β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种3 -受体阻断剂检测试剂及其制备和检测方法，具体涉及一种 3-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法。
【背景技术】
[0002] 0 -受体阻断剂（BetaBlockers)全称为0 -肾上腺素能受体阻断剂，主要通过阻 断@ -受体（0 1-受体或0 2-受体）与儿茶酚胺类物质的结合，从而对心血管系统、代谢 系统、支气管平滑肌等施予调节作用。受体阻断剂的出现是近代药理学的一项重大进 展。1962年第一种受体阻断剂普萘洛尔（心得安）问世并应用于临床实践。至今，全 世界已合成的受体阻断剂数以千计，被批准用于人类疾病治疗并已生产上市者也已有 几十种。目前，最常用的受体阻断剂包括：普萘洛尔、阿替洛尔、美托洛尔、吲哚洛尔以 及比索洛尔等数十种。0 _受体阻断剂主要用于治疗慢性心力衰竭、心绞痛、心肌梗死、高 血压、心律失常、高动力心脏综合征、肥厚型心肌病、冠状动脉疾病、二尖瓣狭窄以及3 -受 体功能亢进症等多种心血管疾病。此外，受体阻断剂还可用于马凡综合征、甲状腺机能 亢进症、青光眼等其它疾病的防治。0 -受体阻断剂问世50多年来，其应用经久不衰，临床 适应症范围不断拓宽，疗效更好的新品种不断涌现，使其在人类心血管疾病及其它多种疾 病的治疗中起到十分重要的作用，正因为如此，受体阻断剂（心得安）的发明者James Black获得了 1988年的诺贝尔生理或医学奖。
[0003] 由于0 -受体阻断剂可用来提高运动成绩，因此国际奥委会将此类药物列为禁用 药物。对受体阻断剂的检测分析不仅在临床药物浓度监测、生物利用度分析、药代动力 学研究等方面有重要意义，而且在体育比赛的赛后尿检中也具有重要价值。0 -受体阻断 剂的分析测定多是针对生物样本中的原型药和代谢物进行的，目前国内外常用的测定方法 有：气-液色谱法、高效液相色谱法、反相液相色谱法、气相色谱法、质谱法、气质联用法、液 相串联质谱法、荧光分光光度法、薄层色谱法、毛细管电泳法、碳糊电极法、放射免疫分析法 等，这些方法各有其特点及优劣，但是都不适用于大批量临床样本的快速检测，并且常用的 检测方法只能针对单一的一种受体阻断剂进行测定。目前市场上还没有一款能同时测 定多种常见的受体阻断剂，且稳定性好、灵敏度高、特异性强的受体阻断剂检测试 齐U，尤其是质量好的自动化检测试剂，因此，研发生产质量达到临床要求、实用性强、性价比 高，可应用于全自动生化分析仪的受体阻断剂测定试剂已成为国内外体外诊断试剂行 业的热点。
[0004] 吲哚洛尔是一种具有0 -受体阻断剂类药物典型结构的常用药物，其结构式如式(IV)所示：
[0005]
【主权项】
1. 一种β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂，其特征在于，包括：抗β-受体阻断剂特 异性抗体、用于检测抗β -受体阻断剂特异性抗体-β -受体阻断剂复合物的指示试剂；上 述β-受体阻断剂包括吲哚洛尔、比索洛尔、阿替洛尔、美托洛尔和普萘洛尔中的一种或多 种；上述抗β -受体阻断剂特异性抗体由吲哚洛尔免疫原免疫动物得到，吲哚洛尔免疫原 的结构式如式（I )所示：
式中，R为连接基团-(CH2)n-COO-, η为1至20之间的任意整数，载体为具有免疫原性 的蛋白质，载体为血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白；上述指示试剂选自酶试剂、放射性 同位素试剂、突光试剂或化学发光试剂。
2. 根据权利要求1所述的β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂，其特征在于，R 为-(CH2)3-COO'
3. 根据权利要求1所述的β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂，其特征在于，上述由吲 哚洛尔免疫原免疫动物得到的抗β_受体阻断剂特异性抗体能识别并结合各种β_受体阻 断剂的核心结构，所述各种β-受体阻断剂的核心结构，其结构式如式（II )所示：
4. 根据权利要求1所述的β -受体阻断剂均相酶免疫检测试剂，其特征在于，上述指示 试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢 酶-半抗原酶标偶联物；上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸；上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半 抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与吲哚洛尔衍生物偶联形成，上述吲哚洛尔衍生 物的结构式如式（III)所示：
上述R为-(CH2)n-COO-, η为1至20之间的整数。
5. 根据权利要求4所述的β -受体阻断剂均相酶免疫检测试剂，其特征在于，η = 3时， 上述的吲哚洛尔衍生物的合成路线为：
6. -种β -受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 权利要求4或5所述的吲哚洛尔衍生物的合成与纯化，并进行结构鉴定； (2) 吲哚洛尔免疫原的合成：使吲哚洛尔衍生物的-(CH2)n-COO-基团与具有免疫原性 的蛋白质载体连接，η为1至20之间的整数； (3) 用吲哚洛尔免疫原免疫动物，制备并纯化抗β-受体阻断剂特异性抗体； (4) 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备：制备葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液， 激活吲哚洛尔衍生物，使G6TOH与吲哚洛尔衍生物连接，纯化连接产物； (5) β -受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的制备： 试剂A的制备：由抗β-受体阻断剂特异性抗体和均相酶底物混合而成； 试剂B的制备：由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与Tris缓冲液混合而成。
7. 根据权利要求6所述的一种β -受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特 征在于，所述的步骤（2)中，蛋白质载体为BSA，η = 3,具体合成步骤如下： (1) 将20mg BSA溶解于5ml 0· 2Μ、pH 8. 5的PBS中，上述溶液置于烧杯A中； (2) 将如下化学品加入到烧杯B中搅拌溶解：20mg吲哚洛尔衍生物、0. 35ml二甲基甲 酰胺DMF、0. 35ml乙醇、0.7ml IOmM pH5.0的磷酸钾缓冲液、40mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨 丙基）碳二亚胺、5mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，于室温下搅拌溶解，反应30分钟； (3)将烧杯B中的溶液滴加至烧杯A中，得到混合溶液，在2?8°C下搅拌过夜；将上 述搅拌后的混合溶液经过中性磷酸盐缓冲液透析纯化，得到BSA-吲哚洛尔免疫原，储存 于-20。。。
8. 根据权利要求6所述的一种β -受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特 征在于，所述的步骤（4)具体过程为： (1) 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PDH溶液的制备： a. 称取15mg规格为100KU的G6PDH，室温溶解于12mL含有72. 6mg 0· 05Μ的Tris、8mg 3. 3mM 的 MgCljP IOOmg NaCl 的溶液中，该溶液 pH = 9. 0 ; b. 加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，135mg葡萄糖-6-磷酸G-6-P以 及0. 75mL卡必醇； c. 逐滴加入2mL _甲基亚讽； (2) 吲哚洛尔衍生物的激活： a. 在无水状态下称取IOmg吲哚洛尔衍生物，溶解于600 μ L DMF中； b. 使上述溶液温度降到_2?-8°C ; c. 加入3yL三丁胺； d. 加入1.5yL氯甲酸异丁酯； e. -2?-8 °C搅拌30分钟； (3) G6H)H与吲哚洛尔衍生物的连接： a. 将上述激活的吲哚洛尔衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中； b. 2-8°C搅拌过夜； (4) 纯化产物： 通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗 原偶联物，于2-8°C下储存。
9. 根据权利要求6所述的一种β -受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特 征在于，步骤（5)的具体过程如下： 试剂A的制备：将4. 036g 11. 25mM的氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、1. 71 Ig 11. 25mM的葡萄糖-6-磷酸用IL 55mM、pH = 8. 0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将 制备的抗β -受体阻断剂特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比 为 1:100 ?1:10000 ; 试剂B的制备：将制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH = 8. 2 的Tris缓冲液中，上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100?1:10000。
10. 利用权利要求1至4任意一项所述的β -受体阻断剂均相酶免疫检测试剂的检测 方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将待测样本与抗β -受体阻断剂特异性抗体接触； (2) 根据待测样本中β -受体阻断剂与抗β -受体阻断剂特异性抗体的结合情况，利用 指示试剂判断样本中β-受体阻断剂的含量； 所述待测样本为尿液、血清、血浆或唾液； 上述指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡 萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸；上述葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与吲哚洛尔衍生物偶联形 成； 上述吲哚洛尔衍生物的结构式如式（III)所示：
上述R为-(CH2)n-COO-, η为1至20之间的整数。
【专利摘要】本发明涉及一种β-受体阻断剂检测试剂及其制备和检测方法，具体涉及一种β-受体阻断剂均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法，包括：抗β-受体阻断剂特异性抗体、用于检测抗β-受体阻断剂特异性抗体-β-受体阻断剂复合物的指示试剂；上述抗β-受体阻断剂特异性抗体由吲哚洛尔免疫原免疫动物得到。本发明的有益之处在于：本发明的吲哚洛尔免疫原特异性强、免疫原性高，制备出的抗体是能与吲哚洛尔、比索洛尔、阿替洛尔、美托洛尔和普萘洛尔等各种常用的β-受体阻断剂特异性结合的抗β-受体阻断剂特异性抗体，且特异性强、效价高，并且与常见的62种药物无任何交叉反应；含有上述抗β-受体阻断剂特异性抗体的均相酶免疫检测试剂可以方便、快速、准确地确定样品中上述各种β-受体阻断剂的含量，并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样品，实现β-受体阻断剂的高通量、快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率较其它方法有了较大的提高。
【IPC分类】G01N33-566
【公开号】CN104535763
【申请号】CN201510042129
【发明人】虞留明
【申请人】爱斯杰科环球有限责任公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月27日