一种复合抗体的肌红蛋白测定试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学检验领域，具体涉及一种纳米胶乳微粒型的肌红蛋白测定试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 肌红蛋白（Mbglobin，Mb)是一个具有153个氨基酸的多肽链和一个含铁血红素 辅基组成的亚铁血红素蛋白，相对分子质量17500,主要分布于横纹肌(心肌和骨骼肌)细胞 中。由于分子量小，当心肌细胞损伤时，Mb是进入血液的最佳早期标志物。Mb通过肾小球 滤过,从尿液中排出，因此测定血清和尿液中Mb的浓度可用于某些肌病和心脏病的诊断。 如急性心肌梗死、急慢性肾衰竭、严重的充血性心力衰竭、长时间休克，神经肌肉病及各种 原因引起的肌病。
[0003] 急性心肌梗死(AMI)是临床常见的一种高病死率的急性心肌损伤性疾病，在发病 初期，Mb最先被释放入血液中，在症状出现约1~3小时后，血中Mb可超出正常上限，9~12小 时达到峰值，24~36小时后恢复正常，测定血清Mb可作为AMI诊断的早期最灵敏的指标。由 于Mb半衰期短（15min)，在胸痛发作后6?12小时不升高，则可排除AMI的诊断；Mb在AMI 后很快从肾脏清除，发病18?30小时内可完全恢复到正常水平，故Mb的测定有助于在AMI 病程中观察有无再梗死或者梗死再扩展，如果Mb频繁出现增高，提示原有心肌梗死仍在延 续。
[0004]有关检测血清肌红蛋白的方法主要采用免疫学方法，以酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)、放身寸免疫测定法（radioimmunoassay, RIA)、化学发光法（Chemiluminescence,CL)和颗粒增强透射免疫比池法 (particle-enhancedturbidimetricimmunoassay,PETIA)这几种方法为主。ELISA方法 虽然在临床上使用了近二十年，但它依然存在一些致命缺点，定量准确性差、操作时间长、 自动化程度低，一般只能用于定性检测。RIA灵敏度高，但不稳定，重复性比ELISA差，而且 存在放射性污染的危险。CL价格昂贵，需要专门的仪器和专业人员操作，不利于基层医院 普及。PETIA是近年来出现的一种较为稳定、快速、准确测定肌红蛋白血清浓度的检测方 法。PETIA的基本原理是在高分子胶乳微粒的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微粒与 抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的透光性能。而且，反应液透光 性能（即吸光度）的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，即胶乳颗粒凝集越多，越会阻 碍光线的透光性，反应液的吸光度就越大，在一定范围内与被测抗原的浓度成正比。PETIA 检测方法反应时间短，精密度好，检测范围宽，黄疸、溶血和脂血标本均不受影响，易于自动 化，是目前使用非常广泛的一种检测方法，但该方法的检测灵敏度和线性范围还有待进一 步提商。
[0005]目前，PETIA检测试剂所采用的胶乳颗粒多为惰性微粒、羧基化微粒及氨基化微 粒。表面修饰的胶乳粒子与抗体的结合是通过其表面的羧基或氨基与抗体的氨基端共价结 合，在微粒与抗体之间有一个桥联化学臂，降低了位阻效应，不仅提高了抗体的结合率，而 且还为抗体提供合适的三维空间立体结构，有效地保护了抗体与抗原结合的活性区域。国 内外已有多家公司提供纳米级表面修饰的微粒粒子原料，并广泛应用于PETIA。这些厂家提 供的粒子直径在20nm~4iim，可以作为多克隆抗体和单克隆抗体的载体。纳米级粒子的推 出解决了对单克隆抗体结合的能力不强，临床检测的线性范围窄，灵敏度低，干扰因素多， 实验稳定性差等问题，大大促进了免疫比浊法在临床上的广泛应用。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是进一步提高检测血清中肌红蛋白含量的分析灵敏 度和检测范围；提供一种特异性好，灵敏度高，精密度好，准确度高的纳米胶乳微粒型肌红 蛋白测定试剂盒。
[0007] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种复合抗体的肌红蛋白测定试 剂盒，包括试剂R1和试剂R2,其中试剂R1和试剂R2的体积比为3 : 1。所述试剂R1为促 进抗体抗原特异性结合的反应液，组分包括：10~30mmol/L的缓冲液、0. 01%~4% (w/v)的增 乳剂、0. 05%~2% (w/v)的稳定剂、0. 1% (w/v)的防腐剂；所述试剂R2为结合有抗人肌红蛋 白抗体纳米胶乳微粒的缓冲液，组分包括：〇. 1%~〇. 5% (w/v)标记有抗人肌红蛋白抗体的纳 米胶乳微粒、〇. 〇2%~2% (w/v)的稳定剂、10~30mmol/L的缓冲液、0. 1% (w/v)的防腐剂。
[0008] 所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、2-吗啉乙横酸（NES)缓冲溶液、磷酸盐 缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸（ffiPES)缓冲液和三羟甲基氨 基甲烷（Tris)缓冲液中的一种或多种；所述缓冲液pH值为6~9。所述缓冲液可以为其他 具有相似特征的缓冲液。
[0009] 所述增乳剂为聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇辛基苯基 醚、NaCl、吐温20或吐温80。增乳剂主要作用是可以增加抗体抗原的反应速率。本发明所 述的增乳剂优选品种为聚乙二醇6000。
[0010] 所述防腐剂为叠氮化钠、硫柳汞、苯酚中的一种或多种。本发明优选品种为叠氮化 钠。
[0011] 所述稳定剂为牛血清白蛋白、聚乙二醇6000、乙二胺四乙酸钠中的一种或多种。
[0012] 所述抗人肌红蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体或单克隆抗体与多克隆抗体 的混合物。
[0013] 所述标记有抗人肌红蛋白抗体的纳米胶乳微粒的制备方法为：选择不同粒径的羧 基化聚苯乙烯纳米胶乳微粒，通过活化剂1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基）碳化二亚胺盐酸 盐（EDAC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS)活化微粒表面的羧基，生成活性酯，再与 肌红蛋白单克隆抗体或多克隆抗体上的伯氨基反应，形成共价键，完成偶联，制成不同粒径 的肌红蛋白单克隆抗体或多克隆抗体纳米胶乳微粒偶联物。所述不同粒径的羧基化聚苯乙 烯纳米胶乳微粒的直径在50~300nm(为市售产品)。其中，小粒径纳米胶乳粒偶联单克隆抗 体，可提高检测的线性范围；大粒径纳米胶乳微粒偶联多克隆抗体，可提高检测灵敏度。
[0014] 本发明的原理：本发明利用交联了抗体的纳米胶乳微粒偶联物，与相应标本中的 抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物形成时所产生的浊 度，即可测出标本中被检物的含量。进一步的，所述本发明中，血清中的肌红蛋白与交联在 纳米胶乳微粒上的抗人肌红蛋白抗体结合，产生抗体抗原反应，使纳米胶乳微粒形成聚集， 在500nm波长处测定反应物吸光度，通过对照标准曲线可计算出标本中肌红蛋白的含量。
[0015] 本发明与现有技术相比，具有以下优点： 1.本发明试剂盒的检测灵敏度可以达到〇. 2Pg/L，线性范围为10~1000l^g/L，二者均 高于同类产品的分析灵敏度和线性范围。是一种灵敏度高、特异性好、准确性高、精密度好、 线性范围宽的纳米胶乳微粒型的肌红蛋白测定试剂盒。
[0016] 2.本发明所涉及的纳米胶乳微粒的粒径在50~300nm;将不同粒径的微粒分别与 肌红蛋白单克隆抗体或肌红蛋白多