新的g蛋白偶联型受体蛋白、其dna及其配体的制作方法

专利名称：新的g蛋白偶联型受体蛋白、其dna及其配体的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型多肽(本说明书通常称为[新型生理活性多肽])；其部分肽；编码该多肽及部分肽的DNA；以及能将该多肽作为配体来识别的受体蛋白；该受体蛋白的部分肽；编码受体蛋白及其部分肽的DNA等等。本发明尤其涉及一种含有RF酰胺状结构的新型多肽及其部分肽。
背景技术：
肽作为一种调节生物机体的代谢、生长、生殖、体内自稳的维持、精神活动、机体防御等功能的分子起着重要的作用。这些功能肽通过与细胞膜上的特异性受体结合而介导细胞的信息传递。其中大多数生理活性肽，根据其生理活性已从组织抽提物中分离得到并确定其结构。最近，利用这些受体已从组织抽提物中分离得到生理活性肽。
另一方面，由于最近对基因组或者是cDNA序列分析的迅速发展，可以获得庞大的DNA信息。推测在这些DNA中可能包括至今尚未知晓的、编码生理活性肽的碱基序列。但是很多生理活性肽只有非常短的氨基酸序列，即使从基因组DNA序列或表达序列标签(EST)中寻找含有与已知生理活性肽类似或者有共同特征的序列的未知生理活性肽，通常只能在与生理活性肽完全无关的蛋白基因或非翻译区的DNA序列中发现已知肽的类似序列，因而要想确定它们是否为真正的生理活性肽是非常困难的。
FMRF酰胺是生理活性肽的一种，它首次从双壳类(bivalve)神经节分离得到，并确定其结构(Price D.A.&Greenberg，M.J.，Science，197670-671，1977)。从此在很多种无脊椎动物中发现了C末端具有RF酰胺结构的肽或具有类似于RF酰胺结构的肽。曾报道，特别是在线虫中有很多具有RF酰胺结构的肽，而且这些肽的大多数来自一个基因且多个肽连续存在(Nelson，L.S.，等，Molecular Brain Research 58103-111，1998)。
在脊椎动物中，从家鸡的脑中已经分离得到LPLRF酰胺并鉴定为具有RF酰胺结构的FMRF酰胺样肽，但其基因结构还不清楚(Dockray，G.J.等，自然，305328-330，983)。最近，在鱼类中报道，C-Rfa是一种具有RF酰胺结构的肽。哺乳动物中具有RF酰胺结构的肽有，从牛中分离纯化的2种肽(Yang，H.-Y.T，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，827757-7761，1985)和与这2种肽相对应的、从人cDNA中分离的神经肽SF(NSF)以及神经肽AF(NAF)。最近我们又鉴定了人、牛、大鼠中具有RF酰胺结构的催乳素释放肽(PrRP)(Hinuma，S.，等，自然，393272-276，1998)。
有关FMRF酰胺肽的生理活性报道得很多。例如促进或抑制心脏的搏动、各种舌齿肌肉或内脏肌肉、各种牵缩肌的收缩或松弛、神经细胞的过极化或去极化等。又报道，PrRP具有促进催乳素释放活性，LPLRF酰胺具有刺激神经细胞或提高血压的作用等。
如上报道，含RF酰胺结构的肽具有很多重要生理功能。但是在哺乳动物中除了NSF、NAF、PrRP之外是否存在具有RF酰胺或类似结构的肽至今还不清楚。
另一方面，多种生理活性物质如激素、神经递质等通过细胞膜上特异性受体蛋白调节着生物机体的功能。很多这类受体蛋白通过活化它们所偶联的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(以下简称为G蛋白)而介导细胞内的信号传递，它们具有共同结构，即7个跨膜区，并因此总称为G蛋白偶联型受体蛋白或7次跨膜型受体蛋白(7TMR)。
G蛋白偶联型受体蛋白存在于机体每一功能性细胞和内脏器官的表面，它们是诸如激素、神经递质、生理活性物质等分子的重要靶，这些分子可调节体内细胞和内脏器官的功能。这些受体蛋白通过结合生理活性物质而介导信号向细胞内传递，并由这些信号引发各种反应如细胞的促进或抑制。
弄清那些调节各种活体内细胞和内脏器官之复杂生物功能的物质与它们的特异性受体蛋白(尤其G蛋白偶联型受体蛋白)之间的关系，将阐明各种活体内细胞和内脏器官的功能机制，并因此提供一种用于开发与这些功能有密切关系之药物的非常重要的方法。
如，在活体的各种器官中，生理功能均通过多种激素、激素样物质、神经递质或生理活性物质控制。尤其是，机体内多个部位的生理活性物质通过其相应受体蛋白调节生理功能。体内还有很多未知激素，神经递质或其他生理活性物质，至今仅对其中少数的受体蛋白有报导。即使是已知的受体蛋白至今也不清楚其是否存在亚型。
药物开发中，弄清调节体内复杂功能的物质与其特异性受体蛋白之间的关系也十分重要。为了在药物开放中更有效地筛选受体蛋白的激动剂和拮抗剂，必须阐明体内表达的受体蛋白基因的功能，并在适当的表达系统中表达这些基因。
近年来，cDNA序列的随机分析已成为体内表达的基因的常用分析方法。如此获得的cDNA片段的序列已注册并作为表达序列标签(EST)公开在数据库中。但大多数EST仅含有序列信息，很难由此推测其功能。
因而，需要寻找未知的具有RF酰胺状结构的多肽(肽)或未知的G蛋白偶联型受体蛋白，并利用这些肽开发含有新的生理活性物质的适用于本发明所述疾病的预防/治疗性药物及诊断药物。
发明公开本发明人为了解决上述问题，反复钻研终于成功地完成根据EST等序列信息制备引物；以人胎儿脑poly(A)+RNA为模板通过RT-PCR克隆具有新的碱基序列的cDNA。同时本发明人还发现由所得cDNA编码的有效多肽其C末端为LPL RF酰胺状、LPL RS酰胺状、LPQ RF酰胺状或LPLRL酰胺状。
本发明人经过大量的研究，根据由简并PCR方法获得的EST信息，成功分离到编码大鼠脑干周边部分以及人下丘脑的新型G蛋白偶联型受体蛋白的cDNA，从而成功分析了该cDNA的完整碱基序列。从该碱基序列推导出的氨基酸序列支持了下述事实从第1个到第7个跨膜结构域在疏水图谱试验中都已发现，这样就确证了由这些cDNA编码的蛋白质是一种7次通过胞膜的G蛋白偶联型受体蛋白。
另外，本发明又发现所述RF酰胺状多肽具有针对G蛋白偶联型受体蛋白的配体活性。
基于这些发现，本发明人进行了广泛的研究，得出了结论，从而完成本发明。
因此，本发明涉及(1)一种多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，其含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列；(2)(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，其所述基本相同的氨基酸序列为SEQ ID NO8、14、18、33或50；
(3)(1)中所述多肽的部分肽，或其酰胺或酯或它们的盐；(4)(3)中所述部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐，其包含SEQ ID NO1中第81(Met)～第92(Phe)位和氨基酸残基；(5)(3)中所述部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐，其包含SEQ ID NO1中第101(Ser)～第112(Ser)位的氨基酸残基；(6)(3)中所述部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐，其包含SEQ ID NO1中第124(Val)～第131(Phe)位的氨基酸残基；(7)(1)中所述多肽的部分肽的酰胺或它们的盐；(8)一种DNA，其包含的DNA具有编码(1)中多肽的碱基序列；(9)(8)中所述的DNA，其具有SEQ ID NO2、9、15、19、34或51所示的碱基序列；(10)一种DNA，其含有编码(3)所述部分肽的DNA；(11)(10)中所述的DNA，其含有SEQ ID NO2中所示碱基序列第241～第276位碱基；(12)(10)中所述的DNA，其含有SEQ ID NO2中所示碱基序列第301～第336位碱基；(13)(10)中所述的DNA，其含有SEQ ID NO2中所示碱基序列第370～第393位碱基；(14)一种重组载体，其含有(8)或(10)所述的DNA；(15)一种转化体，其用(14)所述重组载体转化而成；(16)一种生产(1)所述的多肽、或其酰胺或酯或它们的盐的方法，或者生产(3)所述的部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐的方法，其包含培养(15)所述转化体，并从中产生和积累(1)中的多肽或(3)中的部分肽；(17)一种抗体，其针对(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或者针对(3)中所述部分肽、或其酯或其酰胺或它们的盐；(18)一种诊断组合物，其含有(8)或(10)所述的DNA，或者含有(17)所述的抗体；(19)一种反义DNA，其具有与(8)或(10)所述DNA互补或基本互补的碱基序列，并具有抑制该DNA表达的作用；(20)一种组合物，其含有(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或者含有(3)中所述部分肽、或其酯或其酰胺或它们的盐；
(21)一种药用组合物，其含有(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或者含有(3)中所述部分肽、或其酯或其酰胺或它们的盐；(22)一种用于筛选能促进或抑制(1)中所述多肽、其酰胺或其酯或它们的盐，或者(3)中所述部分肽、其酰胺、其酯或它们的盐的活性的化合物或其盐的方法，其包括对(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或者对(3)中所述部分肽、其酰胺、其酯或它们的盐的应用；(23)如(22)中所述筛选法，其包括使用(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或者(3)中所述部分肽、其酰胺、其酯或它们的盐以及，具有与SEQ ID NO37所示氨基酸序列相同或基本相同的序列的蛋白质或其盐，或者蛋白质的部分肽、其酰胺、其酯或它们的盐；(24)一种用于筛选能促进或抑制(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或者(3)中所述部分肽、其酯或其酰胺或它们的盐的活性的化合物或其盐的试剂盒，其包括(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或者(3)中所述部分肽、其酰胺、其酯或它们的盐；(25)如(24)所述的筛选试剂盒，其包括(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或者(3)中所述部分肽、其酰胺、其酯或它们的盐以及，具有与SEQ ID NO37所示氨基酸序列相同或基本相同的序列的蛋白质或其盐，或者蛋白质的部分肽、其酰胺、其酯或它们的盐；(26)一种能促进或抑制(1)中所述多肽、或其酰胺、或其酯、或它们的盐，或者(3)中所述部分肽、其酰胺、其酯或它们的盐的活性的化合物或其盐，所述化合物或其盐可通过使用(22)所述的筛选法或(24)所述的试剂盒而获得；(27)一种药用组合物，其包含能促进或抑制(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或者(3)中所述部分肽、其酰胺、其酯或它们的盐的活性的化合物或其盐，所述化合物或其盐可通过使用(22)所述的筛选法或(24)所述的试剂盒而获得；(28)一种蛋白质或其盐，其含有与SEQ ID NO37所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列；(29)(28)所述的蛋白质或其盐，其中与SEQ ID NO37所示氨基酸序列基本相同的氨基酸序列为SEQ ID NO54；(30)(28)所述蛋白质的部分肽或其酰胺或酯或它们的盐；
(31)一种DNA，其包含的DNA具有编码(28)所述的蛋白质或(30所述部分肽的碱基序列；(32)(31)所述的DNA，其具有SEQ ID NO38、55或56所示的碱基序列；(33)一种重组载体，其含有(31)所述的DNA；(34)一种转化体，其用(33)所述重组载体转化而成；(35)一种生产(28)中所述蛋白质或其盐的方法，或者生产(30)中所述部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐的方法，其包括培养(34)所述的转化体，并从中产生和积累(28)所述的蛋白质或(30)所述的部分肽；(36)一种抗体，其针对(28)中所述蛋白质或其盐，或者针对(30)中所述部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐；(37)一种诊断组合物，其含有(31)中所述DNA或(36)中所述抗体。
(38)一种配体，其针对(28)中所述蛋白质或其盐，其通过使用(28)中所述蛋白质或其盐，或者(30)中所述部分肽、其酰胺、其酯或它们的盐而获得；(39)一种测定配体的方法，该配体针对(28)中所述蛋白质或其盐，该方法包括使用(28)所述的蛋白质或其盐，或者(30)所述部分肽、其酰胺、其酯或它们的盐；(40)一种筛选能改变配体与(28)中所述蛋白质或其盐之间结合特性的化合物或其盐的方法，其包括使用(28)中所述蛋白质或其盐，或者(30)中所述部分肽、其酰胺、其酯或它们的盐；(41)一种筛选能改变配体与(28)中所述蛋白质或其盐之间结合特性的化合物或其盐的试剂盒，其包含(28)中所述蛋白质或其盐，或者(30)中所述部分肽、其酰胺、其酯或它们的盐；(42)一种能改变配体与(28)所述的蛋白质或其盐之间结合特性的化合物或其盐，所述化合物或其盐可通过使用(40)中所述筛选法或(41)中所述试剂盒而获得；(43)一种药用组合物，其包含能改变配体与(28)中所述蛋白质或其盐之间结合特性的化合物或其盐，所述化合物或其盐可通过使用(40)中所述筛选法或(41)中所述试剂盒而获得；(44)一种定量如(28)所述蛋白质或其盐的方法，其包括使用(36)中所述抗体。
本发明进一步涉及(45)(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，其中与SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的序列是与SEQ ID NO1所示氨基酸序列具有至少约70％同源性的氨基酸序列，优选同源性至少约80％，较优选至少约90％，最优选至少约95％；(46)(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，其中与SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的序列是①SEQ ID NO1、8、14、18、33或50所示氨基酸序列，其中有1～20个氨基酸(优选1～15个氨基酸，更优选1～5个氨基酸，最优选1～3个氨基酸)被缺失、②SEQ ID NO1、8、14、18、33或50所示氨基酸序列，其中有1-20个氨基酸(优选1～15个氨基酸，更优选1～5个氨基酸，最优选1～3个氨基酸)被添加、③SEQ ID NO1、8、14、18、33或50所示氨基酸序列，其中有1～20个氨基酸(优选1～15个氨基酸，更优选1～5个氨基酸，最优选1～3个氨基酸)被插入、④SEQ IDNO1、8、14、18、33或50所示氨基酸序列，其中至少有1～20个氨基酸(优选1～15个氨基酸，更优选1～5个氨基酸，最优选1～3个氨基酸)由其它氨基酸所置换、⑤上述氨基酸序列的组合；(47)一种DNA，其包含可与(8)或(10)中所述碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列；(48)一种重组载体，其含有(47)中所述DNA；(49)一种转化体，其用(48)所述重组载体转化而成；(50)一种生产由(47)中所述DNA编码的多肽、或其酰胺或酯或它们的盐的方法，其包含培养(49)所述转化体，并从中产生和积累(47)中DNA所编码的多肽，并收获该多肽；(51)由(47)中所述DNA编码的多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，其可用(50)所述的方法生产；(52)(28)中所述蛋白质或其盐，其中与SEQ ID NO37所示氨基酸序列基本相同的序列是与SEQ ID NO37所示氨基酸序列具有至少约50％同源性的氨基酸序列，优选同源性至少约70％，较优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约95％；(53)(28)中所述蛋白质或其盐，其中与SEQ ID NO37所示氨基酸序列基本相同的序列是①SEQ ID NO37所示氨基酸序列，其中有1～20个氨基酸(优选1～15个氨基酸，更优选1～5个氨基酸，最优选1～3个氨基酸)被缺失、②SEQ ID NO37所示氨基酸序列，其中有1-20个氨基酸(优选1～15个氨基酸，更优选1～5个氨基酸，最优选1～3个氨基酸)被添加、③SEQ IDNO37所示氨基酸序列，其中有1～20个氨基酸(优选1～15个氨基酸，更优选1～5个氨基酸，最优选1～3个氨基酸)由其它氨基酸所置换、或者④是它们的组合；(54)一种DNA，其包含能与(31)中所述DNA的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列；(55)一种重组载体，其含有(54)中所述DNA；(56)一种转化体，其用(55)所述重组载体转化而成；(57)一种生产由(54)中所述DNA编码的多肽、或其酰胺或酯或它们的盐的方法，其包含培养(56)所述转化体，并从中产生和积累(54)中DNA所编码的多肽，并收获该多肽；(58)由(54)中所述DNA编码的多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，其可用(57)所述的方法生产；(59)(22)中所述筛选法，其中包括，在(i)(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或者(3)中所述部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐与其受体接触的情况下，和(ii)在(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或者(3)中所述部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐与其受体及待测化合物接触的情况下，测定并比较(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或者(3)中所述部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐以及它们的活性；(60)(59)中所述筛选法，其中所述受体为含有与SEQ ID NO37所示氨基酸序列相同或基本相同序列的蛋白质或其盐，或该蛋白质的部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐；(61)一种药用组合物，其包含能促进(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或者(3)中所述部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐的活性的化合物或其盐，所述化合物或其盐可通过使用(22)中所述筛选法或(24)中所述试剂盒而获得；(62)一种药用组合物，其包含能抑制(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或者(3)中所述部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐的活性的化合物或其盐，所述化合物或其盐可通过使用(22)中所述筛选法或(24)中所述试剂盒而获得；(63)一种定量待测样品液中的(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或者(3)中所述部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐的方法，其包括，使(17)中所述抗体与待测样品液以及已标记的(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或者(3)中所述部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐进行竞争反应，测定与该抗体结合的已标记的(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或者(3)中所述部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐的比率；(64)一种定量待测样品液中的(1)中所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或者(3)中所述部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐的方法，其包括，同时或先后使所述待测样品液与固定在不溶性载体上的(17)所述抗体，以及标记的(17)所述抗体反应，测定不溶性载体上标记试剂的活性；(65)一种定量待测样品液中(28)所述蛋白质或其盐，或者(30)所述部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐的方法，其包括，使(36)中所述抗体与待测样品液以及标记的(28)所述蛋白质或其盐，或者(30)所述部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐进行竞争反应，测定与该抗体结合的已标记的(28)所述蛋白质或其盐，或者(30)所述部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐的比率；(66)一种定量待测样品液中(28)所述多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或者(30)所述部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐的方法，其包括，同时或先后使所述待测样品液与固定在不溶性载体上的(36)所述抗体，以及标记的(36)所述抗体反应，测定不溶性载体上标记试剂的活性。
附图简述

图1为编码实施例2中所得本发明多肽(人型)的DNA的碱基序列以及从该碱基序列推导的氨基酸序列。
图2为本发明多肽的疏水性图。
图3为编码实施例3中所得本发明多肽(人型)的DNA的碱基序列以及从该碱基序列推导的氨基酸序列。
图4为编码实施例4中所得本发明多肽(牛型)的DNA的碱基序列以及从该碱基序列推导的氨基酸序列。
图5为编码实施例5中所得本发明多肽(大鼠型)的DNA的碱基序列以及从该碱基序列推导的氨基酸序列。
图6为比较实施例3、4、5中所得本发明多肽的氨基酸序列。
图7为实施例6中所得本发明多肽(小鼠型)的氨基酸序列以及编码该多肽的DNA序列。
图8为在实施例7中通过位点感受器(Cytosensor)分析的各种肽针对rOT7TO22L受体表达型CHO细胞的反应性。图中，●-●为MPHSFANLPLRF酰胺(SEQID NO39)，△-△为VPNLPQRF酰胺(SEQ ID NO40)。
图9为在实施例10中分析MPHSFANLPLRF酰胺(SEQ ID NO39)及VPNLPQRF酰胺(SEQ ID NO40)对rOT7TO22L表达型CHO细胞的cAMP产生进行抑制的活性。图中，□-□为MPHSFANLPLRF酰胺(SEQ IDNO39)，●-●为VPNLPQRF酰胺(SEQ ID NO40)。
本发明实施方案的最佳模式本发明的具有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的序列的多肽(下文通常称为″本发明多肽″)，可以是来自人或温血动物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、家鸡、兔子、猪、绵羊、牛、猴子等)的任一种细胞的任何多肽，所述细胞如视网膜细胞、肝细胞、脾细胞、神经细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞、骨髓细胞、肾小球膜细胞、朗格罕氏细胞、表皮细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞(例如，巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞、肝细胞、间质细胞、或这些细胞的前体细胞、干细胞或癌细胞等；或任一种含此类细胞的组织，例如脑、脑的任何部分(例如，视网膜、嗅球、屏状核、大脑基底神经节、海马回、丘脑、下丘脑、大脑皮质、延髓、小脑)、脊髓、垂体、胃、胰腺、肾、肝、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺、消化道(例如大肠、小肠)、血管、心脏、胸腺、脾、腭下腺、外周血、前列腺、睾丸、卵巢、胎盘、子宫、骨、关节、骨骼肌等；或者是血细胞系或其培养细胞(例如，MEL、M1、CTLL-2、HT-2、WEHI-3、HL-60、JOSK-1、K562、ML-1、MOLT-3、MOLT-4、MOLT-10、CCRF-CEM、TALL-1、Jurkat、CCRT-HSB-2、KE-37、SKW-3、HUT-78、HUT-102、H9、U937、THP-1、HEL、JK-1、CMK、KO-812、MEG-01等)。所述多肽也可以为合成多肽。
与SEQ ID NO1所示序列基本相同的氨基酸序列包括与SEQ ID NO1所示序列至少具有约70％同源性的氨基酸序列，优选同源性至少约80％，更优选约90％，最优选至少约95％。
尤其是，所述与SEQ ID NO1所示序列基本相同的氨基酸序列包括SEQ ID NO1所示氨基酸序列中第22-第180位的氨基酸序列。
具有与本发明SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的序列的多肽优选具有与SEQ ID NO1所示序列基本相同序列(如，SEQ ID NO8、14、18、33或55)且活性与SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的多肽。
基本相同的活性实例包括细胞刺激活性或促生长素抑制素分泌调节活性。例如其中的细胞刺激活性[(以下只作细胞刺激活性)如，花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白磷酸化、C-fos的激活和细胞外pH的变动]是通过将本发明多肽(具体地，是指一种蛋白质或其盐，其包含与SEQ ID NO37所示序列相同或基本相同的氨基酸序列)加入表达该多肽的受体的细胞而导致的细胞刺激活性。
术语“基本相同”是指其活性的特点彼此相同(如，生化方面或药理学方面)。因此优选地，尽管细胞刺激活性或促生长素抑制素分泌调节活性等活性是同等的(如约0.1-100倍，优选约0.5-10倍，更优选0.5-2倍)，但活性的大小以及多肽分子量等量化因素可以彼此不同。
所述细胞刺激活性等活性可以根据公知方法测定，例如，下述筛选方法。
本发明的多肽可以包括所谓的突变蛋白，如包含下述的多肽(i)SEQ IDNO1、8、14、18、33或50所示氨基酸序列，其中的1～20个氨基酸(优选1～15个氨基酸，更优选1～5个氨基酸，最优选1～3个氨基酸)被缺失；(ii)SEQ ID NO1、8、14、18、33或50所示氨基酸序列，其中的1～20个氨基酸(优选1～15个氨基酸，更优选1～5个氨基酸，最优选1～3个氨基酸)被添加；(iii)SEQ ID NO1、8、14、18、33或50所示氨基酸序列，其中的1～20个氨基酸(优选1～15个氨基酸，更优选1～5个氨基酸，最优选1～3个氨基酸)被插入；(iv)SEQ ID NO1、8、14、18、33或50所示氨基酸序列，其中的1～20个氨基酸(优选1～15个氨基酸，更优选1～5个氨基酸，最优选1～3个氨基酸)被其他氨基酸所取代；以及(v)上述氨基酸序列的组合。
如上在氨基酸序列中插入、缺失或置换时，其插入、缺失或置换的位置不作特别限定。
具有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同序列的多肽可包括如，与SEQ ID NO8所示氨基酸序列基本相同的多肽；与SEQ ID NO14所示氨基酸序列基本相同的多肽；与SEQ ID NO18所示氨基酸序列基本相同的多肽；与SEQ ID NO33所示氨基酸序列基本相同的多肽；与SEQ ID NO50所示氨基酸序列基本相同的多肽等。
本说明书中的多肽可以用本领域已知的描述肽的方法来定义。即，左末端为N-末端(氨基端)，右末端为C-末端(羧基端)。本发明多肽中包括SEQID NO1所示的氨基酸序列，C-末端通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，但是C-末端也可以为酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。
R代表的酯如C1-6烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、或正丁基等；C3-8环烷基包括环戊基和环己基等；C6-12芳基包括苯基和α-萘基等；以及C7-14芳烷基包括苯基-C1-2烷基如苯甲基、苯乙基等；或α-萘基-C1-2烷基如α-萘甲基，还有通常用作口服给药的酯的三甲基乙酰氧甲基。
当本发明多肽在C-末端以外的位置上包括一个羧基(或羧酸酯)时，它可以酰胺化或酯化，则这类酰胺或酯也可以包括在本发明所述多肽的范围之内。所述酯基可以与上述C-末端的酯基相同。
另外，本发明多肽可以包括下述衍生物，其中N-末端氨基酸残基(如甲硫氨酸)的氨基用保护基(C1～6酰基，如甲酰基、乙酰基等C1～6烷酰基)保护；所述N末端在体内切割，形成的谷氨酰基焦谷氨酸化；所述多肽分子中氨基酸侧链上的取代基(例如，-OH，-SH，氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)受适当基团(C1～6酰基，如甲酰基、乙酰基等C1～6烷酰基)保护，或结合蛋白质如通过糖链连接的糖蛋白。
本发明多肽的实例包括具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的人源多肽(图1)、具有SEQ ID NO8所示氨基酸序列的人源多肽(图3)、具有SEQ ID NO14所示氨基酸序列的牛源多肽(图4)、具有SEQ ID NO18所示氨基酸序列的大鼠源多肽(图5)、具有SEQ ID NO33所示氨基酸序列的小鼠源多肽(图7)、具有SEQ ID NO50所示氨基酸序列的大鼠源多肽。
本发明多肽可以是下述的部分肽的前体，此时该前体未必有部分肽的活性(如，细胞刺激活性等)。
本发明多肽的部分肽可以是本发明所述多肽的任意部分肽，但优选具有细胞刺激活性或促生长素抑制素分泌调节活性的那些多肽，所述细胞刺激活性通过将所述部分肽(具体地，指包含与SEQ ID NO37所示序列相同或基本相同的氨基酸序列的蛋白质或其盐)加入能表达本发明多肽之部分肽前体的细胞而引起，其包括，花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白磷酸化、C-fos的激活和细胞外pH的变动(下文简称为细胞刺激活性)。
本发明多肽的部分肽优选含有RF酰胺、RS酰胺或RL酰胺结构。
所谓RF酰胺结构是指，肽的C-末端为精氨酸-苯丙氨酸-NH2结构，所谓RS酰胺结构是指，肽的C-末端为精氨酸-丝氨酸-NH2结构，所谓RL酰胺结构是指，肽的C-末端为精氨酸-亮氨酸-NH2结构。
这些肽中优选的肽具有，如①SEQ ID NO1所示氨基酸序列中第81(Met)～第92位(Phe)、第101(Ser)～第112位(Ser)、第124(Val)～第131位(Phe)、第1(Met)～第92位(Phe)、第1(Met)～第112位(Ser)或第1(Met)～第131位(Phe)的氨基酸序列；②SEQ ID NO8所示氨基酸序列中第81(Met)～第92位(Phe)、第101(Ser)～第112位(Ser)、第124(Val)～第131位(Phe)、第1(Met)～第92位(Phe)、第1(Met)～第112位(Ser)或第1(Met)～第131位(Phe)的氨基酸序列；③SEQ ID NO14所示氨基酸序列中第81(Met)～第92位(Phe)、第124(Val)～第131位(Phe)、第1(Met)～第92位(Phe)或第1(Met)～第131位(Phe)的氨基酸序列；④SEQ ID NO33所示氨基酸序列中第84(Pro)～第94位(Phe)的氨基酸序列；⑤SEQ ID NO50所示氨基酸序列中第84(Pro)～第94位(Phe)的氨基酸序列。
尤其优选这些肽的酰胺衍生物。
具体实例包括具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列中第81(Met)～第92位(Phe)氨基酸序列的肽且C-末端被酰胺化(-CONH2)(SEQ ID NO39)、具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列中第101(Ser)～第112位(Ser)氨基酸序列的肽且C-末端被酰胺化(-CONH2)(SEQ ID NO41)以及具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列中第124(Val)～第131位(Phe)氨基酸序列的肽且C-末端被酰胺化(-CONH2)(SEQ ID NO40)。
本发明的部分肽可以含有以下几种氨基酸序列有1-5个氨基酸(优选1-3个氨基酸)缺失的氨基酸序列，或有1-5个氨基酸(优选1-3个)附加的氨基酸序列，或有1-5个氨基酸(优选1-3个)插入的氨基酸序列，或有1-5个氨基酸(优选1-3个)被其它氨基酸取代的氨基酸序列，也可以含有上述氨基酸序列的组合。
本发明的部分肽中C-末端通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，也可以为酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)(其中R具有与上述同等的意义)，如对本发明多肽所述。具体优选C-末端有酰胺(-CONH2)的部分肽。
进一步地，在本发明的部分肽中，如前述本发明多肽一样可以包括下述衍生物，其中N-末端氨基酸残基(如甲硫氨酸)的氨基用保护基保护；所述N-末端在体内切割，形成的谷氨酰胺残基焦谷氨酸化；所述部分肽分子中氨基酸侧链上的取代基受适当基团保护，或结合蛋白质如通过糖链连接的糖蛋白。
又，本发明部分肽可作为抗原用于形成抗体，所以它未必一定具有细胞刺激活性或促生长素抑制素分泌调节活性。
本发明的多肽、其酰胺、其酯，或者其部分肽、其酰胺或其酯盐可以与生理上可接受的碱(如碱金属盐)或酸(如无机酸或有机酸)形成盐而使用，优选为生理上可接受的酸加成盐。这样的盐有，与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐，与有机酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐等。
本发明多肽或它们的盐既可用公知的从人或其它温血动物细胞或组织中纯化多肽的方法来制备。又可以通过培养含有本发明多肽之编码DNA的转化体而制备(如下述)，也可用下述肽合成法或其改良法来制备。
当从人或哺乳动物组织或细胞中制备多肽或它们的盐时，首先将人或哺乳动物组织或细胞匀浆，然后用酸等抽提，通过反向层析、离子交换层析等多种层析技术的联用来分离纯化该抽提物。
为了合成本发明多肽、部分肽或它们的盐或其酰胺物，可以使用可用于多肽合成的商用树脂。这类树脂的实例包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、二苯甲胺树脂、氨甲基树脂、4-苄氧基苯甲醇树脂，4-甲基二苯甲基胺树脂，PAM树脂，4-羟甲基甲苯乙酰胺甲基树脂，聚丙烯酰胺树脂，4-(2′，4′-二甲氧基苯羟甲基)苯氧基树脂以及4-(2′，4′二甲氧苯基-Fmoc-氨乙基)苯氧基树脂。使用这些树脂时，将那些其侧链上α-氨基及功能基团受到相应保护的氨基酸，在树脂上按目标多肽的序列顺序，用本领域公知的各种缩合方法缩合。反应结束时，将多肽从树脂上切除下来，同时除去保护基团。然后在高度稀释的溶液中进行分子内二硫键的形成反应，以获得目标多肽、部分肽或其酰胺物。
进行上述受保护氨基酸的缩合反应时，可使用多肽合成的多种活化试剂，但优选使用碳二亚胺。这样的碳二亚胺有DCC、N，N′-二异丙基碳二亚胺以及N-乙基-N′-(3-二甲基氨基脯氨酰基)碳二亚胺。用这些试剂活化时，直接在树脂上添加受保护的氨基酸及外消旋抑制剂(例如，HOBt，HOOBt)，或先将受保护的氨基酸活化为对称酸酐、HOBt酯或HOOBt酯，然后添加到树脂上。
适用于受保护氨基酸的活化反应或适用于与树脂的缩合反应的溶剂选自已知可用于多肽缩合反应的溶剂。这样的溶剂有酰胺类如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺以及N-甲基吡咯烷酮等；卤化烃类如亚甲基盐酸盐和氯仿等；醇类如三氟乙醇等；亚砜类如二甲亚砜等；醚类如吡啶、二恶烷和四氢呋喃等；腈类如乙腈和丙腈等；酯类如乙酸甲酯和乙酸乙酯等；以及这些溶剂的适当混合物。反应温度从已知适用于多肽成键反应的范围中选取，通常选约-20℃-50℃。活化的氨基酸衍生物通常以过量1.5～4倍的量使用。用茚三酮反应检验所述缩合反应；当所述缩合不充分时，可通过不除去保护基团而重复缩合反应来完成。当即使重复反应后仍未充分缩合时，用乙酸酐或乙酰咪唑将未反应的氨基酸乙酰化，以消除对后续反应的可能负影响。
用于保护初始氨基的保护基团有Z、Boc、叔戊氧基羰基、异冰片基氧羰基、4-甲氧苄氧羰基、Cl-Z、Br-Z、金刚烷(adamantyl)氧基羰基，三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基亚硫酰基、二苯硫膦基，以及Fmoc等。
羧基可用如下的酯化作用保护，例如烷基酯化(烷基如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基和2-金刚烷基等的线性、支链或环状烷基酯)，芳烷基酯化(例如酯化为苄酯、4-硝基苄酯、4-甲氧苄酯、4-氯苄酯以及二苯甲基酯等)，苯甲酰甲基酯化，苄氧羰基酰肼化，叔丁氧羰基酰肼化以及三苯甲基酰肼化等。
丝氨酸的羟基可以通过例如酯化作用或醚化作用来保护。适于酯化作用的基团有低级C1～6烷酰基如乙酰基，芳酰基如苯甲酰基，以及来自碳酸的基团如苄氧羰基和乙氧羰基。适于醚化的基团有苯甲基、四氢吡喃基和叔丁基等。
适于保护酪氨酸中酚羟基的基团有Bzl，Cl2-Bzl，2-硝基苄基、Br-Z和叔丁基等。
适于保护组氨酸中咪唑基的基团有Tos，4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺酰基、DNP、苄氧甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc等。
初始氨基酸中的活化羧基有相应的酸酐、叠氮化物、活化酯(带有醇的酯(如五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基酚、氰甲基醇、对硝基苯酚、HONB，N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、HOBt)。将初始物质中待活化氨基酸的氨基活化时，可以使用其相应磷酰胺。
为了除去(脱离)保护基，在氢气流下用Pd-黑或Pd-碳等催化剂进行催化还原；用氢氟酸酐、甲磺酸、三氟甲磺酸或三氟醋酸，或这些酸的混合液进行酸处理；用二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶或哌嗪等碱进行碱处理；以及用液态氨中的钠还原。用上述酸处理除去所述保护基团的反应通常在约-20℃～40℃进行。在酸处理中，添加阳离子清除剂以使反应有效进行，例如使用甲氧基苯、苯酚、硫代甲氧基苯、间甲酚、对甲酚、二甲基硫化物、1，4-丁二硫醇或1，2-乙二硫醇。此外，用苯硫酚处理以除去已知可作为组氨酸中咪唑的保护基团的2，4-二硝基苯基。用作色氨酸中吲哚的保护基团的甲酰基用下述方法去除在1，2-乙二硫醇或1，4-丁二硫醇存在时用上述酸进行处理，以及用氢氧化钠稀溶液和稀氨水等碱进行处理。
与起始物质之反应无关的功能基团的保护、保护基的选择、该保护基的消除、以及与上述反应有关的功能基团的活化，从公知的基团和公知的方法中适当选择。
获得酰胺化多肽或酰胺化部分肽的其它方法有，如先将羧基末端氨基酸的α-羧基酰胺化而加以保护；然后，将肽(多肽)链从氨基侧延伸至预期长度。然后，制备只将其中N-末端α-氨基的保护基团除去的多肽以及只将其中C-末端羧基的保护基团除去的多肽。将这两种多肽浓缩在上述溶剂的混合液中。浓缩反应的细节同上。对浓缩所得被保护多肽进行纯化后，通过上述方法除去所有的保护基团，获得所需粗制多肽。该粗制多肽可用各种已知的纯化方法进行纯化。冻干主要级分获得所需多肽或部分肽的酰胺物。
将羧基末端氨基酸的α-羧基与所选醇类缩合获得氨基酸酯，然后用与上述制备酰胺化多肽方法类似的方法获得所需酯化本发明多肽或部分肽。
本发明部分肽或它们的盐可通过已知的肽合成方法，或用相应肽酶切割本发明多肽而制备。就肽合成的方法而言，固相合成或液相合成都可使用。即，将能构成本发明部分肽的部分肽或氨基酸与本发明多肽的其他部分缩合在一起。当产物中包含保护基团时，除去这些保护基团得到所需肽。用来缩合或除去保护基团的公知方法见下列1)～5)。
1)M.Bodanszky和MA.Ondetti肽的合成，Interscience Publishers，纽约(1966)2)Schroeder和Luebke肽，Academic Press，纽约(1965)3)泉屋信夫等多肽合成与实验，丸善公司(1975)4)矢岛治明和榊原俊平生物化学实验教材1，蛋白质化学IV，205(1977)5)矢岛治明主编药物开发续篇，卷14，肽合成，广川书店反应完成后，可将常规纯化方法如溶剂提取、蒸馏、柱层析、液相层析以及重结晶等进行组合以纯化回收本发明部分肽。当用上述方法获得的部分肽为游离形式时，可以用公知的方法或其改良方法将所述肽转化为相应盐；当所述部分肽以盐形式获得时，可以用公知的方法或改良方法将其转化为游离形式。
编码本发明多肽的DNA可为任意DNA，只要其含有编码本发明所述多肽的碱基序列。这类DNA也可以是基因组DNA、基因组DNA文库、所述细胞或组织的cDNA、所述细胞或组织的cDNA文库、合成DNA。
用于上述文库的载体可以为噬菌体、质粒、粘粒以及噬菌粒中的任意一种。所述DNA可以用从上述细胞或组织中制备的总RNA或mRNA级分通过反转录聚合酶链反应(以下简称为RT-RCR)直接扩增。
编码本发明多肽的DNA可以为任一种DNA，只要其具有，例如，SEQID NO2、9、15、19、34或51所示碱基序列，或其具有能在严谨条件下与SEQ ID NO2、9、15、19、34或51所示碱基序列杂交的碱基序列，而且其编码多肽的活性基本与本发明多肽的活性(如，细胞刺激活性或促生长素抑制激素分泌调节活性)相同。
在严谨条件下与SEQ ID NO2、9、15、19、34或51所示碱基序列能杂交的DNA，分别为与SEQ ID NO2所示碱基序至少具有约70％同源性的DNA，优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选约95％。
可以用公知方法或其改良方法进行所述杂交反应，例如，分子克隆，第2版；J.Sambrook等，冷泉港实验室出版社，(1989)中所述方法。也可以按照所附说明书使用文库商品。该杂交反应优选在高度严谨的条件下进行。
此处的高严谨度条件是，例如钠离子的浓度约为19-40mM，优选约19-20mM，而温度约为50-70℃，优选约60-65℃。最优选钠离子浓度约19mM，杂交温度约为65℃。
更具体的，对于编码含SEQ ID NO1所代表氨基酸序列的多肽的DNA，可以使用含SEQ ID NO2所代表碱基序列的DNA，而对于编码含SEQ ID NO8所代表氨基酸序列的多肽的DNA，可以使用含SEQ ID NO9所代表碱基序列的DNA，对于编码具有SEQ ID NO14所代表氨基酸序列的多肽的DNA，可以使用具有SEQ ID NO15所代表碱基序列的DNA，对于编码具有SEQ ID NO18所代表氨基酸序列的多肽的DNA，可以使用具有SEQ ID NO19所代表碱基序列的DNA，对于编码含有SEQ ID NO33所代表氨基酸序列的多肽的DNA，可以使用含有SEQ ID NO35所代表碱基序列的DNA，对于编码含有SEQ ID NO50所代表氨基酸序列的多肽的DNA，可以使用含有SEQ ID NO51所代表碱基序列的DNA。
编码本发明部分肽的DNA可为任意一种DNA，只要它含有编码本发明所述部分肽的碱基序列。它们还可以是基因组DNA、基因组DNA文库、所述细胞或组织的cDNA、所述细胞或组织的cDNA文库、合成DNA。
具体而言，编码本发明部分肽的DNA可以为以下DNA，只要其具有，例如，SEQ ID NO2、9、15、19、34或51所示碱基序列，或其具有能在严谨条件下与SEQ ID NO2、9、15、19、34或51所示碱基序列杂交的碱基序列，而且其编码多肽的活性基本与本发明多肽活性相同。
能与SEQ ID NO2、9、15、19、34或51所示碱基序列杂交的DNA与上述具有同等意义。
所使用的杂交方法及严谨条件同上述。
能与SEQ ID NO2、9、15、19、34或51所示碱基序列杂交的DNA，用制备本发明多肽的类似方法生产，见下文，该多肽的酰胺、其酯、它们的盐包括针对本发明多肽所述的酰胺、其酯、它们的盐。
更具体地说，编码本发明部分肽的DNA实例有①具有编码以下各种肽的碱基序列的DNASEQ ID NO1所示氨基酸序列中第81(Met)～第92位(Phe)、第101(Ser)～第112位(Ser)、第124(Val)～第131位(Phe)、第1(Met)～第92位(Phe)、第1(Met)～第112位(Ser)或第1(Met)～第131位(Phe)氨基酸序列，或在严谨条件下与上述那些DNA杂交的碱基序列。
②具有编码以下各种肽的碱基序列的DNASEQ ID NO8所示氨基酸序列中第81(Met)～第92位(Phe)、第101(Ser)～第112位(Ser)、第124(Val)～第131位(Phe)、第1(Met)～第92位(Phe)、第1(Met)～第112位(Ser)或第1(Met)～第131位(Phe)氨基酸序列，或在严谨条件下与上述那些DNA杂交的碱基序列。
③具有编码以下各种肽的碱基序列的DNASEQ ID NO14所示氨基酸序列中第81(Met)～第92位(Phe)、第124(Val)～第131位(Phe)、第1(Met)～第92位(Phe)或第1(Met)～第131位(Phe)氨基酸序列，或者在严谨条件下与上述那些DNA杂交的碱基序列。
④具有编码以下各种肽的碱基序列的DNASEQ ID NO33所示氨基酸序列中第84(Pro)～第94位(Phe)氨基酸序列，或者在严谨条件下与该DNA杂交的碱基序列。
⑤具有编码以下各种肽的碱基序列的DNASEQ ID NO50所示氨基酸序列中第84(Pro)～第94位(Phe)氨基酸序列，或者在严谨条件下与该DNA杂交的碱基序列。
更具体地，所述DNA包括含有SEQ ID NO42所示碱基序列，即SEQ ID NO2中第241～第276位碱基的DNA，其编码SEQ ID NO1中第81(Met)～第92位(Phe)的氨基酸序列；含有SEQ ID NO43所示碱基序列，即SEQ ID NO2中第301～第336位碱基的DNA，其编码SEQ ID NO1中第101(Ser)～第112位(Ser)的氨基酸序列；含有SEQ ID NO44所示碱基序列，即SEQ ID NO2中第370～第393位碱基的DNA，其编码SEQ ID NO1中第124(Val)～第131位(Phe)的氨基酸序列；含有SEQ ID NO45所示碱基序列，即SEQ ID NO2中第1～第276位碱基的DNA，其编码SEQ ID NO1中第1(Met)～第92位(Phe)的氨基酸序列；含有SEQ ID NO46所示碱基序列，即SEQ ID NO2中第1～第336位碱基的DNA，其编码SEQ ID NO1中第1(Met)～第112位(Ser)的氨基酸序列；含有SEQ ID NO47所示碱基序列，即SEQ ID NO2中第1～第393位碱基的DNA，其编码SEQ ID NO1中第1(Met)～第131位(Phe)的氨基酸序列。
编码本发明多肽或其部分肽，还有后述的本发明受体蛋白或其部分肽以及编码这些蛋白质或肽的DNA可以用公知方法标记，具体实例有，同位素标记、荧光标记(如，荧光素等标记)、生物素标记或酶标记。
对完全编码本发明多肽或其部分肽(在下文关于编码这些多肽或类似物的DNA的克隆及表达章节中，有时总称为为本发明多肽)进行克隆时，可以用含有本发明多肽之部分碱基序列的合成型DNA引物按公知的PCR进行扩增，或通过与编码本发明多肽之部分或完整区的标记型DNA片段或合成型DNA片段杂交来筛选，已插入合适载体中的DNA。杂交反应可以根据分子克隆第二版(J.Sambrook等，冷泉港实验室出版社，1989)描述的方法进行。也可用商品化的文库根据所附说明书进行杂交。
DNA碱基序列的转换可根据众所周知的方法如Gupped duplex法或Kunkel法或其改进方法，使用众所周知的商品化试剂盒如MutanTM-G或MutanTM-K(均来自宝酒造株式会社)进行。
已经克隆的编码本发明多肽的DNA，根据需要，可在用限制酶消化后或连接一接头之后使用。该DNA可能在其5′端包含ATG作为翻译起始密码子，而在其3′端有TAA、TGA或TAG作为翻译终止密码子。这些翻译起始和终止密码子也可用合适的合成型DNA接头加上。
本发明多肽的表达载体可通过以下方法生产，例如，(a)从编码本发明多肽的DNA上切下所需DNA片段，(b)将该DNA片段连接到一合适载体上的启动子下游。
可以使用的载体包括来自大肠杆菌的质粒(例如，pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、来自枯草杆菌的质粒(例如，pUB110、pTP5、pC194)、来自酵母的质粒(例如，pSH19、pSH15)、噬菌体如λ噬菌体等、动物病毒如反转录病毒、痘苗病毒、杆状病毒等以及pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。
本发明所使用的启动子可以是任意启动子，只要它能同所用基因表达宿主匹配。在使用动物细胞作为宿主时，启动子有SRα启动子、SV40启动子、HIV.LTR启动子、CMV启动子、HSV-TK启动子等。
在这些启动子中，优选CMV(巨细胞病毒)启动子或SRα启动子。如果宿主为大肠杆菌属的细菌，优选的启动子有trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、T7启动子等。在使用枯草杆菌属的细菌作宿主时，优选的启动子有SPO1启动子、SPO2启动子和penP启动子等。在用酵母作宿主时，优选的启动子有PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子和ADH启动子等。在用昆虫细胞作宿主时，优选的启动子有多角体蛋白启动子和P10启动子等。
除了前述的实例，表达载体还可备选包含增强子、剪接信号、poly A加尾信号、选择标记、SV40复制起始子(下文通常简写为SV40ori)等。选择标记的例子包括，二氢叶酸还原酶(下文通常缩写为dhfr)基因[甲氨喋呤(MTX)抗性]、氨苄青霉素抗性基因(下文通常缩写为Ampr)、新霉素抗性基因(下文通常缩写为Neor，G418抗性)等。尤其是，当CHO(dhfr-)细胞缺少dhfr基因并用dhfr基因作为选择标记时，使用无胸腺嘧啶脱氧核苷的培养基可以筛选目的基因。
根据需要，可在本发明多肽的N-端加上同宿主匹配的信号序列。在用大肠杆菌属细菌作宿主时，可以使用的信号序列为Pho A信号序列、OmpA信号序列等；当用枯草杆菌属的细菌作宿主时，可以使用的信号序列为α-淀粉酶信号序列、枯草杆菌蛋白酶信号序列等；在用酵母作宿主时，可以使用的信号序列为MFα信号序列、SUC2信号序列等；在用动物细胞作宿主时，可以使用的信号序列为胰岛素信号序列、α干扰素信号序列、抗体分子信号序列等。
使用含有如此构建的编码本发明多肽的DNA序列的载体，可获得转化体。
可以使用的宿主的实例有，属于大肠杆菌属的细菌、属于枯草杆菌属的细菌、酵母、昆虫细胞、昆虫以及动物细胞等。
大肠杆菌属的细菌有，大肠杆菌(Escherichia coli)K12 DH1(美国国家科学院院刊，60，160(1968))、JM103(核酸研究，9，309(1981))、JA221(分子生物学杂志，120，517(1978))、HB101(分子生物学杂志，41，459(1969))、C600(遗传学，39，440(1954))等。
枯草杆菌属的细菌有，枯草杆菌MI114(基因，24，255(1983))、207-21(生物化学杂志，95，87(1984))等。
酵母有，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22、AH22R、NA87-11A、DKD-5D、20B-12、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913、NCYC2036、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)KM71等。
就昆虫细胞而言，病毒为AcNPV时有草地夜蛾幼虫(Spodopterafrugiperda，Sf)的细胞株、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)中肠的MG1细胞、粉纹夜蛾卵的High FiveTM细胞、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)的细胞、Estigmenaacrea的细胞等；病毒为BmNPV时有家蚕(Bombyx mori)的N细胞(BmN细胞)等。可用的Sf细胞有Sf9细胞(ATCC CRL1711)和Sf21细胞(这两种细胞均由Vaughn，J.L.等在In Vivo，13，213-217(1977)中描述)。
作为昆虫的例子，可以使用家蚕的幼虫(前田等，自然，315，592(1985))。
动物细胞包括猴COS-7细胞、Vero、中华仓鼠细胞CHO(以下简称CHO细胞)、dhfr基因缺陷的中华仓鼠细胞CHO(以下简称CHO(dhfr)细胞)、小鼠L细胞、小鼠AtT-20细胞、小鼠骨髓瘤细胞、大鼠GH3、人FL细胞等。
大肠杆菌属的细菌可以根据美国国家科学院院刊，69，2110(1972)或基因，17，107(1982)中描述的方法进行转化。
枯草杆菌属的细菌可以根据分子及普通遗传学，168，111(1979)中描述的方法进行转化。
酵母可以根据酶学方法，194，182-187(1991)或美国国家科学院院刊.，75，1929(1978)中描述的方法进行转化。
昆虫细胞或昆虫可以根据生物/技术，6，47-55(1988)中描述的方法进行转化。
动物细胞的转化可以根据《细胞工程学增订版8，细胞工程学实验最新方法》秀润出版社，263-267(1995)或病毒学，52，456(1973)中描述的方法进行。
由此，可以获得用含有本发明多肽之编码DNA的表达载体转化的转化体。
当培养宿主为大肠杆菌或枯草杆菌的转化体时，用于培养的培养基为液体培养基，该培养基含有转化体生长所必需的物质例如碳源、氮源、无机物等。碳源包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等。氮源包括无机或有机物质如铵盐、硝酸盐、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉汁、黄豆饼粉、马铃薯抽提物等。无机物又包括氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁等。此外，在培养基中也可加入酵母、维生素、促生长因子等。培养基的pH值优选约5-8。
用于培养大肠杆菌属细菌的培养基优选为，加有葡萄糖和酪蛋白水解物的M9培养基(Miller，分子遗传学实验杂志，431-433，冷泉港实验室，纽约，1972)。必要时可以在培养基中加入化学试剂如3β-吲哚基丙烯酸，来有效激活启动子。
当用大肠杆菌属的细菌作为转化宿主时，转化体通常在大约15-43℃培养约3-24小时。必要时培养物可以进行充气或搅拌。
当用枯草杆菌属的细菌作为转化宿主时，转化体通常在大约30-40℃培养约6-24小时。必要时培养物可以进行充气或搅拌。
当用酵母作为宿主时，转化体培养在，例如Burkholder氏基本培养基(Bostian，K.L.等，美国国家科学院院刊，77，4505(1980))或加了0.5％酪蛋白水解物的SD培养基(Bitter，GA.等，美国国家科学院院刊，81，5330(1984))上。优选培养基pH值调节到大约5-8。转化体通常在大约20-35℃培养约24-72小时。根据需要，培养物可以进行充气或搅拌。
当用昆虫细胞或昆虫作为宿主时，转化体培养在，例如Grace’s昆虫培养基(Grace，T.C.C.，自然，195，788(1962))上，其中添加有固相化10％胎牛血清等适当添加剂。优选培养基pH值调节到大约6-2-6.4。转化体通常在大约27℃培养大约3-5天。根据需要，培养物可以进行充气或搅拌。
当用动物细胞作为宿主时，转化体培养在，例如含有大约5-20％胎牛血清的MEM培养基(科学，122，501(1952))、DMEM培养基(病毒学，8，396(1959))、RPMI 1640培养基(美国医学会杂志，199，519(1967))、199培养基(Proceeding ofthe Society for the Biological Medicine，73，1(1950))等中。优选培养基pH值调节到大约6-8。转化体通常在大约30-40℃培养大约15-60小时。根据需要，培养物可以进行充气或搅拌。
如上所述，本发明的多肽可以产生在转化体的细胞膜上。
可以根据下述方法从上述培养物中分离纯化本发明的多肽。
在培养后，用众所周知的方法收集转化体或细胞，悬浮在一合适的缓冲液中，从中抽提本发明的多肽。然后用众所周知的方法破碎转化体或细胞，如超声处理、溶菌酶处理和/或反复冻溶等，然后离心、过滤，获得本发明多肽或其部分肽的粗提物。此过程的缓冲液可包含蛋白变性剂如尿素或盐酸胍、或表面活性剂如Triton X-100TM等。当所述多肽分泌在培养液中时，在培养结束后，用众所周知的方法从转化体或细胞中经分离而收集上清。
上清或包含在所获抽提物中的多肽可通过将已知的分离和纯化方法适当组合来进行纯化。这些众所周知的分离纯化方法包括，利用溶解性差异的方法如盐析、溶剂沉淀等；主要利用分子量差异的方法如透析、超滤、凝胶过滤、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等；利用电荷差异的方法如离子交换层析等；利用特异性亲和力差异的方法如亲和层析等；利用疏水性差异的方法例如反相高效液相色谱等；利用等电点差异的方法如等电聚焦电泳。
当如此获得的多肽为游离形式时，可用众所周知的方法或其改良法将其转换为盐。相反，当获得的多肽为盐时，可用众所周知的方法或其改良法将其转换为游离形式或另一种盐形式。
重组产生的多肽，在纯化前或纯化后，可用相应蛋白修饰酶处理，从而使多肽经适当修饰，部分去除一段多肽。这种蛋白修饰酶的例子包括胰酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酰内肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。
由此产生的本发明多肽或它们的盐的存在或其活性，可通过对标记配体的结合试验和利用特异性抗体的酶免疫分析法测定。
本发明的多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或该多肽的部分肽、其酰胺、其酯或其盐，它们的受体(以下通常简称受体蛋白)其具体例子有，具有与SEQ ID NO37所示氨基酸序列相同或基本相同序列的受体蛋白。
本发明的受体蛋白可以是来自人或者其它哺乳动物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、兔子、猪、绵羊、牛、猴子等)任一种细胞的任一种蛋白质，所述细胞如脾细胞、神经细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞、骨髓细胞、肾小球膜细胞、朗格罕氏细胞、表皮细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞(例如，巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞等)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞、肝细胞或间质细胞；或这些细胞的前体细胞、干细胞或癌细胞等或者是血细胞系；或任一种含此类细胞的组织，例如脑、脑的任意部分(例如，嗅球、屏状核、大脑基底神经节、海马回、丘脑、下丘脑、丘脑下核、大脑皮质、延髓、小脑、后额叶、前额叶、颞叶、豆状核、尾状核、胼胝体、黑质)、脊髓、垂体、胃、胰腺、肾、肝、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺、消化道(例如大肠、小肠)、血管、心脏、胸腺、脾、腭下腺、外周血、外周血细胞、前列腺、睾丸、附睾、卵巢、胎盘、子宫、骨、关节、骨骼肌等，尤其是脑及脑的任意部分。所述蛋白也可以为合成蛋白。
与SEQ ID NO37所示序列基本相同的氨基酸序列指与SEQ ID NO37的同源性至少约50％，优选至少约70％，较优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约95％的氨基酸序列。
含有与与本发明的SEQ ID NO37所示序列基本相同的氨基酸序列的蛋白质优选为，与SEQ ID NO37所示氨基酸序列相比，具有基本相同的序列并具有基本相同活性的蛋白质，更具体地指含有SEQ ID NO54所示氨基酸序列的蛋白质。
基本相同的活性实例包括配体结合活性、信号传导活性或者促生长素抑制素分泌调节活性等。术语“基本相同”是指其活性的实质彼此相同。因此尽管优选配体结合活性、信号传导活性或促生长素抑制素分泌调节活性等活性强度是同等的(如约0.01-100倍，优选约0.5-20倍，更优选约0.5-2倍)，但活性的强度等级以及蛋白质分子量等量化因素可以彼此不同。
所述配体结合活性、信号传导活性或者促生长素抑制素分泌调节活性等活性可以根据公知方法测定，例如，用将在下文中描述的配体测定方法或/和筛选方法。
可以利用的本发明受体蛋白含有下述氨基酸序列①SEQ ID NO37或SEQ ID NO54所示氨基酸序列，其中至少有1个或2个氨基酸(优选约1～30个，较优选约1-10个，更优选数个(1或2))缺失；②SEQ ID NO37或SEQ ID NO54所示氨基酸序列，其中至少有1个或2个氨基酸(优选约1～30个，较优选约1-10个，更优选数个(1或2))被添加；③SEQ ID NO37或SEQ ID NO54所示氨基酸序列，其中至少有1个或2个氨基酸(优选约1～30个，较优选约1-10个，更优选数个(1或2))被其他氨基酸所取代；④或者上述氨基酸序列的组合。
本发明受体蛋白可以用本领域的常规肽描述法来定义。即，左端为N-末端(氨基端)，右端为C-末端(羧基端)。本发明受体蛋白中包括SEQ ID NO37所示的氨基酸序列，其C-末端为通常羧基(-COOH)或羧酸酯(-COO-)，但是C-末端也可以为酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。
这里R表示的酯基团有C1～6烷基如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基等；C3～8环烷基如环戊基、环己基等；C6～12芳基如苯基、α-萘基等；以及C7～14芳烷基包括苯基-C1-2烷基如苯甲基、苯乙基等或α-萘基-C1-2烷基，如α-萘甲基等。此外，广泛用作口服酯类的三甲基乙酰氧甲基等也可以使用。
当本发明受体蛋白在C-末端以外的位置上包括一个羧基(或羧酸根)时，它可以酰胺化或酯化，则这类酰胺或酯也可以包括在本发明所述受体蛋白的范围之内。所述酯基可以与上述C-末端的酯基相同。
另外，本发明受体蛋白可包括，上述受体蛋白的变体，其中多肽N-末端氨基酸残基(如甲硫氨酸)的氨基用保护基(C1～6酰基，如甲酰基、乙酰基等的C1～6烷酰基)保护；一种受体蛋白，其N末端在体内切割，形成的谷氨酰基焦谷氨酸化；一种受体蛋白，其氨基酸侧链上的取代基(例如，-OH，-SH，氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)受适当基团(C1～6酰基，如甲酰基、乙酰基等的C1～6烷酰基)保护，或与糖蛋白等具有糖链的蛋白质偶联。
本发明受体蛋白的具体实例包括，含有SEQ ID NO37所示氨基酸序列的大鼠受体蛋白，含有SEQ ID NO54所示序列的人的受体蛋白。
针对本发明受体蛋白所述的任何部分肽均可作为本发明受体蛋白的部分肽使用。例如，本发明受体蛋白分子中暴露于细胞膜外的部分，只要其具有受体结合活性，就可使用。
含SEQ ID NO37或54所示氨基酸序列的本发明受体蛋白的部分肽的一个实例为，包含下述区域的肽，该区域经疏水图分析为胞外区域(亲水区或亲水位点)。含有疏水区或疏水位点的肽也可以使用。另外，分别只包含一个结构域的肽可以使用，同时含有多种结构域的部分肽也可使用。
在本发明受体蛋白中，所述部分肽具有至少20个，优选至少50个，更优选至少100个氨基酸。
所述基本相同的氨基酸序列指具有至少约50％同源性，优选至少约70％，较优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约95％同源性的氨基酸序列。
本发明中，术语“基本相同的活性”定义同上。“基本相同的活性”可以用上述方法分析。
本发明受体蛋白的部分肽的例子有所述氨基酸序列中缺失了1个或2个以上氨基酸(优选约1～10个氨基酸，更优选数个(1或2)氨基酸)；所述氨基酸序列中添加了1个或2个以上氨基酸(优选约1～20个氨基酸，更优选约1～10个氨基酸，最优选数个(1或2)氨基酸)；③或其中的1个或2个以上氨基酸(优选1～10个氨基酸、更优选数个(1或2)氨基酸)被其他氨基酸所取代。
本发明受体蛋白的部分肽其C-末端通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，也可以为酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)(R意义同上)，如本发明上述多肽中一样。
如前述，本发明受体蛋白的部分肽也可以包括上述肽的变体，如N-末端甲硫氨酸的氨基受保护基团保护的肽；N-末端残基被体内切割，产生的Gln转化为焦谷氨酸的肽；肽分子中氨基酸侧链上的取代基受适当保护基团保护的肽；以及以糖链连接为糖肽的肽。
本发明受体蛋白或其部分肽之盐优选为生理上可接受的酸加成盐。这样的盐有，与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐，与有机酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐等。
本发明的受体蛋白或它们的盐既可用公知的从所述人或哺乳动物细胞或组织中纯化受体蛋白的方法来制备，又可以通过培养含有随后所述本发明受体蛋白之编码DNA的转化体(宿主为与本发明所述多肽之编码DNA的转化体一样)而制备，可以通过培养本发明所述多肽之编码DNA的转化体，也可用下述肽合成法或其改良法来制备。
当从人或哺乳动物组织或细胞中制备受体蛋白或它们的盐时，首先将人或哺乳动物组织或细胞匀浆，然后用酸等抽提，通过反向层析、离子交换层析等多种层析技术的联用来分离纯化该抽提物。
本发明受体蛋白的部分肽或它们的盐既可依照公知的肽合成方法，或者用适当的肽酶切割本发明受体蛋白来制备。
本发明的受体蛋白或它们的盐、部分肽或其酰胺或酯或它们的盐可以用制备本发明所述的多肽、或其酰胺或酯或它们的盐的合成方法制备。
编码本发明受体蛋白的多核苷酸可以为任一种多核苷酸，只要其中含有编码本发明受体蛋白的碱基序列(DNA或RNA，优选DNA)即可。所述多核苷酸可以为包含本发明受体蛋白的编码DNA以及RNA如mRNA等。所述多核苷酸可以为双链也可以为单链。当该多核苷酸为双链时，它可以为双链DNA或DNARNA杂合体。当该多核苷酸为单链时，它可以为正义链(即编码链)或反义链(即非编码链)。
使用编码本发明受体蛋白的多核苷酸时，可以用公知的实验医学增刊，15(7)，“新型PCR及其应用″(1997)中公开的方法或其改良法对本发明受体蛋白的mRNA进行定量。
编码本发明受体蛋白的DNA为以下任意一种DNA，它们是基因组DNA、基因组DNA文库、所述细胞或组织的cDNA、所述细胞或组织的cDNA文库、合成DNA。用于文库的载体可以为噬菌体、质粒、粘粒以及噬菌粒中的任意一种。所述DNA可以用从上述细胞或组织中制备的总RNA或mRNA级分通过反转录聚合酶链反应(以下简称为RT-RCR)直接扩增。
具体而言，编码本发明受体蛋白的DNA可以为任一种DNA，只要其具有，例如，SEQ ID NO38、55或56所示碱基序列，或其具有能在严谨条件下与SEQ ID NO38、55或56所示碱基序列杂交的碱基序列，并且以编码具有与本发明受体蛋白基本相同活性(如，配体结合活性、信号传导活性或促生长素抑制激素分泌调节活性等)的DNA。
能与SEQ ID NO38、55或56所示碱基序列杂交的DNA，分别与SEQID NO38、55或56所示碱基序列有至少约70％同源性，优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选约95％。
可以用公知方法或其改良方法进行所述杂交反应，例如，分子克隆，第2版；J.Sambrook等，冷泉港实验室出版社，(1989)中所述方法。也可以按照所附说明书使用文库商品。该杂交反应优选在高度严谨的条件下进行。
所谓高严谨度条件，例如钠离子的浓度约为19-40mM，优选约19-20mM，而温度约为50-70℃，优选约60-65℃。最优选钠离子浓度约为19mM，杂交温度约为65℃。
能与SEQ ID NO38、55或56所示碱基序列杂交的DNA所编码的多肽可以用制备本发明所述多肽的方法的类似方法制备。所述多肽的酰胺、酯、盐与本发明所述多肽的酰胺、酯、盐一样。
更具体的，对于编码含有SEQ ID NO37所代表氨基酸序列的受体蛋白的DNA，可以使用含有SEQ ID NO38所示碱基序列的DNA，而对于编码含有SEQ ID NO54所代表氨基酸序列的受体蛋白的DNA，可以使用含有SEQ ID NO55或56所示碱基序列的DNA。
含有编码本发明受体蛋白之DNA的部分碱基序列的多核苷酸，或含有与所述DNA互补的碱基序列的多核苷酸，不仅指编码本发明下述部分肽的DNA，还指相应RNA。
根据本发明，基于所克隆或测定的G蛋白偶联型受体蛋白编码DNA的碱基序列信息，可设计并合成能够抑制G蛋白偶联型受体蛋白基因复制或表达的反义多核苷酸(核酸)。这些多核苷酸(核酸)可以与G蛋白偶联型蛋白基因的RNA杂交并抑制RNA的合成或RNA功能，或通过与G蛋白偶联型受体蛋白相关RNA的相互作用，来调控G蛋白偶联型受体蛋白基因的表达。与G蛋白偶联型受体蛋白相关RNA的特定序列互补的多核苷酸，以及能与G蛋白偶联型受体蛋白相关RNA特异性杂交的多核苷酸，可用于在体内和体外调控该G蛋白偶联型受体蛋白基因的表达。这些多核苷酸也可用于治疗和诊断下述疾病。术语“相应”是指与含有该基因的特定核酸序列或碱基序列同源或互补。在核苷酸、碱基序列或核酸和肽(蛋白)之间的“相应”通常指由核苷酸(核酸)的序列或其互补序列衍生肽(蛋白)的氨基酸序列。可选定G蛋白偶联型受体蛋白基因的5’端发夹结构、5’端6碱基对重复序列、5’端非翻译区、多肽翻译起始密码子、蛋白编码区、ORF翻译起始密码子、3’端非翻译区、3’端回文区、和3’端发夹环作为优选目标区域，但G蛋白偶联型受体蛋白基因的任何其它区域都可作为目标区域。
编码本发明受体蛋白部分肽的DNA可以为任意一种DNA，只要其含有编码本发明所述部分肽的碱基序列。它们可以是基因组DNA、基因组DNA文库、所述细胞或组织的cDNA、所述细胞或组织的cDNA文库、合成DNA。用于所述文库的载体可以为噬菌体、质粒、粘粒以及噬菌粒中的任意一种。所述DNA可以用从上述细胞或组织中制备的总RNA或mRNA级分通过反转录聚合酶链反应(以下简称为RT-RCR)直接扩增。
具体而言，编码本发明部分肽的DNA包括，例如(1)具有SEQ ID NO38、55或56所示碱基序列的任意DNA，或(2)具有能在严谨条件下与SEQID NO38、55或56所示碱基序列杂交的碱基序列，并且以编码具有与本发明受体蛋白活性(如，配体结合活性、信号传导活性或促生长素抑制激素分泌调节活性等)基本相同活性的DNA。
针对本发明的多肽、部分肽或酯或酰胺，或它们的盐的抗体，或针对本发明受体蛋白或其盐或部分肽，其酰胺或酯的抗体可以是任意多克隆抗体和单克隆抗体，只要它们能识别本发明的多肽，部分肽或酯或酰胺，或它们的盐，或识别本发明受体蛋白或其盐或部分肽，其酰胺或其酯。
针对本发明的多肽、部分肽或酯或酰胺，或它们的盐的抗体，或针对本发明受体蛋白或其盐或部分肽，其酰胺或酯(后文有时简称本发明受体蛋白)的抗体可用众所周知的生产抗体或抗血清的方法生产，其中使用本发明的受体蛋白或本发明多肽作为抗原。(a)单克隆抗体生产细胞的制备将本发明的受体蛋白或多肽，单独或与载体或稀释剂一起给药于温血动物体内能产生抗体的部位。为了增加给药后抗体的产量，可给予弗氏完全或不完全佐剂。有效给药通常约为每2-6周一次，一共2-10次。使用的温血动物包括猴子、兔子、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、家鸡，优选小鼠和大鼠。
在制备单克隆抗体生产细胞时，从抗原免疫的温血动物如小鼠中选择抗体滴度比较明显的动物，在最后一次免疫的2-5天后取胰腺或淋巴结，使其中产生抗体的细胞与同种或异种动物的骨髓瘤细胞融合，获得产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。抗血清中抗体滴度的测定可以通过使抗血清与标记的随后所述的多肽反应，然后测定标记试剂同抗体的结合活性。可以根据Koehler和Milstein(自然，256，495，1975)的方法进行融合。融合加速剂的例子为聚乙二醇(PEG)、仙台病毒等，优选PEG。
温血动物骨髓瘤细胞的例子包括NS-1、P3U1、SP2/0和AP-1，优选P3U1。所用抗体产生细胞(胰腺细胞)同骨髓瘤细胞的比例优选约为1∶1到20∶1，加入浓度约为10％-80％的PEG(优选PEG 1000-6000)。然后在20-40℃保温。为了有效实施细胞融合，优选30-37℃保温约1-10分钟。
可以用各种方法筛选产生单克隆抗体的杂交瘤。这些方法有将作为抗原的多肽(蛋白质)直接或与载体一起吸附至一种固相(如微量反应板)，将杂交瘤上清加入到该固相中，然后加入标记有放射性物质或酶或蛋白A的抗免疫球蛋白抗体(如果用小鼠细胞作融合，则用抗小鼠的免疫球蛋白抗体)，检测结合到固相上的单克隆抗体；另一方法为，将杂交瘤上清加入到吸附有抗免疫球蛋白抗体或蛋白A的固相中，加入标记有放射性物质或酶的多肽，检测结合到固相上的单克隆抗体。
单克隆抗体的筛选可以根据众所周知的方法或其改进方法进行。一般的，在含有HAT(次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸腺嘧啶)的动物细胞培养基中进行筛选。可以使用任何筛选和生长培养基，只要杂交瘤可以在其中生长。例如，可以使用含有1％-20％，优选10-20％胎牛血清的RPMI 1640培养基、含有1％-10％胎牛血清的GIT培养基(和光纯药工业株式会社)、无血清的杂交瘤培养基(SFM-101，日水制药株式会社)作为筛选或生长培养基。通常在含5％CO2的条件下于20-40℃(优选37℃)培养约5天-3周(优选1-2周)。杂交瘤培养上清中抗体滴度的测定同上述抗血清中抗体滴度测定方法相同。
(b)单克隆抗体的纯化单克隆抗体的分离和纯化可根据公知方法，例如免疫球蛋白的分离和纯化方法(如盐析、乙醇沉淀、等电点沉淀、电泳、离子交换剂(如DEAE)吸附和去吸附、超离心、凝胶过滤、或一种特异性纯化方法，其包括仅收集与结合了抗原的固相、蛋白A或蛋白G等已活化吸附剂相结合的抗体并使之分离以获得该抗体)。本发明多克隆抗体的制备用众所周知的方法或其改进方法进行。例如，用与上述生产单克隆抗体相似的方法生产免疫原(多肽抗原)或配制免疫原与载体蛋白形成的复合物并用其免疫温血动物。从已免疫的动物收集产物，其中含有本发明多肽的抗体，分离和纯化该抗体。
在由免疫原和载体蛋白组成的用于免疫温血动物的复合物中，对载体蛋白的类型和载体同半抗原的混合比率无限定，只要能针对与载体一起免疫的半抗原有效产生抗体。例如，牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或匙孔虫戚血蓝蛋白与半抗原以载体比半抗原重量比约0.1-20(优选约1-5)的比率偶联。
不同的缩合剂可用于偶联载体和半抗原。戊二醛、碳二亚胺、马来酰亚胺活化的酯和含有巯基或二硫代吡啶基的活化的酯试剂可用于偶联。
将缩合产物单独或与载体或稀释剂一起给药于温血动物体内能产生抗体的部位。为了增加给药后抗体的产量，可给予弗氏完全或不完全佐剂。大约每2-6周给药一次，共3-10次。
多克隆抗体从用上述方法免疫的温血动物的血液、腹水等(优选血液)中收集。
抗血清中多克隆抗体滴度的测定同上述测定血清抗体滴度的方法相同。可以根据上述用于分离和纯化单克隆抗体的免疫球蛋白分离纯化方法来分离和纯化多克隆抗体。
具有与编码本发明多肽或其部分肽的DNA或者编码本发明受体蛋白或其部分肽的DNA(下文在阐述反义DNA中，将这些DNA称作本发明DNA)互补或基本互补的碱基序列的反义DNA可为任一种反义DNA，只要其含有与本发明DNA互补或基本互补的碱基序列，并能抑制该DNA的表达。
与本发明DNA基本互补的碱基序列，包括具有与互补于本发明DNA之碱基序列(即本发明DNA互补链)的全部或部分碱基序列至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％同源性的DNA。尤其是在本发明DNA互补链的全部碱基序列中，反义DNA具有与编码本发明多肽或本发明受体蛋白N-末端区的部分碱基序列(如起始密码子附近的碱基序列等)的互补链至少70％同源性，优选至少80％同源性，更优选至少90％，最优选至少95％。这些反义DNA可以使用公知的DNA合成装置生产合成。
下面阐述①本发明多肽、或其酯或其酰胺或它们的盐，以及其部分肽、或其酯或其酰胺或它们的盐(以下通常称为本发明多肽)；②本发明受体蛋白或它们的盐以及其部分肽、或其酯或其酰胺或它们的盐(以下通常称为本发明受体蛋白)；③本发明多肽或其部分肽、或本发明受体蛋白或其部分肽之编码DNA(以下通常称为本发明DNA)；针对本发明多肽、或其酯或其酰胺或它们的盐，或其部分肽、或其酯或其酰胺或它们的盐的抗体，或者针对本发明受体蛋白或它们的盐以及其部分肽、或其酯或其酰胺的抗体(以下通常称为本发明抗体)以及反义DNA的用途。
(1)与本发明多肽或本发明受体蛋白相关的各种疾病的预防药物与治疗药物因为本发明多肽具有本发明受体蛋白的细胞刺激活性，所以当编码本发明多肽的DNA发生异常或缺陷，或者当本发明受体蛋白发生异常或缺陷，将导致各种疾病，如高血压、自身免疫疾病、心功能不全、白内障、青光眼、急性细菌性脑膜炎、急性心肌梗塞、急性胰腺炎、急性病毒性脑炎、成人呼吸窘迫综合征、酒精性肝炎、阿尔茨海默氏病、哮喘、动脉硬化、特应性皮炎、细菌性肺炎、膀胱癌、骨折、乳腺癌、贪食症、食多症、烧伤、宫颈癌、慢性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性胰腺炎、肝硬化、大肠癌(结肠癌/直肠癌)、克罗恩氏病、痴呆、糖尿病并发症、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病、胃炎、幽门螺杆菌感染、肝功能不全、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、肝炎、单纯疱疹病毒感染、水痘带状疱疹病毒感染、何杰金氏病、爱滋病、人乳头状瘤病毒感染、高钙血症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、传染病、流行性感冒、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、侵入性葡萄球菌感染、恶性黑色素瘤、癌转移、多发性骨髓瘤、过敏性鼻炎、肾炎、非何杰金氏性淋巴瘤、胰岛素非依赖型糖尿病(II型)、非小细胞肺癌、器官移植、骨关节炎、骨软化、骨质稀少、骨质疏松、卵巢癌、骨贝切特氏病、消化性溃疡、末梢血管疾病、前列腺癌、反流性食管炎、肾功能不全、类风湿性关节炎、精神分裂症、败血病、败血性休克、重度全身性真菌感染、小细胞肺癌、脊髓损伤、胃癌、系统性红斑狼疮、暂时性脑缺血、结核、心瓣膜闭锁不全、血管性多发梗塞痴呆、外伤、失眠、关节炎、垂体激素分泌功能不全、尿频、尿毒症、或者神经性疾病等。因此，本发明多肽、本发明受体蛋白以及本发明DNA都可作为上述各种疾病的治疗药物或预防药物使用。
本发明多肽、本发明受体蛋白以及本发明DNA还可以用作囊状黄斑浮肿(macular edema cystoid)疾病的治疗药物或预防药物。
由于本发明多肽、本发明受体蛋白以及本发明DNA与促生长激素抑制激素的分泌调节有关，它们可作为药物用于(1)治疗肢端肥大症、产TSH肿瘤、非分泌性(非功能性)垂体肿瘤、产异位性ACTH(促肾上腺皮质激素)肿瘤、髓样甲状腺癌、产VIP肿瘤、产高血糖素肿瘤、产促胃液素肿瘤、胰岛细胞瘤、类癌瘤等；(2)治疗胰岛素依赖型或非依赖型糖尿病、或者与这些糖尿病有关的各种疾病，即糖尿病并发症(如糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经功能障碍、Down′s综合征、体位性低血压病等)；(3)治疗因改善高胰岛素血症或抑制食欲引起的肥胖症、贪食症等；(4)治疗急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺瘘、肠瘘、出血性溃疡、消化性溃疡、胃炎、胃酸过多、反流性食管炎等；(5)缓解伴随着幽门螺杆菌感染引起的各种疾病(例如，促胃液素分泌亢进的抑制药物等)；(6)抑制内窥镜胆道胰管照影所致淀粉酶的分泌，以及胰腺手术预后治疗；(7)由小肠吸收能力低下、分泌亢进或消化管运动能力异常引起的腹泻(如短肠道综合征等)、癌症化疗等引起的腹泻、先天性小肠萎缩引起的腹泻、由产VIP肿瘤等神经内分泌肿瘤引起的腹泻、AIDS引起的腹泻、骨髓移植后的移植物抗宿主反应引起的腹泻、糖尿病引起的腹泻、腹腔神经丛损伤引起的腹泻、全身性硬化引起的腹泻、嗜酸性粒细胞增多引起的腹泻等；(8)治疗倾倒综合征、过敏性肠炎、克罗氏病、炎性肠疾患等；(9)治疗肿瘤或癌(例，甲状腺癌、大肠癌、乳腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、胆管癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、恶性褐色细胞瘤、神经母细胞瘤、脑肿瘤、胸腺瘤、肾癌等)、白血病(如，嗜碱性粒细胞白血病、慢性淋巴白血病、慢性髓样白血病、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤等)；以上这些药物可以单独或与其它治癌药物(他莫昔芬、LHRH激动剂、LHRH拮抗剂、IFN-α、β及γ、IL-2等)合用；(10)预防和治疗肥大性心肌病、动脉硬化、心瓣膜疾病、心肌梗塞(尤其是穿皮穿血管冠状动脉成形术后的心肌梗塞)、或血管再生；(11)治疗食道静脉癌出血、肝硬化、末梢血管疾病；(12)治疗因对作用于免疫系统的生理活性物质(例如，物质P、速激肽、细胞因子等)的分泌进行调节而伴有的疾病，例如全身或局部炎症(如多发性动脉炎、类风湿性关节炎、牛皮癣、晒伤、湿疹、过敏反应(例如哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎)等)；(13)对影响神经调节因子的产生与分泌的疾病进行治疗，例如痴呆症(如阿尔茨海默氏病、阿耳茨海默氏型老年性痴呆、血管性·多发性痴呆等)、精神分裂症、癫痫、抑郁症、焦虑症、睡眠障碍、多发性硬化等；(14)治疗眼部疾病(如，青光眼等)；(15)预防和治疗急性细菌性脑膜炎、急性病毒性脑炎、成人呼吸窘迫综合征、细菌性肺炎、重度全身性真菌感染、结核、脊髓损伤、骨折、肝功能不全、肺炎、酒精性肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、AIDS、人乳头状瘤病毒感染、流行性感冒、癌转移、多发性骨髓瘤、骨软化、骨质疏松、骨贝切特氏病、肾炎、肾功能不全、败血病、败血性休克、高钙血症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、系统性红斑狼疮、暂时性脑缺血发作、酒精性肝炎等；(16)使器官移植、烧伤、外伤、脱发等康复；(17)作为镇痛剂用于抑制或缓解慢或急性疼痛(例如，术后疼痛、炎症性疼痛、牙痛、骨疾病(如，关节炎、类风湿、骨质疏松等)的疼痛)。
例如，当患者体内本发明多肽或受体蛋白很少或缺失时，本发明DNA可以通过以下3种方式充分地或正确地为该患者提供本发明多肽或受体蛋白的作用(a)给予该患者本发明DNA，以便体内表达本发明多肽或受体蛋白；(b)将本发明DNA插入细胞中，表达本发明多肽或受体蛋白，再将该细胞移植到患者体内；(c)直接将本发明多肽或受体蛋白投药于该患者体内。
当本发明DNA用作上述预防/治疗药物时，该DNA本身可单独使用，或插入合适载体如反转录病毒载体、腺病毒载体或腺伴随病毒载体后按常规方法给药于人或其它温血动物。本发明DNA也可以以裸露DNA的形式给药，或与佐剂一起给药以便于其被基因枪摄入或通过含有水凝胶的导管。
当本发明多肽或受体蛋白用作所述治疗或预防药物时，优选所用纯度至少90％，优选95％以上，更优选98％以上，最优选99％以上。
例如，本发明的多肽或受体蛋白可以以片剂(必要时加糖衣)、胶囊、酏剂、微胶囊等剂型口服，或以可注射型制剂如无菌溶液或悬浮在水或其它可药用液体中的悬浮液形式经非胃肠道给药。例如，将本发明的多肽或受体蛋白与生理学上可接受的已知载体、调味剂、赋形剂、载色剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂等制成药剂常用的单位剂型。控制制剂中的活性成分使得在给定范围内获得合适剂量。
可与片剂、胶囊等混合的添加剂包括，粘和剂如明胶、玉米淀粉、西黄耆胶和金合欢胶；赋形剂如结晶纤维素；膨胀剂如玉米淀粉、明胶和藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖和糖精；加味剂如薄荷、akamonooil和樱桃。当单位剂型为胶囊形式时，可进一步将液体载体如油和脂肪同上述添加剂一起使用。可根据常规制药方法制备注射用无菌组合物，例如将活性成分与天然植物油如芝麻油和椰子油等溶解或悬浮在载体，如注射用的水中来制备药物。
用于注射的液体介质的例子包括，生理盐水、及包含葡萄糖和其它辅助制剂(如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化钠等)的等渗溶液，并可以进一步同合适的助溶剂如醇(如乙醇等)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇等)、非离子表面活性剂(如聚山梨酸酯80TM和HCO-50等)等结合使用。油性介质有芝麻油和豆油，它们可与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用。此外，上述的治疗/预防制剂可进一步与缓冲液(例如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液等)、镇静剂(例如苯扎氯胺和盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂(例如苯甲醇、酚等)、抗氧化剂等结合使用。由此制备的注射液体一般装在合适的安瓿中。
本发明DNA所插入的载体用与上述类似的方法制成制剂，这类制剂通常经非胃肠道途径给药。
如此所获制剂安全、低毒，因此可用于人或其它温血动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、鸡、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴等)。
本发明多肽或受体蛋白的剂量依赖于病症、受试者和给药方法等而异；例如口服给药治疗神经疾病时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天。当非胃肠道给药时，该多肽或受体蛋白一次投药量依赖于给药受体、症状等而变，例如在治疗神经疾病时，成年人(体重60kg)优选活性成分静脉注射，剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
(2)筛选可作为疾病治疗药物的侯选化合物由于本发明多肽或受体蛋白具有细胞刺激活性等特性，因此能促进或抑制本发明多肽或受体蛋白的功能(例如，细胞刺激活性等功能)的化合物或其盐(这里也称为使本发明多肽或受体蛋白的结合特性发生变化的化合物或其盐，以下相同)可作为以下各种疾病的治疗·预防药物而使用例如高血压、自身免疫疾病、心功能不全、白内障、青光眼、急性细菌性脑膜炎、急性心肌梗塞、急性胰腺炎、急性病毒性脑炎、成人呼吸窘迫综合征、酒精性肝炎、阿尔茨海默氏病、哮喘、动脉硬化、特应性皮炎、细菌性肺炎、膀胱癌、骨折、乳腺癌、贪食症、食多症、烧伤、宫颈癌、慢性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性胰腺炎、肝硬化、大肠癌(结肠癌/直肠癌)、克罗恩氏病、痴呆、糖尿病并发症、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病、胃炎、幽门螺杆菌感染、肝功能不全、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、肝炎、单纯疱疹病毒感染、水痘带状疱疹病毒感染、何杰金氏病、爱滋病、人乳头状瘤病毒感染、高钙血症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、传染病、流行性感冒、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、侵入性葡萄球菌感染、恶性黑色素瘤、癌转移、多发性骨髓瘤、过敏性鼻炎、肾炎、非何杰金氏性淋巴瘤、胰岛素非依赖型糖尿病(II型)、非小细胞肺癌、器官移植、骨关节炎、骨软化、骨质稀少、骨质疏松、卵巢癌、骨贝切特氏病、消化性溃疡、末梢血管疾病、前列腺癌、反流性食管炎、肾功能不全、类风湿性关节炎、精神分裂症、败血病、败血性休克、重度全身性真菌感染、小细胞肺癌、脊髓损伤、胃癌、系统性红斑狼疮、暂时性脑缺血、结核、心瓣膜闭锁不全、血管性多发梗塞痴呆、外伤、失眠、关节炎、垂体激素分泌功能不全、尿频、尿毒症、或者神经性疾病等。
促进或抑制(优选抑制)本发明多肽或本发明受体蛋白功能(例如，细胞刺激活性等)的化合物或其盐还可用作囊状黄斑浮肿疾病的治疗药物或预防药物。
由于本发明多肽或本发明受体蛋白与促生长激素抑制激素的分泌调节有关，促进或抑制本发明多肽或本发明受体蛋白功能(例如，细胞刺激活性等)的化合物或其盐可作为药物用于，(1)治疗肢端肥大症、产TSH肿瘤、非分泌性(非功能性)垂体肿瘤、产异位性ACTH(促肾上腺皮质激素)肿瘤、髓样甲状腺癌、产VIP肿瘤、产高血糖素肿瘤、产促胃液素肿瘤、胰岛细胞瘤、类癌瘤等；(2)治疗胰岛素依赖型或非依赖型糖尿病、或者与这些糖尿病有关的各种疾病，即糖尿病并发症(如糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经功能障碍、Down′s综合征、体位性低血压病等)；(3)治疗因改善高胰岛素血症或抑制食欲引起的肥胖症、贪食症等；(4)治疗急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺瘘·肠瘘、出血性溃疡、消化性溃疡、胃炎、胃酸过多、反流性食管炎等；(5)缓解伴随着幽门螺杆菌感染引起的各种疾病(例如，促胃液素分泌亢进的抑制药物等)；(6)抑制内窥镜胆道胰管照影所致淀粉酶的分泌，以及胰腺手术预后治疗；(7)由小肠吸收能力低下、分泌亢进或消化管运动能力异常引起的腹泻(如短肠道综合征等)、癌症化疗等引起的腹泻、先天性小肠萎缩引起的腹泻、由产VIP肿瘤等神经内分泌肿瘤引起的腹泻、AIDS引起的腹泻、骨髓移植后的移植物抗宿主反应引起的腹泻、糖尿病引起的腹泻、腹腔神经丛损伤引起的腹泻、全身性硬化引起的腹泻、嗜酸性粒细胞增多引起的腹泻等；(8)治疗倾倒综合征、过敏性肠炎、克罗氏病、炎性肠疾患等；(9)治疗肿瘤或癌(例，甲状腺癌、大肠癌、乳腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、胆管癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、恶性褐色细胞瘤、神经母细胞瘤、脑肿瘤、胸腺瘤、肾癌等)、白血病(如，嗜碱粒细胞白血病、慢性淋巴白血病、慢性髓样白血病、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤等)；以上这些药物可以单独或与其它治癌药物(他莫昔芬、LHRH激动剂、LHRH拮抗剂、IFN-α、β及γ、IL-2等)合用；(10)预防和治疗肥大性心肌病、动脉硬化、心瓣膜疾病、心肌梗塞(尤其是穿皮穿血管冠状动脉成形术后的心肌梗塞)、或血管再生；(11)治疗食道静脉癌出血、肝硬化、末梢血管疾病；(12)治疗因对作用于免疫系统的生理活性物质(例如，物质P、速激肽、细胞因子等)的分泌进行调节而伴有的疾病，例如全身或局部炎症(如多发性动脉炎、类风湿性关节炎、牛皮藓、晒伤、湿疹、过敏反应(例如哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎)等)；(13)对影响神经调节因子的产生与分泌的疾病进行治疗，例如痴呆症(如阿尔茨海默氏病、阿耳茨海默氏型老年性痴呆、血管性·多发性痴呆等)、精神分裂症、癫痫、抑郁症、焦虑症、睡眠障碍、多发性硬化等；(14)治疗眼部疾病(如，青光眼等)；(15)预防和治疗急性细菌性脑膜炎、急性病毒性脑炎、成人呼吸窘迫综合征、细菌性肺炎、重度全身性真菌感染、结核、脊髓损伤、骨折、肝功能不全、肺炎、酒精性肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、AIDS、人乳头状瘤病毒感染、流行性感冒、癌转移、多发性骨髓瘤、骨软化、骨质疏松、骨贝切特氏病、肾炎、肾功能不全、败血病、败血性休克、高钙血症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、系统性红斑狼疮、暂时性脑缺血发作、酒精性肝炎等；(16)使器官移植、烧伤、外伤、脱发等康复；(17)作为镇痛剂用于抑制或缓解慢或急性疼痛(例如，术后疼痛、炎症性疼痛、牙痛、骨疾病(如，关节炎、类风湿、骨质疏松等)的疼痛)。
因此，本发明多肽或本发明受体蛋白可作为一种试剂，用于筛选能促进或抑制本发明多肽或本发明受体蛋白的功能的化合物或其盐。
即，本发明提供(1)一种筛选方法，其用于筛选能促进本发明多肽或其酰胺或酯或它们的盐、或其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐的功能(例如，细胞刺激活性或促生长激素抑制素分泌调节活性等)的化合物或其盐(下文通常简称为促进剂)，或者其用于筛选能抑制本发明多肽或其酰胺或酯或它们的盐、或其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐功能的化合物(下文通常简称为抑制剂)，其特征为，该筛选法包括应用本发明多肽或其酰胺或酯或它们的盐、或其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐；(2)一种筛选方法，其用于筛选能促进本发明受体蛋白或它们的盐、或其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐的功能(例如，细胞刺激活性或促生长激素抑制素分泌调节活性等)的化合物或其盐(下文通常简称为促进剂)，或者其用于筛选能抑制本发明多肽或其酰胺或酯或它们的盐、或其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐功能的化合物(下文通常简称为抑制剂)，其特征为，该筛选法应用本发明受体蛋白或它们的盐、或其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐。
更具体地，本发明提供(3)一种筛选方法，其筛选能促进本发明多肽或其酰胺或酯或它们的盐、或其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐以及本发明受体蛋白或它们的盐、或受体蛋白的部分肽或其酰胺或酯或它们的盐的功能(例如，细胞刺激活性或促生长激素抑制素分泌调节活性等)的化合物或其盐(下文通常简称为促进剂)，或者其筛选能抑制本发明多肽或其酰胺或酯或它们的盐、或其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐，还有本发明受体蛋白或它们的盐、或受体蛋白的部分肽或其酰胺或酯或它们的盐的功能(例如，细胞刺激活性或促生长激素抑制素分泌调节活性等)的化合物(下文通常简称为抑制剂)，其特征为，该筛选法应用本发明多肽或其酰胺或酯或它们的盐、其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐以及本发明受体蛋白或它们的盐、受体蛋白的部分肽或其酰胺或酯或它们的盐(具体地，含有与SEQ ID NO37所示氨基酸序列相同或基本相同序列的蛋白质或其盐、其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐)；本发明还提供(4)一种筛选方法，该法筛选能促进本发明多肽或其酰胺或酯或它们的盐、其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐以及本发明受体蛋白或它们的盐、受体蛋白的部分肽或其酰胺或酯或它们的盐的功能(例如，细胞刺激活性或促生长激素抑制素分泌调节活性等)的化合物或其盐(下文通常简称为促进剂)，或者其筛选能抑制本发明多肽或其酰胺或酯或它们的盐、其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐，或本发明受体蛋白或它们的盐、受体蛋白的部分肽或其酰胺或酯或它们的盐的功能(例如，细胞刺激活性或促生长激素抑制素分泌调节活性等)的化合物(下文通常简称为抑制剂)，其特征为，该筛选法(i)当使本发明受体蛋白或它们的盐、其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐(具体地，含有与SEQ ID NO37所示氨基酸序列相同或基本相同序列的蛋白质或其盐、或其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐)与本发明多肽或其酰胺或酯或它们的盐、其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐接触时，和(ii)当使本发明受体蛋白或它们的盐、其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐(具体地，含有与SEQ ID NO37所示氨基酸序列相同或基本相同序列的蛋白质或其盐、其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐)及待测化合物与本发明多肽或其酰胺或酯或它们的盐、其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐接触时，测定并比较本发明多肽或其酰胺或酯或它们的盐、其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐的活性。
具体地，所述筛选法的特征为，在(i)和(ii)的情况下，测定并比较本发明多肽及待测化合物的细胞刺激活性或本发明多肽及待测化合物对本发明受体蛋白的结合量。
本发明多肽的细胞刺激活性的测定可以根据公知的方法，例如在Dockray，G.J.等，自然，305，328-330，1983，Fukusumi，S.，等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，232，157-163，1977，Hinuma，S.，等，自然，393，272-276，1998，Tatemoto，K.，et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.，251，471-476，1998上报道的方法或其改良法。
本发明多肽及待测化合物对本发明受体蛋白的结合量的测定根据随后所述[对本发明受体蛋白的配体(激动剂)的测定]的方法改良后实施。
待测化合物包括肽、蛋白、非肽化合物、合成的化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液等，新化合物或已知化合物均可。
为了实施本筛选方法，首先将本发明多肽悬浮于适合筛选的缓冲液中制成本发明多肽的标本。缓冲液只要不干扰本发明多肽与本发明受体蛋白的反应，可为pH约为4-10(优选pH约6-8)的任何缓冲液如磷酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液等。
例如，一种化合物在上述(ii)中使细胞刺激活性比(i)中增加约至少20％，优选至少30％，更优选至少约50％时，该化合物可以选为促进本发明多肽的细胞刺激活性的化合物，另一方面，当一种待测化合物在上述(iii)中使本发明多肽的细胞刺激活性与(i)相比时，抑制至少约20％，优选至少30％，更优选至少约50％时，该化合物可以作为抑制本发明多肽的细胞刺激活性的化合物。
又，在实施这些实验之前，根据随后所述的[对本发明受体蛋白的配体(激动剂)的测定]中的方法①-③或其改良法检查待测化合物对本发明受体蛋白的结合能力，优选的待测化合物是已经被确认同本发明受体蛋白结合的化合物。
判断该待测化合物或其盐是否能促进或抑制本发明多肽的活性的一个指标，是抑制本发明受体蛋白与已标记的本发明多肽或其部分肽之间结合的活性。例如，如同在Hosoya，M.et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.，194(1)，133-143，1993所述的结合实验体系中，待测化合物在1×102M或以下的浓度抑制标记化合物的结合达至少10％，就很可能是促进或抑制本发明多肽的活性的化合物或其盐。但是，结合抑制活性是以标记化合物的结合为基础而测定的相对值，因此该活性并非判断该化合物是促进或抑制本发明多肽的活性的化合物或其盐所必需的条件。
用于本发明的筛选试剂盒包含本发明多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐。优选本发明的筛选试剂盒还包含针对本发明多肽、或其酰胺或酯或它们的盐，或部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐的受体，即本发明的受体蛋白或它们的盐，其部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐(具体地，含有与SEQ ID NO37所示氨基酸序列相同或基本相同的序列的蛋白质或其盐，其部分肽、或其酰胺或酯或它们的盐)。
用于本发明筛选试剂盒可包括。
1.筛选试剂①用于分析和洗涤的缓冲液加有0.05％牛血清白蛋白(Sigma公司)的Hanks’平衡盐溶液(Gibco公司生产)。
溶液用0.45μm的滤膜过滤除菌，储存于4℃。或者，溶液可以在用时制备。
②受体制剂以5×105细胞/孔的密度，将表达本发明受体蛋白的CHO细胞在12孔板上，在含5％CO2和95％空气的环境中于37℃培养两天。
③标记的配体用市售[3H]、[125I]、[14C]或[35S]标记本发明多肽、或其酰胺或酯，或其部分肽、或其酰胺或酯。产物以水溶液状态保存于4℃或-20℃，使用时用分析缓冲液稀释为1μM。
④配体标准液将本发明多肽、或其酰胺或酯，或其部分肽、或其酰胺或酯用含有0.1％牛血清白蛋白(Sigma公司)的PBS溶解为1mM，于-20℃保存。
2.测定方法①用于表达本发明受体蛋白的CHO细胞在12孔板上进行培养。在用1ml的分析缓冲液洗涤2次后，每孔加入490μl该分析缓冲液。
②在加入5μl的10-3-10-10M待测化合物后，向所述系统中加5μl的标记配体，得到的混合液在室温保温1小时。为了测定非特异结合，在所述系统中加5μl的10-3M配体，而不是待测化合物。
③去除孔中的反应混合液，将培养孔洗涤3遍，每次均用1ml的洗涤缓冲液。用0.2N NaOH-1％SDS溶解与细胞结合的标记配体，然后与4ml的液闪剂A(和光纯药生产)混合。
④用液闪计数器(Beckman公司生产)测定放射性，PMB(相对子最大结合的百分比)用下列[公式1]求出。PMB＝[(B-NSB)/(B0-NSB)]×100PMB最大结合百分率B 加样时的值NSB非特异结合B0最大结合通过本发明筛选法或用本发明筛选试剂盒而获得的化合物或其盐选自上述待测化合物，例如从肽、蛋白、非肽化合物、合成的化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液、血浆等，以及能促进或抑制本发明多肽的功能(例如，细胞刺激活性或促生长激素抑制素分泌调节活性等)的化合物。
其中该化合物的盐可类似于所述本发明多肽的盐。
通过本发明筛选法或用本发明筛选试剂盒而获得的化合物用作上述预防与治疗药物时，可以依照常规方法制备。例如，所述化合物或其盐可以如含有所述本发明多肽的药用组合物一样，制成片剂、胶囊、酏剂、微胶囊、无菌液、悬浮剂等。
由于如此所获制剂安全、低毒，因此可用于人或其它温血动物(例如，小鼠、大鼠、兔子、绵羊、猪、牛、马、鸡、猫、狗、猴等)。
该化合物或其盐的剂量依赖于其活性、病症、受试者和给药方法等而异；将促进本发明多肽功能的化合物经口服给药时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天。在非胃肠道给药时，单位剂量依赖于给药受体、症状等而变，如将促进本发明多肽功能的化合物以静脉注射的形式给药时，通常成人(体重60kg)的剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
另一方面，将抑制本发明多肽功能的化合物经口服给药时，一般成人(体重60kg)的正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天。在非胃肠道给药时，单位剂量依赖于给药受体、症状等而变，如将抑制本发明多肽功能的化合物以针剂的形式给药时，通常成人(体重60kg)的剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
(3)本发明多肽、或其酰胺或酯或它们的盐、其部分肽或其酰胺或酯或它们的盐以及本发明受体蛋白或它们的盐或者它的部分肽或其酰胺或酯或它们的盐的定量针对本发明多肽或本发明受体蛋白的抗体(下文通常简称为本发明抗体)能特异性识别本发明的多肽或受体蛋白，因此可用于定量测试样品溶液中的本发明多肽或受体蛋白，尤其是通过夹心免疫分析进行定量。因此，本发明提供了下述的定量方法(i)一种定量待测样品液中本发明多肽或本发明受体蛋白的方法，其包括，使本发明的抗体与待测样品液以及标记的本发明多肽或本发明受体蛋白进行竞争反应，测定与该抗体结合的本发明标记性多肽或本发明受体蛋白的比率；和，(ii)一种定量待测样品液中本发明多肽或本发明受体蛋白的方法，其包括，同时或先后使所述待测样品液与固定在不溶性载体上的本发明抗体以及标记的本发明其它抗体反应，测定不溶性载体上标记试剂的活性。
在上述方法(ii)中，优选一种抗体能识别本发明多肽或本发明受体蛋白的N-末端区域，而另一抗体能识别本发明多肽或本发明受体蛋白的C-末端区域。
针对本发明多肽或本发明受体蛋白的单克隆抗体可用于定量本发明多肽或本发明受体蛋白。此外，也可通过组织染色来检测本发明多肽或本发明受体蛋白。为此，可用抗体本身或使用抗体分子的F(ab’)2、Fab’或Fab片段。
对使用本发明多肽或本发明受体蛋白的抗体进行的定量方法没有特别的限制；可以使用任何方法，只要它涉及以下方法，即根据待测样品液中相应抗原含量(例如多肽的量)，用化学或物理方法检测抗体、抗原或抗体-抗原复合物的量，然后根据含已知量抗原的标准溶液制备的标准曲线来计算。优选的方法为，例如比浊法(nephrometry)、竞争法、免疫测定法(immunometric)和夹心法；就敏感性和特异性而言，特别优选后面将要描述的夹心法。
用于分析方法的标记试剂的例子为放射性同位素、酶、荧光物质和化学发光物质等。同位素的例子包括[125I]、[131I]、[3H]、[14C]等。优选酶的例子为稳定、具有高比活的酶，包括β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶。荧光物质的例子包括荧光胺、异硫氰酸荧光素等。化学发光物质的例子包括鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、硝酸双-N-甲基吖啶等。此外，也可使用生物素-链霉素系统来对抗原或抗体标记。
在固定抗原或抗体时，可以使用物理吸附。作为替代方法，也使用传统上来固定蛋白或酶的化学结合。载体的例子包括，不溶性多糖如琼脂糖、葡聚糖和纤维素；合成树脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、硅；或玻璃等。
在夹心法中，待测样品溶液与本发明的固定化单克隆抗体反应(第一反应)，然后与本发明的标记的其它单克隆抗体反应(第二反应)，测定不溶性载体上的标记试剂活性，由此可以测定待测样品中本发明多肽的量或本发明受体蛋白的量。第一和第二反应可以以相反次序进行，或同时或有间隔的先后进行。标记试剂的类型和固定的方法同上述的相同。在夹心法免疫分析中，标记抗体和固相抗体未必是一种类型或一个种类的抗体，也可使用两或多种抗体的混合物来改善测定的灵敏度等。
在根据本发明的夹心方法测定本发明多肽或本发明受体蛋白时，优选用于第一和第二反应的单克隆抗体与本发明多肽或本发明受体蛋白的结合位点彼此不同。因此，在第一和第二反应用的抗体为，当第二反应的抗体识别本发明多肽或本发明受体蛋白的C端区域时，优选在第一反应中使用能识别除C端区域以外的位点，如N端区域的抗体。
本发明的单克隆抗体可用于除夹心法以外的其它分析方法，例如竞争法、免疫测定法和比浊法。
在竞争法中，待测溶液中的抗原和标记抗原竞争与抗体反应，然后将未反应的标记抗原(F)及结合于抗体的标记抗原(B)分离(即B/F分离)，测定B或F的标记量，从而可以测定待测溶液中的抗原量。在此类方法的反应中，有一种液相方法和一种固相方法，前者使用可溶性抗体，加入针对第一抗体的第二抗体后，用聚乙二醇来有效分离B/F；后者可用固定的抗体作为第一抗体，或用可溶性抗体作为第一抗体但第二抗体为固相抗体。
在免疫测定法中，待测溶液中的抗原和固相抗原竞争性地与给定量的标记抗体反应，然后使液相与固相分离；或待测溶液中的抗原与过量标记抗体反应，然后加入固相抗原，使未反应的标记抗体与该固相结合，然后使液相与固相分离。随后，测定两相的标记量，来测定待测溶液中的抗原量。
在比浊法中，测定抗原-抗体在凝胶或溶液中反应产生的不溶性沉淀的量。即使待测溶液中抗原量很少且仅获得小量的沉淀，利用激光散射的激光比浊法(nephrometry)也可以实施。
本发明应用这些免疫分析方法中任何一个进行分析时，不需要任何特殊条件和操作。除了每种方法的常规条件和操作外，本领域技术人员可构建测定本发明多肽的分析系统。所述常规技术的细节，参见如入江宽(编)“放射免疫分析”(1974，讲谈社，日本)；入江宽(编)“放射免疫分析，续编”(1979，讲谈社，日本)；石川荣治等(编)“酶免疫分析”(医学书院，1978)；石川荣治等(编)“酶免疫分析，第二版”(医学书院，1982)；石川荣治等(编)“酶免疫分析，第三版”(医学书院，1987)；“酶学方法”卷70(免疫化学技术(A))；同上，卷73(免疫化学技术(B))；同上，卷74(免疫化学技术(C))；同上，卷84(免疫化学技术(D选择性免疫分析))；同上，卷92(免疫化学技术(E单克隆抗体及普通免疫分析方法))；同上，卷121(免疫化学技术(I杂交瘤技术及单克隆抗体))(Academic Press出版)等)。
如上所述，使用本发明的抗体可高度敏感地定量本发明多肽或本发明受体蛋白。
此外，使用本发明的抗体可定量本发明多肽或本发明受体蛋白的浓度，从而当检出本发明多肽或本发明受体蛋白浓度的增加或减少时，能够诊断出如下各种疾病或者将来对这些疾病的高度易感性高血压、自身免疫疾病、心功能不全、白内障、青光眼、急性细菌性脑膜炎、急性心肌梗塞、急性胰腺炎、急性病毒性脑炎、成人呼吸窘迫综合征、酒精性肝炎、阿尔茨海默氏病、哮喘、动脉硬化、特应性皮炎、细菌性肺炎、膀胱癌、骨折、乳腺癌、贪食症、食多症、烧伤、宫颈癌、慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病、慢性胰腺炎、肝硬化、大肠癌(结肠癌/直肠癌)、克罗恩氏病、痴呆、糖尿病并发症、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病、胃炎、幽门螺杆菌感染、肝功能不全、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、肝炎、单纯疱疹病毒感染、水痘带状疱疹病毒感染、何杰金氏病、爱滋病、人乳头状瘤病毒感染、高钙血症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、传染病、流行性感冒、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、侵入性葡萄球菌感染、恶性黑色素瘤、癌转移、多发性骨髓瘤、过敏性鼻炎、肾炎、非何杰金氏性淋巴瘤、胰岛素非依赖型糖尿病(II型)、非小细胞肺癌、器官移植、骨关节炎、骨软化、骨质稀少、骨质疏松、卵巢癌、骨贝切特氏病、消化性溃疡、末梢血管疾病、前列腺癌、反流性食管炎、肾功能不全、类风湿性关节炎、精神分裂症、败血病、败血性休克、重度全身性真菌感染、小细胞肺癌、脊髓损伤、胃癌、系统性红斑狼疮、暂时性脑缺血、结核、心瓣膜闭锁不全、血管性多发梗塞痴呆、外伤、失眠、关节炎、垂体激素分泌功能不全、尿频、尿毒症、或者神经性疾病等。
当检出本发明多肽或本发明受体蛋白浓度的增加或减少时，还可以诊断出囊状黄斑浮肿等疾病、或者将来对这类病的高度易感性。
由于本发明多肽、本发明受体蛋白以及本发明DNA与促生长激素抑制激素的分泌调节有关，当检出本发明多肽或本发明受体蛋白浓度的增加或减少时，可进一步诊断出以下各种疾病或对这类病的高度易感性，疾病如下(1)肢端肥大症、产TSH肿瘤、非分泌性(非功能性)垂体肿瘤、产异位性ACTH肿瘤、髓样甲状腺癌、产VIP肿瘤、产高血糖素肿瘤、产促胃液素肿瘤、胰岛细胞瘤、类癌瘤等；(2)胰岛素依赖性或非依赖性糖尿病、或者与这些糖尿病有关的各种疾病，即糖尿病并发症(如糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经功能障碍、Down′s综合征、体位性低血压病等)；(3)因改善高胰岛素血症或抑制食欲导致的肥胖症、贪食症等；(4)急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺瘘·肠瘘、出血性溃疡、消化性溃疡、胃炎、胃酸过多、反流性食管炎等；(5)幽门螺杆菌感染引起的多种症状；(6)伴随着内窥镜胆道胰管照影而产生的淀粉酶的过渡分泌；(7)由小肠吸收能力低下、分泌亢进或消化管运动能力异常引起的腹泻(如短肠道综合征等)、癌症化疗等引起的腹泻、先天性小肠萎缩引起的腹泻、产VIP肿瘤等神经内分泌肿瘤引起的腹泻、AIDS引起的腹泻、骨髓移植后的移植物抗宿主反应引起的腹泻、糖尿病引起的腹泻、腹腔神经丛损伤引起的腹泻、全身性硬化引起的腹泻、嗜酸性粒细胞增多引起的腹泻等；(8)倾倒综合征、过敏性肠炎、克罗氏病、炎性肠疾患等；(9)肿瘤或癌(例，甲状腺癌、大肠癌、乳腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、胆管癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、恶性褐色细胞瘤、神经母细胞瘤、脑肿瘤、胸腺瘤、肾癌等)、白血病(如，嗜碱性粒细胞白血病、慢性淋巴白血病、慢性骨髓白血病、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴肿瘤等)；(10)肥大性心肌病、动脉硬化、心瓣膜疾病、心肌梗塞(尤其是经皮肤经血管冠状动脉成形术后的心肌梗塞)；(11)食道静脉癌出血、肝硬化、末梢血管疾病；(12)全身或局部炎症的伴随疾病(例如，多发性动脉炎、类风湿性关节炎、牛皮癣、晒伤、湿疹、过敏(例如哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎)等)；(13)痴呆症(如阿尔茨海默氏病、阿耳茨海默氏型老年性痴呆、血管性·多发性痴呆等)、精神分裂症、癫痫、抑郁症、焦虑症、睡眠障碍、多发性硬化等；(14)眼部疾病(如，青光眼等)；(15)急性细菌性脑膜炎、急性病毒性脑炎、成人呼吸窘迫综合征、细菌性肺炎、重度全身性真菌感染、结核、脊髓损伤、骨折、肝功能不全、肺炎、酒精性肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、AIDS、人乳头状瘤病毒感染、流行性感冒、癌转移、多发性骨髓瘤、骨软化、骨质疏松、骨贝切特氏病、肾炎、肾功能不全、败血病、败血性休克、高钙血症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、系统性红斑狼疮、暂时性脑缺血发作、酒精性肝炎等；(16)器官移植、烧伤、外伤、脱发等；(17)慢性或急性疼痛(例如，术后疼痛、炎症性疼痛、牙痛、骨疾病(如，关节炎、类风湿、骨质疏松等)的伴随疼痛)等。
本发明抗体可用于检出体液或者组织等待检标本液中存在的本发明多肽或本发明受体蛋白。又可用于抗体柱的制作，该抗体柱可用于纯化本发明多肽或本发明受体蛋白；检出各纯化组分中的本发明多肽或本发明受体蛋白；对被检细胞内本发明多肽的行踪进行分析等。
(4)基因诊断制剂例如，本发明的DNA作为一种探针可以检出人或温血动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、鸡、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴等)中编码本发明多肽或本发明受体蛋白的DNA或mRNA的异常(基因异常)，因此，本发明的DNA可用作基因诊断制剂，用于诊断DNA或mRNA的损伤、突变，或其表达量的减少、表达量的增加或DNA或mRNA的过表达。
上述基因诊断通过使用编码本发明多肽或本发明受体蛋白等的DNA，用众所周知的Northern杂交分析或PCR-SSCP分析来完成(Genomics，5，874-879(1989)；美国科学院学报，86，2766-2770(1989))。
例如，当用Northern杂交分析检出表达量的减少或者过多时，能够诊断出如下各种疾病或对这些疾病的高度易感性高血压、自身免疫疾病、心功能不全、白内障、青光眼、急性细菌性脑膜炎、急性心肌梗塞、急性胰腺炎、急性病毒性脑炎、成人呼吸窘迫综合征、酒精性肝炎、阿尔茨海默氏病、哮喘、动脉硬化、特应性皮炎、细菌性肺炎、膀胱癌、骨折、乳腺癌、贪食症、食多症、烧伤、宫颈癌、慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病、慢性胰腺炎、肝硬化、大肠癌(结肠癌/直肠癌)、克罗恩氏病、痴呆、糖尿病并发症、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病、胃炎、幽门螺杆菌感染、肝功能不全、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、肝炎、单纯疱疹病毒感染、水痘带状疱疹病毒感染、何杰金氏病、爱滋病、人乳头状瘤病毒感染、高钙血症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、传染病、流行性感冒、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、侵入性葡萄球菌感染、恶性黑色素瘤、癌转移、多发性骨髓瘤、过敏性鼻炎、肾炎、非何杰金氏性淋巴瘤、胰岛素非依赖型糖尿病(II型)、非小细胞肺癌、器官移植、骨关节炎、骨软化、骨质稀少、骨质疏松、卵巢癌、骨贝切特氏病、消化性溃疡、末梢血管疾病、前列腺癌、反流性食管炎、肾功能不全、类风湿性关节炎、精神分裂症、败血病、败血性休克、重度全身性真菌感染、小细胞肺癌、脊髓损伤、胃癌、系统性红斑狼疮、暂时性脑缺血、结核、心瓣膜闭锁不全、血管性多发梗塞痴呆、外伤、失眠、关节炎、垂体激素分泌功能不全、尿频、尿毒症、或者神经性疾病等。
当用Northern杂交分析检出表达量的减少或者过多时，还可以诊断出囊状黄斑浮肿等疾病、或者对这些疾病的高度易感性。
由于本发明多肽、本发明受体蛋白以及本发明DNA与促生长激素抑制激素的分泌调节有关，当用Northern杂交分析检出表达量的减少或者过多时，进一步诊断出以下各种疾病或对这些疾病的高度易感性，疾病如下(1)肢端肥大症、产TSH肿瘤、非分泌性(非功能性)垂体肿瘤、产异位性ACTH肿瘤、髓样甲状腺癌、产VIP肿瘤、产高血糖素肿瘤、产促胃液素肿瘤、胰岛细胞瘤、类癌瘤等；(2)胰岛素依赖性或非依赖性糖尿病、或者与这些糖尿病有关的各种疾病，即糖尿病并发症(如糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经功能障碍、Down′s综合征、体位性低血压病等)；(3)因改善高胰岛素血症或抑制食欲导致的肥胖症、贪食症等；(4)急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺瘘、肠瘘、出血性溃疡、消化性溃疡、胃炎、胃酸过多、反流性食管炎等；(5)幽门螺杆菌感染引起的多种症状；(6)伴随着内窥镜胆道胰管照影而产生的淀粉酶的过渡分泌；(7)由小肠吸收能力低下、分泌亢进或消化管运动能力异常引起的腹泻(如短肠道综合征等)、癌症化疗等引起的腹泻、先天性小肠萎缩引起的腹泻、产VIP肿瘤等神经内分泌肿瘤引起的腹泻、AIDS引起的腹泻、骨髓移植后的移植物抗宿主反应引起的腹泻、糖尿病引起的腹泻、腹腔神经丛损伤引起的腹泻、全身性硬化引起的腹泻、嗜酸性粒细胞增多引起的腹泻等；(8)倾倒综合征、过敏性肠炎、克罗氏病、炎性肠疾患等；(9)肿瘤或癌(例，甲状腺癌、大肠癌、乳腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、胆管癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、恶性褐色细胞瘤、神经母细胞瘤、脑肿瘤、胸腺瘤、肾癌等)、白血病(如，嗜碱性粒细胞白血病、慢性淋巴白血病、慢性骨髓白血病、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴肿瘤等)；(10)肥大性心肌病、动脉硬化、心瓣膜疾病、心肌梗塞(尤其是经皮肤经血管冠状动脉成形术后的心肌梗塞)；(11)食道静脉癌出血、肝硬化、末梢血管疾病；(12)全身或局部炎症的伴随疾病(例如，多发性动脉炎、类风湿性关节炎、牛皮癣、晒伤、湿疹、过敏(例如哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎)等)；(13)痴呆症(如阿尔茨海默氏病、阿耳茨海默氏型老年性痴呆、血管性·多发性痴呆等)、精神分裂症、癫痫、抑郁症、焦虑症、睡眠障碍、多发性硬化等；(14)眼部疾病(如，青光眼等)；(15)急性细菌性脑膜炎、急性病毒性脑炎、成人呼吸窘迫综合征、细菌性肺炎、重度全身性真菌感染、结核、脊髓损伤、骨折、肝功能不全、肺炎、酒精性肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、AIDS、人乳头状瘤病毒感染、流行性感冒、癌转移、多发性骨髓瘤、骨软化、骨质疏松、骨贝切特氏病、肾炎、肾功能不全、败血病、败血性休克、高钙血症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、系统性红斑狼疮、暂时性脑缺血发作、酒精性肝炎等；(16)器官移植、烧伤、外伤、脱发等；(17)慢性或急性疼痛(例如，术后疼痛、炎症性疼痛、牙痛、骨疾病(如，关节炎、类风湿、骨质疏松等)的伴随疼痛)等。
(5)含有反义DNA的药用组合物反义DNA能与本发明DNA互补地结合并抑制该DNA的表达，因此反义DNA可用作治疗或预防以下各种疾病的药物例如，高血压、自身免疫疾病、心功能不全、白内障、青光眼、急性细菌性脑膜炎、急性心肌梗塞、急性胰腺炎、急性病毒性脑炎、成人呼吸窘迫综合征、酒精性肝炎、阿尔茨海默氏病、哮喘、动脉硬化、特应性皮炎、细菌性肺炎、膀胱癌、骨折、乳腺癌、贪食症、食多症、烧伤、宫颈癌、慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病、慢性胰腺炎、肝硬化、大肠癌(结肠癌/直肠癌)、克罗恩氏病、痴呆、糖尿病并发症、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病、胃炎、幽门螺杆菌感染、肝功能不全、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、肝炎、单纯疱疹病毒感染、水痘带状疱疹病毒感染、何杰金氏病、爱滋病、人乳头状瘤病毒感染、高钙血症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、传染病、流行性感冒、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、侵入性葡萄球菌感染、恶性黑色素瘤、癌转移、多发性骨髓瘤、过敏性鼻炎、肾炎、非何杰金氏性淋巴瘤、胰岛素非依赖型糖尿病(II型)、非小细胞肺癌、器官移植、骨关节炎、骨软化、骨质稀少、骨质疏松、卵巢癌、骨贝切特氏病、消化性溃疡、末梢血管疾病、前列腺癌、反流性食管炎、肾功能不全、类风湿性关节炎、精神分裂症、败血病、败血性休克、重度全身性真菌感染、小细胞肺癌、脊髓损伤、胃癌、系统性红斑狼疮、暂时性脑缺血、结核、心瓣膜闭锁不全、血管性多发梗塞痴呆、外伤、失眠、关节炎、垂体激素分泌功能不全、尿频、尿毒症、或者神经性疾病等。
反义DNA能与本发明DNA互补地结合并抑制该DNA的表达，因此反义DNA还可以用作囊状黄斑浮肿等疾病的治疗或预防的药物。
由于本发明多肽、本发明受体蛋白以及本发明DNA与促生长激素抑制激素的分泌调节有关，反义DNA能与本发明DNA互补地结合并抑制该DNA的表达，因此反义DNA还可以作为药物用于(1)治疗肢端肥大症、产TSH肿瘤、非分泌性(非功能性)垂体肿瘤、产异位性ACTH(促肾上腺皮质激素)肿瘤、髓样甲状腺癌、产VIP肿瘤、产高血糖素肿瘤、产促胃液素肿瘤、胰岛细胞瘤、类癌瘤等；(2)治疗胰岛素依赖型或非依赖型糖尿病、或者与这些糖尿病有关的各种疾病，即糖尿病并发症(如糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经功能障碍、Down′s综合征、体位性低血压病等)；(3)治疗因改善高胰岛素血症或抑制食欲引起的肥胖症、贪食症等；(4)治疗急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺瘘、肠瘘、出血性溃疡、消化性溃疡、胃炎、胃酸过多、反流性食管炎等；(5)缓解伴随着幽门螺杆菌感染引起的各种疾病(例如，促胃液素分泌亢进的抑制药物等)；(6)抑制内窥镜胆道胰管照影所致淀粉酶的分泌，以及胰腺手术预后治疗；(7)由小肠吸收能力低下、分泌亢进或消化管运动能力异常引起的腹泻(如短肠道综合征等)、癌症化疗等引起的腹泻、先天性小肠萎缩引起的腹泻、由产VIP肿瘤等神经内分泌肿瘤引起的腹泻、AIDS引起的腹泻、骨髓移植后的移植物抗宿主反应引起的腹泻、糖尿病引起的腹泻、腹腔神经丛损伤引起的腹泻、全身性硬化引起的腹泻、嗜酸性粒细胞增多引起的腹泻等；(8)治疗倾倒综合征、过敏性肠炎、克罗氏病、炎性肠疾患等；(9)治疗肿瘤或癌(例，甲状腺癌、大肠癌、乳腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、胆管癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、恶性褐色细胞瘤、神经母细胞瘤、脑肿瘤、胸腺瘤、肾癌等)、白血病(如，嗜碱粒细胞白血病、慢性淋巴白血病、慢性髓样白血病、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤等)；以上这些药物可以单独或与其它治癌药物(他莫昔芬、LHRH激动剂、LHRH拮抗剂、IFN-α、β及γ、IL-2等)合用；(10)预防和治疗肥大性心肌病、动脉硬化、心瓣膜疾病、心肌梗塞(尤其是穿皮穿血管冠状动脉成形术后的心肌梗塞)、或血管再生；(11)治疗食道静脉癌出血、肝硬化、末梢血管疾病；(12)治疗因对作用于免疫系统的生理活性物质(例如，物质P、速激肽、细胞因子等)的分泌进行调节而伴有的疾病，例如全身或局部炎症(如多发性动脉炎、类风湿性关节炎、牛皮藓、晒伤、湿疹、过敏反应(例如哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎)等)；(13)对影响神经调节因子的产生与分泌的疾病进行治疗，例如痴呆症(如阿尔茨海默氏病、阿耳茨海默氏型老年性痴呆、血管性·多发性痴呆等)、精神分裂症、癫痫、抑郁症、焦虑症、睡眠障碍、多发性硬化等；(14)治疗眼部疾病(如，青光眼等)；(15)预防和治疗急性细菌性脑膜炎、急性病毒性脑炎、成人呼吸窘迫综合征、细菌性肺炎、重度全身性真菌感染、结核、脊髓损伤、骨折、肝功能不全、肺炎、酒精性肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、AIDS、人乳头状瘤病毒感染、流行性感冒、癌转移、多发性骨髓瘤、骨软化、骨质疏松、骨贝切特氏病、肾炎、肾功能不全、败血病、败血性休克、高钙血症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、系统性红斑狼疮、暂时性脑缺血发作、酒精性肝炎等；(16)使器官移植、烧伤、外伤、脱发等康复；(17)作为镇痛剂用于抑制或缓解慢或急性疼痛(例如，术后疼痛、炎症性疼痛、牙痛、骨疾病(如，关节炎、类风湿、骨质疏松等)的疼痛)。
当将所述反义DNA用作上述各种疾病的治疗或预防药物时，同前所述含有本发明DNA的各种疾病的治疗或预防药物一样可以实施。
例如，当反义DNA用作上述预防/治疗药物时，反义DNA可单独使用，或插入合适载体如反转录病毒载体、腺病毒载体或腺伴随病毒载体后按常规方法给药。该反义DNA可以以裸露DNA的形式给药，或与佐剂一起给药以便于其被基因枪摄入或通过含有水凝胶的导管。
该反义DNA也可以用作诊断用寡核苷酸探针，其目的是检查组织或细胞中是否有本发明DNA的存在或者该DNA的表达。
(6)含有本发明抗体的药用组合物本发明抗体具有中和本发明多肽或本发明受体蛋白活性的作用，该抗体可用作治疗或预防以下各种疾病的药物例如，高血压、自身免疫疾病、心功能不全、白内障、青光眼、急性细菌性脑膜炎、急性心肌梗塞、急性胰腺炎、急性病毒性脑炎、成人呼吸窘迫综合征、酒精性肝炎、阿尔茨海默氏病、哮喘、动脉硬化、特应性皮炎、细菌性肺炎、膀胱癌、骨折、乳腺癌、贪食症、食多症、烧伤、宫颈癌、慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病、慢性胰腺炎、肝硬化、大肠癌(结肠癌/直肠癌)、克罗恩氏病、痴呆、糖尿病并发症、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病、胃炎、幽门螺杆菌感染、肝功能不全、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、肝炎、单纯疱疹病毒感染、水痘带状疱疹病毒感染、何杰金氏病、爱滋病、人乳头状瘤病毒感染、高钙血症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、传染病、流行性感冒、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、侵入性葡萄球菌感染、恶性黑色素瘤、癌转移、多发性骨髓瘤、过敏性鼻炎、肾炎、非何杰金氏性淋巴瘤、胰岛素非依赖型糖尿病(II型)、非小细胞肺癌、器官移植、骨关节炎、骨软化、骨质稀少、骨质疏松、卵巢癌、骨贝切特氏病、消化性溃疡、末梢血管疾病、前列腺癌、反流性食管炎、肾功能不全、类风湿性关节炎、精神分裂症、败血病、败血性休克、重度全身性真菌感染、小细胞肺癌、脊髓损伤、胃癌、系统性红斑狼疮、暂时性脑缺血、结核、心瓣膜闭锁不全、血管性多发梗塞痴呆、外伤、失眠、关节炎、垂体激素分泌功能不全、尿频、尿毒症、或者神经性疾病等。
本发明抗体具有中和本发明多肽或本发明受体蛋白活性的作用，该抗体还可用作囊状黄斑浮肿等疾病的治疗或预防的药物。
由于本发明多肽或本发明受体蛋白与促生长激素抑制激素的分泌调节有关，而本发明抗体具有中和本发明多肽或本发明受体蛋白活性的作用，故该抗体还可作为药物用于(1)治疗肢端肥大症、产TSH肿瘤、非分泌性(非功能性)垂体肿瘤、产异位性ACTH(促肾上腺皮质激素)肿瘤、髓样甲状腺癌、产VIP肿瘤、产高血糖素肿瘤、产促胃液素肿瘤、胰岛细胞瘤、类癌瘤等；(2)治疗胰岛素依赖型或非依赖型糖尿病、或者与这些糖尿病有关的各种疾病，即糖尿病并发症(如糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经功能障碍、Down′s综合征、体位性低血压病等)；(3)治疗因改善高胰岛素血症或抑制食欲引起的肥胖症、贪食症等；(4)治疗急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺瘘、肠瘘、出血性溃疡、消化性溃疡、胃炎、胃酸过多、反流性食管炎等；(5)缓解伴随着幽门螺杆菌感染引起的各种疾病(例如，促胃液素分泌亢进的抑制药物等)；(6)抑制内窥镜胆道胰管照影所致淀粉酶的分泌，以及胰腺手术预后治疗；(7)由小肠吸收能力低下、分泌亢进或消化管运动能力异常引起的腹泻(如短肠道综合征等)、癌症化疗等引起的腹泻、先天性小肠萎缩引起的腹泻、由产VIP肿瘤等神经内分泌肿瘤引起的腹泻、AIDS引起的腹泻、骨髓移植后的移植物抗宿主反应引起的腹泻、糖尿病引起的腹泻、腹腔神经丛损伤引起的腹泻、全身性硬化引起的腹泻、嗜酸性粒细胞增多引起的腹泻等；(8)治疗倾倒综合征、过敏性肠炎、克罗氏病、炎性肠疾患等；(9)治疗肿瘤或癌(例，甲状腺癌、大肠癌、乳腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、胆管癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、恶性褐色细胞瘤、神经母细胞瘤、脑肿瘤、胸腺瘤、肾癌等)、白血病(如，嗜碱粒细胞白血病、慢性淋巴白血病、慢性髓样白血病、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤等)；以上这些药物可以单独或与其它治癌药物(他莫昔芬、LHRH激动剂、LHRH拮抗剂、IFN-α、β及γ、IL-2等)合用；(10)预防和治疗肥大性心肌病、动脉硬化、心瓣膜疾病、心肌梗塞(尤其是穿皮穿血管冠状动脉成形术后的心肌梗塞)、或血管再生；(11)治疗食道静脉癌出血、肝硬化、末梢血管疾病；(12)治疗因对作用于免疫系统的生理活性物质(例如，物质P、速激肽、细胞因子等)的分泌进行调节而伴有的疾病，例如全身或局部炎症(如多发性动脉炎、类风湿性关节炎、牛皮藓、晒伤、湿疹、过敏反应(例如哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎)等)；(13)对影响神经调节因子的产生与分泌的疾病进行治疗，例如痴呆症(如阿尔茨海默氏病、阿耳茨海默氏型老年性痴呆、血管性·多发性痴呆等)、精神分裂症、癫痫、抑郁症、焦虑症、睡眠障碍、多发性硬化等；(14)治疗眼部疾病(如，青光眼等)；(15)预防和治疗急性细菌性脑膜炎、急性病毒性脑炎、成人呼吸窘迫综合征、细菌性肺炎、重度全身性真菌感染、结核、脊髓损伤、骨折、肝功能不全、肺炎、酒精性肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、AIDS、人乳头状瘤病毒感染、流行性感冒、癌转移、多发性骨髓瘤、骨软化、骨质疏松、骨贝切特氏病、肾炎、肾功能不全、败血病、败血性休克、高钙血症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、系统性红斑狼疮、暂时性脑缺血发作、酒精性肝炎等；(16)使器官移植、烧伤、外伤、脱发等康复；(17)作为镇痛剂用于抑制或缓解慢或急性疼痛(例如，术后疼痛、炎症性疼痛、牙痛、骨疾病(如，关节炎、类风湿、骨质疏松等)的疼痛)。
上述各种疾病的治疗药物或预防药物含有本发明抗体，其可直接以原始液体制剂或在适当药物剂型中的药用组合物，对人或哺乳动物(例如，大鼠、兔子、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)经过口服或非口服形式给药。本发明抗体的剂量依赖于给药受体、症状和给药方法等而异；当用于治疗或预防成人神经疾病患者时，静脉注射的正常剂量为每天大约0.01-20mg/g体重，优选大约0.1-10mg/kg体重，更优选0.1-5mg/kg体重，一天1-5次，优选一天1-3次。其他非肠道给药或经口给药均依据此量。症状特别严重者根据其病症可以增加使用量。
本发明的抗体可以直接给药或者制成适当的药用组合物给药。所述药用组合物包含上述化合物或它们的盐和可药用载体、稀释剂或者赋形剂。这种组合物可以为适于经口或非肠道给药的剂型。
即，适于经口给药的组合物包括固体型制剂或液体型制剂，具体地有片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片剂)、丸剂、颗粒剂、粉剂、胶囊(包括软胶囊)、糖浆、乳剂、悬浮剂等。这种组合物可以通过公知的方法生产，其制剂通常包括制药领域常规使用的载体、稀释剂、赋形剂。例如用子片剂的载体或赋形剂有乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁等。
适于非胃肠道给药的组合物有针剂、栓剂等，针剂包含的剂型有静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等。这类注射剂根据公知方法，例如将所述抗体或它们的盐溶解、悬浮或者乳化于无菌水性溶液或无菌油性溶液而制备。注射用水溶液有生理盐水、包含葡萄糖及其它辅助制剂的等渗溶液，并还可以进一步与合适的助溶剂如醇(如乙醇)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇)、非离子表面活性剂(如聚山梨酸酯80TM和HCO-50(加氢的蓖麻油的聚氧乙烯(50ml)加成化合物)等结合使用。油性溶液有芝麻油和豆油，它们可与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用。由此制备的注射液一般装在合适的安瓿中。用于直肠给药的栓剂通过将所述抗体或它们的盐与一般的栓剂基质混合而制备。
上述口服或非口服的药用组合物，最好制成适合于活性成分投药剂量的用药剂型。其投药剂型包括，片剂、丸剂、胶囊、注射制剂(安瓿)、栓剂等，每个单位剂型通常含有上述抗体5-500mg，注射剂优选含5-100mg，其他制剂优选含有10-250mg。
此外，前面所述各种组合物也可含有其它活性成分，只要与上述抗体的结合不发生不利的相互作用。
(7)转基因动物本发明提供一种非人哺乳动物，其具有编码外源性本发明多肽或本发明受体蛋白的DNA(以下简称为本发明外源性DNA)或其DNA变体(通常简称为本发明外源性DNA变体)。
即，本发明提供(1)一种非人哺乳动物，其具有本发明外源性DNA或其DNA变体；(2)(1)中所述非人哺乳动物，其为啮齿动物；(3)(2)中所述啮齿动物，其为小鼠或大鼠；以及(4)一种重组载体，其含有本发明外源性DNA或其DNA变体，并能在哺乳动物中表达。
具有编码本发明外源性DNA或其DNA变体的非人哺乳动物(以下简称为本发明转基因动物)可如下产生将所需DNA转染至未受精卵、受精卵、精子以及含有相应原始细胞的胚细胞等，优选它们处于非人哺乳动物发育过程中胚胎发生期(更优选单细胞或受精卵细胞期，一般在8细胞期以前)，可用方法有磷酸钙法、电脉冲法、脂转染技术、凝集法、显微注射法、粒子枪法、DEAE-葡聚糖法等。可根据这些转基因法将本发明外源DNA转移至体细胞、活器官、组织细胞，对转化体进行组织培养或细胞培养。可以进一步地根据公知细胞融合法使这些细胞与所述胚细胞融合而产生本发明的转基因动物。
非人哺乳动物的例子有牛、猪、绵羊、山羊、兔子、狗、猫、豚鼠、仓鼠、小鼠、大鼠等，就构建人类疾病的动物模型而言，优选个体发育以及生命周期比较短，容易繁殖的啮齿动物，主要是小鼠(例如，其纯种系有C57B1/6系、DBA2系等；杂种系有B6C3F1系、BDF1系、B6D2F1系、BALB/c系、ICR系等)或大鼠(例如，Wistar，SD等)等。
能够在哺乳动物中进行表达的重组载体中的[哺乳动物]除了所述非人哺乳动物外还有人等。
所说本发明外源性DNA不是非人哺乳动物本来具有的DNA，而是指从哺乳动物中分离并提取的本发明DNA。
所述本发明的DNA变体包括因本发明原始DNA的碱基序列发生变异(例如，突变等)产生的DNA，具体地说，包括碱基添加、缺失、用其它碱基置换产生的DNA，还有异常DNA。
该异常DNA指表达异常的本发明多肽或本发明受体蛋白的DNA，例如，所述DNA表达的多肽可抑制本发明多肽或本发明受体蛋白的正常功能。
本发明外源性DNA可以来自任一哺乳动物，不论是与靶动物同种还是异种均可。当把本发明DNA转移至靶动物体中时，优选使用DNA构建体，其中使该DNA连接在能于该靶动物中表达该DNA的启动子下游。例如，转移本发明的人源DNA时，以高水平表达本发明DNA的转基因动物可如下制备选择携有与所述人源DNA高度同源的本发明DNA的非人哺乳动物靶，以及能在该靶动物中对来源于各种哺乳动物(如兔、狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠等)的DNA进行表达的各种启动子，将所述本发明人源DNA连接于所述各种启动子的下游形成DNA构建体(如载体等)，然后显微注射至所述靶动物的受精卵中。
本发明多肽的表达载体有大肠杆菌质粒、枯草杆菌质粒、酵母质粒、细菌噬菌体如λ噬菌体、反转录病毒如Moloney白血病病毒、动物病毒如痘苗病毒或杆状病毒。其中优选使用大肠杆菌质粒、枯草杆菌质粒、或酵母质粒。
进行上述DNA表达调节的启动子通常使用如下的启动子①来自病毒(如，人类猿病毒、巨细胞病毒、Moloney白血病病毒、JC病毒、乳腺癌病毒、脊髓灰质炎病毒等)DNA的启动子；②来自各种哺乳动物(人、兔子、狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠等)的启动子，例如下述蛋白启动子白蛋白、胰岛素II、尿空斑蛋白(uroplakin)II、弹性蛋白酶、促红细胞生成素、内皮素、肌酸激酶、胶质原纤维酸性蛋白、谷光甘肽S-转移酶、血小板衍生的生长因子β、角蛋白K1、K10以及K14、胶原蛋白I型及II型、cAMP依赖性蛋白激酶βI亚单位、肌营养不良蛋白、抗酒石酸碱性磷酸酶、心房利钠激素、内皮受体-酪氨酸激酶(缩写为Tie2)、Na/K-ATP酶、神经微丝轻链、金属硫蛋白I及IIA、金属蛋白酶1组织抑制剂、MHC I类抗原(H-2L)、H-ras、肾素、多巴胺β-羟化酶、甲状腺过氧化物酶(TPO)、多肽链延伸因子1α(EF-1α)、β-肌动蛋白、α及β-肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链1及2、髓磷脂基质蛋白、甲状腺球蛋白、Thy-1、免疫球蛋白、H链可变区(VNP)、血清淀粉样蛋白P成分、肌红蛋白、肌钙蛋白C、平滑肌、α-肌动蛋白、前脑啡肽原A、加压素等。其中最好使用能在全身高效表达的巨细胞病毒启动子、人多肽链延伸因子1α(EF-1α)启动子、人及家鸡β-肌动蛋白启动子等。
优选上述载体在转基因动物中有终止目标mRNA转录的序列(一般称为终止子)，例如，可以使用来自病毒以及各种哺乳动物的各种DNA的序列，优选使用类人猿病毒的SV40终止子。
此外，为了更进一步提高外源目标DNA的表达，可根据不同目的将各种DNA的剪接信号、增强子区、真核DNA内含子的一部分连接在该启动子区的5′上游、或启动子区和翻译区之间或翻译区的3′下游。
正常的、本发明多肽或本发明受体蛋白的翻译区可以从人或哺乳动物(例如，兔子、狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠等)的肝脏、肾脏、甲状腺细胞以及成纤维细胞的完整基因组DNA以及市售各种基因组DNA文库中获得，或者从肝脏、肾脏、甲状腺细胞或成纤维细胞的RNA按照公知方法合成其互补DNA，以此DNA为原料获得翻译区。外源异常DNA可使用经已知方法从人的成纤维细胞RNA制备的互补DNA获得。或者，可以通过定点诱变使从所述组织或细胞中得到的正常多肽翻译区发生变异。
该翻译区可以通过常规基因工程方法构建成能在转基因动物中进行表达的DNA构建体，其中将所述DNA连接至所述启动子下游，必要时还同时位于转录终止位点的上游。
在受精卵细胞阶段转移本发明外源DNA必须保证靶动物的所有胚细胞及体细胞中都存在该外源DNA。在转基因DNA之后产生的动物的胚细胞中所述本发明外源性DNA的存在表明该动物的所有后代均在其胚细胞及体细胞中本发明外源性DNA。继承了这种本发明外源性DNA的动物后代在其所有胚细胞及体细胞中应携有本发明外源性DNA。
已转移有正常的本发明外源性DNA的非人哺乳动物通过杂交证实该外源DNA的稳定维持后，可作为携有该DNA的动物在一般饲养环境下传代。
在本发明受精卵细胞阶段中外源DNA的转移必须保证靶动物的所有胚细胞及体细胞中都存在过量外源DNA。在转移DNA之后产生的动物胚细胞中所述本发明外源性DNA的过量存在指示产生的动物后代均在其所有胚细胞及体细胞中含有过量本发明外源性DNA。继承了这种本发明外源性DNA的动物后代在所有胚细胞及体细胞中应保持有过量的本发明外源性DNA。
通过获得一对同源染色体上都有导入的DNA的纯合体动物，再通过它们的雌雄动物杂交其所有的后代就可以维持过量的该DNA。
在具有正常本发明DNA的非人哺乳动物体内正常的本发明DNA高效表达，通过促进内源性正常DNA的功能最终将导致本发明多肽或本发明受体蛋白发生功能亢进病，这时，该动物可以作为这种疾病的病理模型动物使用。例如，使用本发明的正常DNA转基因动物，可以阐明本发明多肽或本发明受体蛋白发生功能亢进病症以及与本发明多肽或本发明受体蛋白有关的疾病的病理机制，研究这些疾病的治疗方法。
又，由于含有正常的本发明外来DNA的哺乳动物具有游离的本发明多肽或本发明受体蛋白增加症状，因此这种动物也可用于筛选与本发明多肽或本发明受体蛋白有关的疾病的治疗药物。
另一方面，具有异常的本发明外源性DNA的非人哺乳动物通过杂交确定外源性DNA的稳定维持之后，可以在一般饲养环境下传代。可通过将外源目标DNA重组到所述质粒中而将该DNA作为原料使用。带有启动子的DNA构建体可以通过一般DNA工程学方法制备而成。在受精卵细胞阶段中本发明的异常DNA的转基因必须保证靶动物的所有胚细胞及体细胞中都存在该异常DNA。在转基因DNA之后产生的动物的胚细胞中所述本发明异常DNA的存在表明该动物的所有后代均在其胚细胞及体细胞中保持本发明异常DNA。继承了这种本发明外源性DNA的动物后代在其所有胚细胞及体细胞中应携有本发明异常DNA。通过获得一对同源染色体上都有导入的DNA的纯合体动物，再通过它们的雌雄动物杂交，其所有的后代就可以维持该DNA。
由于具有本发明异常DNA的非人哺乳动物可使该异常DNA高效表达，通过抑制内在的正常DNA功能，最终将导致该动物发生本发明多肽或本发明受体蛋白的功能失活型不适应病症，因而该动物可作为相应疾病的模型动物使用。例如，使用本发明的异常DNA转基因动物，可以阐明本发明多肽或本发明受体蛋白的功能失活型不适应病症并研究这些疾病的治疗方法。
又，本发明异常DNA高效表达的转基因动物还可能用于阐明本发明多肽或本发明受体蛋白的功能失活型不适应病症中本发明异常多肽对正常多肽的功能的抑制(显性失活作用)作用。
由于携有本发明之异常外源DNA的哺乳动物中游离形式的本发明多肽或本发明受体蛋白增加，因此这类动物也可用于筛选本发明多肽或本发明受体蛋白的功能失活型不适应症的治疗药物。
上述2种转基因动物的其它可能应用包括①作为组织培养的细胞来源；②通过直接分析本发明转基因动物组织中的DNA或RNA，或者间接分析该DNA所表达的组织多肽，来阐述它们与被本发明多肽或本发明受体蛋白特异性表达或活化的多肽的关连性；③用标准组织培养技术培养的含有所述DNA的组织细胞，研究难以培养的组织中细胞的功能；④用上述③中细胞筛选能够提高该细胞功能的药物；
⑤分离纯化本发明多肽的变体并制备其抗体。
用本发明的转基因动物可以研究与本发明多肽或本发明受体蛋白有关的疾病的临床症状，其中包括本发明多肽或本发明受体蛋白的功能失活型不适应症，同时在与本发明多肽或本发明受体蛋白有关的疾病模型中还能得到各器官中更详细的病理学发现，从而开发新治疗方法，以及用于研究和治疗与该疾病相关的继发性疾病的方法。
从本发明转基因动物中取出各种器官，切碎后，用胰蛋白酶等蛋白酶分解可以得到游离的转基因细胞，然后建立培养细胞系。本发明的转基因动物还可用于鉴定能产生本发明多肽或受体蛋白的细胞，研究这些细胞的特殊性、其与细胞凋亡、分化或增殖的关系，或者这些特性中的信号传导机制，从而研究其中的任何异常性，因此本发明的转基因动物可以为研究本发明多肽或本发明受体蛋白并阐明其作用提供有用的研究材料。
为了利用本发明转DNA基因动物，开发与本发明多肽或本发明受体蛋白相关的疾病(包括本发明多肽或本发明受体蛋白的功能失活型不适应症)的治疗药物，可利用上述检查法以及定量法提供有效而快速的药物筛选法。还可利用本发明转基因动物或能表达本发明外源性DNA的载体，研究并开发与本发明多肽或本发明受体蛋白有关的疾病的基因治疗方法。
(8)基因敲除实验动物本发明提供携有无活性的本发明DNA的非人哺乳动物胚胎干细胞及在本发明DNA的表达中有缺陷的非人哺乳动物。
即，本发明提供(1)携有无活性的本发明DNA的非人哺乳动物胚胎干细胞；(2)第(1)所述胚胎干细胞，其中通过导入报道基因(例，大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因)使该DNA灭活；(3)第(1)所述胚胎干细胞，其可抗新霉素；(4)第(1)所述胚胎干细胞，其中所述非人哺乳动物为啮齿动物；(5)第(4)所述胚胎干细胞，其中所述啮齿动物为小鼠；(6)对本发明DNA的表达有缺陷的非人哺乳动物，其中本发明DNA不具活性；
(7)第(6)所述非人哺乳动物，通过导入报道基因(例，大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因)使该DNA灭活，该报道基因能在本发明DNA的启动子控制下表达；(8)第(6)所述非人哺乳动物，其为啮齿动物；(9)第(8)所述非人哺乳动物，其中所述啮齿动物为小鼠，以及(10)一种对本发明DNA的启动子活性具有促进或抑制作用的化合物或其盐的筛选方法，包括给第(7)所述动物投与待测化合物，并检测报道基因的表达。
所谓携有无活性本发明DNA的非人哺乳动物胚胎干细胞是指，通过对本发明DNA进行人工突变而抑制该非人哺乳动物表达所述DNA，或通过使该DNA编码的本发明多肽或受体蛋白活性基本丧失，从而使该DNA基本上不具有表达本发明多肽或受体蛋白的能力(下文有时称本发明的基因敲除DNA)的胚胎干细胞(简称ES细胞)。
非人哺乳动物可以用与前述同样的动物。
对本发明DNA进行人工突变的方法包括，该DNA序列的一部分或全部缺失，插入或用其它DNA置换。通过这些变异，可以利用诸如读码框的移动，或启动子或外显子功能的破坏来制备本发明的基因敲除DNA。
携有无活性本发明DNA的非人哺乳动物胚胎干细胞(下文简称携有无活性本发明DNA的ES细胞或本发明的基因敲除ES细胞)可如下获得分离所选非人哺乳动物所具有的本发明DNA，在其外显子部分插入抗药基因如抗新霉素基因、抗潮霉素基因，或插入报道基因如1acZ(β-半乳糖苷酶基因)、cat(氯霉素乙酰转移酶基因)以破坏外显子的功能，或在外显子之间的内含子上插入能够终止基因转录的DNA序列(如，polyA加尾信号等)以抑制完整mRNA的合成，将如此构建的含有被破坏的上述DNA的序列(下文简称为靶载体)通过同源重组整合至该动物的染色体上。对如此获得的ES细胞用本发明DNA上或其附近的DNA序列作为探针进行Southern杂交分析，或用上述靶载体上的DNA序列和另一种位于本发明DNA附近但不包括在上述靶载体中的DNA序列作为引物进行PCR，从而筛选本发明的基因敲除ES细胞。
通过同源重组使本发明DNA失活的亲本ES细胞可以是上述已建立的细胞株，也可以是根据Evans及Kaufma方法(出处同上)的改良法建立的细胞株。例如，目前常用的小鼠ES细胞是129系ES细胞，但其免疫学背景不十分清楚，故优选使用C57BL/6小鼠或BDF1小鼠(C57BL/6和DBA/2的F1代)，而不是设法获得遗传免疫学背景清晰的纯系ES细胞或作它用，其中所述BDF1小鼠是使C57BL/6通过与DBA/2杂交而改良其卵数少的特点。BDF1小鼠其优点卵数多且卵饱满，具有C57BL/6小鼠的背景，因此用其ES细胞产生病理模型小鼠时，通过再与C57BL/6小鼠进行回交可以使其遗传背景恢复为C57BL/6小鼠的背景。
当建立ES细胞时，一般使用受精后第3.5天的胚细胞，本发明优选在8细胞胚期采集胚胎并培养至胚细胞，通过使用此胚细胞可以更有效地获得大量的初期胚细胞。
虽然可以利用的ES细胞无所谓性别，但是通常雄性ES细胞比较容易形成生殖细胞系的嵌合体。为了减少培养时的繁杂过程最好尽快判断雌雄性。
ES细胞的雌雄判断方法有，用PCR法扩增并检测Y染色体上性决定区的基因。如果使用这种方法，只需一个菌落(约50个)的ES细胞就足以进行性别分析，而进行核型分析则需要约106个细胞；因此可在培养初期根据对性别的鉴定对ES细胞进行第一次筛选，及早选出雄性细胞，从而大大缩短培养初期的时间。
可用G带法确定染色体数而完成第二次选择。优选所获得的ES细胞染色体数为正常数的100％，但经物理操作建立细胞系很难获得具有正常染色体数的细胞时，优选对ES细胞的基因实施基因敲除后，再克隆成正常细胞(如，染色体数为2n＝40的小鼠体细胞)。
这样所得的胚胎干细胞通常繁殖能力强，但个体发育能力低，因此必须传代。例如，在适当饲养细胞如STO成纤维细胞上，在有LIF(1-10000U/ml)的情况下，在CO2培养箱(优选约5％CO2和约95％空气，或约5％CO2、约5％O2和90％空气)内约37℃培养所述胚胎干细胞系，传代时，可用胰酶/EDTA溶液(通常约0.001-0.5％胰酶/约0.1-5mM EDTA，优选约0.1％胰酶/1mM EDTA)处理以获得单细胞，然后接种至新鲜制备的饲养细胞。通常每1-3天传代一次，并在传代时观察细胞，将形态异常的细胞除去。
ES细胞在适当条件下，在单层培养中长至高密度，或在悬浮培养中形成细胞集团后，它们可自发分化成各种细胞，如头顶肌细胞、内脏肌细胞、心肌细胞等[M.J.Evans及M.H.Kaufman，自然，292，154(1981)；G.R.Martin，美国国家科学院院刊，78，7634(1981)；T.C.Doetschman等，胚胎学和实验形态学杂志87，27(1985)]，从本发明分化的ES细胞得到对本发明DNA的表达有缺陷的细胞，它们可用于体外进行本发明多肽或本发明受体蛋白的细胞学或分子生物学研究。
可用公知方法测定所选动物的mRNA量，并间接比较表达量，从而使本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物与正常动物区别。
非人哺乳动物的例子如前述。
对本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物而言，可将如上制备的靶载体导入小鼠胚胎干细胞或小鼠卵细胞，然后通过同源重组使小鼠胚胎干细胞或小鼠卵细胞染色体上的本发明DNA被靶载体上的已失活的本发明DNA序列所取代，从而完成对本发明DNA的基因敲除。
以位于本发明DNA内或附近的一段DNA序列作为探针通过DNA杂交分析，或以靶载体上的一段DNA序列以及不包含在该靶载体中的另一DNA序列为引物通过PCR分析，可以鉴定携有本发明已破坏的DNA的基因敲除细胞。当使用非人哺乳动物胚胎干细胞时，对其中所含本发明DNA已失活的一个细胞系通过同源重组进行克隆；在适当时期如8细胞期将所得已克隆的细胞注射至，例如非人哺乳动物胚胎或胚细胞中。将所得嵌合体胚胎移植到非人哺乳动物的假妊娠子宫。所得动物是由具有正常的本发明DNA位点的细胞和具有人工突变的本发明DNA位点的细胞构成的嵌合体。
当该嵌合体动物的部分生殖细胞中本发明DNA位点发生突变后，可从这种嵌合动物与正常动物交配得到的子代群体中，通过毛色(coat color)鉴定等方法，筛选以下个体，其所有组织均由具有突变的本发明DNA位点的细胞组成。所得个体通常在本发明多肽的杂合子表达中有缺陷。通过这些杂合体的交配后代可获得本发明多肽或本发明受体蛋白的纯合子表达有缺陷的个体。
使用卵细胞时，可将DNA溶液显微注射至细胞核内，获得一种非人哺乳类转基因动物，其中已将靶载体导入其染色体上。可根据同源重组从这些非人哺乳类转基因动物中筛选本发明DNA位点上有变异的个体。
如上述，针对本发明DNA的基因敲除个体的杂交后代在证实了带有此基因敲除后，可通过常规培养条件进行繁衍。
可按照常规方法获得并维持繁殖系。即通过含有所述非活性DNA的雌雄动物交配，可以获得两条同源染色体上都具有该非活性DNA的纯合体。对于母本动物来说，在1个正常个体、多个纯合体的状态下饲养，就能更有效地得到这种纯合体动物。通过雌雄杂合体的杂交，可繁殖并传代具有该非活性DNA的纯合体以及杂合体动物。
本发明DNA已失活的非人哺乳动物胚胎干细胞在产生本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物方面十分有用。
由于本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物丧失了本发明多肽或本发明受体蛋白的各种生物活性，故可作为本发明多肽或本发明受体蛋白的生物活性失活的疾病模型，并因此有利于阐明这些疾病的原因及研究其治疗方法。
(8a)对本发明DNA之缺失或损伤等所致疾病能进行有效预防/治疗的化合物的筛选方法可用本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物筛选对本发明DNA之缺失或损伤所致疾病进行有效预防/治疗的化合物。
即，本发明提供对本发明DNA之缺失或损伤等所致疾病能进行有效预防/治疗的化合物的筛选方法，其特征为，对本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物施用一种待测化合物，观察和测定该动物的变化。
可用于所述筛选方法的本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物实例如上述。
所述待测化合物如多肽、蛋白质、非多肽化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液、血浆等，它们既可为新化合物也可为已知化合物。
具体地，用待测化合物处理本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物，与未处理的对照动物比较，以动物的各个器官、组织、疾病的症状变化为指标，可以评价此待测化合物的治疗/预防效果。
所述用待测化合物处理对象动物，可以口服给药、静脉注射，可以根据待测动物的状况和待测化合物的性质等适当地进行选择。另外，待测化合物的给药量还可以根据投药途径、待测化合物的性质等进行适当选择。
当筛选针对下述疾病具有治疗/预防效应的化合物时，对本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物进行葡萄糖耐量试验，在该试验之前或之后给予待测化合物，经常地测定该动物的血糖值以及体重的变化。所述疾病如，高血压、自身免疫疾病、心功能不全、白内障、青光眼、急性细菌性脑膜炎、急性心肌梗塞、急性胰腺炎、急性病毒性脑炎、成人呼吸窘迫综合征、酒精性肝炎、阿尔茨海默氏病、哮喘、动脉硬化、特应性皮炎、细菌性肺炎、膀胱癌、骨折、乳腺癌、贪食症、食多症、烧伤、宫颈癌、慢性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性胰腺炎、肝硬化、大肠癌(结肠癌/直肠癌)、克罗恩氏病、痴呆、糖尿病并发症、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病、胃炎、幽门螺杆菌感染、肝功能不全、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、肝炎、单纯疱疹病毒感染、水痘带状疱疹病毒感染、何杰金氏病、爱滋病、人乳头状瘤病毒感染、高钙血症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、传染病、流行性感冒、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、侵入性葡萄球菌感染、恶性黑色素瘤、癌转移、多发性骨髓瘤、过敏性鼻炎、肾炎、非何杰金氏性淋巴瘤、胰岛素非依赖型糖尿病(II型)、非小细胞肺癌、器官移植、骨关节炎、骨软化、骨质稀少、骨质疏松、卵巢癌、骨贝切特氏病、消化性溃疡、末梢血管疾病、前列腺癌、反流性食管炎、肾功能不全、类风湿性关节炎、精神分裂症、败血病、败血性休克、重度全身性真菌感染、小细胞肺癌、脊髓损伤、胃癌、系统性红斑狼疮、暂时性脑缺血、结核、心瓣膜闭锁不全、血管性多发梗塞痴呆、外伤、失眠、关节炎、垂体激素分泌功能不全、尿频、尿毒症、或者神经性疾病等；囊状黄斑浮肿；以及(1)肢端肥大症、产TSH肿瘤、非分泌性(非功能性)垂体肿瘤、产异位性ACTH肿瘤、髓样甲状腺癌、产VIP肿瘤、产高血糖素肿瘤、产促胃液素肿瘤、胰岛细胞瘤、类癌瘤等；(2)胰岛素依赖性或非依赖性糖尿病、或者与这些糖尿病有关的各种疾病，即糖尿病并发症(如糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经功能障碍、Down′s综合征、体位性低血压病等)；(3)因改善高胰岛素血症或抑制食欲导致的肥胖症、贪食症等；(4)急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺瘘、肠瘘、出血性溃疡、消化性溃疡、胃炎、胃酸过多、反流性食管炎等；(5)幽门螺杆菌感染引起的多种症状；(6)伴随着内窥镜胆道胰管照影而产生的淀粉酶的过渡分泌；(7)由小肠吸收能力低下、分泌亢进或消化管运动能力异常引起的腹泻(如短肠道综合征等)、癌症化疗等引起的腹泻、先天性小肠萎缩引起的腹泻、产VIP肿瘤等神经内分泌肿瘤引起的腹泻、AIDS引起的腹泻、骨髓移植后的移植物抗宿主反应引起的腹泻、糖尿病引起的腹泻、腹腔神经丛损伤引起的腹泻、全身性硬化引起的腹泻、嗜酸性粒细胞增多引起的腹泻等；(8)倾倒综合征、过敏性肠炎、克罗氏病、炎性肠疾患等；(9)肿瘤或癌(例，甲状腺癌、大肠癌、乳腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、胆管癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、恶性褐色细胞瘤、神经母细胞瘤、脑肿瘤、胸腺瘤、肾癌等)、白血病(如，嗜碱性粒细胞白血病、慢性淋巴白血病、慢性骨髓白血病、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴肿瘤等)；(10)肥大性心肌病、动脉硬化、心瓣膜疾病、心肌梗塞(尤其是经皮肤经血管冠状动脉成形术后的心肌梗塞)；(11)食道静脉癌出血、肝硬化、末梢血管疾病；(12)全身或局部炎症的伴随疾病(例如，多发性动脉炎、类风湿性关节炎、牛皮癣、晒伤、湿疹、过敏(例如哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎)等)；(13)痴呆症(如阿尔茨海默氏病、阿耳茨海默氏型老年性痴呆、血管性·多发性痴呆等)、精神分裂症、癫痫、抑郁症、焦虑症、睡眠障碍、多发性硬化等；(14)眼部疾病(如，青光眼等)；(15)急性细菌性脑膜炎、急性病毒性脑炎、成人呼吸窘迫综合征、细菌性肺炎、重度全身性真菌感染、结核、脊髓损伤、骨折、肝功能不全、肺炎、酒精性肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、AIDS、人乳头状瘤病毒感染、流行性感冒、癌转移、多发性骨髓瘤、骨软化、骨质疏松、骨贝切特氏病、肾炎、肾功能不全、败血病、败血性休克、高钙血症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、系统性红斑狼疮、暂时性脑缺血发作、酒精性肝炎等；(16)器官移植、烧伤、外伤、脱发等；(17)慢性或急性疼痛(例如，术后疼痛、炎症性疼痛、牙痛、骨疾病(如，关节炎、类风湿、骨质疏松等)的伴随疼痛)等。
在该筛选方法中，当对试验动物投与待测化合物而该试验动物的血糖值降低至少约10％，优选至少约30％，更优选至少约50％时，该化合物可被选为对上述疾病具有治疗和预防效应的化合物。
用该筛选法得到的化合物是从上述的待测化合物中选出的化合物，对因本发明多肽或本发明受体蛋白的缺陷、损伤引起的疾病具有治疗和预防效应，所以这种化合物可以用作治疗和预防这些疾病的药物，既安全又毒性低。另外，如上述筛选的化合物所衍生的化合物也可以使用。
用上述筛选法得到的化合物可以与生理上可接受的碱(如碱金属盐)或酸(如无机酸或有机酸)形成盐而使用，优选为生理上可接受的酸加成盐。这样的盐有，与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐，与有机酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐等。
含有用上述筛选法所得的化合物或其盐的药用组合物，可以用类似于制备含上述本发明多肽的组合物的方法进行制备。
如此得到的制剂安全、低毒，因此可以对人或哺乳动物投药，例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴子等。
该化合物或其盐的剂量依赖于病症、受试者和给药方法等而异；例如经口投药时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天。非胃肠道给药时，单位剂量依赖于给药受体、症状等而变，例如，以针剂注射该化合物时成年人(体重60kg)的剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
(8b)筛选能促进或抑制本发明DNA中启动子之活性的化合物的方法本发明提供筛选能促进或抑制本发明DNA中启动子之活性的化合物的方法，其特征为，对本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物给予待测化合物，并检测报道基因的表达。
在上述筛选方法中，本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物选自上述本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物，该动物中通过导入报道基因使本发明DNA失活，而该报道基因是在本发明DNA的启动子控制下表达。
用于筛选的具体化合物实例同上。
报道基因实例同上，优选β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、可溶性碱性磷酸酶基因或荧光素酶基因等。
由于本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物之中，本发明DNA以报道基因取代，而报道基因又受本发明DNA启动子的调控而出现，因此追踪报道基因编码物质的表达可以检测启动子活性。
例如，当用大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ)取代本发明多肽或本发明受体蛋白的DNA区的一部分时，原本表达本发明多肽或本发明受体蛋白的组织中，表达了β-半乳糖苷酶基因以代替本发明多肽或本发明受体蛋白。因此，用试剂β-半乳糖苷酶的底物如5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖吡喃糖苷(X-gal)染色可以很容易地观察到本发明多肽或本发明受体蛋白在动物体内的表达状态。具体地，选取本发明多肽或本发明受体蛋白缺陷型小鼠或其经戊二醛等固定的组织切片，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，用含有X-gal的染色液在室温或37℃左右反应约30分至1个小时，之后将组织标本用1mM EDTA/PBS溶液洗涤，观察β-半乳糖苷酶产生的颜色。或者，可按照常规法检测编码lacZ的mRNA。
用该筛选法得到的化合物或其盐是从上述待测化合物中选出，具有促进或抑制本发明DNA启动子活性的化合物。
用上述筛选法得到的化合物可以与生理上可接受的碱(如碱金属盐)或酸(如无机酸或有机酸)形成盐而使用，优选为生理上可接受的酸加成盐。这样的盐有，与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐，与有机酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐等。
由于具有促进或抑制本发明DNA启动子的活性的化合物或其盐，可促进或抑制本发明多肽或本发明受体蛋白的表达，或可促进或抑制本发明多肽或本发明受体蛋白的功能，因此它们可作为安全、低毒性药物用于治疗和预防高血压、自身免疫疾病、心功能不全、白内障、青光眼、急性细菌性脑膜炎、急性心肌梗塞、急性胰腺炎、急性病毒性脑炎、成人呼吸窘迫综合征、酒精性肝炎、阿尔茨海默氏病、哮喘、动脉硬化、特应性皮炎、细菌性肺炎、膀胱癌、骨折、乳腺癌、贪食症、食多症、烧伤、宫颈癌、慢性淋巴性白血病、慢性髓样性白血病、慢性胰腺炎、肝硬化、大肠癌(结肠癌/直肠癌)、克罗恩氏病、痴呆、糖尿病并发症、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病、胃炎、幽门螺杆菌感染、肝功能不全、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、肝炎、单纯疱疹病毒感染、水痘带状疱疹病毒感染、何杰金氏病、爱滋病、人乳头状瘤病毒感染、高钙血症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、传染病、流行性感冒、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、侵入性葡萄球菌感染、恶性黑色素瘤、癌转移、多发性骨髓瘤、过敏性鼻炎、肾炎、非何杰金氏性淋巴瘤、胰岛素非依赖型糖尿病(II型)、非小细胞肺癌、器官移植、骨关节炎、骨软化、骨质稀少、骨质疏松、卵巢癌、骨贝切特氏病、消化性溃疡、末梢血管疾病、前列腺癌、反流性食管炎、肾功能不全、类风湿性关节炎、精神分裂症、败血病、败血性休克、重度全身性真菌感染、小细胞肺癌、脊髓损伤、胃癌、系统性红斑狼疮、暂时性脑缺血、结核、心瓣膜疾病、血管性多发梗塞痴呆、外伤、失眠、关节炎、垂体激素分泌功能不全、尿频、尿毒症、或者神经性疾病等。
此外，能促进或抑制本发明DNA启动子的活性的化合物或其盐还可作为安全、低毒性药物用于治疗和预防囊状黄斑浮肿。
能促进或抑制本发明DNA启动子的活性的化合物或其盐还可作为安全、低毒性药物用于(1)治疗肢端肥大症、产TSH肿瘤、非分泌性(非功能性)垂体肿瘤、产异位性ACTH(促肾上腺皮质激素)肿瘤、髓样甲状腺癌、产VIP肿瘤、产高血糖素肿瘤、产促胃液素肿瘤、胰岛细胞瘤、类癌瘤等；(2)治疗胰岛素依赖型或非依赖型糖尿病、或者与这些糖尿病有关的各种疾病，即糖尿病并发症(如糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经功能障碍、Down′s综合征、体位性低血压病等)；(3)治疗因改善高胰岛素血症或抑制食欲引起的肥胖症、贪食症等；(4)治疗急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺瘘·肠瘘、出血性溃疡、消化性溃疡、胃炎、胃酸过多、反流性食管炎等；(5)缓解伴随着幽门螺杆菌感染引起的各种疾病(例如，促胃液素分泌亢进的抑制药物等)；(6)抑制内窥镜胆道胰管照影所致淀粉酶的分泌，以及胰腺手术预后治疗；(7)由小肠吸收能力低下、分泌亢进或消化管运动能力异常引起的腹泻(如短肠道综合征等)、癌症化疗等引起的腹泻、先天性小肠萎缩引起的腹泻、由产VIP肿瘤等神经内分泌肿瘤引起的腹泻、AIDS引起的腹泻、骨髓移植后的移植物抗宿主反应引起的腹泻、糖尿病引起的腹泻、腹腔神经丛损伤引起的腹泻、全身性硬化引起的腹泻、嗜酸性粒细胞增多引起的腹泻等；(8)治疗倾倒综合征、过敏性肠炎、克罗氏病、炎性肠疾患等；(9)治疗肿瘤或癌(例，甲状腺癌、大肠癌、乳腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、胆管癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、恶性褐色细胞瘤、神经母细胞瘤、脑肿瘤、胸腺瘤、肾癌等)、白血病(如，嗜碱性粒细胞白血病、慢性淋巴白血病、慢性髓样白血病、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤等)；以上这些药物可以单独或与其它治癌药物(他莫昔芬、LHRH激动剂、LHRH拮抗剂、IFN-α、β及γ、IL-2等)合用；(10)预防和治疗肥大性心肌病、动脉硬化、心瓣膜疾病、心肌梗塞(尤其是穿皮穿血管冠状动脉成形术后的心肌梗塞)、或血管再生；(11)治疗食道静脉癌出血、肝硬化、末梢血管疾病；(12)治疗因对作用于免疫系统的生理活性物质(例如，物质P、速激肽、细胞因子等)的分泌进行调节而伴有的疾病，例如全身或局部炎症(如多发性动脉炎、类风湿性关节炎、牛皮癣、晒伤、湿疹、过敏反应(例如哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎)等)；(13)对影响神经调节因子的产生与分泌的疾病进行治疗，例如痴呆症(如阿尔茨海默氏病、阿耳茨海默氏型老年性痴呆、血管性·多发性痴呆等)、精神分裂症、癫痫、抑郁症、焦虑症、睡眠障碍、多发性硬化等；(14)治疗眼部疾病(如，青光眼等)；(15)预防和治疗急性细菌性脑膜炎、急性病毒性脑炎、成人呼吸窘迫综合征、细菌性肺炎、重度全身性真菌感染、结核、脊髓损伤、骨折、肝功能不全、肺炎、酒精性肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、AIDS、人乳头状瘤病毒感染、流行性感冒、癌转移、多发性骨髓瘤、骨软化、骨质疏松、骨贝切特氏病、肾炎、肾功能不全、败血病、败血性休克、高钙血症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高脂血症、系统性红斑狼疮、暂时性脑缺血发作、酒精性肝炎等；(16)使器官移植、烧伤、外伤、脱发等康复；(17)作为镇痛剂用于抑制或缓解慢或急性疼痛(例如，术后疼痛、炎症性疼痛、牙痛、骨疾病(如，关节炎、类风湿、骨质疏松等)的疼痛)。另外，还可以同样地使用如上筛选的化合物的衍生物。
含有用上述筛选法所得的化合物或其盐的药用组合物，可以用类似于制备含上述本发明多肽的组合物的方法进行制备。
如此得到的制剂安全、低毒，因此可以对人或哺乳动物投药，例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴子等。
该化合物或其盐的剂量依赖于病症、受试者和给药途径等而异；例如经口投药时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天。非胃肠道给药时，单位剂量依赖于给药受体、症状等而变，例如，以针剂注射该化合物时成年人(体重60kg)的剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
相反，经口服给予抑制本发明DNA启动子活性的化合物时，一般成年人(体重60kg)正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天。非胃肠道给药时，单位剂量依赖于给药受体、症状等而变，例如，以针剂注射抑制本发明DNA启动子活性的化合物时，成年人(体重60kg)的剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
根据上述，本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物可有效用于筛选能促进或抑制本发明DNA启动子活性的化合物或其盐，研究疑为本发明DNA表达缺陷的各种疾病的病因，和开发针对这些疾病的预防和治疗药物。
使用含有本发明多肽或本发明受体蛋白启动子区的DNA，在其下游连接编码各种蛋白质的基因，将这个连接产物注射到动物卵细胞即可产生所谓的转基因动物。然后可针对性地合成所述多肽或蛋白质并研究其体内活性。另外，使所述启动子部分结合适当的报道基因，并建立表达该基因的细胞系，所得系统可用于检测能特异性促进或抑制本发明多肽或本发明受体蛋白的体内产生能力的低分子化合物。
(9)对本发明多肽的受体的鉴定可以如下鉴定本发明多肽的受体。大多数生理活性多肽的受体为7个跨膜型受体，现已报道了很多孤儿受体(相应配体未知)。因此，使这些孤儿受体在适当的细胞如CHO细胞或HEK293细胞内表达并加入本发明多肽，检查是否有诸如诱导特异信号传导作用的细胞刺激活性，从而可以特异地鉴定受体。还有，将基因组或cDNA文库导入适当的动物细胞内，加入标记有放射性同位素的本发明多肽以检查其结合情况，可以分离编码所述受体的基因。
编码生理活性肽的基因常常使此肽的某一序列基元重复排列，本发明利用这个特征，提供对未知的具有生理活性的肽或其酰胺或酯或它们的盐的鉴定方法，同时还提供由经该方法得到的生理活性肽或其酰胺或酯或它们的盐。
所述生理活性肽的所述序列基元如，本发明具有RF酰胺、RS酰胺或RL酰胺结构的多肽上的RFG(R/K)序列、RSG(R/K)序列或RLG(R/K)序列，或编码该氨基酸序列的碱基序列等。能够编码如此短的氨基酸序列的DNA序列偶然出现，而在除所述生理活性肽的DNA序列以外的其它DNA序列中极高频率出现。通过检测以这种重复序列为特征的序列，可以较准确地发现编码生理活性肽的DNA。
更具体地，用RFG(R/K)序列、RSG(R/K)序列或RLG(R/K)序列，或编码该氨基酸的序列，以及含有编码该氨基酸序列的碱基序列的序列为探针，根据检索数据库可以获得目标基因。所述探针如RFGK5′-(C/A)G(A/C/G/T)TT(T/C)GG(A/C/G/T)AA(A/G)-3′(SEQ IDNO20)RFGR5′-(C/A)G(A/C/G/T)TT(T/C)GG(A/C/G/T)(A/C)G(A/C/GT)-3′(SEQ ID NO21)RSGK5′-(C/A)G(A/C/G/T)(A/T)(C/G)(A/C/G/T)GG(A/C/G/T)AA(A/G)-3′(SEQ ID NO22)RSGR5′-(C/A)G(A/C/G/T)(A/T)(C/G)(A/C/G/T)GG(A/C/G/T)(A/C)G(A/C/G/T)-3′(SEQ ID NO23)RLGK5′-(C/A)G(A/C/G/T)(T/C)T(A/C/T/G)GG(A/C/G/T)AA(A/G)-3′(SEQ ID NO24)RLGR5′-(C/A)G(A/C/G/T)(T/C)T(A/C/T/G)GG(A/C/G/T)(A/C)G(A/C/G/T)-3′(SEQ ID NO25)等，作为对应于RFG(R/K)序列、RSG(R/K)序列或RLG(R/K)序列的DNA排列。
用上述序列基元筛选cDNA或基因组文库也可获得目标基因。使用上述探针，可以纯化目标基因，也可在基因捕捉器中从上述纯化的mRNA获得cDNA。另外，通过利用其它序列基元(由该基因重复编码的氨基酸序列或可编码该氨基酸序列的碱基序列)，这些探针也可以用于鉴定具有除RF酰胺、RS酰胺或RL酰胺结构以外的结构的生理活性肽。
具有RF酰胺、RS酰胺或RL酰胺结构的肽在其C末端区有共同的RF酰胺、RS酰胺或RL酰胺结构，因此使用含有RF酰胺、RS酰胺或RL酰胺结构的抗体，可以研究具有未知的RF酰胺、RS酰胺或RL酰胺结构的肽。大多数具有RF酰胺、RS酰胺或RL酰胺结构的肽的受体均为7次跨膜型受体。将浓缩或分级分离的动物组织提取物加入孤儿受体(其相应配体未测出)表达细胞内，使用抗RF酰胺抗体、抗RS酰胺抗体或抗RL酰胺抗体，再根据其信号传导作用可以测定孤儿受体的配体。除了具有RF酰胺、RS酰胺或RL酰胺结构的肽之外还存在大量有共同序列的肽，因此本方法也可用于不具有RF酰胺、RS酰胺或RL酰胺结构的肽。
(10)测定针对本发明受体蛋白的配体(激动剂)本发明受体蛋白可用作发现或测定针对本发明受体蛋白或它们的盐的配体(激动剂)的一种试剂。
也就是说，本发明提供了一种测定针对本发明受体蛋白的配体的方法，其中包括，使本发明的受体蛋白与待测化合物接触。
待测化合物包括众所周知的配体(例如，血管紧张素、蛙皮素、canavinoid、缩胆囊素、谷氨酰胺、5-羟色胺、褪黑激素、神经肽Y、类阿片、嘌呤、加压素、催产素、PACAP、促胰泌素、胰高血糖素、降钙素、肾上腺皮质激素、生长激素抑制素、GHRH、CRF、ACTH、GRP、PTH、VIP(血管肠肽及相关多肽)、多巴胺、胃动素、糊精、缓激肽、降钙素基因相关肽(CGRP)、白三烯、胰抑制素、前列腺素、血栓素、腺苷、肾上腺素、α和β-趋化因子(例如IL-8、GRO α、GROβ、GROγ、NAP-2、ENA-78、PF4、IP10、GCP-2、MCP-1、HC14、MCP-3、I-309、MIP1α、MIP1β和RANTES)、内皮素、肠抑胃素、组胺、神经降压素、TRH、胰多肽、促生长激素神经肽等)，除此之外还包括，例如人和哺乳动物(例如小鼠、大鼠、猪、牛、羊和猴)的组织抽提物或细胞培养上清。例如，将组织抽提物或细胞培养上清加入到本发明的受体蛋白，分析细胞刺激活性并同时使该部分分级分离，最后获得单一配体。
更具体的，用以测定本发明配体的方法包括，利用本发明的受体蛋白，或利用在受体结合实验中构建的重组受体蛋白表达系统，测定化合物(例如，肽、蛋白、非肽类化合物、合成化合物、发酵产物)或它们的盐，所述化合物或其盐与本发明的受体蛋白结合后具有细胞刺激活性(例如，促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的降低)。
测定本发明配体的方法有以下特征，通过使待测化合物与本发明的受体蛋白接触，测定其结合于本发明受体蛋白的量或其细胞刺激活性。
更具体的，本发明提供了(1)一种测定针对本发明受体蛋白的配体的方法，包括使一标记的待测化合物与本发明的受体蛋白接触，测定与受体蛋白结合的标记化合物的量(2)一种测定针对本发明受体蛋白的配体的方法，包括使一标记的待测化合物与包含本发明受体蛋白的细胞或该细胞的膜级分接触，测定与所述细胞或细胞膜级分结合的标记化合物的量；(3)一种测定针对本发明受体蛋白的配体的方法，其中包括，培养含有编码本发明受体蛋白的DNA的转化体，使一标记的待测化合物与表达在细胞膜上的本发明受体蛋白接触，测定与表达的受体蛋白结合的标记化合物的量；(4)一种测定针对本发明受体蛋白的配体的方法，包括，使一待测化合物同包含本发明受体蛋白的细胞接触，测定受体介导的细胞刺激活性(例如，促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的降低)；(5)一种测定针对本发明受体蛋白的配体的方法，其中包括，培养含有本发明受体蛋白的DNA的转化体，使一待测化合物同表达在细胞膜上的本发明受体蛋白接触，测定受体蛋白介导的细胞刺激活性(例如，促进或抑制花生四烯酸释放、乙烯胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的降低)；尤其是，优选进行方法(1)至(3)来确认待测化合物可与本发明受体蛋白结合，然后进行方法(4)和(5)。
任何可作为本发明受体蛋白使用的实例均可用于本发明测定配体的方法。但是，在动物细胞中大量表达的受体蛋白等更适合于本发明。
可使用上述表达方法生产本发明受体蛋白，优选在哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达编码所述受体蛋白的DNA。编码该蛋白预期部分的DNA片段包括，但不限于互补DNA(cDNA)。例如，可使用基因片段或合成DNA。为了将编码所述受体蛋白等的DNA片段导入宿主动物细胞，并高效表达，优选将DNA片段插入具有昆虫宿主的杆状病毒属核多角体病毒(NPV)的多角体启动子、SV40来源的启动子、金属硫蛋白启动子、人热休克启动子、反转录病毒启动子、巨细胞病毒启动子、SRα启动子或类似启动子的下游。所表达受体的量和质用众所周知的方法检测，如Nambi，P.等，生物化学杂志，267，19555-19559(1992)所述。
因此，在本发明的测定配体的方法中，含有本发明受体蛋白的主体可以是用众所周知的方法纯化的受体蛋白、含有受体蛋白的细胞或这些细胞的膜级分。
使用含有本发明受体蛋白的细胞测定配体时，这些细胞可用戊二醛、福尔马林等固定。固定可用众所周知的方法进行。
含有本发明受体蛋白的细胞指表达本发明受体蛋白的宿主细胞。这类细胞的例子包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞和动物细胞。
细胞膜级分指，用众所周知的方法破裂细胞并进行分级分离而制备的含有大量细胞膜的级分。细胞破裂的有效方法包括用Potter-Elvehjem匀浆器挤压、用Waring blender或Polytron(Kinematica公司生产)破碎、超声破碎、用French press加压使细胞通过细嘴喷射而破裂。细胞膜级分分离主要通过离心力来实现，如分级离心和密度梯度离心。例如，细胞破碎液在低速(500-3000rpm)离心一小段时间(通常为约1-10分钟)，得到的上清在较高速(15000-30000rpm)通常离心0.5-2小时。由此获得的沉淀部分用作细胞膜级分。细胞膜级分富含表达的受体蛋白以及膜成分如细胞来源的磷脂和膜蛋白。
在含有受体蛋白等的细胞和细胞膜级分中，受体蛋白含量优选103-108分子/细胞，更优选105-107分子/细胞。随着表达量的增加，单位细胞膜级分的配体结合活性(比活)增加，因而不但可以构建高敏感筛选体系，而且可以一次获得大量的样品。
为了进行方法(1)-(3)来测定针对本发明受体蛋白的配体，需要合适的受体级分和标记的待测化合物。
受体蛋白级分优选天然的受体蛋白级分，或与其具有同等活性的重组受体蛋白级分。此处术语“同等活性”是指在配体结合活性或信号传导活性方面同天然受体蛋白所拥有的活性同等。
优选标记的待测化合物有血管紧张素、蛙皮素、canavinoid、缩胆囊素、谷氨酰胺、5-羟色胺、褪黑激素、神经肽Y、类阿片、嘌呤、加压素、催产素、PACAP、促胰泌素、胰高血糖素、降钙素、肾上腺皮质激素、生长激素抑制素、GHRH、CRF、ACTH、GRP、PTH、VIP(血管肠肽及相关多肽)、多巴胺、胃动素、糊精、缓激肽、降钙素基因相关肽(CGRP)、白三烯、胰抑制素、前列腺素、血栓素、腺苷、肾上腺素、α和β-趋化因子(例如IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2、ENA-78、PF4、IP10、GCP-2、MCP-1、HC14、MCP-3、I-309、MIP1α、MIP1β和RANTES)、内皮素、肠抑胃素、组胺、神经降压素、TRH、胰多肽、促生长激素神经肽等，它们用[3H]、[125I]、[14C]或[35S]等标记。
更具体地，本发明受体蛋白的配体用下述方法测定。首先，将含有本发明受体蛋白的细胞或其膜级分悬浮于本方法的相应的缓冲液中，制备标准受体制剂。可以使用任何缓冲液，只要它不干扰配体-受体结合。此类缓冲液有pH值约4-10(优选6-8)的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。为了降低非特异结合，可任选在缓冲液中加入表面活性剂如CHAPS、吐温-80TM(Kao-Atlas公司)、毛地黄皂苷或脱氧胆酸和各种蛋白如牛血清白蛋白或明胶等。为了抑制蛋白酶对受体或配体的降解，可加入蛋白酶抑制剂如PMSF、亮抑蛋白酶肽、E-64(Peptide Institute公司生产)和胃蛋白酶抑制剂。将一定量(5000-500000cpm)的用[3H]、[125I]、[14C]或[35S]标记的待测化合物加入到0.01-10ml的受体溶液中。为了测定非特异性结合(NSB)，需提供一个含有过量未标记的待测化合物的反应管。在约0-50℃(优选约4-37℃)反应约20分钟-约24小时(优选约30分钟-约3小时)。在反应完成后，反应混合物用玻璃纤维滤纸等过滤，用适量的相同缓冲液洗涤。然后用液闪仪或γ-计数仪测定玻璃纤维滤纸中的残留放射活性。从总结合数值(B)中减去非特异结合值(NSB)(B-NSB)，得到待测化合物的值，该值超过0时相应化合物被选为本发明受体蛋白的配体(激动剂)。
上述用于测定本发明受体蛋白的配体的方法(4)或(5)可按照下述进行。用众所周知的方法或商品化的分析试剂盒来测定受体蛋白介导的细胞刺激活性(例如，促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白的磷酸化、c-fos的激活和pH的降低)。更详细地，首先，将包含受体蛋白的细胞在多孔平板上培养。在测定配体之前，先置换新鲜培养基或对细胞无毒的缓冲液，加入待测化合物并保温一定时间，提取细胞或回收上清，用相应方法定量所得产物。当由于细胞内有分解代谢酶使作为细胞刺激活性指示剂的物质(例如花生四烯酸)的测定有困难时，可加入该分解代谢酶的抑制剂再进行测定。为了检测对cAMP产生的抑制活性等活性，可通过毛喉素等刺激使所述细胞的基线生产水平增加，然后可检测对这种增加的基线生产水平的抑制作用。
用于测定能与本发明受体蛋白结合之配体的试剂盒包含本发明的受体蛋白、含有本发明受体蛋白的细胞，或含有本发明受体蛋白的细胞膜级分。
本发明配体测定试剂盒包括如1.用于测定配体的试剂(1)测定用缓冲液和冲洗缓冲液加有0.05％牛血清白蛋白(Sigma)的Hanks’平衡盐溶液(Gibco)。
溶液用0.45μm孔径的滤膜过滤除菌并在4℃贮存。或可以在临用时配制。
(2)G蛋白偶联性受体蛋白标准将表达本发明受体蛋白的CHO细胞在12孔板上，以每孔5×105细胞的密度，在5％CO2和95％空气中37℃培养两天以传代。
(3)标记的待测化合物用市售[3H]、[125I]、[14C]或[35S]标记的化合物，或用合适方法标记的化合物。
所述化合物的水溶液贮存在4℃或-20℃。该溶液在使用时用测定缓冲液稀释到1μM。低水溶性的待测化合物溶解在二甲基甲酰胺、DMSO或甲醇中。
(4)非标记化合物所述标记化合物的非标记形式，配制的浓度比标记化合物的高100-1000倍。
2.测定方法(1)用于表达本发明受体蛋白的CHO细胞在12孔板上进行培养。在用1m1的测定缓冲液洗涤2次后，每孔加入490μl该测定缓冲液。
(2)加5μl的标记待测化合物，得到的混合液在室温保温1小时。为了测定非特异结合，先在该系统中加5μl的非标记待测化合物。
(3)去除反应混合液，用1ml的洗涤液将培养孔洗涤3遍。同细胞结合的标记待测化合物用0.2N NaOH-1％SDS溶解，然后同4ml的液闪剂A(和光纯药生产)混合。
(4)用液闪计数器(Beckman公司生产)测定放射性。
能与本发明受体蛋白结合的配体包括，在脑、垂体和胰腺中特异存在的物质。这些配体的例子包括血管紧张素、蛙皮素、canavinoid、缩胆囊素、谷氨酰胺、5-羟色胺、褪黑激素、神经肽Y、类阿片、嘌呤、加压素、催产素、PACAP、促胰泌素、胰高血糖素、降钙素、肾上腺皮质激素、生长激素抑制素、GHRH、CRF、ACTH、GRP、PTH、VIP(血管肠肽及相关多肽)、多巴胺、胃动素、糊精、缓激肽、降钙素基因相关肽(CGRP)、白三烯、胰抑制素、前列腺素、血栓素、腺苷、肾上腺素、α和β-趋化因子(例如IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2、ENA-78、PF4、IP10、GCP-2、MCP-1、HC14、MCP-3、I-309、MIP1 α、MIP1β和RANTES)、内皮素、肠抑胃素、组胺、神经降压素、TRH、胰多肽、促生长激素神经肽等。
在说明书和附图中，碱基和氨基酸的代码使用IUPAC-IUB生化命名委员会规定的或本领域通用的代码，如下述例示。对于有光学异构体的氨基酸，除非特别说明，指L形式。
DNA 脱氧核糖核酸cDNA互补的脱氧核糖核酸A 腺嘌呤T 胸腺嘧啶G 鸟嘌呤C 胞嘧啶I 次黄苷R 腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)Y 胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)M 腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)K 鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)S 鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)W 腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)B 鸟嘌呤(G)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)D 腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)V 腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)N 腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)
或不明或其他碱基RNA 核糖核酸mRNA 信使核糖核酸dATP 脱氧腺苷三磷酸dTTP 脱氧胸腺嘧啶三磷酸dGTP 脱氧鸟苷三磷酸dCTP 脱氧胞嘧啶三磷酸ATP 腺苷三磷酸EDTA 乙二胺四乙酸SDS 十二烷基硫酸钠BHA 二苯甲基胺pMBHA对甲基二苯甲基胺Tos 对甲苯磺酰基Bzl 苄基Bom 苄氧甲基Boc 叔丁氧基羰基DCM 二氯甲烷HOBt 1-羟基苯并三唑DCC N，N′-二环已基碳二亚胺TFA 三氟乙酸DIEA 二异丙基乙胺Gly 甘氨酸Ala 丙氨酸Val 缬氨酸Leu 亮氨酸Ile 异亮氨酸Ser 丝氨酸Thr 苏氨酸Cys 半胱氨酸Met 甲硫氨酸Glu 谷氨酸
Asp 天冬氨酸Lys 赖氨酸Arg 精氨酸His 组氨酸Phe 苯丙氨酸Tyr 酪氨酸Trp 色氨酸Pro 脯氨酸Asn 天冬酰胺Gln 谷氨酰胺pGlu谷氨酸本说明书的序列表中的序列编号(SEQID NO)分别表示下列序列。表示随后实施例1所述本发明多肽(人型)的氨基酸序列。表示编码本发明多肽的DNA的碱基序列，该多肽含有[SEQ ID NO1]所述氨基酸序列。表示随后实施例1所述引物F5的碱基序列。表示随后实施例1所述引物F6的碱基序列。表示随后实施例1所述引物F1的碱基序列。表示随后实施例1所述引物R5的碱基序列。表示随后实施例3所述引物hR1的碱基序列。表示随后实施例3所述本发明多肽(人型)的氨基酸序列。
表示编码本发明多肽的DNA的碱基序列，该多肽含有[SEQ ID NO8]所述氨基酸序列。表示随后实施例4所述引物bF6的碱基序列。表示随后实施例4所述引物bF7的碱基序列。表示随后实施例4所述引物bR6的碱基序列。表示随后实施例4所述引物bR7的碱基序列。表示随后实施例4所述本发明多肽(牛型)的氨基酸序列。表示编码本发明多肽的DNA的碱基序列，该多肽含有[SEQ ID NO15]所述氨基酸序列。表示随后实施例5所述引物rLPR1的碱基序列。表示随后实施例5所述引物rLPF1的碱基序列。表示随后实施例5所述本发明多肽(大鼠型)(克隆前)的氨基酸序列。表示编码本发明多肽的DNA的碱基序列，该多肽含有[SEQ ID NO18]所述氨基酸序列。表示编码RFGK序列的碱基序列。表示编码RFGR序列的碱基序列。表示编码RSGK序列的碱基序列。
表示编码RSGR序列的碱基序列。表示编码RLGK序列的碱基序列。表示编码RLGR序列的碱基序列。表示随后实施例6所述引物FF2的碱基序列。表示随后实施例6所述引物rR4的碱基序列。表示随后实施例6所述引物mF1的碱基序列。表示随后实施例6所述引物mF3的碱基序列。表示随后实施例6所述引物mR1的碱基序列。表示随后实施例6所述引物moF的碱基序列。表示随后实施例6所述引物moR的碱基序列。表示随后实施例6所述本发明多肽(小鼠型)的氨基酸序列。表示编码本发明多肽的DNA的碱基序列，该多肽含有[SEQ ID NO33]所示的氨基酸序列。表示引物1的碱基序列，该引物用于克隆来源于大鼠脑干周边部的新型G蛋白偶联性受体蛋白rOT7T022L的cDNA(实施例7)。表示引物2的碱基序列，该引物用于克隆来源于大鼠脑干周边部的新型G蛋白偶联性受体蛋白rOT7T022L的cDNA(实施例7)。
表示随后实施例7所得来自大鼠脑干周边部新型G蛋白偶联性受体蛋白rOT7T022L的氨基酸序列。表示编码随后实施例7所得来自大鼠脑干周边部新型G蛋白偶联性受体蛋白rOT7T022L的cDNA碱基序列。表示随后实施例7(3)所得肽的氨基酸序列。表示随后实施例7(4)所得肽的氨基酸序列。表示随后实施例7(5)所得肽的氨基酸序列。表示碱基序列，其编码含有SEQ ID NO1中第81(Met)至第92位(Phe)的氨基酸序列的肽。表示碱基序列，其编码含有SEQ ID NO1中第101(Ser)至第112位(Ser)的氨基酸序列的肽[SEQ ID NO44]表示碱基序列，其编码含有SEQ ID NO1中第124(Val)至第131位(Phe)的氨基酸序列的肽氨基酸序列的肽。表示碱基序列，其编码含有SEQ ID NO1中第1(Met)至第92位(Phe)的氨基酸序列的肽氨基酸序列的肽。表示碱基序列，其编码含有SEQ ID NO1中第1(Met)至第112位(Ser)的氨基酸序列的肽氨基酸序列的肽。表示碱基序列，其编码含有SEQ ID NO1中第1(Met)至第131位(Phe)的氨基酸序列的肽氨基酸序列的肽。表示实施例5所用的引物ratF2的碱基序列。表示实施例5所用的引物ratR的碱基序列。表示随后实施例5所述本发明多肽(大鼠型)(克隆之后)的氨基酸序列。表示编码本发明多肽的DNA的碱基序列，该多肽含有[SEQ ID NO50]中的氨基酸序列。表示实施例9所用的引物bFF的碱基序列。表示实施例9所用的引物bFR的碱基序列。表示实施例11所得的编码hOT7T022所示蛋白质(多肽)的氨基酸序列。表示编码hOT7T022所示蛋白质(多肽)的DNA的碱基序列，所述蛋白质(多肽)含有[SEQ IDNO54]中的氨基酸序列。表示编码hOT7T022所示蛋白质(多肽)的DNA的碱基序列，所述蛋白质(多肽)含有[SEQ ID NO54]中的氨基酸序列。表示实施例11所用的引物1的碱基序列。表示实施例11所用的引物2的碱基序列。
随后实施例2描述的大肠杆菌转化体JM109/phRF1于1999年4月14日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERMBP-6702，于1999年3月5日保藏于财团法人发酵研究所(IFO)，保藏编号为IFO 16265。
随后实施例7描述的大肠杆菌转化体DH10B/pAK-rOT022L于1998年11月2日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERM BP-6558，于1998年10月16日保藏于财团法人发酵研究所(IFO)，保藏编号为IFO 16211。
随后实施例9描述的大肠杆菌转化体JM109/pbRF2于1999年8月2日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERM BP-6811，于1999年6月18日保藏于财团法人发酵研究所(IFO)，保藏编号为IFO 16288。
随后实施例8描述的大肠杆菌转化体JM109/phRF2于1999年8月2日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERM BP-6812，于1999年6月18日保藏于财团法人发酵研究所(IFO)，保藏编号为IFO 16289。
随后实施例6描述的大肠杆菌转化体JM109/p mLP4于1999年8月2日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERM BP-6813，于1999年6月18日保藏于财团法人发酵研究所(IFO)，保藏编号为IFO 16290。
随后实施例5描述的大肠杆菌转化体JM109/prLPL6于1999年8月2日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERMBP-6814，于1999年6月18日保藏于财团法人发酵研究所(IFO)，保藏编号为IFO 16291。
随后实施例11描述的大肠杆菌转化体DH5α/pCR2.1-hOT022T于1999年11月8日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERM BP-6930，于1999年10月27日保藏于财团法人发酵研究所(IFO)，保藏编号为IFO 16330。
随后实施例11描述的大肠杆菌转化体DH5α/pCR2.1-hOT022G于1999年11月8日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERM BP-6931，于1999年10月27日保藏于财团法人发酵研究所(IFO)，保藏编号为IFO 16331。
实施例用参考实施例详述本发明，但并非限制本发明的范围。使用大肠杆菌(Escherichia coil)进行基因操作按“分子克隆”的方法进行。
实施例1 从人胎脑poly(A)+RNA级分中合成cDNA并用RT-PCR法扩增生理活性肽的cDNA
由Clontech公司购入的人胎儿脑poly(A)+RNA级分，在该级分1μg中加入寡dT引物(Gibco BRL公司)，用莫洛尼(Moloney)小鼠白血病病毒的反转录酶(Gibco BRL公司)以所附缓冲液合成cDNA。反应后的产物用苯酚∶氯仿(1∶1)抽提，乙醇沉淀后溶解于30μl的TE中。所得cDNA取1μl为模板，用以下两个引物(F5及F6)进行PCR扩增。
F55′-GGGCTGCACATAGAGACTTAATTTTAG-3′(SEQ ID NO3)F65′-CTAGACCACCTCTATATAACTGCCCAT-3′(SEQ ID NO4)上述反应溶液包括合成的DNA引物(F5和F6)各20pM、0.25mM dNTP、0.5μl的Ex Taq DNA聚合酶及5μl的该酶所附缓冲液，总体积为50μl。用热循环仪(Perkin-Elmer公司)以98℃10秒、63℃20秒、72℃40秒扩增40个循环。
再以1μl该PCR产物为模板，用以下2个引物(F1及R5)，进行巢式PCR扩增。
F15′-GCACATAGAGACTTAATTTTAGATTTAGAC-3′(SEQ ID NO5)R55′-CATGCACTTTGACTGGTTTCCAGGTAT-3′(SEQ ID NO6)上述反应溶液包括合成的DNA引物(F1及R5)各为20pM、0.25mMdNTP、0.5μl的Ex Taq DNA聚合酶及5μl的该酶所附缓冲液，总体积为50μl。用热循环仪(Perkin-Elmer公司)以98℃10秒、60℃20秒、72℃40秒扩增40个循环。通过1.2％琼脂糖电泳及溴乙锭染色确认扩增的产物。
实施例2将上述PCR产物克隆至质粒载体并通过对已插入的cDNA区的碱基序列解码来筛选新生理活性肽候选克隆将实施例1的PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶分离，当证实DNA片段已扩增至所需大小后，用Quiagen PCR纯化试剂盒(Quigen)回收这些DNA。用TA克隆试剂盒(Invitrogen)按说明书将回收的DNA亚克隆到质粒载体pCRTM2.1。再导入大肠杆菌菌株JM109感受态细胞(宝酒造)中进行转化，然后携带所述插入cDNA片段的克隆在含氨苄青霉素和IPTG、X-gal的LB琼脂平板上进行筛选。用灭菌牙签挑取白色的克隆，得到转化体大肠杆菌JM109/phRF1。
得到的克隆在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上过夜培养，用自动质粒抽提仪(Kurabo)制备质粒DNA。取一份该DNA用EcoRI切割以检验插入cDNA片段的大小。将所剩DNA取一份用RNase处理、苯酚·氯仿抽提以及乙醇沉淀浓缩。用DyeDeoxy终止子循环测序试剂盒(Terminator CycleSequencing Kit)(ABI公司)进行测序，用荧光自动序列分析仪解读该DNA的密码。用DNASIS(日立系统工程公司)读取这些碱基序列的信息。所测定的碱基序列如图1所示。
以图1为基础对所测碱基序列进行同源性检索和序列分析，结果表明，插入到转化的大肠杆菌JM109/phRF1质粒上的cDNA片段可编码新型生理活性肽。
实施例3从人胎儿脑中提取生理活性肽的cDNA的剪接变异体以实施例1制备的1ml人胎儿脑cDNA为模板用以下2个引物(F5、hR1)进行PCR扩增。
F5 5′-GGGCTGCACATAGAGACTTAATTTTAG-3′(SEQ ID NO3)hR15′-CAGCTTTAGGGACAGGCTCCAGGTTTC-3′(SEQ ID NO7)上述反应溶液包括合成的DNA引物(F5和hR1)各20pM、0.25mMdNTP、0.5ml的Ex Taq DNA聚合酶及酶缓冲液，总体积为50ml。用热循环仪(Perkin-Elmer)以98℃10秒、65℃20秒、72℃20秒扩增40个循环。通过1.2％琼脂糖电泳及溴乙锭染色确认扩增的产物。之后，用QIA快速PCR纯化试剂盒(Quiagen)纯化反应产物，测定其序列。用Big Dye Deoxy终止子循环测序试剂盒(ABI公司)测序，用荧光自动序列分析仪(ABI377)译码。用DNASIS(日立系统工程公司)读取这些碱基序列的信息。结果，获得的cDNA其3′末端区与实施例2所得cDNA的不同。进而表明，本实施例所得cDNA是实施例2所得cDNA的剪接变异体。所测得的碱基序列(SEQ IDNO9)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO8)见图3。
实施例4从牛下丘脑poly(A)+RNA中提取生理活性肽的cDNA用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)提取牛下丘脑poly(A)+RNA中的牛型生理活性肽cDNA。按照试剂盒所付说明书制备牛下丘脑cDNA，并以此cDNA为模板合成下列4个引物(bF6、bF7、bR6、bR7)，再与试剂盒所付的AP1和AP2两种引物一起进行PCR扩增。
bF65′-GCCTAGAGGAGATCTAGGCTGGGAGGA-3′(SEQ ID NO10)bF75′-GGGAGGAACATGGAAGAAGAAAGGAGC-3′(SEQ ID NO11)
bR65′-GATGGTGAATGCATGGACTGCTGGAGC-3′(SEQ ID NO12)bR75′-TTCCTCCCAAATCTCAGTGGCAGGTTG-3′(SEQ ID NO13)为了扩增5′端(N-末端区)，首先用合成引物(bR6和AP1)进行第一次PCR反应。反应液中包含引物各20pM，0.25mM dNTP、0.5ml的Klen TaqDNA聚合酶及酶缓冲液，总体积25ml。用热循环仪(Perkin-Elmer)以98℃10秒、72℃2分钟扩增5个循环，再以98℃10秒、70℃2分钟扩增5个循环，又以98℃10秒、68℃2分30秒扩增25个循环。将第1次PCR的反应液稀释10倍，取其中的1ml为模板用引物(bR7和AP2)进行第2次PCR反应。反应液中包含引物各20pM，0.25mM dNTP、0.5ml的Klen Taq DNA聚合酶及酶缓冲液，总体积25ml。用热循环仪(Perkin-Elmer)以98℃10秒、72℃2分钟扩增5个循环，再以98℃10秒、70℃2分钟扩增5个循环，然后以98℃10秒、68℃2分30秒扩增35个循环。
为了扩增3′端(C-末端区)，首先用合成引物(bF6和AP1)进行第一次PCR反应。反应液中包含引物各20pM，0.25mM dNTP、0.5ml的Klen Taq DNA聚合酶及酶缓冲液，总体积25ml。用热循环仪(Perkin-Elmer)以98℃10秒、72℃2分钟扩增5个循环，再以98℃10秒、70℃2分钟扩增5个循环，然后以98℃10秒、68℃2分30秒扩增25个循环。将第1次PCR反应液稀释10倍，取其中的1ml为模板用引物(bF7和AP2)进行第2次PCR反应。反应液中包含引物各20pM，0.25mM dNTP、0.5ml的Klen Taq DNA聚合酶及酶缓冲液，总体积25ml。用热循环仪(Perkin-Elmer)以98℃10秒、72℃2分钟扩增5个循环，再以98℃10秒、70℃2分钟扩增5个循环，然后以98℃10秒、68℃2分30秒扩增35个循环。通过1.2％琼脂糖电泳及溴乙锭染色确认5′端和3′端各自扩增的产物。之后，用QUIA quick PCR纯化试剂盒(Quiagen)纯化所述反应产物并测序。用Big Dye Deoxy终止子循环测序试剂盒(ABI公司)进行测序，用荧光自动序列分析仪(ABI377)译码。
用DNASIS(日立系统工程公司)读取这些碱基序列的信息。所测定的碱基序列(SEQ ID NO15)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO14)见图4。
实施例5从大鼠脑poly(A)+RNA中提取生理活性肽cDNA用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)提取大鼠脑poly(A)+RNA中的大鼠型生理活性肽cDNA。按照试剂盒所付说明书制备大鼠脑cDNA，并以此cDNA为模板合成下列2个引物，再与试剂盒所付的AP1和AP2两种引物一起进行PCR扩增。
rLPR15′-CCCTGGGGCTTCTTCTGTCTTCTATGT-3′(SEQ ID NO16)rLPF15′-AGCGATTCATTTTATTGACTTTAGCA-3′(SEQ ID NO17)为了扩增5′端(N-末端区)，首先用引物对rLPR1和AP1进行第一次PCR反应。反应液中包含引物各20pM，0.25mM dNTP、0.5ml的Klen Taq DNA聚合酶及酶缓冲液，总体积25ml。用热循环仪(Perkin-Elmer)以98℃10秒、72℃2分钟扩增5个循环，再以98℃10秒、70℃2分钟扩增5个循环，然后以98℃10秒、68℃2分30秒扩增25个循环。以第1次PCR的反应液为模板，用第1对引物和相同组成的反应液进行第2次PCR反应。以98℃10秒、72℃2分钟扩增5个循环，再以98℃10秒、70℃2分钟扩增5个循环，然后以98℃10秒、68℃2分30秒扩增38个循环。
为了扩增3′端(C-末端区)，首先用引物对rLPF1和AP1进行第一次PCR反应。反应液的组成与扩增5′端(N-末端区)所用相同。以98℃10秒、72℃2分钟扩增5个循环，再以98℃10秒、70℃2分钟扩增5个循环，然后以98℃10秒、65℃20秒、72℃2分钟扩增25个循环。以第1次PCR的反应液为模板，用引物对rLPF1和AP2进行第2次PCR反应。反应液组成同第1次PCR反应的相同。用热循环仪(Perkin-Elmer)以98℃10秒、72℃2分钟扩增5个循环，再以98℃10秒、70℃2分钟扩增5个循环，然后以98℃10秒、65℃20秒、72℃2分钟扩增38个循环。通过1.2％琼脂糖电泳及溴乙锭染色确认5′端和3′端各自扩增的产物。用QIA快速凝胶提取试剂盒(Quiagen)纯化反应产物带，测定其序列。测序方法如实施例3所述。所测碱基序列(SEQID NO19)和预测的氨基酸序列(SEQ ID NO18)见图5。根据此序列，在起始密码子和终止密码子附近又合成2个引物，如下ratF25′-AATGGAAATTATTTCATCAAAGCGATTCAT-3′(SEQ IDNO48)ratR5′-CACCTATACTGACAGGAATGATGGCTCTCC-3′(SEQ IDNO49)用AMV反转录酶(宝酒造)和随机9聚体(random 9mer)(宝酒造)从大鼠下丘脑poly(A)+RNA中合成cDNA，以该cDNA为模板进行PCR反应，其中以98℃10秒、68℃40秒进行33个循环。再用这个反应液为模板以98℃10秒、68℃1分钟进行38个循环的PCR反应，得到大约690bp的PCR产物。用TA克隆试剂盒(Invitrogen)按说明书将该PCR产物克隆到质粒载体pCR2.1 TOPO。再将此载体导入大肠杆菌JM109菌株获得大肠杆菌JM109/prLPL6转化体。如实施例3所述测定碱基序列(SEQ ID NO51)并推导氨基酸序列(SEQ ID NO50)。
实施例6从小鼠脑poly(A)+RNA中依据Marathon PCR法提取小鼠型生理活性肽cDNA并确定其序列为了从小鼠脑poly(A)+RNA中提取小鼠型生理活性肽cDNA，首先将1μg的小鼠脑poly(A)+RNA，在2.5pmol寡d(T)引物(宝酒造)、0.5mM dNTP、10mM DTT存在下，用SuperScriptII RNase H-反转录酶(GIBCO BRL)，42℃反应1个小时，以合成cDNA。以此cDNA为模板，用以下引物FF25′-GACTTAATTTTAGATTTAGACAAAATGGAA-3′(SEQ ID NO26)rR45′-TTCTCCCAAACCTTTGGGGCAGGTT-3′(SEQID NO27)以及Klen Taq DNA聚合酶(Clontech)，以98℃10秒、56℃20秒、72℃25秒进行39个循环的PCR反应。再用同样的引物对，以98℃10秒、60℃20秒、72℃25秒进行25个循环的PCR反应，通过1.2％琼脂糖电泳及溴乙锭染色证实扩增产物，用QIA快速凝胶提取试剂盒(Quiagen)纯化电泳带，用实施例3的方法测定其碱基序列。为了获得该小鼠型生理活性肽cDNA片段的5′及3′末端区，从1μg的小鼠脑poly(A)+RNA中如实施例5所述用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)合成cDNA并作模板。合成以下3个引物mF15′-ACAGCAAAGAAGGTGACGGAAAATACTC-3′(SEQ ID NO28)mF35′-ATAGATGAGAAAAGAAGCCCCGCAGCAC-3′(SEQ ID NO29)mR15′-GTGCTGCGGGGCTTCTTITCTCATCTAT-3′(SEQ ID NO30)与试剂盒所附的AP1引物组合进行PCR反应。
为了扩增5′端区(N-末端区)，用引物对mR1和AP1进行第一次PCR反应。为了扩增3′端区(C-末端区)，用引物对mF1和AP1进行第一次PCR反应。总反应量为25ml，其中每个引物200pM，0.1mM dNTP、0.25ml的Klen Taq DNA聚合酶及酶缓冲液。以98℃10秒、72℃2分钟扩增5个循环，再以98℃10秒、70℃2分钟扩增5个循环，然后以98℃10秒、68℃2分30秒扩增25个循环。以第1次PCR反应液为模板进行第2次PCR反应。5′端区用第1次的引物进行扩增，3′端区用引物对mF3和AP1，以相同于第1次的反应液组成进行扩增。PCR反应以98℃10秒、72℃2分钟进行5个循环，再以98℃10秒、70℃2分钟进行5个循环，然后以98℃10秒、68℃2分30秒进行38个循环。
通过1.2％琼脂糖电泳及溴乙锭染色检测5′端及3′端区各自的扩增产物。用QIA快速凝胶提取试剂盒(Quiagen)纯化PCR产物带，用实施例3的方法测定其碱基序列。
再以所得序列为基础合成2个引物moF5′-TTTAGACTTAGACGAAATGGA-3′(SEQ ID NO31)moR5′-GCTCCGTAGCCTCTTGAAGTC-3′(SEQ ID NO32)用如上述从小鼠脑poly(A)+RNA中以SuperScriptII RNase H-反转录酶合成的cDNA为模板进行PCR反应，以扩增含有小鼠型生理活性肽全长cDNA的片段。反应过程用Klen Taq DNA聚合酶(Clontech)，以98℃10秒、56℃20秒、72℃15秒进行35个循环。通过2％琼脂糖电泳及溴乙锭染色检测到约600bp的扩增产物，用QIA quick Gel提取试剂盒(ExtractionKit)(Quiagen)纯化该PCR产物带，再亚克隆至克隆载体pCR2.1-TOOP(TOPOTA克隆试剂盒，Invitrogen)，然后将载体导入大肠杆菌JM109菌株，获得大肠杆菌转化体JM109/pmLP4。用实施例3的方法分析其碱基序列，所测的碱基序列(SEQ ID NO34)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO33)见图7。
实施例7(1)大鼠脑干周边部G蛋白偶联型受体蛋白的编码cDNA的克隆和碱基序列的测定用来自大鼠脑干周边部的cDNA为模板，用2个引物即引物1(SEQ IDNO35)和引物2(SEQ ID NO36)进行PCR反应。反应液包括1/10体积的上述cDNA，1/50体积的Advantage cDNA聚合酶混合物(CLONTECH公司)、0.2μM的引物1(SEQ ID NO35)和0.2μM的引物2(SEQ ID NO36)、200μM的dNTP和酶缓冲液，总体积为50μl。PCR反应为(1)94℃2分钟，(2)94℃30秒，72℃2分钟进行3个循环，(3)94℃30秒，68℃2分钟进行3个循环，(4)94℃30秒、64℃30秒和68℃2分钟进行30个循环，(5)最后在68℃延伸8分钟。在完成PCR反应后，用TA克隆试剂盒(Invitrogen)按说明书将PCR产物亚克隆到质粒载体pCR2.1(Invitrogen)，然后将该载体导入大肠杆菌DH5α菌株，在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选携所述cDNA的克隆，并分析每个克隆的序列，其结果得到编码新型G蛋白偶联型受体蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO38)。含有从该cDNA推导的氨基酸序列(SEQ ID NO37)的新型G蛋白偶联型受体蛋白被命名为rOT7T022L。
含有本发明大鼠脑干周边部分中G蛋白偶联型受体蛋白rOT7T022L的编码cDNA(SEQ ID NO38)被亚克隆到质粒pAK-rOT7T022L，然后用已知方法导入大肠杆菌DH10B菌株，获得大肠杆菌转化体DH10B/pAK-rOT022L。
(2)建立能表达G蛋白偶联型受体蛋白rOT7T022L的CHO细胞将1×106的CHOdhfr-细胞接种到直径为10cm的组织培养平皿中。培养24个小时。取(1)中所得rOT7T022L的表达载体pAK-rOT7T022L20μg，用基因转移试剂盒(基因转移、日本基因公司)经脂质体法形成DNA-脂质体的复合体。将培养基换成新鲜的培养基，加入所述DNA-脂质体复合体保温一夜。再次将培养基换成新鲜的培养基，培养一天，然后换成用于筛选转换体的培养基培养2天。通过胰蛋白酶-EDTA处理回收平皿内的细胞，稀释后再进行培养，使转换体的比例增加。从而获得既稳定又高效表达rOT7T022L的细胞株CHO-rOT7T022L的克隆。
(3)Met-Pro-His-Ser-Phe-Ala-Asn-Leu-Pro-Leu-Arg-Phe-NH2(SEQ IDNO39)的合成将市售对甲基BHA树脂(Applied Biosystems制造，该公司现为Perkin-Elmer公司)0.5m mole放入肽合成仪(ABI 430A)的反应罐中，用DCM溶胀。随后，将第一个氨基酸Boc-Phe用HOBt/DDC法活化，导入对甲基BHA树脂。用50％TFA/DCM处理树脂，除去Boc基团使氨基游离，用DIEA中和该氨基。用HOBt/DDC法使该氨基与下一个氨基酸Boc-Arg(Tos)浓缩。用茚三酮试验检查有无未反应的氨基，当确认反应完成后，依次缩合Boc-Leu、Boc-PrO、Boc-Leu、Boc-Asn、Boc-Ala、Boc-Phe、Boc-Ser(Bzl)、Boc-His(Bom)、Boc-Pro、Boc-Met。树脂中导入全部序列氨基酸后，用50％TFA/DCM处理以除去树脂上的Boc基团。干燥树脂得到0.73g的Met-Pro-His(Bom)-Ser(Bzl)-Phe-Ala-Asn-Leu-Pro-Leu-Arg(Tos)-Phe-pMBHA-树脂。
使0.25g树脂与5.1g对甲酚、15ml氢氟酸在用聚四氟乙烯制成的氢氟酸反应装置中于0℃搅拌60分钟。然后真空蒸馏除去氢氟酸。残留物中加入100ml的二乙醚，搅拌后，在玻璃滤膜上过滤、干燥。干燥产物悬浮于50％的醋酸水溶液50ml中搅拌。提请所述肽后，使之从树脂上脱离，真空浓缩至约5ml后，上样于Sephadex G-25柱(2.0×90cm)，用50％醋酸水溶液洗脱。收集主要级分，冻干。将粗纯化的肽溶于1.5ml 5％巯基乙酸/50％醋酸，50℃保温12小时以使Met氧化的肽还原，然后上样于反相层析柱，该柱装有LiChroprep(商品名)RP-18(MERCK公司)，用0.1％含水TFA和含有0.1％TFA的33％乙腈水溶液进行梯度洗脱以反复纯化，收集乙腈溶液浓度达到27％左右时的洗脱级分，冻干，获得26mg白色粉末。
质谱(M+H)+1428.7(理论值1428.8)HPLC洗脱时间18.0分钟。
柱条件柱子Wakosil 5C18(4.6×100mm)洗脱剂用A液(含有0.1％TFA的5％乙腈水溶液)B液(含0.1％TFA的55％乙腈水溶液)按A液到B液的线性密度梯度洗脱(25分钟)。
流速1.0ml/min(4)Val-Pro-Asn-Leu-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2(SEQ ID NO40)的合成如实施例7(3)所述，依次缩合Boc-Phe、Boc-Arg(Tos)、Boc-Gln、Boc-Pro、Boc-Leu、Boc-Asn、Boc-Pro、Boc-Val，得到0.43g Boc-Val-Pro-Asn-Leu-Pro-Gln-Arg(Tos)-Phe-pMBHA-树脂。同样地用氢氟酸处理该树脂0.22g，经过柱层析纯化得到46mg白色粉末的目的肽。
质谱(M+H)+969.5(理论值969.6)HPLC洗脱时间11.8分钟。
柱条件柱子Wakosil 5C18(4.6×100mm)洗脱剂用A液(含有0.1％TFA的5％乙腈水溶液)B液(含0.1％TFA的55％乙腈水溶液)
按A液到B液的线性密度梯度洗脱(25分钟)。
流速1.0ml/min(5)Ser-Ala-Gly-Ala-Thr-Ala-Asn-Leu-Pro-Arg-Ser-NH2(SEQ ID NO41)的合成如实施例7(3)所述，依次缩合Boc-Ser(Bzl)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Leu、Boc-Pro、Boc-Leu、Boc-Asn、Boc-Ala、Boc-Thr(Bzl)、Boc-Ala、Boc-Gly、Boc-Ala、Boc-Ser(Bzl)，得到0.62g Boc-Ser(Bzl)-Ala-Gly-Ala-Thr(Bzl)-Ala-Asn-Leu-Pro-Leu-Arg(Tos)-Ser-(Bzl)-pMBHA-树脂。同样地用氢氟酸处理该树脂0.23g，经过柱层析纯化得到71mg白色粉末的目的肽。
质谱(M+H)+1156.4(理论值1156.6)HPLC洗脱时间11.8分钟。
柱条件柱子Wakosil 5C18(4.6×100mm)洗脱剂用A液(含有0.1％TFA的5％乙腈水溶液)B液(含0.1％TFA的55％乙腈水溶液)按A液到B液的线性密度梯度洗脱(25分钟)。
流速1.0ml/min(6)rOT7T022L(SEQ ID NO37)和肽MPHSFANLPLRF酰胺(SEQ IDNO39)以及肽VPNLPQRF酰胺(SEQ ID NO40)的定位传感器反应将上述实施例7(2)所得rOT7T022L受体表达型CHO细胞以2.7×105细胞/囊的密度接种于用于定位传感器(site sensor)的囊中，过夜培养，然后插入定位传感器上。将已接至该定位传感器通路上的试验培养基(含有0.1％牛血清白蛋白的弱缓冲型RPMI 1640培养基)以开机(80秒)和关机(40秒)的周期用泵供给细胞，停机后计算8秒至30秒的细胞外pH变化率作为酸化率。监控酸化率随时间的改变，当获得稳定读数时，切断流路以使每种肽暴露于细胞7分2秒。以恰在肽暴露前3个周期将的各孔酸化率为100％，使数据标准化。细胞反应的比较表明，rOT7T022L表达型CHO细胞对肽MPHSFANLPLRF酰胺(SEQ ID NO39)以及肽VPNLPQRF酰胺(SEQ IDNO40)显示强烈的剂量依赖型反应(图8)。
实施例8构建携有人的新型生理活性肽候选者之cDNA剪接变体的转化体用1.2％琼脂糖电泳分离上述实施例3的PCR产物，当证明这些DNA片段已扩增至所需量时，用Quiagen PCR纯化试剂盒(Quiagen)回收这些DNA。用TA克隆试剂盒(Invitrogen)按说明书将回收的DNA亚克隆到质粒载体pCRTM2.1中。将其导入大肠杆菌菌株JM109感受态细胞(宝酒造)进行转化，然后在含氨苄青霉素和IPTG、X-gal的LB琼脂平板上筛选携带所述cDNA插入片段的克隆。用灭菌牙签挑取呈白色的克隆。在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上过夜培养所得每个克隆，用自动质粒抽提仪(Kurabo公司)制备质粒DNA。取一份该DNA经EcoRI切割以证实cDNA插入片段的大小。将所剩DNA取一份经RNase处理、苯酚/氯仿抽提以及乙醇沉淀浓缩。用DyeDeoxy终止子循环测序试剂盒(ABI公司)测序，用荧光自动序列分析仪译码，获得大肠杆菌转化体JM109/phRF2。
实施例9构建牛的新型生理活性肽cDNA的转化体以实施例4制备的1ml牛下丘脑cDNA为模板用下列2个引物(bFF、bFR)进行PCR扩增。
bFF5′-TTCTAGATTTTGGACAAAATGGAAATT-3′(SEQ ID NO52)bFR5′-CGTCTTTAGGGACAGGCTCCAGATTTC-3′(SEQ ID NO53)反应溶液包括合成引物(bFF及bFR)各20pM、0.25mM dNTP、0.5ml的Ex Taq DNA聚合酶及酶缓冲液，总体积为50ml。用热循环仪(Perkin-Elmer公司)以98℃10秒、65℃20秒、72℃20秒扩增40个循环。通过1.2％琼脂糖电泳及溴乙锭染色确认扩增的产物。用1.2％琼脂糖电泳分离上述实施例3PCR所得反应产物，当证明这些DNA片段已扩增至所需量时，用QuiagenPCR纯化试剂盒(Quiagen)回收这些DNA。用TA克隆试剂盒(Invitrogen)按说明书将回收的DNA亚克隆到质粒载体pCRTM2.1中。将其导入大肠杆菌菌株JM109感受态细胞(宝酒造)进行转化，然后在含氨苄青霉素和IPTG、X-gal的LB琼脂平板上筛选携带所述cDNA插入片段的克隆。用灭菌牙签挑取呈白色的克隆。在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上过夜培养所得每个克隆，用自动质粒抽提仪(Kurabo公司)制备质粒DNA。取一份该DNA经EcoRI切割以证实cDNA插入片段的大小。将所剩DNA取一份经RNase处理、苯酚/氯仿抽提以及乙醇沉淀浓缩。用DyeDeoxy终止子循环测序试剂盒(ABI公司)测序，用荧光自动序列分析仪译码，获得大肠杆菌转化体JM109/pbRF2。
实施例10 肽 MPHSFANLPLRF酰胺(SEQ ID NO39)以及肽VPNLPQRF酰胺(SEQ ID NO40)对rOT7T022L(SEQ ID NO37)表达型CHO细胞的cAMP产生的抑制活性实施例7(6)的定位传感器实验证实，实施例7(3)及(4)合成的肽MPHSFANLPLRF酰胺(SEQ ID NO39)及肽VPNLPQRF酰胺(SEQ ID NO40)可与rOT7T022L受体特异性反应。下一步，测定这些肽对rOT7T022L表达型CHO细胞的cAMP产生的抑制活性。
将实施例7(2)所得的rOT7T022L表达型CHO细胞以1.0×105细胞/每孔的浓度接种24孔板，37℃培养2天。用含有0.05％BSA和0.2mM IBMX的Hanks’缓冲液(HBSS)洗涤细胞，然后将该系统在相同缓冲液中37℃静置30分钟。30分钟后将这些细胞加入含有10-6M毛喉素的上述缓冲液中，并同时加入各种浓度的上述肽，37℃温育30分钟。
30分钟后按照cAMP EIA Kit(Amersham公司)的方法测定各孔内细胞的cAMP水平。其结果如图9所示，肽MPHSFANLPLRF酰胺(SEQ IDNO39)以及肽VPNLPQRF酰胺(SEQ ID NO40)均显示对rOT7T022L受体表达型CHO细胞之cAMP产生的强效抑制，其IC50值分别为0.5nM和0.7nM，表明所述肽的浓度很低。
实施例11人下丘脑G蛋白偶联型受体蛋白的编码cDNA的克隆及其碱基序列的测定以人下丘脑cDNA(CLONTECH公司)为模板，用2个引物即引物15′-GTCGACATGG AGGGGGAGCC CTCCCAGCCT C-3′(SEQID NO57)及引物25′-ACTAGTTCAG ATATCCCAGG CTGGAATGG-3′(SEQ ID NO58)进行PCR反应。该反应液含有1/10体积的所述cDNA为模板，1/50体积的Advantage cDNA聚合酶混合物(CLCNTECH公司)、0.2μM引物1(SEQ ID NO57)、0.2μM引物2(SEQ ID NO58)、200μM dNTP、4％二甲亚砜和酶缓冲液，溶液总体积为25μl。PCR反应条件为(1)94℃2分钟进行1个循环，(2)然后以94℃20秒，72℃1分30秒进行3个循环，(3)以94℃20秒，然后67℃1分30秒进行3个循环，(4)以94℃20秒、62℃20秒、72℃.68℃1分30秒进行38个循环，(5)最后在68℃延伸7分钟。在完成PCR反应后，将反应产物用TA克隆试剂盒(Invitrogen)按说明书亚克隆到质粒载体pCR2.1(Invitrogen)，然后导入大肠杆菌DH5α菌株，在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选携带所述cDNA的克隆，并分析每个克隆的序列，其结果得到编码新型G蛋白偶联型受体蛋白的cDNA序列(SEQID NO55及56)。这两个序列仅在第597位上有一个碱基不同，但它们推导同一氨基酸序列(SEQ ID NO57)。将含有该氨基酸序列的新型G蛋白偶联型受体蛋白命名为hOT7T022。另外将2个转化体命名为大肠杆菌DH5α/pCR2.1-hOT022T(含有SEQ ID NO55所示的cDNA)，以及大肠杆菌DH5α/pCR2.1-hOT022G(含有SEQ ID NO56所示的cDNA)。
工业应用由于本发明多肽、受体蛋白具有神经细胞刺激活性，故可作为治疗神经疾病的药用组合物。本发明多肽或受体蛋白可作为试剂有效筛选能促进或抑制本发明多肽或受体蛋白活性的化合物或其盐。通过筛选而获得的化合物可用作预防或治疗神经疾病的药物。本发明多肽或受体蛋白的抗体可特异性识别本发明的多肽或受体蛋白，因此可用来定量待测溶液中本发明的多肽或受体蛋白。
权利要求
1.一种多肽，或其酰胺或酯，或它们的盐，所述多肽含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的序列。
2.权利要求1的多肽，或其酰胺或酯，或它们的盐，其中所述基本相同的氨基酸序列为SEQ ID NO8、14、18、33或50所示。
3.权利要求1所述多肽的部分肽，或其酰胺或酯，或它们的盐。
4.权利要求3所述的部分肽、或其酰胺或酯，或它们的盐，其包含SEQID NO1中第81(Met)～第92(Phe)位的氨基酸残基。
5.权利要求3所述的部分肽、或其酰胺或酯，或它们的盐，其包含SEQID NO1中第101(Ser)～第112(Ser)位的氨基酸残基。
6.权利要求3所述的部分肽、或其酰胺或酯，或它们的盐，其包含SEQID NO1中第124(Val)～第131(Phe)位的氨基酸残基。
7.权利要求1所述多肽之部分肽的酰胺或其盐。
8.一种DNA，其包含编码权利要求1所述多肽的碱基序列。
9.权利要求8所述的DNA，其具有SEQ ID NO2、9、15、19、34或51所示的碱基序列。
10.一种DNA，其含有编码权利要求3所述部分肽的DNA。
11.权利要求10所述的DNA，其含有SEQ ID NO2中第241～第276位所示碱基序列。
12.权利要求10所述的DNA，其含有SEQ ID NO2中第301～第336位所示碱基序列。
13.权利要求10所述的DNA，其含有SEQ ID NO2中第370～第393位所示碱基序列。
14.一种重组载体，其含有权利要求8或权利要求10中所述DNA。
15.一种转化体，其用权利要求14所述重组载体转化而成。
16.一种生产权利要求1的多肽或其酰胺或酯、或它们的盐的方法，或者生产权利要求3的部分肽或其酰胺或酯、或它们的盐的方法，其包含培养权利要求15的转化体，并从中产生和积累权利要求1的多肽或权利要求3的部分肽。
17.一种抗体，其针对权利要求1的多肽或其酰胺或酯、或它们的盐，或者针对权利要求3的部分肽或其酯或其酰胺、或它们的盐。
18.一种诊断组合物，其含有权利要求8或权利要求10的DNA，或者含有权利要求17的抗体。
19.一种反义DNA，其具有与权利要求8或权利要求10的DNA互补或基本互补的碱基序列，并具有抑制该DNA表达的作用。
20.一种组合物，其含有权利要求1的多肽或其酰胺或酯、或它们的盐，或者含有权利要求3的部分肽或其酯或其酰胺、或它们的盐。
21.一种药用组合物，其含有权利要求1的多肽或其酰胺或酯、或它们的盐，或者含有权利要求3的部分肽或其酯或其酰胺、或它们的盐。
22.一种筛选化合物的方法，所述化合物能促进或抑制权利要求1的多肽或其酰胺或酯、或它们的盐，或者权利要求3的部分肽或其酯或酰胺、或它们的盐的活性，该方法包括使用权利要求1的多肽或其酰胺或酯、或它们的盐，或者权利要求3的部分肽或其酰胺或酯、或它们的盐。
23.权利要求22的筛选法，其中包括使用权利要求1的多肽或其酰胺或酯、或它们的盐，或者权利要求3的部分肽或其酰胺或酯、或它们的盐，以及具有与SEQ ID NO37所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列的蛋白质或其盐，或者所述蛋白质的部分肽或其酰胺或酯、或它们的盐。
24.一种筛选化合物的试剂盒，所述化合物能促进或抑制权利要求1的多肽或其酰胺或酯、或它们的盐，或者权利要求3的部分肽或其酯或酰胺、或它们的盐的活性，该试剂盒包括权利要求1的多肽或其酰胺或酯、或它们的盐，或者权利要求3的部分肽或其酰胺或酯、或它们的盐。
25.权利要求24所述的筛选试剂盒，其包括权利要求1的多肽或其酰胺或酯、或它们的盐，或者权利要求3的部分肽或其酰胺或酯、或它们的盐，以及具有与SEQ ID NO37所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列的蛋白质或其盐，或者所述蛋白质的部分肽或其酰胺或酯、或它们的盐。
26.一种化合物或其盐，其能促进或抑制权利要求1的多肽或其酰胺或酯、或它们的盐，或者权利要求3的部分肽或其酰胺或酯、或它们的盐的活性，所述化合物或其盐可通过使用权利要求22的筛选法或权利要求24的筛选试剂盒而获得。
27.一种药用组合物，其包含能促进或抑制权利要求1的多肽或其酰胺或酯、或它们的盐，或者权利要求3的部分肽或其酰胺或酯、或它们的盐的活性的化合物或其盐，所述化合物或其盐可通过使用权利要求22的筛选法或权利要求24的筛选试剂盒而获得。
28.一种蛋白质或其盐，其含有与SEQ ID NO37所示氨基酸序列相同或基本相同的序列。
29.权利要求28的蛋白质或其盐，其中与SEQ ID NO37所示氨基酸序列基本相同的序列为SEQ ID NO54所示的氨基酸序列。
30.权利要求28所述蛋白质的部分肽或其酰胺或酯，或它们的盐。
31.一种DNA，其包含编码权利要求28的蛋白质或权利要求30的部分肽的碱基序列。
32.权利要求31的DNA，其具有SEQ ID NO38、55或56所示碱基序列。
33.一种重组载体，其含有权利要求31所述的DNA。
34.一种转化体，其用权利要求33所述重组载体转化而成。
35.一种生产权利要求28的蛋白质或其盐的方法，或者生产 30的部分肽或其酰胺或酯、或它们的盐的方法，该方法包括培养 34的转化体，并从中产生和积累权利要求28的蛋白质或权利要求30的部分肽。
36.一种抗体，其针对权利要求28的蛋白质或其盐，或者针对权利要求30的部分肽或其酰胺或酯、或它们的盐。
37.一种诊断组合物，其含有权利要求31的DNA或权利要求36的抗体。
38.一种针对权利要求28的蛋白质或其盐的配体，其可通过使用权利要求28的蛋白质或其盐，或者权利要求30的部分肽或其酰胺或酯、或它们的盐而获得。
39.一种测定针对权利要求28中蛋白质或其盐的配体的方法，其包括使用权利要求28的蛋白质或其盐，或者权利要求30的部分肽或其酰胺或酯、或它们的盐。
40.一种筛选能改变配体与权利要求28的蛋白质或其盐之间结合特性的化合物或其盐的方法，其包括使用权利要求28的蛋白质或其盐，或者权利要求30的部分肽或其酰胺或酯、或它们的盐。
41.一种筛选能改变配体与权利要求28的蛋白质或其盐之间结合特性的化合物或其盐的试剂盒，其中包括权利要求28的蛋白质或其盐，或者权利要求30的部分肽或其酰胺或酯、或它们的盐。
42.一种能改变配体与权利要求28的蛋白质或其盐之间结合特性的化合物或其盐，所述化合物或其盐可通过使用权利要求40的筛选法或权利要求41的筛选试剂盒而获得。
43.一种药用组合物，其包含能改变配体与权利要求28的蛋白质或其盐之间结合特性的化合物或其盐，所述化合物或其盐可通过使用权利要求40的筛选法或权利要求41的筛选试剂盒而获得。
44.一种定量权利要求28的蛋白质或其盐的方法，其包括使用权利要求36的抗体。
全文摘要
本发明涉及新型多肽,其部分肽或它们的盐类;生产该多肽的方法;该多肽的受体;含有该多肽或其类似物的药用组合物;该多肽的抗体;筛选能促进或抑制该多肽活性的化合物或其盐的方法或/和试剂盒;通过该筛选法可获得的化合物;含有该化合物或其类似物的药用组合物。本发明的新型多肽或其部分肽等可用作:治疗神经疾病的制剂;促进分泌促生长激素抑制素的制剂。本发明的抗体可用于:定量待测溶液中本发明的多肽。本发明的多肽又可用于:作为一种试剂,其用于有效筛选能促进或抑制本发明的多肽活性的化合物。
文档编号G01N33/566GK1333786SQ9981545
公开日2002年1月30日 申请日期1999年11月11日 优先权日1998年11月13日
发明者渡边卓也, 菊地久仁子, 寺尾宁子, 新谷靖, 日沼州司, 福住昌司, 藤井亮, 细谷昌树, 北田千惠子 申请人:武田药品工业株式会社