一种总胆碱的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种总胆碱的测定方法，属于化学成分分析技术领域，特别适用饲料 成分分析应用。
【背景技术】
[0002] 胆碱（choline)，分子式*C5H14NO+r，胆碱是机体内许多生理功能所必需的营养物 质，在构成细胞结构、维持脂质代谢、保证神经系统的正常功能方面发挥重要作用，是动物 饲料中需要添加的重要营养物质。胆碱在动植物界广泛存在，尤其是谷物、豆科类及菜柏类 副产品，此外，鱼粉和肉骨粉也都是胆碱的丰富来源。饲料生产中要求客观、准确地评定胆 碱含量，合理科学地制定饲料配方。
[0003] 已报道的饲料中总胆碱的测定方法有以下几种：①基于雷氏盐和四苯硼钠络合反 应的分光光度计法，该方法测定误差较大是因为四苯硼钠测定胆碱会受到钾、钠、胺离子干 扰，雷氏盐会受到三甲胺等季胺盐的干扰；②气相色谱法，该方法需要将季胺胆碱降解成叔 胺，添加内标，然后衍生测定，操作繁琐且重重复性差；③液相色谱法，样品中的胆碱利用示 差折光检测器进行测定，该方法虽然灵敏，但对仪器和操作人员要求高、且费用高、难以普 及；④离子色谱法，NY/T1819-2009《饲料中胆碱的测定离子色谱法》，该方法未建立原料水 解步骤，检测出原料胆碱含量测定结果非常低，通常低于200mg/kg，而这些与实际情况（即 一般原料胆碱含量应在l〇〇〇mg/kg以上）是极不相符。导致该问题的原因是饲料中胆碱多 以复合磷脂的形成存在，游离形式胆碱很少，需要经过彻底水解释放出胆碱部分，总胆碱才 能被准确定量。因此，NY/T1819-2009不适用于原料总胆碱测定，且原料采用强酸或强碱 水解释放出游离态胆碱成为定量的首个关键步骤。
[0004] 同时，GB/T5413. 20-2013《婴幼儿配方食品和乳粉胆碱的测定》中，虽选用强酸水 解，但未对原料水解液作净化处理，即存在以下问题：原料中富含核黄素等发色物质，原料 经水解后颜色加深，造成原料背景值增高；且原料富含维生素C等还原性物质，会阻碍酶的 氧化反应，造成胆碱测定值偏低。因此，原料水解液净化处理成为胆碱准确定量的第二个关 键步骤。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术测试饲料中胆碱时，必须采用大型色谱设备，应 用困难，且饲料中胆碱释放不完全，容易受到背景因素干扰，测试结果不准确的问题，提供 一种检测饲料中总胆碱的方法。本发明的方法可以用于饲料原料、配合饲料、添加剂预混合 饲料中总胆碱浓度的定量测定。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
[0007] -种总胆碱的测定方法，包括以下步骤：
[0008] (1)配制试验用缓冲溶液：配制弱酸性缓冲液，弱碱性缓冲液和酶反应液。所述弱 酸性缓冲液是pH= 4-7的缓冲液，优选为pH= 4. 0的缓冲液，特别是乙酸钠缓冲液。所述 弱碱性缓冲液是pH= 7-8的缓冲液，优选为pH= 8. 0的缓冲液，特别是Tris-盐酸缓冲液 (也称Tris缓冲液）。所述酶反应液是混合酶反应液，混合酶反应液至少包含有胆碱氧化 酶和磷脂酶D。优选的，磷脂酶D的浓度至少为0.7U/mL，优选为0.75-1.0U/mL。胆碱氧化 酶至少为0. 8U/mL，优选为1. 0-1. 2U/mL。胆碱氧化酶可以在弱酸至弱碱性的条件下发挥酶 催化反应的作用，而磷脂酶D在弱碱性的条件下能够发挥出较好的活性，所以优选使用弱 碱性的缓冲液配制酶反应液。
[0009] 进一步，上述弱酸性缓冲液为乙酸钠缓冲液，pH= 4. 0,摩尔浓度为0. 2mol/L的。 上述弱碱性缓冲液为Tris-盐酸缓冲液，三羟甲基氨基甲烷的摩尔浓度为0.lmol/L，pH= 8. 0〇
[0010] 进一步，所述混合酶反应液含有胆碱氧化酶、过氧化物酶、邻联茴香胺、曲拉通和 磷脂酶D。这些混合酶的浓度分别为胆碱氧化酶1. 0-1. 2U/mL、过氧化物酶2. 5-2. 8U/mL、邻 联茴香胺lmm〇l/L、曲拉通1%和磷脂酶D0. 75-1.OU/mL。更优选的，所述混合酶反应液：用 Tris-盐酸缓冲液配制含有胆碱氧化酶、过氧化物酶、邻联茴香胺、曲拉通和磷脂酶D的混 合酶反应液。磷脂酶D的反应活性是影响混合酶反应液的酶催化反应的关键步骤，优选保 证其磷脂酶的活性，使用Tris-盐酸缓冲液配制的混合酶液整体活性最佳，使用效果最好。
[0011] (2)配制标准溶液：配制氯化胆碱标准溶液。
[0012] (3)用可见光分光光度计测定氯化胆碱标准溶液的吸光系数。
[0013] (4)将样品预处理，然后用分光光度计测定经过预处理的样品的吸光系数，并计算 出样品中胆碱的含量。优选使用可见光分光光度计进行测试。本发明将胆碱的主要测试工 作分配集中到相对条件要求较低的分光光度计上进行，可以降低检测过程的设备/环境要 求，提高总胆碱测试方法的通用性。
[0014] 步骤（4)中样品的预处理及测定，包括以下步骤：
[0015] (4a)取含有胆碱的饲料样品，粉碎，优选粉碎至粒度小于0. 45mm，加入无水乙醇， 溶解分散均匀，优选采用涡旋振荡至样品完全分散。优选的涡旋振荡处理，还可以采用搅拌 促进溶解分散，特别是磁力搅拌，设备简单，操作方便，搅拌效果优良。
[0016] 样品混合均匀后进行水解处理，优选为酸碱水解处理，使样品中的胆碱充分释放 到溶液中。更优选的，如果样品主要为植物性原料则加入酸液，如果样品主要为动物性原 料则加入碱液。所述酸液是酸性溶液，可以是有机酸溶液也可以是无机酸溶液，优选为无 机酸溶液，特别是盐酸、硫酸、磷酸等。所述碱溶液是碱性溶液，可以是有机碱溶液也可以是 无机碱溶液，优选为无机碱溶液，特别是氢氧化钠、氢氧化钾等配制的溶液。所述植物性原 料是指样品的制备原料是从植物材料获得的，如豆柏、菜柏、棉柏、米糠、玉米、小麦等，所述 动物性原料是指样品的制备原料是从动物材料获得的，如鱼粉、肉粉、羽毛粉、血球蛋白粉、 血浆蛋白粉等。然后，搅拌使样品分散均匀，优选磁力搅拌，水浴加热至50-80°C，优选为 65-72°C，加热时长170-240分钟为宜，优选为170-190分钟。而后振荡均匀，调节pH至弱 酸性，优选调节pH= 4.0,并用步骤（1)中配制的弱酸性缓冲液定容。
[0017] (4b)涡旋振荡，离心，取上清液过滤，收集滤液用于测定。优选的初始滤液弃去不 用。所述初始滤液又称最初滤液，开始进行过滤后，先被过滤下来到烧杯的滤液称为初滤液 /最初滤液，因为此时的滤液是对过滤装置清洗的影响，容易含有杂质纯净度不佳，所以把 初滤液倒掉之后继续采集到的滤液用于后续测定，纯净度较高，可有效减少误差。通常根据 过滤的溶液量可以大致判断初始滤液为最初1-30秒内流出滤液为初始滤液，本领域技术 人员可以根据实际测试经验进行相应调整，不影响本发明方法的实施。
[0018] (4c)用于测定的滤液，加入Tris缓冲液所配置的酶反应液，优选的加入酶反应液 用量为10-20倍体积量，保证用于测试的滤液呈弱碱性，优选测试用滤液pH= 7-8。在37°C 左右保温反应10-60分钟，保温在37°C左右是依据酶的反应活性调整的温度范围，一般来 说可以是34-38°C之间，根据实际工作情况可以小幅调整，优选保温酶促反应25-40分钟， 特别是30分钟。以样品空白为参比，在步骤（3)中相同的测试波长下，测试样品溶液的吸 光值，并计算胆碱的含量。
[0019] 本发明是基于酶联氧化法测定原料中总胆碱，本发明方法可以将饲料中结合态 胆碱完全释放出来，成功地解决了背景干扰除杂的问题，具有易操作、可重复、特异性强、 灵敏度高、准确性好的特点。与现有技术测定饲料中胆碱方法（NY/T1819-2009和GB/T 5413.20-2013)相比存在以下不同：通过强酸或强碱完全分解饲料中结合态胆碱。饲料中 胆碱多以复合磷脂的形成存在，经过彻底水解释放出游离胆碱部分，再经胆碱氧化酶特异 性的氧化偶联反应，利用分光光度计测定游离胆碱含量，进而推算饲料中总胆碱含量。当待 测样品为植物源性原料时，采用酸液水解，当待测样品动物源性样品时，采用碱液水解。对 于不同来源的样品采取不再的水解方式，结合态胆碱释放完全，测定结果准确，弥补了NY/T 1819-2009方法仅用0.lmol/L盐酸水解，方式单一，不彻底的缺陷。
[0020] 进一步，步骤（4b)还包括加入活性炭脱色处理。浓度不低于10mg/mL。在待测样 品水解液中加入浓度为l〇-3〇mg/mL的活性炭，优选18-24mg/mL的活性炭，特别优选20mg/ mL的活性炭。加入活性炭避免了水解液生色后空白吸光值增大，使得样品背景吸光值均落 在0. 05以内，明显降低了样品的测定误差，有效地消除背景干扰。同时，添加活性炭还避免 了原料中维生素C等对氧化反应的干扰，提高了样品测定的准确性和重复性。
[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果：
[0022] (1)本发明方法首先针对植物性原料和动物性原料分别采用强酸和强碱的水解方 式，促