Dna和rna的测序方法

文档序号:5880353阅读:1141来源:国知局
专利名称:Dna和rna的测序方法
技术领域
本发明涉及脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的碱基测序测定方法。
现今,脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的碱基测序在生物技术、制药工业、食品工业、医学诊断及其他应用领域是最重要的分析技术。生物基因组的破译为疾病的诊断、治疗和预防提供了可能,以及为对人类基因组进行目标修饰从而产生具有修饰特征的有机体提供了可能。为能利用这些潜力,需要能足够快速测序的方法。
按照Sanger等(Proceedings of the National Academy of Science,USA,74,5463-7;1977)及Maxam和Gilbert(Proceedings of the NationalAcademy of Science,USA,74,560-564;1977)的经典测序法,至今仍为标准测序方法的基础。测定200个核苷酸,该法需1-3天。对于人类基因组的约3×109个碱基对,用此方法测序,显得太慢。
新近尝试加快测序的方法集中于使用荧光光谱来检测单个核苷酸的方法。U.S.专利4962037公开了一测序方法,根据该方法,在一单链上合成互补核酸链,其中代表碱基的荧光颜料分子与每个碱基共价结合。该荧光标记的核酸分子与一粒子表面结合,并以单个粒子保存,例如以液体流保存在微注射吸管中。利用核酸外切酶逐一从此荧光标记了的核酸链切下每一荧光标记的碱基,并在液体流中被激光束聚焦,并在激发后检测对碱基特异的荧光。理论上该方法的测序速度只受外切酶的酶切速度的限制,因此估计测速可达100-1000个碱基/秒。
实施美国专利4962037已公开方法的先决条件是只有一个核酸分子保持在一个微粒上。然而,此操作,即将单个微粒与单个核苷酸分子结合,在技术上很困难、复杂,并且已证实其并不适用于实际应用。此外,外切酶的使用是必需的,所述外切酶能切割颜料标记了的核苷酸。这使该方法的发展复杂化,此外,对修饰了的外切酶的使用通常情况下导致碱基序列测定出现较高的误差。
因此本发明的目标是提供用于DNA或RNA碱基测序的方法,该方法利用了如上现有技术中所述单分子检测测序方法的高速率的优点,并同时克服了如前所述的缺点。
为实现此目标,本发明提供第一种DNA或RNA测序方法,包括如下步骤(1)将DNA或RNA单链固定于表面上;(2)将一束激光聚焦于一条固定化的单链上;(3)通过加入含有(i)用于合成DNA互补链的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的混合物或用于合成RNA互补链的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶核苷酸的混合物和(ii)一种聚合酶的溶液,来产生上述被固定的、被聚焦的单链的DNA或RNA互补链,其中3a)腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸这四种核苷酸中的至少两种或腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶核苷酸这四种核苷酸中的至少两种用不同的发光标记物进行了部分或全部标记,3b)插入到互补链中的每一个被发光标记物标记了的核苷酸用单分子检测器进行检测,和3c)在下一个被发光标记物标记的核苷酸插入之前对前一个被发光标记物标记的核苷酸的发光信号进行检测。
本发明还提供第二种DNA或RNA碱基测序方法,包括如下步骤(1)将DNA或RNA单链固定于表面上;(2)将一束激光聚焦于一条固定化的单链上;(3′)通过按续加入含有(i)用于合成DNA互补链的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸中的一种或用于合成RNA互补链的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶核苷酸中的一种和(ii)一种聚合酶的溶液,来产生上述被固定的、被聚焦的单链的DNA或RNA互补链,其中3a′)上述溶液中所含的核苷酸被发光标记物标记;3b)每一个插入到互补链中的被发光标记物标记的核苷酸用单分子检测器检测;3c)当检测到插入互补链中的被发光标记物标记的核苷酸时,对该被插入的核苷酸的发光信号进行检测,并且3d′)每加入下一种溶液前进行漂洗。
根据本发明,术语“单链DNA或RNA”是指未杂交的DNA或RNA分子。这样一条单链可直接从生物体中分离提取,例如用基因技术法以及用限制性酶对所述分子进行处理后而获得。寡核苷酸、PCR产物、c-DNA可算作这种单链。从双链产生单链的方法对本领域技术人员来讲是已知的,例如,参见J.Sambrook等‘Molecular Cloning’(分子克隆)第二版,1989,冷泉港实验室手册。限制性酶切处理可直接在固定之前进行,这导致具有不同的碱基序列分子的固定。此单链最好为5-2000个碱基对,更好是100-1000碱基对。然而,原则上,碱基长度至100千碱基对也在考虑范围之内。
根据本发明方法的步骤(1),固定单链DNA或RNA于表面上。所述表面优选是平面支持物的表面,最好是光学上透明的,这是如下所描述单分子检测所必需的。最好是玻璃支持物,尤其是石英玻璃支持物更好。在优选的实施方案中,所述支持物的表面最好是用一Langmuir-Blodgett膜进行化学修饰,单链即固定在所述表面上。纤维素衍生物的Langmuir-Blodgett膜是特别优选的,尤其是三甲基硅烷基醚纤维素肉桂酸酯(TMSCC)和氨基烷基三甲基硅烷基醚纤维素(ATMSC)。
通过共价结合及通过净化剂分子,单链可通过吸附固定在表面上。净化剂分子是特殊的被固定在表面上的核苷酸寡聚体,并可通过杂交结合单链。寡聚体于表面上的固定可通过吸附或通过与化学反应性基团共价结合固定在表面上。这种固定优先选用(链霉素-)抗生物素蛋白-生物素技术,寡聚体为生物素衍生物并与(链霉素-)抗生物素蛋白分子结合而固定在表面上。(链霉素-)抗生物素蛋白分子的固定是不受限制的。在一优选实施方案中,(链霉素-)抗生物素蛋白分子通过纤维素衍生物制成的Langmuir-Blodgett膜而固定在表面上。特别优选的是此表面首先涂上1-8层单层氨基烷基三甲基硅烷基醚纤维素(ATMSC),之后涂上1-8层单层三甲基硅烷基醚纤维素肉桂酸酯(TMSCC)。为共价连接(链霉素-)抗生物素蛋白分子,TMSCC的肉桂酰基随后被氧化成醛基。此外,根据本发明,优先使用5’-氨基修饰的寡聚核苷酸作净化剂分子,其可直接与醛基结合,如按上述方法获得的在Langrnuir-Blodgett膜上的醛基。
而且,优选在步骤(1)中将单链DNA或RNA固定在表面上以使DNA或RNA单链的表面的密度为≤1分子/um2。
表面密度的调节优选通过调节共价结合位点的表面密度来进行。这样做的一种可能性是通过可光交联的Langrnuir-Blodgett膜,例如,如前所述的TMSCC膜实现的,根据UV光辐照的时间在所述膜的表面上形式反应活性基团。这些反应活性基团可用于与单链DNA或RNA、寡核苷酸、(链霉素-)抗生物素蛋白分子共价结合。单链的表面密度还可通过预被固定的单链浓度或通过预被固定的寡聚体的浓度来调节。此浓度取决于支撑物的表面积以及取决于被固定的单链或被固定的寡聚体溶液的体积。
根据本发明方法的步骤(2),一激光束聚焦于单个被固定的单链上。激光的选择取决于碱基的发光标记物,下面将作进一步描述。在步骤(2)中,为了将激光聚焦在单链上,优选使(a)发光标记物标记的核苷酸寡聚体与单链杂交;(b)杂交的核苷酸寡聚体位置通过激光束在固定了单链的表面扫描而确定;(c)此后检测杂交的核苷酸寡聚体的发光信号。步骤(a)可在单链固定之前或之后进行。选择核苷酸寡聚体的发光标记物和激光束,以在步骤(b)中激发发光标记物进行发光。激光束对表面的扫描在步骤(b)中用常规的栅极或扫描装置进行,如在激光扫描显微镜中应用的那些。步骤(c)中发光信号的消除可通过切除发光标记物(特别是光-裂解法切除)或通过光-漂白。
在本发明第一种方法步骤(3)中,通过加入含有(i)用于合成DNA互补链的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶四种核苷酸的混合物或用于合成RNA互补链的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶四种核苷酸的混合物和(ii)一种聚合酶的溶液,来产生上述被固定的、被聚焦的单链的DNA或RNA互补链。碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶和/或腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶的多聚体产物也可被转化成合成的核苷酸,换言之,这样的核酸不含磷酸酯骨架,但是,例如,是一肽骨架(肽核酸)。根据本发明,四种碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸中的至少两种或四种碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶核苷酸中的至少两种被不同的发光标记物部分或全部标记。尤其优选所有四种碱基包含不同的发光标记物。这使通过简单地产生互补链确定碱基顺序成为可能。假如四种碱基中只有两种被不同的发光物标记,为获得一完整的序列,生产互补链必须重复五次,每次重复中采用标记碱基的不同组合。当用三种标记碱基时,互补链的生产必须重复三次,每次采用一种不同的标记碱基组合。
根据本发明的第二种方法步骤(3’),通过按续加入含有(i)用于合成DNA互补链的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸中的一种或用于合成RNA互补链的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶核苷酸中的一种和(ii)一种聚合酶的溶液,来产生上述被固定的、被聚焦的单链的DNA或RNA互补链,其中上述溶液中所含的核苷酸被发光标记物标记。另一方面,作为另一种方式,碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶或碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶的多聚体产物也可被转化成合成的核苷酸,换言之,这样的核酸不含磷酸酯骨架,但是,例如,是一肽骨架(肽核酸)。根据本发明的第二种方法,通过相继添加各自的核苷酸溶液进行互补链的生产,在添加各自的下一个溶液之前,需漂洗。假如添加核苷酸溶液之后产物信号应该产生,通过单分子检测器,此信号从而可被定位属于某一碱基。假如,例如,将包含多聚酶以及分别含有腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶中的一种的溶液,添加到被固定的单链中,如果信号仅在添加第二种溶液时被检测到,换言之,与胞嘧啶溶液相符,因此被固定单链的相应的碱基是鸟嘌呤。假如,另一方面,当添加第二种和第三种溶液时检测到了信号,可发现在被固定的单链上有序列鸟嘌呤胞嘧啶。因此,被固定单链的完整序列可通过重复添加相应的溶液而确定。
溶液中所含的聚合酶催化产生互补链。只要能使带有被颜料标记的核苷酸的互补链产生,酶的选择即不受限制。根据本发明,聚合酶可用T4合成酶,天然T7合成酶,大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段,Exo III,E.coli pol III全酶,蛇毒磷酸二酯酶和Taq聚合酶。
由聚合酶催化每个被发光标记物标记的核苷酸的产生,在互补链中根据本发明用一单分子检测器被检测。根据本发明单分子检测器的使用不受限制,只要它允许对于一定的检测容量、一定的波长、一定的激光输出量和一定的被发光标记物标记的核苷酸,单个发光标记的核苷酸分子进行检测即可。对单分子检测器的敏感度的要求是随检测体积的增加和随激光束输出量的减小,敏感度提高。基于此原因,最好将检测体积减至最小,因此激光束聚焦限制在衍射。
激发发光标记物的激光光谱优选为波长600nm或以上,以尽量减少散射光。特别是,根据本发明的方法,在此波长范围的半导体激光由于较经济而是优选的。如果检测通过荧光持续时间的测定而完成,根据本发明使用的激光应调节,最好是脉冲光。
发光标记物既根据使用的激光又根据单分子检测器进行调节。根据本发明最好使用荧光基团作发光标记物。不考虑检测种类,选择一套适宜的荧光基团(即一种荧光基团与一种相应的标记核苷酸相对应)。在颜色(即发射光子的波长)的检测和荧光基团荧光持续时间的检测之间存在差异。用于作荧光发光时间检测的颜料样品被描述于S.Seeger等,在“Ber Bunsenges.Physikal.Chem.”97,1542-1548,1993和M.Sauer等在“荧光杂志”(J.Fluorescence)3,131-139,1993;作颜色检测的颜料样品由L.M.Smith等1989年在“自然”(Nature)312,674-670,以及J.M.Prober等1987年在“科学”(Science)238,336-341述及。例如,颜料JA22,JA66,JA51-DS以及颜料青蓝Cy5(Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)(公开于Sauer等“荧光杂志”(J.Fluor.)5,247-254,1995),可用于检测荧光持续时间;颜料FAM,JOE,TAMRA和ROX(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)可应用于颜色的检测。根据本发明,在发明的第一种方法中发光标记物标记的核苷酸被不同的发光基团标记的同时,所用颜料可与在第二种方法中的相一致,因为核苷酸差别的产生可通过各自的不同溶液造成。鉴于简化的激发和检测,根据本发明此种方式是优选的。
单分子检测器包括一目镜,一随光子的冲击而产生电流的装置以及一计算机(包括计算电流信号的软件)。目镜最好能使发出的光子与激光束的焦点共焦投影在所述装置上产生电子信号。此装置最好是一光敏二极管,特别是单光子计数雪崩光敏二极管。此外,可用一光电倍增管或一放大CCD相机。特别是最好建立此根据本发明的单分子检测器,其方式是在激光(gating)激发一定时间后才开始检测。Loescher等在“Anal.Chem.”,Vol.70,p.3202-3205,1998发表了根据本发明的单分子检测器是可应用的。为区分不同的着色,单分子检测器配以相应的滤光片。为测定荧光持续时间,最好使用以时间相关单个光子计数方式的检测器。此外,需要快速测量电子学,例如,此可在SL Microtest GmbH,Jena上找到。
在优选的实施方案中,单分子检测器有自动相关功能,此功能使得从固定核苷链的发光信号中排除混淆的分子并分辨出发光信号成为可能,从而提高了信噪比。
根据本发明,在下一个被发光标记物标记的核苷酸插入之前,将已插入的核苷酸的发光信号删除,这可以通过将发光标记物裂解,特别是光裂解产生。如果发光标记物通过光敏基团,例如WO95/31429中公开的那些基团与核苷酸结合,这是可行的。此时一个短激光脉冲可以导致发光标记物裂解。原则上,用以裂解的激光波长不同于用于激发的波长,而且,优选用光漂白核苷酸的发光标记物来进行发光信号的消除。这可通过,比如,短时光强度上升,即,短激光脉冲来实现。
因此,发光信号的消除的速率主要取决于激光脉冲的输出量以及探测与激光脉冲之间所持续的时间,这两个参数都容易控制。为了保证所插入核苷酸的发光信号能在下一核苷酸插入之前被消除,这两个参数要与互补链的产生速率相匹配,互补链的产生速率可通过设置溶液的温度(对聚合酶活性有决定性影响)和核苷酸浓度来控制。
本发明的第一种方法中,如果并非所有的核苷酸都被发光标记物标记,固定化的单链上的碱基序列就不能通过产生单一的互补链来充分准确地测出。因此,为了测定完整序列,必须重复进行互补链的生产。根据本发明,优选在同一单链上进行互补链的生产。为了达到此目的,通过升温,上述DNA或RNA互补链被从固定的DNA或RNA的单链上切下,并重复上述方法的步骤(3)。因此,根据本发明的方法可在同一分子上进行多次序列测定,即使,只用被发光标记物标记的核苷酸,这也有利于增加序列测定的精确性。
本发明的方法,对于固定在支持物上的另一单链也可被重复进行。对于具有相同碱基序列的单链来说,用此方法可以增加所测序列的准确性。如果预被测序的核酸序列在固定之前用限制性酶处理,仍然可以成功地测出经限制性酶处理后所产生的单链不同片段的顺序。因此,在固定前,可用限制性酶直接对同一反应容器进行处理。
实施例2在第二种方法中,即在固定之前进行杂交步骤,将单链、氨基-官能化寡聚核苷酸和染料标记的寡核苷酸与1ml缓冲液混合,浓度都为10-7mol/L;最后,溶液被稀释到10-10并且用于固定;这样最后也可得到密度大约为1分子复合物/10μm2。
实施例32μl10-11M的单核苷酸,用染料Cy5(AmershamPharmacia Biotech AB,Uppsala,Sweden)标记,将之和3.5U P7测序酶-聚合物一起加入到被固定的单链中。用一个输出功率为400μW和聚焦直径为2μm的激光来检测所产生的核苷酸。
权利要求
1.DNA或RNA碱基序列测定方法,包括以下步骤(1)将DNA或RNA单链固定于表面上;(2)将一束激光聚焦于一条固定化的单链上;(3)通过加入含有(i)用于合成DNA互补链的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的混合物或用于合成RNA互补链的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶核苷酸的混合物和(ii)一种聚合酶的溶液,来产生上述被固定的、被聚焦的单链的DNA或RNA互补链,其中3a)腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸这四种核苷酸中的至少两种或腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶核苷酸这四种核苷酸中的至少两种被不同的发光标记物进行了部分或全部标记,3b)插入到互补链中的每一个被发光标记物标记了的核苷酸用单分子检测器进行检测,和3c)在下一个被发光标记物标记的核苷酸插入之前对前一个被发光标记物标记的核苷酸的发光信号进行检测。
2.DNA或RNA碱基序列测定方法,包括以下步骤(1)将DNA或RNA单链固定于表面上;(2)将一束激光聚焦于一条固定化的单链上;(3′)通过按续加入含有(i)用于合成DNA互补链的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸中的一种或用于合成RNA互补链的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶核苷酸中的一种和(ii)一种聚合酶的溶液,来产生上述被固定的、被聚焦的单链的DNA或RNA互补链,其中3a′)上述溶液中所含的核苷酸被发光标记物标记;3b)每一个插入到互补链中的被发光标记物标记的核苷酸用单分子检测器检测;3c)当检测到插入互补链中的被发光标记物标记的核苷酸时,对该插入的核苷酸的发光信号进行检测,并且3d′)每加入下一种溶液前进行漂洗。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中对于将DNA或RNA单链固定在一个表面上,在步骤(1)中通过将所述单链与固定在所述表面上的核苷酸寡聚体进行杂交来进行固定。
4.根据前述权利要求中的任一项所述的方法,其中在将所述DNA或RNA单链固定的过程中,在步骤(1)中以≤1分子/μm2的表面密度将将DNA或RNA单链固定在一个表面上。
5.根据权利要求4所述的方法,通过调节共价结合位点的表面密度来调节所述表面上的单链的表面密度。
6.根据权利要求4所述的方法,通过调节预被固定的单链浓度或预被固定的寡聚体的浓度来调节单链的表面密度。
7.根据前述权利要求中的任一项所述的方法,其中为在步骤(2)把激光束聚焦到被固定的单链上a)被发光标记物标记的核苷酸寡聚体与单链进行杂交;b)用激光束扫描所述的表面,以确定被杂交的核苷酸-寡聚体的位置;c)随后对被杂交的核苷酸-寡聚体发光信号进行检测。
8.根据前述权利要求中的任一项所述的方法,其中在步骤(3b),根据被发光标记物标记的核苷酸的荧光持续时间来检测每一个插入到互补链中的被发光标记物标记的核苷酸。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中在步骤(3b),根据被发光标记物标记的核苷酸的颜色来检测每一个插入到互补链中的被发光标记物标记的核苷酸。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(3b)中的单分子检测器具有自动相关功能。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中通过将被发光标记物标记的核苷酸裂解来去除步骤(3c)中的发光信号。
12.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中通过光漂白被发光标记物标记的核苷酸来去除步骤(3c)中的发光信号。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中通过调节聚合酶活性、激光密度和核苷酸的浓度这些参数,在步骤(3c)中,在每插入下一个核苷酸之前先将发光信号去除。
14.一种测定DNA或RNA碱基序列的方法,其中通过升高温度,使根据上述权利要求之一所述方法制备的互补DNA或RNA链从所述被固定的DNA或RNA单链上裂解下来,并且针对同一条单链,重复上述权利要求之一所述的方法。
15.一种测定DNA或RNA碱基序列的方法,其中对被固定在表面上的另一条DNA或RNA单链,重复以上权利要求之一所述的方法。
全文摘要
DNA或RNA碱基序列测定方法,包括步骤:1)将DNA或RNA单链固定于平面支持物上;2)将一束激光聚焦于一条固定化的单链上;和3)通过加入含有(ⅰ)用于合成DNA互补链的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶四种核苷酸的混合物或用于合成RNA互补链的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶四种核苷酸的混合物和(ⅱ)一种聚合酶的溶液,用来产生上述被固定的、被聚焦的单链的DNA或RNA互补链,插入到互补链中的每一个被发光标记物标记了的核苷酸用单分子检测器进行检测,以及在下一个被发光标记物标记的核苷酸插入之前对前一个被发光标记物标记的核苷酸的发光信号进行检测。
文档编号G01N21/78GK1328604SQ99813808
公开日2001年12月26日 申请日期1999年9月29日 优先权日1998年9月30日
发明者斯特凡·泽格 申请人:分子机械和工业股份有限公司
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1