，多功能IGFⅡ/甘露糖6磷酸受体作用的结合也可导致绵羊LOS中观察到的复杂表型。
本研究建立了绵羊巨大后代综合征的一种模型，该模型也可适用于牛的类似综合征(Kruip,T.A.M.和den Daas,J.H.G.，动物生殖学47 43-52(1996))的研究。本研究中胚胎培养处理引起的巨大后代的高发生率产生综合表型描述，和对与干扰机制有关的基因的第一次报道。对下调的Igf2r表达的鉴定使该印记基因成为引发该综合征的有力侯选基因，而该综合征的发生是由于因培养条件诱导的植入前胚胎的外遗传改变，这一点目前尚在研究中。对该机理的进一步理解将导致可避免该问题的胚胎操作方案的发展。这对于家畜克隆技术及体外胚胎产生的发展非常重要。此外，由于仍不知在非反刍动物胚胎操作之后为何未有类似干扰，所以巨大后代综合征对于新的人类辅助生殖方法也是有意义的。
表1第125日胎组织的基因转录水平
表2第125日胎组织中的IGFⅡR及IGF结合蛋白
权利要求
1．一种筛查动物胚胎巨大后代综合征(LOS)的方法，其包括分析动物胚胎中或来源于胚胎的生物样品中胰岛素样生长因子-2受体(Igf2r)基因表达的步骤。
2．如权利要求1所述的方法，其中动物是哺乳动物。
3．如权利要求2所述的方法，其中哺乳动物是人。
4．如权利要求2所述的方法，其中哺乳动物是有蹄动物种。
5．如权利要求4所述的方法，其中有蹄动物种是牛、绵羊、猪、山羊、马、骆驼或水牛。
6．如权利要求4或权利要求5所述的方法，其中有蹄哺乳动物是一种转基因动物。
7．如权利要求1-6任一项所述的方法，其中生物样品包括组织活检、细胞或细胞物质或生物液体。
8．一种体外产生动物胚胎的方法，其包括下列步骤向体外培养系统中的卵母细胞导入精细胞，随后培养得到的胚胎，并通过分析动物胚胎中或来源于该胚胎的生物样品中的Igf2r基因的表达，筛查该胚胎的巨大后代综合征(LOS)。
9．如权利要求8所述的方法，其中该方法包括在受精前使卵母细胞体外成熟的另外步骤。
10．一种重建动物胚胎的方法，其包括下列步骤向适当的受体细胞中移植供体细胞核，并通过分析动物胚胎中或来源于胚胎的生物样品中的Igf2r基因表达，筛查得到的胚胎的巨大后代综合征(LOS)。
11．一种重建动物胚胎的方法，该方法包括向停止于第二次减数分裂中期的卵母细胞中移植二倍体核而不同时活化该卵母细胞，使核暴露于受体细胞质中一段时间，使胚胎足以能够活产，随后活化重建的胚胎而保持正确的倍性，包括通过分析胚胎或来源于胚胎的生物样品中的Igf2r基因表达，筛查胚胎的巨大后代综合征(LOS)。
12．一种用如权利要求10或权利要求11所述的方法制备的重建动物胚胎。
13．一种产生非人类动物的方法，该方法包括(a)体外培养一种动物胚胎，其中该胚胎是通过体外产生或通过重建如权利要求8-11任一项所述的动物胚胎而制备的；(b)通过分析该胚胎或来源于该胚胎的生物样品中的Igf2r基因表达，筛查该胚胎的巨大后代综合征(LOS)；(c)使该动物由胚胎发育至足月；和(d)任选地由这样产生的动物繁殖。
14．一种如权利要求13所述制备的非人类动物。
15．一种筛查动物细胞巨大后代综合征的方法，其包括分析动物细胞中Igf2r基因表达的步骤。
16．一种检测在动物胚胎中诱发巨大后代综合征的胚胎培养环境的方法，其包括分析胚胎或来源于胚胎的生物样品中的Igf2r基因表达的步骤。
17．一种治疗方法，包括对患者施用动物细胞，其中由用权利要求1-7任一项所述的方法筛查的胚胎制备该细胞。
18．编码胰岛素样生长因子-2受体(IGF2R)的核酸序列或其片段或与之互补或同源的序列在制备用于诊断动物胚胎或胚胎样品中巨大后代综合征(LOS)的试剂中的应用。
19．用如权利要求1-7任一项所述的方法筛查的胚胎衍生的细胞或细胞系在医药中的应用。
20．用如权利要求1-7任一项所述的方法筛查的胚胎衍生的细胞或细胞系在制备用来移植的细胞移植物中的应用。
21．一种诊断动物胚胎或来自胚胎的样品中巨大后代综合征(LOS)的试剂盒，其包含检测Igf2r基因表达的工具。
全文摘要
提供了一种用于诊断经核移植制备的动物或经体外受精或培养方法制备的动物中巨大后代综合征(LOS)的方法,其包括分析动物胚胎或来源于胚胎的生物样品中的胰岛素样生长因子－2受体(Igf2r)基因表达。
文档编号G01N33/50GK1324400SQ9981255
公开日2001年11月28日 申请日期1999年9月23日 优先权日1998年9月25日
发明者T·G·莫西沃伊, K·D·辛克莱尔, L·E·杨, I·维尔穆特 申请人:罗斯林学院(爱丁堡)