一种多光束同轴检测与调整方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及激光扫描共聚焦显微成像技术领域，特别是一种多光束同轴检测与调整方法。
【背景技术】
[0002]激光扫描共聚焦显微镜(Confocallaser scanning microscope，CLSM)用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像信息，这些图像信息经成像装置接收并储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示样品的立体结构。
[0003]在显微成像应用中，特别是以激光扫描共聚焦显微技术为基础的应用中，双光束乃至多光束的成像应用非常普遍，包括荧光多标记成像、荧光共定位、相干反斯托克斯拉曼散射显微成像等等，都需要使用多路光束，多光束的同轴检测与调整是保证多路光束观察和与物质作用位置准确定位的基本条件。
[0004]现有技术中，如中国专利:201010177761.6提出了一种双光束同轴实时调整的装置与方法，分别将每条入射光束分出部分能量作为检测光，分出部分的能量再一分为二分别通过平行偏移探测器和角偏移探测器，通过探测器得到的实测光斑位置与预设标定光斑位置进行比对得到光束的平行偏移量和角偏移量，并发出反馈信号，控制单元根据反馈信号控制调整机构进行相应调整，使得每条入射光束与标定路径同轴，从而实现双光束的同轴检测与调整，此发明存在以下不足之处:1)设备复杂、成本高，需要增设大量的附加设备来对双光束进行同轴度检测和调整；2)操作过程繁琐，调整速率慢，且无法有效适用于多光束的同轴调整。
【发明内容】
[0005]针对上述不足之处，本发明公开了一种多光束同轴度的调整方法，利用金纳米颗粒作为探针，经过系统自带的成像装置扫描成像，所得图像反映了物镜焦点处多光束的重合状态，由此来调整反射镜使得多光束保持同轴，解决了在激光扫描共聚焦显微技术中多光束光源的同轴度不易检测和调整的问题。
[0006]具体而言，本发明提供的技术方案为:一种多光束同轴度的调整方法，其用于在激光扫描共聚焦显微镜对物质进行成像前，将所述激光扫描共聚焦显微镜中由多个激光光源发出的光调整为一束同轴的光线；包括:
[0007]步骤I)通过在多个激光光源的光路上设置若干个反射镜或分束器，使得所述多个激光光源发出的光合并为一束肉眼无法区分开的光线；
[0008]步骤2)选取一个能够反射激光的颗粒物，该颗粒物中每个颗粒的粒径小于所述的一束肉眼无法区分开的光线的光斑直径；
[0009]步骤3)利用激光扫描共聚焦显微镜中自带的成像装置，将所述的一束肉眼无法区分开的光线对所述颗粒物进行扫描成像；
[0010]步骤4)若得到的图像含有重影，则判定所述的一束肉眼无法区分开的光线不是一束同轴的光线，调节所述反射镜或分束器，回到步骤3);若得到的图像没有重影，则判定所述的一束肉眼无法区分开的光线是一束同轴的光线，调整结束。
[0011]优选的，所述颗粒物为透光载体，其内至少含一颗金纳米颗粒，激光只能在所述颗粒物中的金纳米颗粒上反射光线。
[0012]优选的，所述颗粒物含多个金纳米颗粒，每个金纳米颗粒之间的距离大于所述的一束肉眼无法区分开的光线的光斑直径。
[0013]优选的，在步骤I)和步骤2)之间还包括:
[0014]步骤a)通过增设分束器将所述的一束肉眼无法区分开的光线分割出一部分，形成一个新的预调光路；
[0015]步骤b)增设一个低分辨的成像装置，对所述预调光路进行成像；
[0016]步骤c)若步骤b)所成的像是同心光斑，则进入步骤2);若步骤b)所成的像不是同心光斑，则调整所述反射镜或分束器，回到步骤b)。
[0017]优选的，所述多个激光光源中至少有一个激光光源的路径上设置有第一反射镜和第二反射镜，激光经所述第一、第二反射镜反射后与其他各光路合并为所述的一束肉眼无法区分开的光线。
[0018]优选的，所述步骤c)对应调整所述第一反射镜，使预调光路中所成的像为同心光斑。
[0019]优选的，所述步骤4)对应调整所述第二反射镜，消除所得图像中的阴影。
[0020]优选的，所述第一反射镜和第二反射镜的调整同时进行，经过多次迭代调整和光线逼近，直至多光束实现同轴。
[0021]本发明相较于现有技术的有益效果是，提供的一种多光束同轴度的调整方法，
[0022]I)充分利用系统自带的成像系统，根据所得图像进行多光束同轴度的检测和调整，额外添加的元件较少，降低了系统的复杂度和成本；
[0023]2)采用金纳米颗粒作为检测同轴度的探针，检测和调整精度可达到十纳米以下，大幅度增加了多光束的同轴精度；
[0024]3)采用双成像系统配合工作的方式，对多光束的同轴度进行粗略和精密的检测和调整，调整效率更高；
[0025]4)可拓展应用至多光源系统，使用范围更广。
【附图说明】
[0026]图1是本发明应用于一实施例中的光路示意图；
[0027]图2是所述预调光路上聚焦光斑的示意图；
[0028]图3是所述成像装置对同一个金纳米颗粒用第一束激光独立成像、第二束激光独立成像与双光束同时成像时实心光斑的示意图；
[0029]图4是本实施例中光束的入射路径与预期路径的光路示意图；
[0030]图5是所述第一反射镜的调整原理图；
[0031]图6是所述第二反射镜的调整原理图。
【具体实施方式】
[0032]下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0033]本发明提供的一种多光束同轴度的调整方法，如图1所示的是应用本发明的一实施例的光路示意图，本实施例以双光束入射系统来说明，当然显而易见的是，本发明可以拓展至多光束入射系统同轴度的调整，只需相应增设如第一束激光I的入射路径，并分别采用本发明提供的方法一一调整即可。
[0034]本发明的【具体实施方式】包括:
[0035]步骤I)将第一束激光I依次通过第一反射镜3和第二反射镜4反射，并通过第二分束器6透射传播至物镜10上，第二束激光2直接入射到所述第二分束器6上，并经其反射，与第一束激光I经过所述第二分束器6透射的光线会合成一束用肉眼无法区分开的光线，通过物镜10，会聚至所述物镜10的焦点处；
[0036]步骤2)选取一个颗粒物11放置在所述物镜10的焦平面上，用肉眼无法区分开的入射光线经所述物镜10会聚于所述颗粒物11上形成聚焦光斑，所述颗粒物11为透明载体，如透明液体和透明玻璃，其内包含有若干个金纳米颗粒，作为检测入射双光束同轴度的探针，入射激光只能在所述金纳米颗粒上反射光线，而在颗粒物11的其他部位不反射光线。每个金纳米颗粒之间的距离大于所述的一束肉眼无法区分开的光线的光斑直径，并且所述金纳米颗粒的粒径小于所述的一束肉眼无法区分开的光线的光斑直径；
[0037]步骤3)所述颗粒物11设置在三维位移台12上，所述位移台12带动所述颗粒物11在XY平面上进行逐点逐行扫描运动，使得会聚在颗粒物11上的聚焦光斑遍历所述颗粒物11某一平面上的所有范围，反射回的光线穿回所述物镜10，传播至激光扫描共聚焦显微镜中自带的成像装置，本实施例中具体是将带有颗粒物11信息的光被点探测器15接收，将接收到的信号和扫描运动的位置进行重建，得到所述颗粒物11的图像，所得图像反应了金纳米颗粒在颗粒物11中某一层面上的位置分布情况，具体来说，聚焦光斑扫描至金纳米颗粒时，反射光强度会显著提高，而扫描在所述颗粒物11的其他位置时基本上不反光射光线，在所得图像中会形成高亮实心光斑，此高亮实心光斑即是金纳米颗粒的像，由此在颗粒物11中区别出金纳米颗粒，并确定其位置分布。并且所得图像还显示了在颗粒物11上入射光束聚焦光斑的形状和强度分布，具体来说，金纳米颗粒的直径小于入射光束聚焦光斑的直径，当聚焦光斑逐点逐行扫过金纳米颗粒时，相当于是用尺寸更小的金纳米颗粒作为探针，逐点逐行对聚焦光斑扫描成像，扫描图像上即可显示出聚焦光斑的形状，当聚焦光斑上的能量分布不均时，相应在所述金纳米颗粒上反射线的光强也会变化，所述实心光斑显示的亮度会有相对强弱，以此得知入射光束聚焦光斑的强度分布，当双束入射光不同轴时，也就是说在扫描图像上形成若干个不重合的高亮实心光斑，看上去就会有阴影，完全分立的双入射光束对同一个金纳米颗粒同时成像时，扫描图像上会形成两个分立的高亮实心光斑，如图3所示，当双束入射光不同轴但有重叠部分时，两个高亮实心光斑也会有部分重叠，而重叠部分的光强会进一步增强，由此可以检测双光束的同轴度。也就